BIOLOGIA CELULAR

Autor: TOMÁS CABALLERO MÓNICA.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSITAT DE VALENC.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL "LA FE" DE VALENCIA.

Resumen: El etanol (EtOH) es una droga que afecta al organismo siendo el hígado y el sistema nervioso central (SNC) los principales órganos dianas. El EtOH es un potente teratogénico y es quizás la droga que presenta mayor número de mecanismos de acción sobre el cerebro y la que produce los trastornos mentales más graves y diversos. En este trabajo se ha tomado como célula de estudio a los astrocitos ya que son los tipos celulares más abundantes en el SNC y son clave en la función neuronal por actuar de soporte estructural y nutritivo de las neuronas. Todos los experimentos se han realizado utilizando cultivo primario de astrocitos de 7 días de desarrollo, que corresponde al periodo de proliferación donde liberan factores neurotróficos y expresan sus receptores. En el desarrollo del SNC son necesarias interacciones entre las neuronas y los astrocitos y muchas de estas interacciones son mediadas por glicoproteínas. Se conoce que el consumo crónico y agudo de EtOH afecta al proceso de glicosilación e hepatocitos, neuronas y células astrogliales pero se desconocen los mecanismos bioquímicos y moleculares por los cuales el EtOH altera este proceso en células nerviosas. Nos hemos centrado en descubrir si el mecanismo de acción de esta droga se localizaba en algún paso específico de la biosíntesis de los glicanos y/o si la diana de acción podría ser algún elemento de citoesqueleto que llevaría a un tráfico vesicular alterado. Hemos conflrnlado que la exposición al EtOH altera la maquínaria molecular del proceso de glicosilación produciendo microheterogeneidad en algunas glicoproteínas, produce retención de glicoproteínas en el complejo de Golgi (CG), altera la ultraestructura del CG y disminuye los niveles de algunas proteínas implicadas en la función de este orgánulo y/o transporte intracelular. El tráfico de la vía tanto biosintética como no biosintética de glicoproteínas y glicolípidos en los astrocitos está enlentecido por efecto del EtOH además de afectar al proceso de endocitosis y transcitosis. La exposición al EtOH produce una reorganización del citoesqueleto de actina a través de la cascada de señalización de RhoA y altera la dinámica de repolimerización de los microtúbulos (MTs). El efecto protector del LPA en los citoesqueletos de actina y MTs y en la incorporación de glucosa abren la posibilidad de que el LPA o un derivado lipídico no hídrolizable similar podría ser usado como un agente citoprotector contra los efectos nocivos del EtOH.Los hallazgos encontrados en este estudio apoyan la hípótesis de que las alteraciones inducidas por el EtOH sobre la biosíntesis de los glicanos así como, sobre los sistemas de transporte intracelular, incluyendo el citoesqueleto, tienen una relevancia fundamental en el efecto teratogénico del EtOH en los astrocitos y así, en el desarrollo del SNC. También confirman el postulado de que el EtOH es capaz de ejercer su efecto a través de múltiples dianas.

Autor: DIEZ ALARCIA REBECA.
Año: 2003.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES.

