VIRUS DE LAS PLANTAS

Autor: LEIVA BRONDO MIGUEL.
Año: 2004.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: El pepino dulce es una especie de origen andino cultivada por sus frutos que en las últimas décadas ha iniciado una tímida expansión fuera de su zona de origen. Sus posibilidade de éxito como fruta exótica son grandes en los mercados asiáticos y europeos, sin embargo es necesario obtener cultivares adaptados a la zona de cultivo y utilizar las técnicas más adecuadas para conseguir frutos de calidad que satisfagan al exigente consumidor actual. Uno de los problemas que más afecta al pepino dulce en nuestra zona es el ataque por enfermedades de origen vírico, dada la propagación vegeetativa de este cultivo opues disminuyen la produccción y dañan los frutos haciéndolos no comerciales. El virus del mosaico del tomate (ToMV) se encuentra entre las enfermedades más dañinas en este cultivo. La ineficacia de las labores preventivas contra el ToMV hace de especial importancia la obtención de variedades resistentes. En este trabajo se hace un cribado en la especie cultivada y especies relacionadas y se comprueba la utilidad de entradas resistentes halladas en anteriores trabajos. Las entradas resistensts son caracterizadas a distintas temperaturas y con distintos tipos de inóculo y se observa el patrón de distribución del virus a larga y corta distancia del punto de infección. Las entradas resistentes retringen el movimiento del virus a temperaturas bajas y medias, mientras que a temperaturas altas la resistencia se ve superada por el virus. Asi mismo, para su utilización en planes de mejora es necesario caracterizar el modo de herencia de estas entradas. Se han obtenido cruces entre entradas susceptibles y resistentes y se han caracterizado frente a la infección con TomV. Los resultados muestran un posible modo de herencia distinto entre entradas resistentes, y posiblemente monogénico, lo cual favorecería la obtención de una resistencia más duradera al aunar en un mismo material diversos genes de resistencia y de fácil introgresión.

Autor: HERRANZ GORDO Mª CARMEN.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE ECONÓMICAS.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: El éxito de una determinada virosis depende de la capacidad del patógeno de transportarse, primero célula a célula para luego alcanzar el sistema vascular e invadir a la planta sistémicamente. En el movimiento célula a célula están implicadas las protéinas de movimiento (MPs) virales. Los objetivos globales de la presente tesis versan sobre los líneas de actuación complementarias para el desarrollo de medidas de control de la virosis. -Estudios relacionados con el transporte intercelular de virus de la `superfamilia 30k` analizando in vitro las propiedades de unión a RNA de la MP del PNRSV, la determinación del dominio implicado y la relación in vivo de éste con el movimiento célula a célula. La MP del PNRSV une preferentemente RNA de simple cadena, de forma cooperativa y sin espcificidad de secuencia. El diminio de unión a RNA se localiza en el extremo N-terminal de la MP y es rico en aminoácidos básicos y además esencial en el movimiento célula a célula. Por otro lado se comprobó la intercambialidad funcional de distintas NPs de virus de la `superfamilia 30k`. -Desarrollo de dos métodos de detección simultánea de los principales virus que afectan a frutales de hueso. Uno de ellos permite la detección simultánea mediante RT-PCR en un sólo paso, de ocho virus que afectan a frutales de hueso y en el segundo se desarrolla una nueva estrategia basada en el clonaje en tándem de seis secuencias parciales, lo que permite la obtención de una única vibosonda a la que hemos denominado polisonda, y que permite la detección simultánea de los virus clonados.

Autor: JIMENEZ TORRES IGNACIO.
Año: 2004.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: Los potyvirus son virus de RNA de polaridad positiva cuyo genoma codifica una poliproteína que se procesa autocatalíticamente para dar lugar a al menos nueve proteínas maduras. Una característica de las infecciones por potyvirus es la acumulación de inclusiones citoplásmicas en forma de ruedas de molino, también llamadas inclusiones cilíndricas. Estas inclusiones están formadas por la proteína CI. Esta proteína está implicada en la replicación y en el movimiento de célula a célula del virus. En estudios previos, se realizó un escrutinio mediante el método de los dos híbridos de una genoteca de cDNA de Nicotiana benthamiana utilizando la proteína CI del virus de la sharka (PPV) como cebo. Se identificaron dos proteínas (L1 y L2) que interaccionaban específicamente con la proteína CI de PPV. L1 es una proteína desconocida con un dominio de dedos de zinc de tipo HIT, y L2 es el precursor de la subunidad PSI-K del fotosistema I. Con objeto de caracterizar dichas interacciones, se ha empleado el sistema de los dos híbridos para analizar los dominios implicados y la especificidad. Se ha comprobado que es necesario un fragmento que comprende los 409 aminoácidos N-terminales de la proteína CI para que la interacción tenga lugar. Las interacciones también se han detectado con la proteína CI de otro potyvirus (TVMV) y las proteínas L1 y L2 de otra planta (Arabidopsis thaliana), sugiriendo que dichas interacciones son un evento general en las infecciones por potyvirus. Para determinar la importancia biológica de las interacciones se ha analizado la infección de PPV en plantas de N. benthamiana con la expresión de L1 y L2 reducida mediante el silenciamiento de su RNA. Cuando el gen de L1 es silenciado, la acumulación del virus es más baja que en plantas control, sugiriendo que la proteína L1 puede tener un papel positivo para la infección de PPV. Sin embargo, cuando el gen de L2 es el silenciado, se observó una mayor acumulación de PPV. Se utilizó también un mutante nulo de la proteína L2 (PSI-K) de A. thaliana asegurando así la ausencia total de la proteína. Los resultados fueron similares a los obtenidos mediante el silenciamiento, sugiriendo que esta proteína interfiere con la infección de PPV, posiblemente a través de su interacción con la proteína CI. Además se han identificado dos proteína más de N. benthamiana que interaccionan con la proteína CI, así como tres proteínas de Arabidopsis, pero la importancia de estas interacciones está aún por determinar.

