VIRUS DE LAS PLANTAS, 2

Autor: ESTEBAN TORTAJADA OLGA M..
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR-UNIVERSITAT DE VALENCIA .

Resumen: La enfermedad de la sharka es considerada como la enfermedad viral mas grave de frutales de hueso. Con objeto de evaluar la inmunomodulacion de la funcion viral como via de control de esta enfermedad, se han generado anticuerpos recombinantes frente a la proteina viral tanto en estado desnaturalizados como nativo. A su vez, se ha evaluado la especificidad de dichos anticuerpos determinandose el epitopo de la proteina viral que reconocen. El fragmento de anticuerpo especifico de la CP ha sido expresado de forma estable en plantas de xicotiaana bethamiana observandose proteccion frente a la infeccion por el virus de la sharka cuando se emplean dosis moderadas -bajas de inóculo. Asimismo, se han generado diferentes versiones del fragmento de anticuerpo especifico de Nib o RNA replicasa para ser dirigidas a distintos compartimentos moleculares. La estabilidad y niveles de expresion de estas versiones de anticuerpo han sido evaluadas mediante sistemas de expresion transitoria basados en agroinfiltracion y vectores virales (PLX).

Autor: FRANCO REDREJO M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: AREA DE GENÉTICA.

Resumen: En esta tesis, se ha intentado obtener plantas transgéncias resistentes al virus del rizado amarillo del tomate TYLCSV. Este virus pertenece al género Begomovirus de la familia Geminiviridae, que son virus de DNA de plantas con un genomio de ssDNA circular. La principal novedad de esta tesis ha sido el desarrollo de una estrategia mixta, que combina la exprsión de RNA-antisentido, con la producción de partículas interferentes, que además de amplificar la expresión del RNA-antisentido, compoten por la maquinaria de síntesis que el virus necesita para su replicación. La estrategia consiste en la construcción de un casete para la expresión del RNA-antisentido del gen Rep de TYLCSV, único gen codificado por el virus imprescindible para la replicación, flanqueado por una repetición directa de un fragmento de TYLCSV que contiene el origen de replicación y todos los elementos en cis requeridos para la replicación de la molécula. Una vez introducida esta construcción en el DNA de una planta (Nicotiana benthamiana en este trabajo), además de expresarse el RNA-antisentido, que podría combatir la infección vírica, se produciría una escisión de esta construcción en respuesta a una infección viral, produciéndose moléculas circulares con capacidad replicativa, que expresarían a su vez mas cantidad de RNA-antisentido. Se han conseguido ocho líneas transgénicas conteniendo esta construcción y se ha realizado un estudio sobre el grado de resistencia conferido por la misma así como de determinados aspectos del funcionamiento del sistema.

Autor: VIVES GARCÍA M. CARMEN.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: En los ensayos de infectividad realizados en el "Programa de mejora de variedades de cítricos propagadas sobre citrange Trover. A partir de este Kumquat se aisló el virus del manchado foliar de los cítricos (Citrus leaf blotch virus, CLBV). Para determinar la incidencia de CLBV en nuestro país era necesario estudiar las características moleculares del virus y desarrollar métodos sensibles y rápidos para el diagnóstico del mismo. En este trabajo se ha determinado la secuencia nucleotídica del genoma completo del aislado SRA-153 de CLBV. El RNA genómico (gRNA) es de polaridad positiva y tiene un tamaño de 8747 nt, está poliadenilado en el extremo 3' y contiene 3 marcos de lectura abierta (ORFs) y dos regiones no codificantes en los extremos 5' y 3'. El ORF 1 codifica una posible poliproteína de replicación que contiene los dominios metil-transferasa, proteasas, helicasa y RNA polimerasa. El ORF 2 codifica una posible proteína de movimiento célula-célula y el ORF 3 codifica la proteína de cápsida. La hibidración en Horthern blot de RNAs totales y dsRNAs de CLBV mostró la presencia de cuatro RNAs subgenómicos (sgRNAs). Dos de ellos son 3' coterminales y los otros dos son 5' coterminales. Tanto el gRNA como los sgRNAs 3' coterminales están encapsidados. Los genes internos de CLBV se expresarían mediante la formación de sgRNAs 3' coterminales que se transcribirían a partir de la cadena negativa del RNA genómico. Los srgRNAs5' coterminales podrían generarse por terminación temprana del gRNA durante la síntesis de la cadena positiva. Considerando las características biológicas, estructurales y moleculares de CLBV y las diferencias respecto a virus de otros géneros, se ha propuesto su inclusión en un nuevo género para el que se sugiere el nombre de Citrivirus. Se ha analizado la estructura poblacional y la diversidad genética de diversos aislados de CLBV mediante SSCP y análisis de la secuencia nucleotídica de dos regiones de los ORFs 1 y 3. La estructura poblacional intra-aislado está formada por un conjunto de haplotipos genéticamente relacionados, siendo uno de ellos predominante. El análisis de 37 aislados españoles sugiere que la población es muy homogénea y que puede provenir de una introducción única y reciente. La baja diversidad genética observada al analizar 14 aislados de CLBV procedentes de diferentes huéspedes cítricos y distintos países, sugiere que no hay correlación entre distancia genética y origen geográfico o especie huésped. Se ha puesto a punto un método de detección rápida del virus mediante RT-PCR en un solo paso. La detección más consistente de CLBV se obtuvo con extractos de RNA total de hoja joven. Este método permite el diagnóstico fiable del virus en numerosas variedades de cítricos. En condiciones de campo la detección de CLBV fue menos consistente debido a que el título viral es más bajo y la distribución más errática. Los resultados obtenidos indican que CLBV no está restringido al Kumquat sino que está presente en otras variedades comerciales en diferentes áreas geográficas.

Autor: GONZÁLEZ JARA PABLO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA Y CENTRO DE INVESTIGACIONES: BIOLÓGICAS (CSIC).