Resumen: Mediante estudios de fijación de radiligando a membranas y técnicas autorradiográficas se trató de caracterizar la farmacología y distribución de los recpetores a2-adrenérgicos presentes en el encéfalo de Gallus gallus. ESTUDIOS DE FIJACIN DE RADIOLIGANDO A MEMBRANAS ESTUDIOS DE SATURACION Los estudios de saturación realizados con el radioligando [3H]RX 821002 nos permitieron determinar qu este radioligando, de manera similar a lo descrito en mamíferos, es capaz de reconocer en pollo un componente serotonérgico. Esta radioligando muestra una afinidad similar por sus componentes a2-adrenérgico y serotonérgico en pollo, y similares a los de mamíferos. ESTUDIOS DE COMPETICION HETEROLOGA Los estudios de competición heteróloga de la fijación del radioligando [3H]RX 821002 se realizaron utilizando como ligandos competidores: Agonistas a2-adrenérgicos: oximetazolina y UK 14304 Antagonistas a2-adrenérgicos: BRL 44408, ARC 239 y prazosín Serotonina Los resultados de estos estudios realizados paralelamente con rata y en presencia de una concentración de serotonina 300nM permiten determinar que rodos los ligandos se comportan de manera similar a lo descrito para mamíferos en cuanto a los receptores a2-adrenérgicos marcados por nuestros radioligando, pero aparecen diferencias en cuanto a la afinidad de los ligandos BRL 44408, ARC 239 y RS 79948 por los componentes serotonérgicos marcados por el [3H]RX 821002 en ambas especies. ESTUDIOS AUTORRADIOGRAFICOS AUTORRADIOGRAFIA CUANTITATIVA Los estudios de autorradiografía cuantitativa realizados con una concentración 2nM del radioligando [3H]RX 821002, nos permiten describir una fijación de este antagonistas similar a la descrita previamente en la literatura para estas y otras especies de aves utilizando enste y otros radioligandos a2-adrenérgicos. AUTORRADIOGRAFIA FUNCIONAL Realizamos varios ensayos previos de distintas aproximaciones metodológicas para tratar de determinar las condiciones óptimas que nos permitieran estudiar el acoplamiento funcional de los receptores a2-adrenérgicos encefálicos de pollo a proteínas G mediante este tipo de técnica. Nuestros resultados muestran que este tipo de estudio es posible para los receptores a2-adrenérgicos y que la eleccion del tampón a utilizar en las invubaciones debe hacerse de manera muy cuidadosa ya que puede afectar tanto a la eficacia de los agonistas como al marcado de algunos núcleos. En nuestros ensayos los mejores resultados de estimulación de la fijación de [35S]GTPyS en pollo se obtuvieron utilizando una concentración 10 elevado a la -6 M del agonistas a2-adrenérgico genérico UK 14304 en tampón glicilglicina.

Autor: MORALES GONZALEZ M. CELIA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGIA.

Resumen: Los retinoides constituyen una familia de moléculas capaces de regular importantes funciones celulares. La capacidad de estos agentes para inhibir la proliferación e inducir diferenciación y apoptosis en células malignas les confiere un gran potencial como agentes terapéuticos. Entre éstos la retinamida sobresale como uno de los candidatos más interesantes; se ha demostrado su efecto antineoplásico y quimiopreventivo tanto in vitro como en modelos animales y además, muestra una baja toxicidad en los ensayos clínicos llevados a cabo. En el presente trabajo demostramos que los tratamientos in vitro con el retinoide sintético 4-HPR, inducen un proceso de muerte celular por apoptosis en líneas celulares humanas de leucemia linfoblástica aguda CCRF-CEM y JURKAT, pero no así en linfocitos de sangre periférica. Asimismo, hemos establecido una secuencia de acontecimientos que se activan y llevan a término este proceso. De este modo hemos descrito que la retinamida causa un incremento de la concentración intracelular de ceramida activando tanto la hidrólisis de esfingomielina como la síntesis de novo. Mediante inhibidores específicos hemos demostrado que la ceramida es la principal responsable de provocar un estrés oxidativo, el cual a su vez desencadena la apoptosis activando la ruta mitocondrial. Concretamente, los ROS se originan en la cadena respiratoria mitocondrial, en un paso posterior al complejo I y II y anterior al paso de los electrones entre la ubisemiquinona y ubiquinona en el complejo III; los ROS provocan la perioxidación de cardiolipina, la activación de las proteínas proapoptóticas Bak y Bax, la disipación del DYm y en definitiva la permeabilización mitocondrial con la consiguiente liberación al citosol del citocromo c, AIF y Ca2+. La liberación de estos factores se asocia a la activación de la caspasa-3 y la degradación del DNA dependiente de caspasas. La proteína Bcl-2 regula los acontecimientos mitocondriales asociados al proceso y el GSH es fundamental para amortiguar el estrés oxidativo generado. En definitiva, la expresión de Bcl-2 y los niveles de GSH de las células determinan la sensibilidad / resistencia a los tratamientos con retinamida.