Autor: SACRISTAN BENAYAS SOLEDAD.
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: E.T.S.I. AGRNOMOS.
Centro de realización: ESCUELA TECNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: En esta tesis se estudian las implicaciones que la adaptación a diferentes huéspedes puede tener en la ecología y epidemiología de un patógeno con múltiples huéspedes y sus consecuencias en su evolución y en la de su virulencia. La investigación se ha centrado en un patógeno de plantas: el virus del mosaico del pepino (Cucumber Mosaic Virus, CMV), que es el virus de plantas con la mayor gama de huéspedes conocida. Los objetivos de esta tesis se han abordado mediante un análisis de las poblaciones de CMV y su dinámica en diferentes huéspedes y un examen de la adaptación de CMV a distintos huéspedes, investigando la existencia de compromisos en la adaptación de CMV a distintos huéspedes y explorando la relación entre adaptación a huésped y virulencia.El análisis de las poblaciones de CMV y su dinámica en diferentes huéspedes se ha realizado en una zona hortícola del Centro de España (Vega del Tajo, Comunidad de Madrid). Este análisis ha consistido en comparar la dinámica de la incidencia y la estructura de las poblaciones de CMV en distintos huéspedes, que comprenden la flora arvense de la zona y el cultivo del melón. El cultivo del melón es uno de los principales cultivos hortícolas de la región y sobre el que cada año se producen epidemias de CMV. Las epidemias de CMV en los cultivos suelen ser muy variables de un año a otro. Trabajos anteriores de nuestro grupo habían analizado epidemias de CMV en melón en esta misma zona y apuntaban a la flora arvense como posible reservorio y fuente de inóculo primario de CMV, sugiriendo un posible papel de la flora arvense en las diferencias anuales entre epidemias. La dinámica de la incidencia de CMV se ha estudiado en esta Tesis en referencia a la cantidad y composición de la vegetación en distintos hábitats con diferentes niveles de intervención humana y, como consecuencia, distintos niveles de estabilidad de la vegetación. Durante los tres años de estudio, se ha detectado CMV en la flora arvense durante todas las épocas del año y no se han detectado diferencias significativas en la estructura y caracterización biológica de las poblaciones de CMV de la flora arvense y de melón, lo que indica que la flora arvense puede ser fuente de inóculo para las epidemias de CMV en melón. No obstante, no se ha encontrado relación entre la incidencia de CMV en la flora arvense y las diferencias en incidencia y en duración de las epidemias de CMV en melón. La incidencia de CMV en la flora arvense en cada estación ha mostrado estar relacionada positivamente con la cantidad de vegetación en las estaciones anteriores. La incidencia de CMV, su variación a lo largo del año y su relación con la vegetación han sido distintas según el hábitat. Estas diferencias se podrían atribuir a diferencias en la dinámica de los pulgones en relación con la estabilidad de la vegetación. Estos datos subrayan la complejidad de la ecología de un virus generalista y han permitido sacar conclusiones que no eran obvias.El examen de la adaptación y compromisos de CMV en distintos huéspedes y de la relación entre adaptación a huésped y virulencia se ha llevado a cabo mediante la comparación de la eficacia biológica y el efecto sobre diferentes huéspedes de seis aislados procedentes de tres huéspedes distintos. Los aislados han sido comparados antes y después de haber sido sometidos a un proceso de evolución experimental de diez pases seriados en su huésped de origen. Los resultados de este trabajo, unidos al análisis de las secuencias de los aislados estudiados, sugieren la existencia de estructuración de las poblaciones respecto a su eficacia biológica según huésped y que la eficacia biológica encontrada en las poblaciones naturales podría ser máxima. Respecto a la relación entre capacidad de multiplicación y virulencia, este trabajo indica que no existe o es muy débil. Además, la evolución de la virulencia en el proceso de pases seriados no ha seguido la misma dirección que la de la eficacia biológica. Este es el primer trabajo que examina el grado de adaptación a huésped de CMV en la naturaleza y el primer análisis exhaustivo de la relación entre su multiplicación y su virulencia.

Autor: SAMBADE ZUMOFFEN ADRIÁN JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: Biblioteca Campus de Burjassot.
Centro de realización: INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS.

Resumen: La tristeza es una de las enfermedades más graves de los cítricos. Ha causado en España la muerte de más de 35 millones de árboles de naranjo dulce, mandarino y pomelo injertados sobre naranjo amargo. Esta enfermedad está causada por un closterovirus (Citrus tristeza virus, CTV) cuyo RNA genómico, de unas 20 kb, contiene 12 ORFs y zonas no codificantes en sus extremos 5' y 3' . Los aislados de CTV están formados por poblaciones complejas de variantes de secuencia, cuya composición puede alterarse en los procesos de transmisión y/o cambio de especie huésped. Estos cambios acompañados en ocasiones de cambios en la virulencia, lo que supone una amenaza permanente para la citricultura. Dada la escasa información disponible sobre la variación genética de CTV y las presiones evolutivas que actúan sobre sus poblaciones, se planteó como objetivo general de esta tesis estudiar la variabilidad en distintas regiones genómicas y desarrollar en su caso marcadores para identificar las secuencias características de los aislados más virulentos. Primero se optimizó un protocolo para la amplificación rápida de secuencias virales por RT-PCR que permitió obtener cDNA altamente específico. Para hacer los diferentes estudios en las poblaciones de variantes de secuencia se eligió un panel de aislados de CTV de distinta patogenididad y origen geográfico. Utilizando el análisis del polimorfismo conformacional del DNA de cadena sencilla (SSCP) se pudo observar que los aislados más virulentos mostraban perfiles más complejos. Aunque en ningún gen se encontraron perfiles de SSCP específicos que pudiesen asociarse con el origen de los aislados o su patogeneidad, todos los aislados estudiados pudieron diferenciarse de los demás. Esta información sirvió para poder monitorizar ensayos de doble inoculación utilizando dos aislados de diferente patogenicidad. Esto permitió asociar la aparición de un perfil característico de un aislado virulento con la inducción de los síntomas producido por dicho aislado. De este mismo panel de aislados se obtuvieron las secuencias predominantes del den p23 que s analizaron filogenéticamente y se clasificaron en tres grupos, aquellas predominantes en los aislados poco agresivos, las predomiantes en los más virulentos y el tercer grupo, que incluía aislados con caracteristicas variables. Basados en esta información se estableció un sistema de RT-PCR bi-direccional, para la detección especifica de estos grupos y se probó que los aislados menos agresivos sólo contenian la secuencia característica de su grupo. Al evaluar un experimento de protección cruzada utilizando el aislado asintomatico T32 y el aislado virulento T318 se observó que: i) el aislado T32 no tiene capacidad protectora frente al aislado T318,ii) la aparición de sintomas siempre estuvo asociada a la presencia de variantes de secuencia, carateristica de T318, y iii) la transmisión por pulgón del aislado T318 seleccionó en todos los casos una variante de secuencia, caracteristica de este aislado, y asociada con la expresión de sintomas que se hizo predominante en las plantas co-inoculadas. Finalmente, para profundizar en los mecanismos evolutivos que afectan a CTV, se realizó un estudio sobre la diversidad genética y relaciones filogenética de siete regiones genómicas predominantes en los aislados de CTV del panel seleccionado. Se determinó que estas regiones están sujetas a presiones variables de selección negativa para el cambio de aminoácidos e incluso de nucleócitos. Por otra parte, relaciones filogenéticas incongruentes en distintas regiones genómicas sugieren la presencia de múltiples eventos de recombinación. Toda esta información nos permitió identificar al menos tres lijanes diferentes de CTV que incluyen: los aislados poco agresivos, los más virulentos, y algunas secuencias detectadas sólo en aislados de Sudamérica.

Autor: LUCINI BAQUERO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: ESCUELA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: CEBTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA CSIC.

Resumen: En esta tesis se estudian los vectores de expresión basados en el virus de la sharka (PPV), compaando su comportamiento en diferentes huéspedes herbáceos a nivel de sintomatología, acumulación viral, expresión de la proteína heteróloga y estabilidad de la secuencia insertada. Se estudia la estabilidad de los vectores virales basados en PPV insertando diferentes secuencias heterólogas y analizando los diferentes comportamientos observados. Por otro lado, en esta Tesis se han modificado los vectores virales existentes a nivel de secuencia y a nivel de expresión: obteniendo expresión constitutiva mediante plantas trangénicas que incorporan genoma parcial o completo de PPV. Es el primer caso descrito con plantas transgénicas que poseen como trangen el genoma completo de PPV y de PPV insorporando la secuencia de la proteína de la fluorescencia verde. Por último se ha conseguido desarrollar por primera vez una doble quimera en la que se expresan dos proteínas heterologas de forma simultánea e independiente expresadas en el mismo foco celular mediante PPV.