Resumen: En la presente Tesis hemos demostrado que las enfermedades sinérgicas causadas por la infección doble de diferentes virus pertenecientes a la familia Potyviridae con el virus X de la patata (PVX), en el húesped Nicotiana benthamiana, presentan características diferentes que las descritas en N.tabacum. Dado que estas enfermedades están relacionadas con la actividad supresora del mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS), un mecanismo de defensa antiviral de las plantas, que realiza la proteína HC-Pro de los potyvirus, nuestros resultados parecen indicar que los requerimientos necesarios para la inhibición de este mecanismo de defensa de la planta dependen del húsped empleado. Para profundizar en el conocimiento de la función supresora del PTGS de la proteína HC-Pro, se han obtenido quimeras de PVX que expresan diferentes versiones de la secuencia codificadora del gen HC-Pro del potyrus de la Sharka (PPV). Los resultados obtenidos en los experimentos con estas quimeras demuestran que una sola mutación puntual localizada en la región central de la proteína HC-Pro, la mutación L442H, es suficiente para anular su función supresora de la defensa antiviral de la planta mediada por PTGS.

Autor: CASTILLO GARRIGA ARACELI.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El objetivo de este trabajo de Tesis Doctoral ha sido el aislamiento y caracterización de proteínas de la célula vegetal que interaccionen con la proteína de replicación C1, del geminivirus TYLCSV. Para ello se ha utilizado el sistema del doble híbrido en levaduras basado en el factor de transcripción GAL4. Se disponían de dos genotecas de cDNA de plantas (Arabidopsis thaliana y Nicotina bethamiana) fusionadas al dominio de activación de GAL4. Se clonó el gen C1 de TYLCSV en tres plasmidos cebo distintos, uno de baja expresión (pBD-GAL4) y dos de alta expresión (pAS2 y pGBKT7) pero con características funcionales diferentes. Los resultados obtenidos han sido diferentes dependiendo del plásmido utilizado para expresar la proteína cebo. La estirpe de S.cerevisiae utilizada para realizar las búsquedas (PJ696), posee tres genes chivatos para la interacción entre las dos proteínas de fusión: HIS3, ADE2 y LacZ. Sólo consideramos interacciones positivas, aquellas que eran capaces de activar los tres genes chivatos de la levadura (positivos primarios). Una vez obtenidos lo positivos primarios comprobábamos: A,- La existencia de la interacción retransformando levaduras con el clon de la genoteca y el plásmido cebo. B,- Su especificidad, comprobando que el clon no activa por si sólo. C,- La naturaleza del clon, sucuenciándolo. En las búsquedas detectamos tres tipos de falsos positivos: A,- Clones que no se confirmaron cuando se retransformaron levaduras. B,- Clones que activaban por si solos los genes chivatos. C,- Clones que recuperaban el fenotipo de interacción, no activaban por si solos, pero cuya secuencia correspondía a un poliA. La mayoría de los falsos positivos obtenidos fueron de tipo (a) en las búsquedas con el plámido pAS2 y de tipo (b) en las búsquedas realizadas con pGBKT7. El gen Ubc9 de N.benthamiana (NbUbc9), aislado en este trabajo mediante el sistema del doble híbrido por su interacción con la proteína de replicación (C1) de TYLCSV, es un homólogo funcional del gen UCB9 de S.cerevisiae. Este gen codifica para una proteína que conjuga un péptido denominado SUMO-1 a proteínas diana. UBC9 está implicado en numerosos procesos celulares que controlan la actividad y la compartimentalización celular de las proteínas. La interacción entre NbUbc9 y C1 se ha demostrado tanto in vivo, en levaduras, como in vitro. El gen NbUbc9, es un gen de copia única, que se expresa en todos los tejidos vegetales ensayados en este trabajo (hoja, flor, tallo y nervios foliares). La interacción entre NbUbc9 y la proteína C1, está conservada en otros Begomovirus, como TGMV y ACMV-KE. La proteína C1 interacciona mediante su extremo amino terminal (primeros 180 aminoácidos) con la proteína NbUbc9.

Autor: RODRIGO VILLAR GEMA.
Año: 2001.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ETSEA-UDL.

Resumen: La enfermedad del amarrilleo de las cucurbitáceas, de gran importancia en los cultivos del sudeste español, está producida por dos Closteroviridae transmitidos por moscas blancas, el virus del falso amarilleo de la remolacha (BPYV) y el virus del amarilleo enanizante de las cucurbitáceas (CYSDV). BPYV es transmitido específicamente y de modo semipersistente por Trialeurodes vaporatiorum (Westwood) y CYSDV por Bemisia Tabaci (Gennadius). En los últimos años, aunque se ha producido un gran avance en el conocimiento a escala molecular, algunos de los aspectos de la relación virus-planta y virus-vector son todavía desconocidos. El objeto de este trabajo ha sido el estudio de las relaciones que BPYV y CYSDV establecen con las cucurbitáceas y las moscas blancas para ajustarlo a uno de los modelos virus-planta-vector descrito. Se abordaron tres grupos de estudios: 1,- En el primero, destinado al establecimiento de una técnica de diagnóstico y a la propagación de BPYV y CYSDV, durante dos años se realizaron muestreos dirigidos a plantas con síntomas de amarilleo en cultivos protegidos de melón y pepino del sudeste español y en cultivos de melón al aire libre de la zona de Lleida, se evaluaron distintas técnicas de diagnóstico y se realizaron ensayos de transmisión con los vectores. 2,- En el segundo se abordaron las relaciones virus-planta, mediante estudios citopatológicos y de localización en los que se ensayó inmunomarcaje con oro coloidal (IGL) e hibridación in situ (ISH) con sondas de ARN. 3,- En el tercero se estudiaron las relaciones virus-sector, se realizó un estudio comparativo de la anantomía interna de T.vaporariorum y de B.tabaci relacionada con la transmisión, se ensayaron dos técnicas de inclusión para IGL y se realizaron pruebas de IGL e ISH. En el sudeste español, el amarilleo está asociado con BPYV y CYSDV, detectándose este último en un mayor número de muestras. En cambio, en el área de Lleida, éstos virus no se detectan y únicamente están presentes virus del mosaico de la sandía cepa 2 (WMV-2) y el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV). En esta zona, los casos de amarilleo no asociados a virus son mayores cuando las muestras son recogidas al final del cultivo. Los estudios citopatológicos realizados con BPYV y CYSDV mostraron la presencia de alteraciones en las células de floema, en las que se observó la proliferación de vesículas membranosas citoplasmáticas con distinta morfología, grandes agregados de partículas virales, hipertrofia en mitocondrias y la desorganización de las membranas de los cloroplastos. Ninguno de lso virus estudiados produce la formación de depósitos cónicos de material electrodenso en la zona del plasmalema característicos del virus del amarilleo infeccioso de la lechuga (LIYV), miembro tipo de los Crinvirus. Los resultados de las pruebas de IGL e IHS confirmaron la limitación de estos virus al floema. Las proteínas de cubierta de CYSDV y LIYV se detectaron en el citoplasma de las células acompañantes del floema; y mediante ISH, BPYV y CYSDV se localizaron en el citoplasma de estas células. El canal alimentario de T.vaporariorum presenta unas características anatómicas semejantes a las de B.tabaci, por lo que las diferencias en su comportamiento como insectos vectores no se pueden explicar con este tipo de observaciones. Las pruebas de IGL mostraron la localización tanto de CYSDV como de LIYV en los tramaos iniciales del canal alimentario y del intestino anterior de su insecto vector, B.tabaci, descartándose la posible circulación de estos virus en el interior del cuerpo del insecto. En base a los resultados obtenidos, el modelo de transmisión que más se ajusta a la transmisión semipersistente a los Crinivirus por moscas blancas es el de ingestión-regurgitación.