Autor: GARCÍA OLIVAS RAQUEL IMELDA.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA - UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: El PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) es un factor de crecimiento que activa la proliferación y migración de las células musculares lisas y que por consiguiente, presenta importancia fundamental en el desarrollo de la aterosclerosis. El PDGF de cadena -A y de cadena -B presentan distintas isoformas de cadena larga o corta que se diferencian según la presencia o ausencia de la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son componentes glucídicos de los proteoglicanos que entre otras funciones median la actividad de los factores de crecimiento en la superficie de las células y en la matriz extracelular. En el trabajo de esta tesis doctoral nos planteamos los objetivos siguientes: - Caracterizamos la unión de las isoformas de PDGF a las diferentes especies de glicosaminoglicanos utilizando los clones de células CHO que presentan diferencias en la expresión de glicosaminoglicanos y en las hASMC (células musculares lisas provenientes de arteria humana). - Estudiamos el efecto de las diferentes isoformas de PDGF en la mitogénesis y migración en las hASMC. En este último punto, estudiamos el efecto de las isoformas de PDGF en cuanto a la inducción de la migración al azar (quimiocinesis) y la migración dirigida (quimiotaxis) hacia los factores de crecimiento. - Analizar la importancia de la interacción de las isoformas de PDGF con los glicosaminoglicanos en la activación de la mitogénesis y migración inducida por el PDGF en las hASMC. Con este fin, utilizamos la heparina como competidor soluble de la interacción con los glicosaminoglicanos e inhibidores del la sulfatación y de la síntesis de los glicosaminoglicanos. Los resultados de este trabajo nos permite concluir que: - Los isoformas de PDGF de cadena larga (y principalmente el PDGF-A de cadena larga) que presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor afinidad de unión a la membrana de las células CHO y hASMC. - Las isoformas de PDGF de cadena larga se unen a glicosaminoglicanos de tipo heparán sulfatos y glicosaminoglicanos de tipo condroitín sulfatos. Las isoformas de PDGF de cadena corta se unen principalmente a de heparán sulfatos. - El PDGF de cadena corta es la isoforma de PDGF que activa en mayor grado la mitogénesis, quiiotaxis y quimiocinesis en las células musulares lisas. - La heparina y el sodio clorato (inhibidor de la sulfatación de los glicosaminoglicanos) inhiben de forma parcial y dependiente de concentración la mitogénesis de las hASMC activada por los factores del suero. La heparina también inhibe de forma parcial y dependiente de concentración la quimiotaxis de las hASMC inducida por los factores del suero. - La heparina inhibe en mayor grado la quimiotaxis que la mitogénesis de la shASMC activada por el PDGF-B de cadena corta. - La mitogenésis de las hASMC activada por las isoformas de PDGF se inhibe principalmente por sodio clorato y beta-xilósido (inhibidores de la sulfatación y de las síntesis de glicosaminoglicanos respectivamente). En consecuencia, estos resultados sugieren que la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos presenta importancia en la inmovilización y retención de las isoformas de PDGF por parte de los glicosainoglicanos de la superficie y de la matriz extracelular. Las isoformas de PDGF de cadena corta que no presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor efecto inductor de la proliferación y migración de las células musculares lisas.