Autor: FERNANDEZ MARCO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD MÁLAGA.

Resumen: Esta tesis tiene como objetivo general el estudio de aspectos relacionados con la identificación y el uso de la resistencia genética como estrategia para el control del Virus del amarilleo de las venas del pepino (Cucumber vein yellowing virus, CVYV), y del Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV), dos virus transmitidos por moscas blancas que afectan gravemente a los cultivos protegidos de melón del sureste peninsular espapol. Así, se ha llevado a cabo la caracterización de un aislado español de CVYV, que es un virus de reciente aparición en nuestro país, así como la puesta a punto de métodos de detección de este virus que se han utilizado para realizar una búsqueda de fuentes de resistencia. Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto la escasez de fuentes de resistencia naturales a CVYV en melón, ya que no se ha encontrado ninguna en dicha especie. Sin embargo, plantas de las especias afines Cucumis africanus, Cucunis dipsaceus y Cucunis prophetarum si resultaron resistentes. La utilidad de estas entradas como donadores de resistencia a CVYV dependerá, en gran medida, del desarrollo de estrategias de transferencia de genes que superen las barreras de compatibilidad de estas especies con C. Melo. Además, se ha llevado a cabo un análisis fisiológico de la resistencia a CYSDV de una entrada de melón procedente de Zimbabwe (C-105). Para ello se desarrollaron previamente herramientas para la detección de los RNAs de CYSDV en tejido vegetal y se estudió su acumulación en plantas de cultivares susceptibles de cuatro especies de cucurbitáceas para establecer una adecuada metodología de trabajo. El mecanismo de resistencia de C-105 puede implicar una restricción del movimiento del virus en el sistema vascular de estas plantas y/o una prevención de la acumulación viral a altos niveles. Se ha estudiado, en relación con la durabilidad de esta resistencia, la variabilidad genética de poblaciones de CYSDV muestreadas durante un período de 8 años. Se han determinado y analizado secuencias parciales de los ORF 2, ORF 3y ORF 4 del RNA 1, y HSP70h, CP y una región del extremo 5' no codificante del RNA 2. EL resultado más notable del trabajo consiste en que la población de CYSDV resultó ser extraordinariamente homogénea.

Autor: SIMON DE GOÑI OIHANE.
Año: 2003.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: ETS INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ETS INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: Los nucleopoliedrovirus (NPVs) han mostrado un gran potencial insecticida para el control de plagas. El aislamiento de genotipos individuales han indicado que las poblaciones silvestres (WT) de NPVs son genéticamente heterogéneas. En esta tesis se han analizado las relaciones entre las características moleculares y biológicas de los genotipos individuales así como su contribución a la estructura poblacional de un NPV. El estudio se ha basado en el NPV múltiple aislado de larvas de Spodoptera frugiperda (SfMNPV) originarias de Nicaragua (SfNIC). El SfMNPV presenta un genoma de alrededor de 129 kb. Se han secuenciado un total de 27,92 kb, (21,5% del genoma) que representan 38 ORFs. Su comparación con otros baculovirus ha revelado que SfMNPV y SeMNPV presentan un alto grado de homología a nivel genético, sin embargo, estos dos virus difieren mucho en su espectro de huéspedes. El SfMNPV es letal para los huéspedes heterólogos S. exigua y S. littoralis, pero no se observa la sintomatología típica. Por el contrario, la patogénesis del SeMNPV fue bloqueada y eliminada durante la infección secundaria, aunque se demostró que ni la entrada ni la infección primaria son factores determinantes del espectro. El SfNIC consiste en una mezcla de nueve genotipos. El genotipo SfNIC-B es el que predomina en la población SfNIC (frecuencia relativa 80%). El resto de los genotipos presentan deleciones comparativamente con SfNIC-B, que se localizan en una región comprendida entre las 14,8 y 27,6 unidades de mapa. El análisis de la secuencia de esta región del genoma reveló la presencia de 18 ORFs. Entre ellos el gen pif y pif-2. La actividad transcripcional del gen pif muestra pautas muy similares a las del gen pif del NPV de S. littoralis (SpliMNPV). Se han descrito los genes ausentes en cada uno de los genotipos individuales del SfNIC y la posible influencia en sus características fenotípicas. Por ejemplo, los genotipos deletados SfNIC-C y -D no son capaces de infectar las larvas de S. frugiperda por ingestión ya que no contienen los genes pif y pif-2 (genes esenciales para la unión y penetración del virión a las células epiteliales). Sin embargo, estos tienen una influencia positiva sobre la probabilidad de transmisión del genotipo completo. La actividad biológica de los genotipos únicos fue menor que la del aislado silvestre SfNIC. Las mezclas de genotipos B+A, B+C, B+D y B+F tuvieron una patogenicidad y virulencia superior a la de los genotipos individuales, aunque sólo las mezclas de genotipos B+C y B+D, coincluidos en una proporción de 3+1, restablecieron la actividad biológica del aislado silvestre SfNIC. Estos resultados contradicen la idea generalmente aceptada de que un genotipo mutante deletado tiende a tener efectos adversos sobre la población del virus. En OBs que coincluyen un genotipo completo (B) y uno deletado (C) en diferentes proporciones, la dinámica de los genotipos deletados convergen a una misma frecuencia de equilibrio representada por ~20% del genotipo C y ~80% del genotipo B después de cuatro pases sucesivos en larvas. Después del último pase, la patogenicidad de los OBs de las poblaciones experimentales no difirió respecto a la de los OBs del WT pero fue significativamente mayor que la de los OBs monoclonales del genotipo B. Todo parece indicar que las poblaciones naturales de los NPV están genéticamente estructuradas para optimizar su probabilidad de transmisión. Los genotipos deletados minoritarios en la población desempeñan un importante papel como determinantes de patogenicidad y virulencia. Estos resultados demuestran claramente la importancia de retener la diversidad genotípica en los bioinsecticidas basados en baculovirus y su conocimiento para entender la ecología de los baculovirus.

Autor: GÓMEZ DE CEDRÓN CARDEÑOSA MARTA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA (CSIC).