Autor: CIFUENTES GUERRA ZAÍDA GABRIELA.
Año: 2001.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS .
Centro de realización: E.T.S.I. AGRÓNOMOS DE MADRID.

Resumen: Los potyvirus del mosaico común (Bean common mosaic virus, BCMV), el de la necrosis del mosaico común (bean common mosaic necrosis virus, BCMNV) y del mosaico amarillo (Bean yellow mosaic virus, BYMV), son los principales virus que infectan la judía (Phaseolus vulgaris L.) en España. Son transmitidos por semilla y dispersados en los campos por pulgones de forma no persistente. Durante los años 1998-2000 se realizó un estudio temporal, espacial y espacio-temporal de las epidemias que ocasionaron estos potyvirus en dos variedades: Canela y Palmeña cultivadas en Villalís de La Valduerna (León), se marcaron plantas al azar, las cuales se analizaron cada 15 días por ELISA para evaluar la fecha de infección durante los diferentes estados fenológicos de las plantas. Al final del cultivo estas plantas se consecharon individualmente y se evaluó el efecto de las virosis en el rendimiento y calidad del grano cosechado. En las dos variedades, la incidencia de la enfermedad en las plantas marcadas fue de cerca del 100%, excepto en la variedad Palmeña año 2000 cuya incidencia alcanzó el 71,4%. Esta alta incidencia de la enfermedad estuvo motivada por la tasa de infección de las semillas sembradas, entre un 2 y un 40%. BCMV fue el virus responsable de la mayor infección en los campos de Palmeña durante los tres años y BCMNV el virus mayoritario en los campos de Canela. Las curvas de incidencia de la enfermedad se ajustaron mediante regresión lineal a las formas linearizadas de los modelos estadísticos: Monomolecular, Logístico, Exponencial y de Gompertz. El mejor ajuste para las dos variedades en los tres años fue el del modelo Logístico. El análisis de la evolución temporal de las curvas de progreso de la enfermedad, la distribución espacial y evolución espacio-temporal de las epidemias, mostraron que en las seis parcelas estudiadas se dectectó dos tipos de epidemias, el inicio de las epidemias dependió del inóculo inicial, de las condiciones colimatológicas y de la presencia de insectos vectores. Se analizó el efecto de las virosis en el rendimiento y calidad del grano cosechado. La producción de judía se vio reducida hasta un 75% cuando la infección viral se produjo antes de la floración, y después de la floración, la reducción fue entre un 22 y 56%, afectando a variables de número, peso y tamaño de semillas por planta. En la transmisión de virus en las semillas obtenidas de la producción se observó que fue mayor cuanto más temprano se produjo la infección, así, en semillas obtenidas de plantas infectadas durante el primer estado fenológico se llegó a alcanzar valores de hasta un 49% de infección.

Autor: SANDOVAL BRIONES CLAUDIO.
Año: 2001.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: E.T.S.I. AGRÓNOMOS.

Resumen: Las moléculas defectivas y defectivos interferentes han sido materia de estudio durante los últimos años, cuyo objetivo ha sido establecer los mecanismos de formación y el papel que estas partículas tienen en el control de la replicación viral. En este sentido, ha sido importante no solo analizar las interacciones y relaciones existentes entre estas moléculas, virus auxiliar y la planta huésped donde se replican, sino también el efecto de factores externos que pueden influir en la generación de éstas. En esta tesis, se han estudiado factores externos que influyen en la formación y acumulación de los D-RNAs del virus del moteado del haba (BBMV), virus del mosaico del bromo (BMV) y virus del moteado clorótico de la carilla (CCMV). Adicionalmente y con el fin de tener una mejor comprensión de la capacidad de infección y movimiento de las moléculas defectivas interferentes (DI-RNAs) del BBMV se ha utilizado el gen de la proteína verde fluorescente de la medusa (GFP) como gen delator. El cDNA de este gen, fue introducido reemplazando parte del cDNA genómico de la molécula defectiva interferente del BBMV. Finalmente se evaluó la capacidad de los RNAs defectivos de este virus para actuar como vectores en la expresión de proteínas. Los resultados obtenidos muestran que el tamaño de los DI-RNAs de BBMV formados está íntimamente ligado al huésped y las condiciones ambientales en las que se desarrollan las plantas. Por otra parte,los D-RNAs del BBMV y BMV no sólo se formaron y acumularon luego de sucesivos pases en alta multiplicidad de inóculo, sino también tras periodos prolongados de incubación en sus plantas huéspedes. Como factor externo, la temperatura afecta la formación de las moléculas defectivas. Temperaturas bajas favorecieron la formación y acumulación de los DI-RNAs de BBMV y los D-RNAs de BMV. CCMV no generó moléculas defectivas en carilla o Nicotiana benthamiana tras sucesivos pases de un inóculo o luego de periodos prolongados de infección. BBMV tuvo un claro efecto sobre el rendimiento con niveles de reducción en productividad que variaron entre un 75% y un 36% dependiendo de la fecha de inoculación. La presencia de partículas defectivas junto con el virus, conllevaron a una reducción adicional de un 25% en la producción de semilla. El gen de la GFP se expresó en niveles detectables al ser clonado en la DI-Mo71. La expresión del gen delator varió entre haba y guisante. En guisante, la expresión se mantuvo localizada en células del parénquima, no observándose fluorescencia a nivel del floema. En haba, la fluorescencia se presentó de modo más uniforme, si bien en un comienzo, se expresó en los bordes y ápices de la hoja. Aquí se observó expresión del gen delator en el floema. En guisante, cv.Lincoln, el defectivo quimérico conteniendo el gen delator, sólo se expresó en las hojas inoculadas. Esta variedad fue capaz de generar, encapsidar y acumular el DI-RNA conteniendo la GFP en un segundo pase a partir de hojas inoculadas. Los resultados de hibridación de impresión de tejidos de hojas superiores de haba, muestran que la DI conteniendo la GFP y el virus auxiliar, no se distribuyen de forma similar. El defectivo modificado tiende a acumularese en los bordes de la hoja, mientras que el RNA2 del BBMV se distribuye de forma más uniforme. La DI-quimérica se mantuvo hasta el séptimo pase. Las plantas infectadas con BBMV y la DI modificada con el gen de la GFP mostraron expresión de ésta incluso hasta 3 meses luego de la inoculación. De acuerdo a estos resultados, los DI-RNAs del BBMV presentan un claro potencial como vector de expresión génica de proteínas foráneas.