Autor: COMPAÑÓ CASANOVAS MÓNICA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La pérdida de colesterol de las membranas juega un papel importante en la capacitación y la reacción acrosómica (RA) del espermatozoide. En esta tesis se ha establecido el efecto de la salida de colesterol sobre la "fluidez" de la membrana plasmática y sobre la RA del espermatozoide de macho cabrío. La incubación de los espermatozoides en beta-ciclodextrina (betaCD) 8 mM como aceptor de colesterol dio lugar a una salida de aproximadamente el 50% del colesterol de la membranas y a un 35% de RA. Esta salida de colesterol no iba acompañada de salida de fosfolípicos, hecho que indica la preservación de las membranas. No obstante, cuando sólo se eliminaba el 30% de colesterol no se inducía RA. Dicha salida es muy rápida, sigue una cinética exponencial decreciente con un tiempo de semivida de aproximadamente 10 min., llegando al nivel asintomático al cabo de unos 30 min. Esta cinética contrasta con la cinética lenta de la RA; se necesitan casi 2h para alcanzar el máximo porcentaje de RA. Se concluye que, la salida de colesterol, por sí sola, induce RA. Utilizando la anisotropía de fluorescencia del 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH) se estudió el comportamiento termotrópico de los lípidos de membrana después de 1h., de incubación de los espermatozoides en presencia o ausencia de BetaCD 8mM. Los datos experimentales se ajustaron a curvas sigmoidales en las cuales se distinguieron dos transiciones de fase, atribuibles a diferentes dominios lipídicos. Así pues, en las membranas de los espermatozoides coexiten regiones fluidas con regiones claramente más rígidas. La salida de colesterol dio lugar a importantes cambios en la extensión de dichas transiciones, indicando un incremento de la fuidez de algunos microdominios lipídicos, así como una reorganización lateral de dichos dominios, justo antes del inicio de la RA. Para establecer cuáles de estos macrodominios estaban implicados en la salida de colesterol se utilizó la microscopía confocal. Mediante la merocianina 540 como marcador de fluidez se determinaron cuatro patrones de marcaje. Estos cuatro patrones tenían en común un intenso marcaje de la peiza intermedia, y se diferenciaban por su marcaje en la cabeza. La salida de colesterol modificaba la frecuencia de estos patrones, aumetnando la fluidez de membrana en unos macrodominios bien definidos, el segmento ecuatroial y la zona apical. La fluidez de la región postacrosomal permaneció inalterada. Para pode cuantificar, a nivel poblacional, los cambios de fluidez de membrana de los espermatozoides durante la capacitación, se utilizó la citometría de flujo. Con esta técnica se atribuyó al conjunto de la población de espermatozoides vivos un augmento de la fluidez de membrana inducida por la incubación en betaCD8 mM durante 1h. Esta fluidez se vió incrementada aún, al cabo de 2h, coincidiendo con la RA masiva.

Autor: MONTERO GONZALEZ JUAN CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA BIOQUÍMICA.

Resumen: El ectodominio de una variedad de proteínas transmembranales puede ser liberado por la acción de proteasas de membrana, denominadas secretasas. Recientmente, se ha descrito que la actividad de estas secretasas ser controlada por rutas de MAP quinasas (Erk1/2 y p38). En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado el papel que pueden desempeñar las diferentes rutas de MAPKs como mediadores en el procesamiento de proteínas de membrana, inducido por activadores de la PKC o por agentes que promueven estrés. Proporcionamos evidencias de que Erk1/2 actúa como intermediario en el procesamiento de TrkA inducido por la activación de PKC. Además, el procesamiento de factores de crecimiento transmembranales puede ocurrir a través de rutas dependientes o independientes de MAPKs. Identificamos a la metaloproteasa TACE como la enzima responsable del procesamiento de estas proteínas transmembranales inducido por activadores de la PKC. En cambio, la ruta de p38 activada por sorbitol o luz ultravioleta, fue capaz de estimilar el procesamiento que otras proteasas son también capaces de procesar a estas proteínas transmembranales. También concluimos que TACE es fosforilado por Erk en Treomina 735, y que ambas proteínas son capaces de interaccionar. Esta interacción es favorecida cuando Erk es activado, y por la presencia de la Treomina 735. Además, demostramos que esta fosforilación es importante para la regulación de la actividad de TACE por Erk1/2 en el procesamiento de TrkA. Estos resultados demuestran que las secretasas son capaces de discriminar entre diferentes estímulos que inducen el procesamiento de proteínas transmembranales, e indican que la fosforilación por MAPKs puede regular la función proteolítica de secretasas de membrana.