Autor: MARTÍN GARCÍA SUSANA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: Los cítricos constituyen el cultivo frutal más importante a escala mundial. Siendo Espafía el primer exportador mundial de fruta fresca, lo que hace de los cítricos un factor de gran importancia económica. La psoriasis de los cítricos causa importantes pérdidas en las cosechas espafiolas, donde se transmite por injerto, por lo que la certificación sanitaria del material propagativo sería suficiente para controlar la enfermedad. Sin embargo único método de diagnóstico fiable de la enfermedad es el ensayo de protección cruzada frente a psoriasis B ocho meses de duración y elevado coste económico ya que requiere espacio en invernadero y personal especializado. Esto impone la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico rápido basados en la detección del patógeno. Se ha encontrado un virus. Esto impone la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico rápido basados en la detección de patógeno. Se ha encontrado un virus, Citrus psorosis virus (CPsV) asociado a esta enfermedad: sin embargo no han podido cumplirse los postulados de Koch debido a que los viriones pierden infectividad en el proceso de purificación. En este trabajo se han desarrollado métodos de detección de CPsV fiables basados en la detección de la proteína capsídica y de RNAs. La detección del virus se ha comparado, por primera vez, con el ensayo de protección cruzada en II aislados de colección y 47 árboles de campo, encontrándose una correlación perfecta entre el diagnóstico de la enfermedad y la presencia de CPsV. Nuestros resultados indican que la enfermedad se puede diagnosticar mediante técnicas de labomtorio de modo tan fiable como mediant el ensayo de protección cruzada, y apoyan la hipótesis de que CPsV es el agente causal de la enfermedad CPsV es la especie tipo del género Ophiovirus, no asignado a ninguna familiar viral. El género engloba virus que infectan plantas, de genoma segmentado compuesto por RNAs de cadena simple y polaridad negativa, encapsidados por una única proteína de 43-50 KDa, formando viriones de morfología característica. Sólo se ha secuenciado el genoma completo del ophiovirus de las venas grandes de la lechuga (MLBVV) y el asilado del CPsV CPV -4, cuya fuetne original es un árbol de Florida importado desde Texas. En este trabajo se ha obtenido la secuencia completa del aislado espafiol P-121, encontrándose baja identidad de secuencia nucleotídica (80%) entre los aislados de CPsV pero una organización genómica idéntica, identidades y similitudes aminoacídicas altas, y motivos de secuencia conservados entre las regiones no codificantes de ambos aislados. Sin embargo, MLBVV contiene una RNA más que CPsV, las identidades aminoacídicas fueron bajas o no significativas y no se econtraron motivos de secuencia conservados entre las regiones no codificiantes de ambos ophiovirus. La comparación con secuencias parciales de otros ophiovirus mostró que el resto de ophiovirus están más relacionados entre sí que con CPsV. Nuestros resultados junto con otras diferencias biológicas y moleculares descritas en la litemtum revelan diferencias notables entre CPsV y otros ophiovirus. A la vista de las variaciones gen éticas encontradas entre aislados de CPsV de distinta procedencia geográfica, se realizaron estudios filogenéticos y de diversidad gen ética de tres reigones del genoma, dentro y entre 23 aislados de España, Italia, Florida, California y Argentina. Nuestros resultados mostraron que los aislados de CPsV forman dos poblaciones diferenciadas desde un punto de vista gen ético, una formada por los aislados de Argentina, y otra por los de España, Italia, Florida y California. Las distancias gen éticas entre los aislados de ambas poblaciones fueron de un 80% entre sí y con el aislado de CPV-4, por lo que éste podría representar una tercem población. La comparación entre las relaciones filogenéticas de las tres regiones sugiere que pueden haber ocurrido reordenamientos entre segmentos genómicos en algunos aislados. El estudio de la relación entre las sustituciones sinónimas y no sinónimas, mostró que existe una fuerte presión de selección contra el cambio de secuencia uminoacídica en las tres regiones estudiadas, una perteneciente al gen que codifica la RdRp, otra en el extremo 3' terminal de una proteína de 54KDa y funcion desconocida y otra en el extremo terminal de la proteína de la cápsida viml, en ésta última la presión de selección es especialmente intensa y mayor a la encontrada en otros virus. Este estudio es el primer estudio de diversidad gen ética en virus de RMA de cadena negativa que infectan plantas.

Autor: MARROQUÍN CÁCERES CARLOS ARTURO.
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA .

Resumen: Entre los años 1997 y 2000 se han realizado varios ensayos en campos de cítricos de l'Horta (Valencia) y la plana (Castellón), conducentes a determinar la fauna afídica de diversas especies cítricas utilizando distintos métodos de captura, a obtener el número de pulgones de cada especie que visitan los árboles adultos de las especies cítricas, a determinar el número de áfidos portadores de Citrus tristeza virus (CTV) que visitan los árboles adultos y comparar el porcentaje de pulgones portadores de CTV entre especies afídicas y cítricas, y a comprobar si los resultados obtenidos explican las diferencias en la dispersión de CTV que se observan entre zonas y entre especies cítricas. Además, se han realizado ensayos de detección de CTV por "nested" RT-PCR en pulgones individuales y de transmisión tras diferentes períodos de adquisición. Se ha determinado que los pulgones mayoritarios en las zonas estudiadas son: Aphis gossypii y A.spiraecola, siendo el primero más abundante en l'Horta que en la Plana, lo que explica el mayor incremento de tristeza que se ha observado en l'Horta. Se ha fijado la dinámica poblacional de las especies afídicas encontradas y se ha comprobado la mayor atracción que ejercen las trampas amarillas de Moericke sobre A.spiraecola. Se ha evaluado el número de pulgones de cada especie que visitan árboles adultos de naranjo ducle, clementino, satsuma, limonero y pomelo, utilizando el método del "brote pegajoso". Como media un cítrico cultivado en L'Horta fue visitado en mayo de 2000 por más de 147.000 pulgones. Para estos mismos cítricos se ha obtenido el número de pulgones portadores de dianas de ARN de CTV amplificables por "nested" RT-PCR en un solo tubo cerrado, de cada especie afídica que visita un árbol. Se ha comprobado que el porcentaje de pulgones portadores de tristeza es el mismo en A.gossypii que en A.spiraecola, independientemente de su distinta eficacia transmisora de CTV. Se ha determinado que el clementino recibe una proporción mayor de A.gossypii, que se desarrolla mejor en él, y que el clementino además, recibe por árbol un mayor número de pulgones en general, de A.gossypii en particular, y también de pulgones portadores de CTV. Ello explica la mayor rapidez que se observa en clementino para infectarse con CTV comparada con otros cítricos como el naranjo. Se ha comprobado que pulgones de especies no descritas como vectoras de CTV pueden adquirir ARN del virus. Se ha determinado que un mayor período de alimentación (adquisición) de los pulgones enplantas infectas con CTV no conduce a un mayor porcentaje de detección de dianas de CTV en pulgones individuales, aunque se traduce en un aumento de la transmisión. El tiempo de adquisición no esta relacionado con una detección preferente del virus en el estilete o en el estómago de los pulgones. Existe una buena relación entre transmisión y detección cuando se emplea un solo individuo tras períodos largos de alimentación. Se ha demostrado que un único individuo áptero de A.gossypii es capaz de transmitir CTV tras períodos de adquisición superiores a 5 horas. Este hecho soporta la importancia epidemiológica de esta especie en la dispersión de CTV.

Autor: MARTÍN URDÍROZ M. NIEVES.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La finalidad de este trabajo ha sido establecer un sistema de transformación estable de Allium sativum L. Utilizando el sistema biolístico. Para ello, en este trabajo se desarrollan nuevos sistemas de regeneración in vitro de brotes que se incluyen en el proceso de transformación biolística. Por una parte, se estudia la influencia de la luz y el inhibidor de la biosíntesis de fiberelinas, flurprimidol, sobre un sistema de regeneración continuo, es decir, en el que los explantos no se subcultivan ni se cambian de condición lumínica (fotoperíodo 16/8h u oscuridad) en los dos meses de incubación. Se encuentran diferencias significativas en relación a la formación de callo y a la regeneración de brotes entre las entradas, los medios nutritivos y la condición lumínica utilizadas. En resumen, la luz no afecta a la callogénesis y favorece considerablemente la regeneración de brotes. La entrada Mallorquín produce hasta 250 brotes por gramo de callo producido en el medio que contienen 0,30 mg/l de 2,4-D, 2 mg/l de ANA y 3 mg/l de BAP. Este resultado supera a otros publicados con anterioridad. Por otra parte, se estudian las condiciones de precultivo, bombardeo y selección más adecuadas para obtener expresión estable del gen marcador uidA (gus) en los distintos explantos empleados. Finalmente, se obtienen puntas de raíces, callos y yemas axilares que expresan establemente el gen gus, además de una planta resistente a paromomicina.