Autor: GARZO GONZÁLEZ ELISA ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: ESC. TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS.

Resumen: En la presente Tesis se ha evaluado el grado de eficacia en la transmisión diferencial de virus no persistentes que infectan el melón por diferentes especies y clones de pulgones. Se ha observado diferencias significativas en la transmisión vectorial de deiferentes aislados virales. Los resultados que se han obtenido indican que la especie Aphis gossypii actúa como vector más eficaz en la transmisión del Cucumber mosaic virus(CMV) mientras que Myzus persicae actúa como vector más eficaz en la transmisión del Water melon virus-2 (WMV-2) y Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). No se observaron diferencias significativas en la eficacia de la transmisión entre diferentes clones de la misma especie de pulgón. Asimismo, se realizó un cribado de 49 entradas españolas de melón para seleccionar genotipos resistentes a A.gossypii y a la transmisión vectorial de los virus CMV y WMV-2. Se incluyen los genotipos TGR-1551, OI-161375 y PI-414723, previamente identificados como resistentes a A.gossypii. Los resultados mostraron niveles moderados de resistencia a A.gossypii en las entradas españolas Escrito-Z, baza y ANC-46 y niveles altos de resistencia en TGR-1551, PI-161375 y PI-414723. En el estudio de la resistencia a la transmisión vectorial del CMV y WMV-2 no se observó resistencia a la transmisión del CMV en las entradas españolas evaluadas, pero en Escrito-Z se obtuvo un cierto grado de resitencia a la transmisión vectorial del WMV-2. En el caso de la TGR-1551 se obtuvo un 100% de resistencia a la transmisión vectorial del CMV mientras que en la PI-414723 solo se obtuvo un 50% de resistencia empleando 20 pulgones por planta como presión de inóculo. A continuación se abordó la caracterización de los mecanismos de resistencia presentes en los genotipos de melón seleccionados tanto al pulgón del melón como a la resistencia a la transmisión del CMV por A.gossypii. Los resultados pusieron de manifiesto que existían distintos mecanismos de resistencia (antibiosis y no preferencia) en las entradas de melón TGR-1551, PI-414723 y PI-161375. Sin embargo, las entradas españolas seleccionadas no mostraron resistencia por antibiosis. Como parte de los estudios de caracterización de la resistencia se estudio el comportamiento alimenticio de A.gossypii en los genotipos de melón antes mencionados mediante la técnica de gráficos de penetración eléctrica (EPGs). Los resultados obtenidos indican la presencia de factores de resistencia localizados tnato a nivel pre-floemático como floemático. En la TGR-1551 se observó una larga fase de salivación floemática (E1) que en la mayoría de los casos no era seguida de ingestión floemática (E2). Esto sugiere que la TGR-1551 presenta un mecanismo de resistencia adicional que previene a A.gossypii iniciar la ingestión del floema. También se llevo a cabo un ensayo de no preferencia bajo condiciones de libre elección. Los resultados demostraron que A.gossypii rechaza más rápidamente las entradas de melón TGR-1551 y PI-414723 que la PI-161375. Se llevaron a cabo determinaciones de los niveles de los compuestos floemáticos (Sacarosa y aminoácidos ) en tres entradas resistentes (TGR-1551, PI414723 y PI-161375) y en dos entradas susceptibles (Cv "Regal" y PMR-45) por si hubieran podido estar implicados en la respuesta insecto-planta. Los resultados indicaron que no existe una relación directa entre las concentraciones de sacarosa y aminoácidos analizados y el grado de susceptibilidad/resistencia de los genotipos evaluados. También se realizaron ensayos de transmisión vectorial con A.gossypii y M.persicae para poder evaluar la presencia del cáncer Vat en las entradas de melón TGR-1551 y PI-414723. Los resultados mostraron que la TGR-1551 se comporta como portada del cáncer Vat mientras que la PI-414723 presenta variabilidad en cuanto a la resistencia a la transmisión de CMV por A.gossypii.

Autor: SANCHEZ CAMPOS SONIA.
Año: 2000.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FAC. CIENCIAS.

Resumen: El rizado amarillo del tomate es una enfermedad causada por varias especies virales deonominadas virus del rizado amarillo del tomate (Tomato yelow leaf curl virus, TYLCV. Peretenecientes al género Begomomoviurs d ela familia Geminiviridae de virus de plantas. En esta memoria de Tesis Doctoral se analiza la diverdiad genética de las poblaciones de la especie -Sar de TYLCV en el sur de la Península Ibérica a lo largo de un período de casi una década, desde el inicio de la epidemia en España. Los resultados muestran que la población de TYLCV -Sar analizada es muy homogénea aunque se ovserva cierta estructuración geográfica así como unincremento de la variabildiad con el tiempo. Se describe la llegada a España de otra especie de TYLCV, TYLCV-Is. De esta nueva especie en España se ha obtenido un clon de DNA que contiene el fenoma completo de un aislado obtenido partir de una muestra de tomate. Se ha obtenido su secuencia completa y desmotrado que es infectivo y transmisible mediante su insecto vector, Bemisia tabaci. Además, se demuestra la implicación de TYLC-Is en una nueva enfermedad de judía. Se analizan las posibles causas del desplazamiento de TYLCV-Sar frente a TYLCV-Is observado en la epidemia de tomate del sur peninsular. Las conclusiones derivadas de este análisis apuntan a la trasmisión preferencial de TYLCV-Is por B. Tabaci y al mantenimiento más eficiente de TYLCV-Is a lo largo de la epidemia en huéspedes alternativos como causas del desplazamiento. Se han realizado una serie de estudios sobre los mecanismos de adaptación a huésped de TYLCV mediante la construcciónde virus quiméricos entre los genomas de ambas especies virales (TYLCV-Sar y TYLCV-Is) y el análisis de su comportamiento en húespedes diferenciales.