Autor: MURUZÁBAL DEL CASTILLO FRANCISCO JOSE.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El interés por el estudio del control de la ingesta es creciente, especialmente tras el descubrimiento de hormonas como la leptina, las orexinas y más recientemente la ghrelina que intervienen en esta función. Estas hormonas son producidas por distintos tipos de células epiteliales y, en algunos casos, también por neuronaas de los plexos digestivos de mamíferos. Concretamente, las células principales, secretoras de pepsinógeno, son las productoras de leptina, mientras que la orexina A es producida por células endocrinas del antro. En vertebrados no mamíferos los estudios sobre la leptina son escasos. Sin embargo se ha observado una alta conservación de la secuencia del gen ob en diversas especies de vertebrados mamíferos y no mamíferos y se ha sugerido que la leptina está altamente conservada en la evolución. En nuestro estudio quisimos averiguar la posible influencia del estado nutricional sobre la producción de leptina y orexina A en la mucosa gástrica. Para ello se constituyeron 5 grupos experimentales de ratas; un grupo de ayuno de 48 horas, tres grupos realimentarios 30 min, 4h y 20h tras el ayuno de 48h, y un grupo control alimentado. También se dispuso de diferentes especies de vertebrados no mamíferos como trucha (Oncorhynkus mykiss), rana (Xenopus laevis), culebra (Natrix maura) y largatija (Podarcis hispánica). También quisimos comprobar la posible expresión de leptina en el estómago de vertebrados no mamíferos. Se realizaron técnicas inmunocitoquímicas (ICQ) y de hibridación in situ (HIS) para detectar la presencia de la leptina y de su RNAm, respectivamente. Con ambas técnicas el marcaje aparecía en el tercio inferior de las glándulas oxínticas, concretamente en las células principales. Las muestras en las que se realizó ICQ se sometieron a análisis de imagen para cuantificar el área inmunorreactiva para la leptina. No se encontraron diferencias significativas en cuanto al área marcada en los distintos grupos. Sin embargo, un estudio microscópico detallado, tanto en cortes emifinos al MO como en cortes finos al ME, puso de manifiesto diferencias en el número, tamaño y distribución de los gránulos positivos para la leptina en las células principales en los distintos grupo experimentales. El diámetro del os gránulos es considerablemente mayor en el grupo de ayuno que en el grupo control. Al producirse la realimentación, el diámetro disminuye llegando alm ínimo en el grupo realimentado 30 min., en el que además los gránulos quedan restringidos a una fina zona apical. Conforme aumenta el periodo de realimentación, los gránulos aumentan su tamaño hasta alcanzar el del grupo control. Mediante las técnicas de ICQ y de HIS hemos encontrado expresión de la leptina en algunos elementos nerviosos del plexo mientérico del estómago de la rata. También hemos detectado inmunorreactividad para la leptina en el endotelio de algnas arterias, pero no en el de las venas. En el caso de la orexina A se cuantificó por análisis de imagen el número de células marcadas en cada grupo. No se encontraron diferencias significativas en cuanto al número de células maracadas entre los diferentes grupos, aunque se observaba una tendencia al aumento en el número de células marcadas en el grupo de Ayuno con respecto al resto de grupos estudiados. En vertebrados no mamíferos, el marcaje inmunocitoquímico para la leptina aparece en las células marcadas en el grupo de Ayuno con respecto al resto de grupos estudiados. En vertebrados no mamíferos, el marcaje inmunocitoquímico para la leptina aparece en las células oxíntico-pépticas en todas las especies estudiadas excepto en la trucha, en la que el marcaje se encontró en células dispersas a lo largo de la mucosa gástrica que presentaban un claro aspecto endocrino. Al igual que ocurre en la rata, hemos encontrado marcaje para la leptina en el plexo mientérico de la trucha, la rana y la culebra. En algunas neuronas la leptina colocalizaba con el péptido inhibidor vasoactivo (VIP).