Autor: DÍAZ PENDÓN JUAN ANTONIO.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Y DE MONTES.

Resumen: Esta tesis trata sobre la resistencia genética del melón (C.melo) al Virus de las manchas necróticas del melón (Melon necrotic spot virus, MNSV) y a virus inductores de mosaicos transmitidos de forma no persistente por pulgones (Hemiptera, Aphididae), con especial atención al Virus del mosaico de la sandía (Watermelon mosaic virus, WMV). Tanto MNSV como WMV son virus de gran importancia económica en los cultivos de melón de nuestro país. MNSV es un Carmovirus (familia Tombusviridae) endémico en cultivos protegidos de cucurbitáceas. Recientemente hemos identificado en cultivos de melón de la provincia de Almería una cepa de MNSV (MNSV-264) capaz de superar la resistencia conferida por el gen recesivo nsv de melón. Esta resistencia es la única descrita hasta el momento a MNSV y los cultivares comerciales de melón que la portan están siendo ampliamente utilizados. Se ha determinado la secuencia de nucleótidos completa de los genomas de MNSV-264 y de MNSV-Malfa5, otro aislado español que no supera la resistencia de genotipos nsv/nsv. Un análisis de estas secuencias y su comparación con las secuencias de MNSV disponibles en bases de datos ha mostrado que MNSV-264 tiene una alta similitud con otros aislados de MNSV en todo el genoma excepto en la región 3' no codificante (3'-UTR). Los análisis filogenéticos que hemos llevado a cabo sugieren que esta región debe haberse adquirido evolutivamente por recombinación. Se ha estudiado la posible implicación de esta región como determinante genético de la virulencia de MNSV-264 sobre genotipos nsv/nsv. Para ello, se han generado clones de cDNA al RNA genómico de MNSV-264 y de MNSV-Malfa5 a partir los cuales se pueden sintetizar in vitro RNAs infectivos que reproducen las propiedades biológicas de los virus parentales. En base a estos clones, la generación y caracterización de mutantes quiméricos entre las dos cepas ha confirmado que la región 3'-UTR contiene el determinante genético de la virulencia de MNSV-264 sobre genotipos nsv/nsv. Los análisis histológicos y celulares llevado a cabo con diferentes genotipos de melón infectados con MNSV-264, MNSV-Malfa5 y los mutantes quiméricos derivados de ellos muestran que la resistencia se expresa a nivel unicelular. Dado que la región 3'-UTR contiene el determinante de virulencia de MNSV-264 sobre melones resistentes, y esta región está implicada en la traducción y replicación de RNAs virales, la resistencia conferida por nsv debe actuar en la replicación y/o traducción del genoma viral. Por otro lado, se ha llevado a cabo una búsqueda de nuevas fuentes de resistencia genética a virus transmitidios por pulgones de forma no persistente, como son el Virus del mosaico del pepino (CMV), el Virus de las manchas anulares de la papaya-W (PRSV-W), el Virus del mosaico de la sandía (WMV) y el Virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV), con especial atención de WMV, para el que no se dispone de cultivares comerciales de melón resistentes. Este estudio ha puesto de manifiesto que las fuentes de resistencia a estos virus en C.melo son muy limitadas. Se encontrado en una entrada de melón (TGR-1551), procedente del Zimbawe, que ha mostrado una resistencia a WMV que se manifiesta en una limitación notable de la acumulación sistémica del virus acompañada por una casi total ausencia de síntomas, ya sea tras inoculación mecánica o por pulgones. Además, los resultados de nuestro estudio han puesto de manifiesto que esta resistencia se mantiene frente a un número amplio de aislados de WMV recogidos en las principales regiones de producción de melón de España, lo que sugiere que podría ser una buena fuente de resistencia al menos para el control de las infecciones de WMV en las condiciones de cultivo españolas. Estudios detallados sobre el comportamiento de TGR-1551 a la infección por WMV muestran que no parece que exista una restricción a la replicación y movimiento a corta distancia del virus, al menos durante las etapas iniciales de la infección, mientras que la invasión sistémica sí parece estar impedida en este genotipo. Asimismo, los resultados de una análisis de las bases genéticas de la resistencia de TGR-1551 a WMV parecen ser consistentes con una hipótesis de implicación de dos genes recesivos independientes. Nuestros estudios indican además que la limitación a la invasión sistémica observada en TTGR-1551 cosegrega con una reducción de los síntomas sistémicos, sugiriendo que ambos caracteres tienen un mismo control genético o están estrechamente ligados.

Autor: MALLOR GIMÉNEZ CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CENTRO POLITÉCNICO SUPERIOR.
Centro de realización: SERVICIO DE INVESTIGACIÓN AGROALIMENTARIA-DGA .

Resumen: El melón (Cucumis melo L.) es uno de los principales cultivos hortícolas en España. Las enfermedades cuasadas por virus constituyen un problema importante, entre ellas, las debidas a los virus mosaico del pepino (CMV), manchas necróticas del melón (MNSV) y mosaico amarillo del calabacín (ZYMV). El método de control más eficaz para estas enfermedades es el uso de variedades resistentes. Con la finalidad de obtener una fuente de inóculo representativa para la evaluación del material vegetal, se caracterizaron biológicamente aislados españoles de CMV, MNSV y ZYMV. En cada uno de los tres virus se obtuvieron dos grupos diferenciados según su comportamiento sobre líneas de melón resistentes. Seis de estos aislados, dos de cada virus, fueron utilizados para la evaluación del material vegetal de melón. Todas las entradas evaluadas fueron susceptibles a CMV; frente a ZYMV fueron susceptibles todas excepto "PSH" que fue resistente al aislado del patotipo 1; respecto a MNSV, "Cantaloup Haogen" no mostró síntomas, y un grupo de entradas presentaron reacción local y ausencia de síntomas sistémicos, entre ellas "Doublon". En relación a MNSV, se estudió la influencia de las condiciones ambientales en la expresión de síntomas sistémicos. Los resultados mostraron que las temperaturas bajas y medias favorecieron su aparición. El cultivar "Doublon" no se mostró síntomas sistémicos en ninguna de las condiciones probadas y el virus sólo se detectó en las lesiones necróticas, por lo que se consideró que presentaba resistencia a la expresión de síntomas sistémicos producidos por MNSV en inoculación mecánica artificial. Cuando se realizó la transmisión de MNSV con el vctor O.bornovanus, "Doublon" presentó síntomas menos severos que los de la variedad susceptible y parecieron no interferir en el desarrollo de las plantas. El estudio genético de la resistencia en "Doublon" determinó que está controlada por dos genes independientes con dominancia completa, para los cuales se proponen los nombres Melon necrotic resistance 1 y Melon necrotic resistance 2 y los símbolos Mnr1 y Mnr2 respectivamente.