Autor: GARCIA CASTILLO SILVIA .
Año: 2000.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: CENTRO DE EDAFOLOGIA Y BIOLOGIA APLICADA DEL SEGURA(CEBAS-CSIC).

Resumen: El Virus del moteado del clavel pertenece al genero Carmovirus dentro de la familia Tombusviridae de virus de plantas, es el virus más importante desde el punto de vista economico que afecta al cultivo de clavel no por la sintomatologia que produce sino porque tiene un efecto sinergioco en combinación con otros virus que afectan tambien al cultivo de clavel. En esta memoria se ha llevado a cabo el estudio del movimiento a larga distancia del Virus del moteado del clavel (CarMV) en su huesped natural clavel y en un huesped experimental Chenopodium quinoa,y la influencia de determinados factores ambientales en la distribución final del virus. Tambien se ha realizado un estudio de la cinetica de acumulacion de las cadenas positivas y negativas de los RNAs genomico y subgenómicos del CarMV y de sus productos de traducción CP y MP (p7), asi como,la distribucion espacio-temporal de las cadenas positivas y negativas de los RNAs y la localizacion subcelular de la CP y MP (p7). Los estudios de la cinética de acumulación de las cadenas positivas y negativas de los RNAs del CarMV se realizaron mediante analisis tipo Norther de extractos de RNA total de hoja inoculada de Chenopodium quinoa utilizando sondas marcadas con digoxigenina. Estos experimentos mostraron que las cadenas positivas se acumularon del orden de 100 veces mas que las negativas y en ambos casos los RNAs subgenomicos aparecieron antes y sus niveles de acumulación fueron mayores que los del genómico en estadios tempranos en la infeccion (2-5 dias postinoculacioni). La detección de cadenas negativas completas de los RNAs subgenómicos es compatible con un mecanismo de sintesis de terminación prematura a partir de un RNA genomico molde de longitud completa. La distribución espacio-temporal de las cadenas positivas y negativas del RNA viral se estudio mediante hibridación in situ al microscopio optico tras incluir en parafina tejido de hoja inoculada de Chenopodum quinoa, poniendo de manifiesto que la replicacion parece estar espacialmente regulada localizandose inmediatamente detrás del frente de infección. Los sujetos de cinética de acumulación de las proteinas de cubierta (CP)y de movimiento (p7) mediante analisis tipo western de extractos de proteinas totales de hoja inoculada de Chenopodium quinoa, utilizando anticuerpos policlonales especificas de las respectivas proteinas, mostraron que la proteina de movimiento p7 no se expresa de manera transitoria como lo hacen la gran mayoria de proteinas de movimiento virales lo que sugiere su implicacion en otras funciones del ciclo viral, además del movimiento celula a celula. Experimentos de fraccionamiento subcelular y posteror western demostraron que tanto la p7 como la CP presentan una localizacion subcelular mayoritariamente citosólica. Sin embargo, a diferencia de la CP, la proporcion de proteina p7 que se detecto en la parede celular fue aumentando con los días de infección. El movimento a larga distancia del CarMV en los huespedes clavel y C.quinoa, fue estudiado mediante experimentos de hibridación tissue-printing o impresiones de tejido y mediante las tecnicas de hibridación in situ e inmunocitoquimica al microscopio optico, demostrando asi que el virus se transporta por el sistema vascular de la planta via floema y esta translocacion sigue los mismas pautas que el flujo del fotoasimilado al observar que el movimiento del virus ocurre preferentemente desde una hoja o tejido maduro(fuente) hacia el tejido joven (sumidero) mas cercano, que esta directamente conectado por el sistema vascular. En la infeccion sitemica de plantas de clavel inoculadas, se demostro que el tiempo minimo necesario para que el virus entrara en el sistema de transporte general de la planta desde una hoja inoculada fue de 5-7 dias. En cuanto a la carga del CarMV en el floema de la hoja inoculada de clavel parecia ocurrir directamente en la vena principal desde celulas no vasculares, o bien a traves de las venas intermedias, mientras que la descarga en las hojas sistematicas seria llevada a cabo por los haces laterales o secundarios(venas deorden II). Una vez que el virus sale de la hoja inoculada sigue dos direcciones una ascendente hacia el brote apical y otra descendente hacia la raiz. En los estadios tempranos de la infeccion se observó la influencia de la filotaxis entre las hojas inoculadas y las hojas sistemicas en el movimiento del virus, asi como la asimetria de la infeccion enel tallo, solo se infectaba el lateral del tallo que estaba en la misma posicion de la hoja inoculada. En todas las plantas de clavel analizadas, procedentes de una infeccion natural como inoculadas con el CarMV, el meristemo apical aparecia libre de infeccion y por tanto el virus era incapaz de invadirlo, al igual que ocurria en los meristemos de brotes laterales y yemas axilares. Sin embargo, el virus si se acumula en el tejido floematico del brote apical, sobre todo en la zona de interseccion de la vasculatura de las hojas nacientes alrededor del meristemo apical y el tejido floematico del tallo del brote apical, que constituye una via de entrada del virus a estas hojas en el momento que desarrollan una vasculatura(protofloema) y esto sólo ocurre a partir del segundo o tercer par de hojas separadas del meristemo. Otros tejidos de tipo meristemático como el cambium y el felógeno del tallo subterraneo y raiz tampoco furon invadidos por el virus. En la interacción CarMV-C.quinoa se demuestra que la intensidad de la luz y/o la temperatura juegan un papel clave en la modulación de la distribucion final del CarMV, de manera que plantas crecidas en condiciones de invernadero(35-40 ºC dia/10-15ºC noche) fueron más susceptibles a la infeccion sistematica del virus que aquellas crecidas en camara de cultivo(25ºC dia/18ºC noche). No se encontraron diferencias en la tasa de replicacion y/acumulacion, ni en el movimiento celula a celula del virus en hojas inoculadas de plantas crecidas en ambas condiciones de crecimiento, ni tampoco se observó una barrera celular que impidiera al virus alcanzar el sistema vascular. La restriccion a la infeccion sistematica ocurre por tanto, despues de la entrada en floema, observandose una diferente acumulacion del virus en el peciolo de la hoja inoculada en ambas condiciones de crecimiento, de manera que en las plantas crecidas en condiciones de camara de cultivo el virus solo afecto a uno o dos haces vasculares en secciones del peciolo cercanas a la hoja inoculada, pero esta infeccion va gradualmente desapareciendo el trayecto del peciolo hacia el tallo. Mientras que el peciolo de hoja inoculada de plantas crecidas en condiciones de invernadero mostro infeccion en la mayoria de sus haces vasculares y esta infeccion se continuaba en el tallo infectando otras hojas de la planta y por tanto infectado sistematicamente la planta.

Autor: CHAFFAI MOHAMMED.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Se ha pretendido abordar distintos aspectos de la interacción viroide-huesped. 1.- Se ha planteado el estudio de la variabilidad de secuencia entre dos aislados del CEVd que difieren en sus propiedades biologicas, como una aproximación al estudio de las relaciones estructura-función en este viroide. La caracterizacion molecular de los dos aislados CEVd-s y CEV-d-129, que inducen sintomas acusados y suaves en G, aurantiaca, ha mostrado que estan constituidos por una mezcla de variantes de secuencia. Los únicos nucleótidos que estaban mutados en todas las variables del aislado suave respecto a las del aislado agresivo, estaban localizados en la rama inferior del dominio C. El bioensayo de secuencias individuales revelo que las distintas propiedades biologicas de dichos aislados podian relacionarse con diferencias en su composicion de variantes de secuencia. El estudio de la evolucion molecular de una secuencia individual del aislado suave, ha revelado que este viroide es capaz de acumular mutaciones rapidamente. Ademas, se han obtenido datos que indican que los motivos de secuencia responsables de la modulacion de los sintomas en G. Aurantiaca y tomate son distintos a los que modulaban la virulencia en P.trifoliata. 2.- Se ha procedido a estudiar aspectos relacionados con la proteccion cruzada entre dos aislados del CEVd. Los dos aislados mostraron un comportamiento similar en cuanto a su movimiento en la planta. La tecnica de PCR ha permitido realizar un seguimiento temporal de la evolución de la poblacion viroidal en plantas coinoculadas con los dos aislados. Se constató un proceso de competencia en el que uno de los aislados, el agresivo, despues de un intervalo de tiempo suficiente para que el primero se disperse y se acumule en la planta manifestaron un retraso en la aparición de los sintomas y en el establecimiento del aislado agresivo. 3.- Se ha estudiado la posible resistencia adquirida en plantas infectadas por viroides frente a distintos patógenos. Se ha encontrado la existencia de un fenómeno de resitencia en plantas infectadas con viroides o tratadas con acido salicilico frente a hongos y bacterias. Se ha determinado que no existe resistencia en plantas infectadas con el CEVd y el CVd-IV frente a otros viroides, pero si en plantas tratadas con acido salicilico. La resistencia observada en plantas infectadas con viroides frente a hongos y bacterias y no esta mediada por incrementos en el contenido de acido salicilico endogeno.

Autor: MARTINEZ GARCIA BELEN.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLOGICAS.

Resumen: En el presente trabajo de tesis hemos abordado el estudio de los aspectos moleculares implicados en el proceso de transmisión de los poty virus por pulgones, centrándonos en dos proteínas virales implicadas en dicho proceso: la proteína de la cápsida (CP) y el factor de adquisión (HC). Para que la transmisión del virus por pulgones tenga lugar es imprescindible la unión de la CP al HC y de este último al estilete del pulgón. Se han analizado las secuencias que codificanla CP y el HC de dos aislados españoles del potyvirus denominado virus de la Sharka o Plum Pox Virus (PPV) obtenidos de muestras de campo y denominados PPV 5,15 y PPV3,3, el segundo de los cuales no se transminte por pulgones. La CP de PVV 3,3 presenta una deleciónd e quince aminoácidos en su extremo amino terminal que afecta a un triplete DAG conservado enpotyvirus por el que parece ocurrir la unión entre la CP y el HC. La CP de PPV3,3 así como la de otro aislado de iguales características (PPV R3-NAT) no parecen haber perdio, sin embargo, la capacidad de unión al HC ya que ensayos de trasnmisión in vitro en lo que intervien un HC funcional de otro potyvirus, el virus Y de la patata (PVY), resultaron positivos. Por otra parte, en nuestro grupo hemos conseguido por primera vez la purificación parcial del HC de PPV,lo cual nos ha permitido llevar a cabo análisis in vitro de interacción entre la CP y el HC de PPV que confiramronla unión entre ambas proteínas. Esta comprobación se basa en la unión que PPV purificado y adherido a una membrana experimenta cuanda dicha membrana se incuba conuna soluciónd e HC de PPV purificado. Teniendo en cuanta los datos expuestos, la no transmisiónpor pulgones de PPV 3,3 así como de PPV R3-NAT no radicaría en la falta de interacción CP-HC sino en la ausencia de unión del HC con el estilete del pulgón. En la línea del estudio de la transmisión heteróloga se han reallizado quimeras del genoma de un aislajdo de PPV (asislado Rankovik) en donde se ha sustituido la región codificadora del HC por la correspondiente a aislados de PVY. Las construcciones resultaron infectivas en planta pero la transmisiónpor pulgones fue negativa. Parece, por tanto, que el HC d ePVY en un contexto de genoma de PPV permite la infección viral, pero no la transmisión. Este resultado es diferene al obtenido en experimentos de transmisión invitro en los que el HC purificado de PVY es capaz de promover la transmisión de PPV. Las posibles causa de este comportameinto se analizan en este trabajo.