Autor: GANDÍA GÓMEZ MÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: Los viroides son moléculas de RNA circulares de cadena simple covalentemente cerradas, sincapacidad codificante y que se replican autónomamente. Su tamaño oscila entre 246 y 399 nucleótidos y se les considera fósiles moleculares del mundo de RNA. Los viroides, al igual que otros genomas de RNA, se replican en ausencia de mecanismos de prueba de lectura lo cual da lugar a una elevada tasa de variabilidad, que se traduce en una rápida evolución de los mismos. Siguen el modelo de cuasiespecies (Eigen, 1993) según el cual los genomas de RNA dan lugar a poblaciones heterogéneas de variantes de secuencia. Éstos no poseen una secuencia única, son mezclas más o menos complejas de secuencias relacionadas que se distribuyen en torno a una secuencia maestra definida como la de mayor eficacia biológica. Así pues un viroide infectaría un húesped susceptible como un conjunto de variantes de secuencia. En este trabajo se estudia la variabilidad de dos viroides de los cítricos, el viroide causante de la exocortis (CEVd) y el viroide I (CVd-I). Se estudió un aislado típico de CEV d (E-117) y se determinó que estaba compuesto por 44 variantes de secuencia distintas, de las cuales una (VI) era predominante en la población. Se llevaron acabo estudios para determinar las propiedades biológicas de 9 variantes distintas representadas por más de un clon (VI-V9). Los resultados mostraron que sólo la variante dominante (VI) y otra de las variantes (V6), resultaban infecciosas, generando una población de variantes similar a la del aislado del cual procedían. En ambos casos se recuperó a variante VI como dominante. Se realizaron estudios de infectividad en otro huésped alternativo (ginura) distinto del huésped en el que se habían identificado las variantes (cidro) y se observó ausencia de infectividad de las variantes aisladas, lo cual apunta a que éstas deben estar sometidas a alguna presión selectiva por parte del huésped. Se estudió también un aislado de CEVd (CEVd-i) que había sido identificado como una infección natural en plantas de haba que no mostraban síntomas y en las que el viroide se encontraba a concentraciones muy bajas. Este asilado al ser inoculado en plantas de tomate y después vuelto a inocular en nuevas plantas de haba, generó un nuevo aislado (CEVd-f) que inducía síntomas en las habas infectadas donde el viroide se acumulaba a concentraciones elevadas. Se caracterizaron las poblaciones generadas por ambos aislados comprobándose que la generada por CEVd-1 era muy heterogénea y estaba compuesta por variantes homólogas a variantes de la clase A (Visvader y Symons 1985) productoras de síntomas agresivos en tomate, variantes homólogas a la clase B productoras de síntomas suaves y variantes que diferían considerablemente de ambas clases. Las variantes de esta poblción que resutlaron infecciosas, generaron una progenie homóloga a clase V. La población generada por el aislado CEVd-f era muy homogéneas y estaba constituida solamente por variantes homólogas a la clase A. Sólo dos variantes de CEV d-i que poseían cambios específicos de variantes de CEV d identificadas en tomate, resultaron infecciones en este huésped, lo que confina de nuevo la existencia de una presión selectiva por parte de la planta hospedadora. Se analizó también la variabilidad del viroide, 1 de los cítricos, comprobándose que sigue también el modelo de cuasiespecies. Se estudió un aislado específico de CVd-i que daba lugar a una población heerogénea con dos variantes dominantes (Grupo I y Grupo II). Los ensayos de infectividad con representantes de dichos grupos revelaron que sólo la variante dominante del grupo II inducía síntomas y generaba una progenie heterogénea con una variante dominante de características intennedias entre lasdos variantes dominantes del aislado priginal. Los resultados de esta tesis demuestran que los viroides se comportan como poblaciones heterogéneas de moléculas de RNA como ocurre con la mayoría de los virus.

Autor: BERNET ZAMANILLO GUILLERMO PABLO.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: En primer lugar se ha estudiado la presencia, distribución y heterogeneidad de retrotransposones en el genoma de los cítricos. Los retrotransposones son especialmente abundantes en los genomas de las plantas, están implicados en su evolución y parecen contribuir a la generación de nuevos genes de resistencia. Los resultados revelan la existencia de elementos gypsy en los genomas de P.trifoliata y de la especies de cítricos estudiadas (C.limón, C.sintesis y C.elementina). El desarrollo de marcadores moleculares a partir de fragmentos de retrotansposones (IRAPs) tipo gyp, proporciona nuevas herramientas para el análisis genético de los cítricos. En P.trifoliata se ha detectado un menor número de IRAPs y grado de heterozigosidad qu een C.aurantium (naranjo Amargo). Los mapas genéticos obtenidos con IRAPs tipo gypsy confirman una distribución homogénea (y diferente respecto a los elementos tipo copia) de retrotransposones por el genoma de los cítricos. Los resultados también indican que la introducción de retrotransposones tipo gypsy en los genomas de Citrus y Poncirus tuvo lugar con anterioridad a la divergencia de ambos géneros para posteriormente evolucionar indpendientemente. Con distintos tipos de marcadores moleculares, entre ellos los obtenidos a partir de secuencias retrotransposónicas, se ha intentado saturar la región cromosómica donde anteriormente se había descrito la existencia del gen de resistencia a CTV (Ctv-R) en P.trifoliata. Los mapas resultantes de este estudio se han utilizado para localizar la resistencia al virus bajo la hipótesis de transmisión (herencia) monogénica. El análisis genético de la interacción virus-plata en una familia de citradias (P.trffoliata x C.aurantium) tras la infección crónica con CTV ha revelado cinco tipos distintos de interacción lo cual es incompatible con la hipótesis de un solo gen de resistencia. Asimismo, en la familia segregante estudiada, la posición de Ctv-R no coincide con la anteriormente descrita en otras progenies. El estudio de la resistencia a CTV considerada como carácter cuantitativo (acumulación de virus) mediante análisis de QTLs, ha revelado la presencia de tres QTLs de resistencia principales (de gran efecto), dos en P.trifotliata (Ctv-R1 y Ctv-R2) y uno en Amargo (Ctv-Ra), en la región donde se había localizado Ctv-R en otra sprogenies. Además, se han detectado otros QTLs de acumulación (Clv-A/.. Clv-Az.. Ctv-A)..C:tv-A4y (Clv-Aj) donde se localizan genes de menor efecto y se han detectado interacciones espistáticas implicadas en el control genético del carácter. Los resultados sugieren que el gen de resistencia del Amargo podría se el responsable de la muerte del naranjo dulce injertado sobre Amargo.

Autor: ORTIZ CORTÉS VILMA.
Año: 2002.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID (ETSIA).