Autor: ESCRIU PARADELL FERNANDO.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: El trabajo presentado en esta tesis analiza los factores implicados en la evolución de la virulencia de un patógeno de plantas en condiciones naturales: el viros del mosaico del pepino(CMV) y su RNA satelite (RNAsat) produciendo una epidemia de necrosis sistemica en los cultivos de tomate de la costa mediterranea. El analisis de la incidencia de la necrosis y de la frecuencia de aislados de CMV con RNAsat en el campo, y la elevada correlación entre los sintomas de necrosis y la presencia de varientes de RNAsat necrogénicas en tomate, indico que la población de CMV y su RNAsat evolucionó hacia una menor virulencia. El analisis experimental de los factores de la eficacia biologica de CMV y de su RNAsat ha permitido estimar la relación existente entre los factores relacionados con la virulencia y los factores relacionados con la transmisión de este patógeno. Dicha relación se ha utilizado para realizar predicciones teoricas sobre la evolución de la virulencia de CMV y de su RNAsat mediante la aplicación de modelos epidemiológicos de coevolución huesped-patógeno. Las predicciones obtenidas permiten explicar la expansión de los RNAsat en la población de CMV y su posterior desaparición, dando lugar a la evolución de la población de CMV y su RNAsat hacia una menor virulencia. Los resultados de esta tesis destacan la importancia de los factores ecologicos, como la variación de las poblaciones de vectores, en la evolucion de la virulencia de un patogeno de plantas en la naturaleza.

Autor: LLAMAS ESPINOSA SUSANA .
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ETSIA.

Resumen: Los RNAs defectivos(D) y defectivos interferentes (DI-RNAs) se han descrito en diversos grupos de virus de plantas y animales y se diferencian porque los RNAs defectivos a diferencia de los DI-RNAs no tienen un efecto aparente en los sintomas que ocasionan en el virus auxiliar. DI-RNAs se han encontrado en diversas razas del Bromovirus del moteado del haba(BBMV) y se han estudiado sus propiedades. La eficiente propagación de estas particulas depende de la presencia de las señales de replicacion y de otros factores intrinsecos y extrinsecos. Para conocer como estas particulas influyen en el ciclo de vida de un virus, parece necesario conocer en detalle los factores implicados en la formación replicación y acumulación de los DI-RNAs en sus huespedes. Ensayos biologicos en diversas plantas demostraron un efecto diferencial de los huespedes en la formacion, acumulacion y encapsidación de los DI-RNAs y un condicionamiento en el tamaño de estar particulas cuando son formadas de novo a traves de pases sucesivos sobre un determinado huesped en diversas condiciones ambientales. De esta manera habas crecidas en invernadero producen DI-RNAs denominados grandes (2.3 kb) y en fitotrón a 20ºC DI-RNAs pequeños(1.9 kb). En plántulas de guisante el efecto es diferente produciendo DI-RNAs pequeños en invernadero y grandes en fitotrón. Un factor importante de esta relación es la temperatura, ya que temperaturas bajas 12-16ºC favorecen la formación de los DI-RNAs uno o dos pases antes y manifiestan sintomas 2-3 dias antes de los respectivos controles. Diversas construcciones de DI-RNAs artificiales han servido para determinar las necesidades de tamaño, secuencias y capacidad codificadora necesarios para la eficiente replicación, acumulación y encapsidación de los DI-RNAs. Finalmente se ha estudiado la capacidad interferente de estas moléculas en protoplastos y en planta y los efectos que producen en la infección viral. La formación de particulas defectivas interferentes en una infección del BBMV, podria ser un mecanismo usado por el virus para superar procesos de selección en la infeccion viral y un componente esencial en el proceso evolutivo del virus.

Autor: LLAVE CORREAS CESAR.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En la presente tesis hemos abordado el estudio de los aspectos moleculares que gobiernen la transmisión por pulgones de los potyvirus a través del análisis de las dos proteínas implicadas en este proceso: la proteína de la cápsida (CP) y el factor de adquisición (HC). Hemos estudiado las propiedades serológicas de una colección de aislados de pimiento del virus Y de la patata. Los métodos serológicos y el análisis de la secuencia de aminoácidos de la CP no nos han permitido diferenciar ni entre patotipos 0, 1 y 1-2 ni entre aislados de pimiento con distintas propiedades de transmisión, si bien fue posible discriminar éstos de los aislados de tabaco y patata. El alto grado de homología en la CP de los patotipos de pimiento parece indicar que la capacidad para sobrepasar la resistencia impuesta por los genes pvr2 de pimiento radica en una región del genoma distinta de la CP. Por otra parte, todos ellos presentan en su CP el triplete DAG implicado en la transmisión de los potyvirus por pulgones. Este dato confirma que la pérdida de transmisibilidad de PVY-0 NAT y -1 es debida a una alteración en su factor HC. El estudio de las propiedades de transmisión vectorial de una aislado perteneciente al patotipo 1-2 (PVY-1-2) muestra que no pudo ser transmitido en experimentos de transmisión por pulgones planta a planta si bien se consiguieron altas frecuencias de transmisión en ensayos de adquisición a través de membranas en presencia de un factor HC heterólogo funcional. Su proteína HC revela la presencia de dos cambios de aminoácidos con respecto a la de PVY-0 AT (Arg a Gln en posición 89 y Met a lle en posición 152) que podrían ser los responsables de su pérdida de transmisibilidad. El análisis comparativo entre potyvirus del extremo amino terminal del factor HC revela la presencia de un dominio altamente conservado rico en residuos de Cys y en el que se encuentran además del motivo KITC conocido por su implicación en la transmisión por pulgones, otros residuos invariables cuyo papel en transmisión es aún desconocido. Mediante experimentos de mutagénesis dirigida hemos creado mutantes en estas posiciones en un clon del genoma completo del virus de grado del tabaco y analizado su efecto sobre el desarrollo de síntomas, la inefectividad y la transmisibilidad. Todos los mutantes resultaron inefectivos en plantas de tabaco desarrollando síntomas similares a los mostrados por la variedad salvaje TEV-HAT. Los mutantes TEV-P355R y -K358N tenían seriamente afectada su transmisión mientras que los mutantes TEV-G343D, -V345E, -A346H, -I348D y -P355L no pudieron ser transmitidos en ningún experimento. Tan solo los mutantes TEV-I359M, que reproduce la sustitución presente en el HC del aislado transmisible PVY-0 AT, y TEV-K662G, que afecta a un residuo en posición carboxilo terminal, mostraron niveles de transmisión idénticas al TEV control. La pérdida de transmisibilidad de estos mutantes no se debe a un efecto de las correspondientes mutaciones sobre el nivel de acumulación de proteínas HC y CP en las plantas infectadas. Todos los residuos alterados, altamente conservados entre potyvirus, forman parte de una región rica en Cys para la que se supone un papel estructural y/o funcional a través de la formación de estructuras denominadas "dedos de zinc". Nosotros proponemos, en virtud de la homología con otras proteínas con dedos de zinc, que la región amino terminal del HC de los potyvirus presenta una configuración del tipo C-X8-C-X18-C-X2-C con los residuos de Cys coordinados en el espacio por un ion metálico y discutimos el papel que dicha estructura podría desempeñar en la funcionalidad del factor HC en transmisión.#

Autor: REINA INIESTA JOSE.
Año: 1999.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Durante el otoño de 1992 aparecieron síntomas de curvamiento, raquitismo y clorosis en plantas de tomate en invernaderos de la provincia de Almería. En esta tesis se describe la caracterización de la agente causal de dicha enfermedad y la puesta a punto de métodos de diagnóstico para el mismo. Las principales conclusiones extraidas de esta tesis son: El virus causante de los síntomas de amarilleamiento y rizado de tomate aparecidos en el otoño de 1992 es un geminivirus de la especie TYLCV-Sar que hemos denominado TYLCV-Sar/ES. Las impresiones de plantas (Squash blot) de tomate son un buen método para el diágnostico y la detección rutinarios de TYLCV, y pueden detectar la presencia del virus hacia la mitad del periodo de incubación. La PCR usando como substrato DNA purificado es una técnica más sensible que las impresiones pudiendo detectar el virus en las plantas tan sólo tres días después de la infección. Sin embargo, este sistema de detección es menos fiable que la hibridación ya que la reacción de amplificación es frecuentemente inhibida por sustancias presentes en los extractos de ácidos nucleicos obtenidos de la planta. El uso de sondas con diversa especificidad puede ser utilizado como método de detección y diferenciación de los diferentes grupos de geminivirus. Cuando se hibrida con extractos crudos obtenidos de plantas, los métodos de marcaje mediante digoxigenina presentan niveles de sensibilidad próximos a los del marcaje radiactivo. Los niveles de variabilidad de detectados en TYLCV-Sr//Es son bajos, no habiendose detectado un incremento de la distancia genética entre los aislados desde 1992 hasta 1996. La variabilidad se acumula principalmente en la región intergénica. La distribución filogénetica de los aislados secuenciados de TYLCV-Sar//Es sugiere que la infección se produjo desde un único foco a partir del cual se extendió la enfermedad. El RFLP aunque presenta niveles de detección de variabilidad menores que la secuenciación puede ser usado como sistema rápido y sencillo de agrupamiento de aislados, y permite detectar la presencia de nuevos aislados de TYLCV.#

Autor: ABD-EL KARIM MOUSTAFA YOUSSEF TAREK.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE VALENCIA.

Resumen: España es uno de los primeros productores mundiales de albaricoque. Sin embargo, existen algunos factores limitantes del cultivo, de los cuales el más importante es el virus de la sharka. La única forma efectiva a largo plazo de lucha contra la sharka es la creación de nuevas variedades que reúnan los caracteres de resistencia al virus y de una buena adaptación agronómica y comercial. Con este fin, en 1993 se inició en el IVIA un programa de mejora genéticia del albaricoquero mediante cruzamientos entre variedades norteamericanas resistentes y variedades valencianas susceptibles. Las contribuciones más importantes de esta tesis al programa de mejora genética del IVIA han sido las siguientes: * La optimización de la metodología para determinar la resistencia a sharka en híbridos de albaricoquero. * La aplicación de dicha metodología a 167 híbridos intraespecíficos obtenidos en el período 1993-96. * La preselección de 3 híbridos resistentes que presentan, además, buenas características agronómicas y de calidad organoléptica y que podrían sustituir a algunas de las mejores variedades autócotnas valencianas que no pueden seguir cultivándose por su susceptibilidad frente al virus de la sharka.

Autor: AYLLON TALAVERA M. ANGELES.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: CTV causa una de las enfermedades económicamente más importantes de los cítricos a nivel mundial. El análisis de SSCP del gen p18 permitió diferenciar aislados españoles de CTV. La mayoria de los aislados españoles parecen estar formados por una secuencia predominante. La transmisión por áfidos y el cambio de huésped causan cambios en la estructura poblacional de este gen. Las poblaciones de p18 genéticamente más próximas fueron las de los aislados más agresivos. En las comparaciones filogenéticas los aislados suaves y los más agresivos se agruparon separadamente. El mecanismo de transcripción de CTV parece similar al de otros virus del supergrupo alfavirus. El estudio de la secuencia de la región no codificante de los RNAs subgenómicos (sgRNAs) de p13 y p18 puso de manifiesto que existe polimorfismo en su extremo 5'. El codón de iniciación del gen p13 podría no ser el propuesto sino otro situado a 30 nt hacia el extremo 3'. No se ha encontrado una secuencia promotora única en los sgRNAs estudiados. Los aislados españoles de CTV contienen RNAs defectivos (D-RNAs) que parecen originarse de la secuencia genómica mayoritaria mediante un mecanismo de cambio de molde de la polimerasa ayudado por la presencia de secuencias repetidas en dos zonas distantes del genoma. La presencia de una D-RNA similar en dos aislados con características patogénicas muy diferentes parece indicar que al menos éste no está directamente implicado en la producción de síntomas.

Autor: PALACIO BIELSA ANA.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: Se ha puesto a punto la técnica de análisis de ssep para la caracterización de viroides. Permite analizar forma rápida y sencilla un elevado número de muestras de secuencia desconocida e identificar tanto las variables mayoritarias como aquellas poco frecuentes en una población. Se han identificado 5 cambios nucleotídicos en el dominio variable que diferencia aislados inductores de cachexia y no patogénicos de MSVd en cítricos. Estos cambios son responsables de la adopción de estructuras secundarias subóptimas ramificadas, posiblemente relacionadas con la patogénesis. Se ha puesto a punto un método de detección de los viroides de los cítricos mediante hibridación de impresiones de tejido de cidro Etrog. La técnica permite analizar un elevado número de muestras en un corto período de tiempo, ya que no se requiere la extracción de ácidos nucléicos. El protocolo se ha adoptado para los análisis rutinarios del programa de certificación nacional de cítricos. Análisis en 9 especies comerciales en campo demuestran que la detección es enóbica y que es recomendable la inoculación en cidro Etrog como huésped intermediario.