Resumen: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha incrementado su uso en el diagnóstico molecular de virus de plantas, principalmente es una herramienta de gran utilidad para la detección de virus confinados al floema, como es el caso de los miembros de la familia Luteoviridae. En esta tesis se ha confirmado mediante la RT-PCR, la presencia del virus del enrollado de la hoja de la judía, Bean leaf roll virus (BLRV) en España, se ha puesto a punto un procedimiento en la extracción de ácidos nucleicos basado en el uso del LiCl y la metodología a seguir como técnica de rutina para su diagnóstico en el huésped y vector. En ensayos de transmisión con pulgones observamos una dependencia del cultivar utilizando como fuente de inóculo. La detección de BLRV en Aphis fabae demostró que esta especie fue capaz de adquirirlo aunque no haya sido capaz de transmitirlo. La dispersión en España de BLRV es amplia se detectó en todas las zonas productoras de leguminosas para grano muestreadas. En muestreos realizados en cultivos de haba cv. Muchamiel, en la comunidad autónoma de Murcia detectamos por primera vez en España la presencia del virus del amarilleamiento necrótido del haba, Faba bean, necrotic yellow virus (FBNYV), en plantas presentando necrosamiento en los bordes de las hojas y amarilleamiento. FBNYV fue detectado y caracterizado mediante ELISA-TAS, IC-PCR y secuenciación de fragmentos de su genoma. Inspecciones posteriores en otras comunidades españolas (Andalucía, Castilla y León y Extremadura) y huéspedes (haba forrajera, garbanzos) demostraron que hasta el momento, FBNYV se localiza únicamente en Murcia. Muestreos periódicos durante un ciclo de cultivo de haba cv. Muchamiel (octubre/1999 a enero/2000), reflejando que no hay un claro avance de la enfermedad dentro de un mismo campo o hacia campos aledaños. La infección mixta de FBNYV con TSWV y Potyvirus durante los muestreos 1999 y 2000 demostraron ser frecuentes y los síntomas de necrosamiento en los bordes de las hojas parecían agravarse en las infecciones mixtas. En los ensayos de transmisión por pulgones utilizando como inóculo un aislado español de FBNYV, tanto Acyrtosphon pisum como Aphis craccivora demostraron ser vectores eficientes en la transmisión de este virus. Los cultivares de haba cv. Aguadulce y Valenciana fueron susceptibles a la infección por FBNYV. La variabilidad de aislados del virus de mosaico amarillo de la judía, Bean yellow mosaic virus (BYMV) y el virus del amarilleamiento de las venas del trébol, Clover yellow vein virus (CIYVV) fue estimada usando la distancia genética como parámetros cuantitativo. En el análisis fueron incluidos aislados de origen español (distinta procedencia geográfica, año de recolección y diferente huésped) y aislados extraídos del banco de genes. Se analizaron secuencias de fragmentos de PCR de 525 nucleótidos correspondiente al extremo carboxilo del gen de la proteína de la cápsida y parte de la región 3'NCR. De acuerdo a la topología de los árboles filogenéticos, la población de aislados de BYMV es deiversa, ya que los aislados se atribuyeron en varios grupos; no obstante, de acuerdo a los valores de diversidad nucleotídica la dinámica de cambios de esta población es baja, siendo la población formada por los aislados españoles más estables que la población de los aislados del banco de genes. En el caso de CIYVV la estabilidad genética parece también ser el mecanismos evolutivo. En BYMV los aislados se separaron por procedencia y no por huésped y año de recolección, con CIYVV la separación coincidía con variaciones biológicas y serológicas de algunos aislados. Los aislados españoles se localizaron junto a aislados clasificados como raza 1. En BYMV los valores de diversidad nucleotídica estimados por fragmentos, demostraron ser mayor en la región C-terminal del gen de la CP que en la 3'NCR. En relación con la substitución nucleotídica tanto para la población total de aislados como dentro de cada población de BYMV y CIYVV, la cantidad de cambios sinónimos fue mayor que la de los no sinónimos, demostrando que la selección negativa es la que está actuando en este fragmento del gen que cofifica para la CP.

Autor: CAÑIZARES NOLASCO M. CARMEN.
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA-UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: El clavel (Dianthus caryphyllus L.) uno de los cultivos más importantes dentro del sector ornamental, se ve particularmente afectado por una serie de enfermedades de origen viral que limitan de manera muy significativa su comercializacion. Entre los virus que afectan al clavel caben destacar el CarMV, CERV, CLV,CVMV,CRSV o CIRV. Ya que en la producción de material vegetal es imprescindible aplicar unos controles exhaustivos de ausencia de virus, se necesitan tecnicas de diagnostico sensibles y rapidas. En este trabajo se ha desarrollado un metodo basado en la hibridación molecular no radioactiva que permite detectar simultaneamente 5 virus de RNA que afectan a clavel (CarMV,CLV, CVMV,CRSV y CIRV) sin disminir los limites de sensibilidad con respecto a la deteccion individualizada. Este test de deteccion simultaneo no introduce ningun paso adicional en el proceso y puede ser llevado a cabo en el mismo tiempo en el que se realizan los ensayos individuales. Tambien relacionado con la optimización de este metodo en diagnosis rutinaria, se ha hecho un estudio de la distribucion viral en plantas infectadas, que nos ha permitido elegir el mejor tejido para dichos análisis, asi como poder diferenciar 2 patrones de distribución viral que pueden sugerir vias de transmisión distintas entre los 2 grupos de virus. Ademas, se ha llevado a cabo la caracterización molecular de un aislado español del Virus del moteado del clavel (CarMV), cuya estructura primaria se ha utilizado para comparar el grado de variabilidad con los dos aislados secuenciados hasta el momento de este virus, y para realizar un analisis filogenetico de todos los miembros de la familita Tombusviridae. Asi, se ha puesto de manifiesto que se trata de secuencias muy conservadas a pesar de estar separadas tanto espacial como temporalmente. La comparación de la región 3´del RNA genómico del CarMV entre los 3 aislados mostro que las posiciones variables en esta region correspondian a mutaciones compesatorias de manera que no se desorganiza el plegamiento en forma de tallo propuesto para todos los miembros del genero Carmovirus. Por otra parte, se ha llevado a cabo un estudio de variabilidad de las proteinas de movimiento (p7 y p9) y la proteina de cubierta(CP) de aislados del CarMV procedentes de clavel de origenes geograficos distintos y de aislados procedentes de plantas silvestres que ha puesto de manifiesto el alto grado de conservacion entre las distintas secuencias. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos correspondientes a la p7 mostro la existencia de 3 posibles dominios en esta proteina. El dominio N-terminal que seria la zona donde se concentra la variabilidad existente entre los distintos aislados; el dominio central, donde estan conservados los propuestos residuos de aminoacidos capaces de plegarse en alfa-helice y con propiedades de union a RNA, y el dominio carboxilo terminal que tambien es altamente conservado entre los distintos aislados. El alineamiento de las secuencias de aminoacidos correspondientes a la proteina CP de los distintos aislados mostró la existencia de una covariación de los residuos de aminoacidos de las posiciones 164 y 331, lo que parece indicar la existencia de algun tipo de interacción(posiblemente terciaria) entre estas 2 partes de la indicar la existencia de algun tipo de interaccion(posiblemente terciaria) entre estas 2 partes de la molecula de proteina. Por último, y con el objeto de poder disponer de una de las herramientas imprescindibles para el estudio de los mecanismos de expresion de este virus, se ha obtenido un clon de longitud completa del CarMV, cuyos RNAs transcritos se replican en hoja inoculada del hospedador experimental Chenopodium quinoa, aunque con una eficiencia mucho menor que la del RNA genomico correspondiente.

Autor: APARICIO HERRERO FREDERIC.
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA, UNIVERSIDAD MURCIA.

Resumen: La presente tesis engloba una serie de estudios dirigidos a profundizar en el conocimiento de diversos aspectos funcionales del ciclo viral del Ilarvirus de los anillos necróticos de los Prunus(PNRSV). Como primer objetivo de la presente memoria, se abordó la localización de las particulas virales en granos del polen procedentes de nectarinas infectadas con el PNRSV con una combinacion de estrategias complementarias(moleculares y celulares), que nos permitiera resolver de manera definitiva esta cuestión y ayudara a clarificar el mecanismo de transmisión del virus. El análisis mediante hibridación molecular no radioactiva puso de manifiesto que en nectarina infectada, el virus invade todos los organos florales. Estudios mediante hibridación in situ revelaron que en el grano de polen el virus se localiza internamente y que en el estadio bicelular, se acumula en la celula vegetativa mientras que,en la generativa no se encuentran cantidades detectables de particulas virales. Estos resultados sugieren que en el proceso de transmisión vertical en este huesped, el PNRSN no seria transmitido directamente de los gametos masculinos al ovulo sino que el virus alcanzaria la semilla recien formada invadiendo el saco embrionario desde el tubo polinico. El PNRSV es un importante patógeno en frutales de hueso cultivado en los que provoca en algunas ocasione alteraciones importantes en calidad y produccion de frutos. El segundo objetivo consistió en un analisis de la variabilidad de la estructura primaria del RNA 3 de diversos aislados del PNRSV procedentes de varios huespedes y mostrando diferente sintomatologia(patotipos), con el fin de tratar de identificar motivos de secuencia que pudieran correlacionarse con las propiedades biologicas de los aislados. Al igual que en otros trabajos realizados paralelamente por otros autores, no se encontró una clara correlación entre la variabilidad molecular del RNA 3 y su especificidad de huesped y/o la modulacion de los sintomas ocasionados por estos aislados. La comparación de las secuencias de aminoacidos de la proteina de movimiento y la de cubierta mostro un alto grado de conservacion en los dominios/motivos propuestos como responsables de i) la interaccion con el RNA viral(dominio básico en el N terminal de la MP y la CP, motivo en dedo de zinc de la CP) y iii) la posible unión a la membrana plasmatica (dominio transmembrana de la MP) en los procesos del movimiento viral celula a celula. Las plantas de tabaco P12 constituyen un importante sistema para estudiar elementos de secuencia y/o estructurales implicados en los diferentes pasos del ciclo viral del AMV. Los resultados obtenidos tanto in vitro como en plantas P12 utilizando RNA 3 quimeras construidos mediante el intercambio de las regiones no codificantes entre el AMV y el PNRSV pusieron de manifiesto un importante grado de similitud funcional entre los promotores de ambos virus implicados en la sintesis de cadenas negativas y del RNA 4 subgenómico. De manera interesante, la reversión del unico nucleótido diferente( de entre los ultimos cuatro) entre PNRSV y AMV resultó en la recuperación de los niveles de sintesis de cadenas negativas que se obtienen con el RNA 3 de AM. El fenómeno de la activación genómica, que implica la interacción de la proteina de cubierta con los extremos 3´no codificantes de los RNAs virales, ha sido ampliamente estudiado en el AMV pero hasta el inicio de la presente memoria no existian estudios experimentales sobre las bases moleculares de esta interacción en el genero Ilarvirus. Como último objetivo de esta Tesis, se abordó un estudio sobre las propiedades de union in vitro de la proteina de cubierta del PNRSV al extremo 3´no traducible de su RNA3. Este estudio demostró que la CP se une como minimo a tres sitios diferentes del 3´-NTR con cooperatividad negativa. Mediante el uso de péptidos sinteticos se comprobó que la región comprendida entre los aminoacidos 25-50, con una alta proporción de residuos de arginina, los responsables de dicha interacción. Esta observacion refuerza el papel critico de dichos residuos encontrado en otras proteinas con capacidad de union a RNA mediada por dominios ricos en aminoácidos basicos. El analisis mutacional del extremo 3-´NTR reveló importantes evidencias sobre la capacidad de esta región para adoptar una segunda conformación en forma de pseudonudo alternativa a la de tallos/bucles y no permisiva para la interacción con la CP. Este resultado es consistente con la hipótesis que propone que el modelo de equilibrio de las dos conformaciones del extremo 3´-NTR mediado por la interación con la CP seria un mecanismo de regulación general en el AMV y en los Ilarvirus.

Autor: NARVAEZ RUIZ VICTORIA GIOCONDA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL.

Resumen: El virus de la tristeza de los citricos(Citrus tristeza virus, CTV) es muy variable y se han descrito numerosos aislados que difieren en sus caracteristicas patogenicas y en su transmisibilidad por pulgones. Los daños que causa CTV dependen en gran medida de las propiedades biologicas de los aislados predominantes en cada zona, y por tanto, para el control de los mismos se requieren metodos adecuados de caracterizacion. En este trabajo se ha caracterizado biológica, y molecularmente un grupo de aislados españoles de CTV, se ha explorado la diversidad de CTV en distintas zonas citricolas mediante reaccion con anticuerpos monoclonales o hibridacion con distintas sondas de cDNA y se ha estudiado la dispersion temporal de tipos especificos de CTV en dos zonas de la Comunidad Valenciana. Asimismo, se ha examinado los cambios que sufre la poblacion de CTV cuando es adquirida por pulgones, cuando se co-inoculan dos aislados en la misma planta o cuando se inoculan plantas transgenicas que expresan el gen p25 homologos. En primer lugar, se amplio la colección de aislados de CTV caracterizados biologicamente del IVIA con dos aislados virulentos que producen acanaladuras en la madera de pomelo, pumelo y naranjo dulce, y "seeding yellows" en naranjo amargo, pomelo y pumelo, uno asintomático y dos que solo producen sintomas tenues en lima mexicana. En la caracterizacion serologica con 15 anticuerpos monoclanales se detectaron al menos 14 epitopos diferentes y se observaron 33 serotipos distintos entre las fuentes españolas de CTV examinadas. Por otra parte, la hibridacion con un panel de diez sondas y caracteristicas patogenicas de los aislados, pero se observo una tendencia de los aislados mas virulentos a hibridar más intensamente con la sonda PM33(secuencia 5´UTR tipo II) y con las derivadas del aislado virulento T305, que con PM34 (secuencia 5´UTR tipo III) o las derivadas del aislado asintomatico T385. Los sub-aislados obtenidos de distintos aislados de CTV mediante cambio de huesped o transmision por pulgones presentaron con frecuencia serotipos y perfiles de hibridacion distintos entre ellos y con respecto al aislado original, lo que indica que la composicion de variantes de la poblacion viral puede alterarse en los procesos de transmision. Mediante análisis de pulgones individuales con dos sondas diferentes se puso de manifiesto que muchos individuos adquieren solo una parte de la poblacion de variantes de secuencia presente en la planta infectada. Se observo que la tasa de la dispersion temporal de CTV en el norte de la Comunidad Valenciana es más alta que en el sur, y que en la primera existe una dispersión activa de poblaciones de CTV que reaccionan con el anticuerpo monoclonal MCA13, cuyo epitopo se halla conservado en los aislados más virulentos. Tambien se detectaron diferencias importantes en la tasa de dispersion temporal de poblaciones de CTV con distinto perfil de hibridación. El perfil de hibridación de las fuentes de CTV MCA 13 positivas se asemejaban al de los aislados virutlentos y varias de estas fuentes indujeron acanaladuras en la madera del naranjo y "seeding yellows" en naranjo amargo tras inoculacion experimental en condiciones de invernadero. En plantas pre-inoculadas con un aislado poco agresivo y sobre-inoculadas con otro virulento, la aparición de sintomas se asoció con la aparicion de reactividad con el anticuerpo monoclonal MCA 13 y de perfil de hibridacion caracteristico del aislado virulento. No se pudo detectar cambios en la poblacion viral de aislados de CTV inoculados en plantas.