Autor: AGORRETA ARRAZUBI JACKELINE.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El tratamniento con lipopolisacárido (LPS) reproduce algunos de los síntomas de la lesión aguda de pulmón (ALI), y la hipoxemia es una de las principales características de esta enfermedad; por lo que hemos desarrollado un modelo de lesión aguda de pulmón que combina los tratamientos de hipoxia normobárica aguda y LPS en pulmón de rata (modelo in vivo) y en distintas líneas celulares establecidas (modelo in vitro). En ambos modelos se combinan el tratamiento de LPS (0,1 mg/kg, i.p en el modelo animal y 100 ng/ml en las líneas celulares) e hipoxia aguda (9% O2 en el modelo animal y 1% O2 en las línes celulares) en ratas Fisher Harlan y líneas celulares procedentes de pulmón de rata. Se analizaron cuatro grupos de estudio: grupo 1 (normoxia), grupo 2 (hipoxia), grupo 3 (normoxia + LPS), grupo 4 (hipoxia +LPS). Varios autores han descrito un aumento de la expresión de la sintasa inducible de óxido nítrico NOS2)j y la adrenomedulina (AM) en pacientes con ALI, y ambos factores son regulados por los tratamientos con hipoxia y LPS. Se ha estudiado la expresión de mabos factores en los modelos in vivo e in vitro aplicando las técnicas de Northern blot, Western blot, hibridación in situ de mRNA, inmunocitoquímica y radioinmunoensayo para detectar la producción NOS2 y AM. Se ha obervado que el tratamiento con hipoxia + LPS produce edema pulmonar y una acumulación de moléculas extravasadas en la pared de los vasos sanguíneos, lo qu epareceindicar que este tratamiento reproduce las fases tempras de ALI. En el modelo in vivo el tratamiento combinado produce una potenciación de la expresión de NOS2 y AM en comparación con ambos tratamientos por separado. En el caso de NOS2, este aumento de la expresión es debido a una inducción de la migración al pulmón de células inflamatorias inmunorreactivas para NOS2 identificadas como monocitos, neutrófilos y linfocitos. En el caso de la AM, sólo la línea celular de macrófagos alveolares responde a la coestimulación con hipoxia y LPS induciendo una expresión del mRNA de la AM mayora que con cada tratamiento por separado, lo que apoya la hipótesis de que estas células son relevantes en la producción de AM en condiciones de ALI.

Autor: BERAZA AGUILAR NAIARA.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La Cardiotrofina-1 (CT-1) pertenece a la familia de la Interleuquina-6 y fue descrita inicialmente como una citoquina secretada por cardiomiocitos con funciones protectoras en células cardíacas y neuronales. Este trabajo identifica a CT-1 como una citoquina con una función claramente antiapoptótica en hepatocitos. Cinco líneas de evidencia lo demuestran: A,- CT-1 e secretada por los hepatocitos en cultivo en condiciones de privación de suero y ante estímulos proapoptóticos como el TGF-beta. B,- CT-1 reduce la muerte provocada por TGF-beta en hepatocitos primarios. C,- La presencia de anticuerpos anti CT-1 reduce la viabilidad de los hepatocitos en cultivo. D,- CT-1 activa las vías de señalización antiapoptóticas STAT-3, ERK 1/2 y Akt e induce la traslocación al núcleo de NF-kB y finalmente. E,- La administración de un adenovirus que codifica para el gen de CT-1 (AdCT-1) previa a un daño hepático agudo mejora la supervivenc ia, la homeostasis del hígado y reduce la apoptosis en modelos experimentales de fallo hepático fulminante en rata y ratón. Durante el proceso de regeneración hepática se product un aumento en la expresión de moléculas antiapoptóticas como son las prostaglandinas (PGs) y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). En este trabajo demostramos que la expresión de CT-1 se induce durante la regeneración hepático coincidiendo con la proliferación de hepatocitos y que la responsable de la síntesis de PGs durante este periodo es la isoforma inducible de la enzima ciclooxigenasa (COX);COX-2. La inhibición de esta enzima durante la proliferación hepatocitaria provoca la disminución de los niveles de CT-1, la pérdida de la isoforma VEGF188 así como el bloqueo de la proliferación hepatocitaria y la inducción de la apoptosis. La administración del AdCT-1 antes de la inhibición de COX-2 revierte el bloqueo de la regeneración hepática reestableciendo los niveles de PGs, de CT-1 y de VEGF además de impedir la apotosis celular y recuperar la proliferación hepatocitaria.

Autor: GARMENDIA GOÑÍ OIHANA.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: En el presente estudio, se ha demostrado por primera vez, la presencia de los dominios PHM y citoplasmático del enzima amidante PAM en las células A, B y C del páncreas de ratón adulto y en desarrollo. Por otro lado, se ha confirmado la ausencia de PAM en las células dePP. Los diversos factores técnicos han influido decisivamente en laidentificación inmunocitoquímica del PAM. La técnica de En Visión y el desenmascaramiento de antígenos mediante el uso del microondas favorecen la aparición de inmunorreactividad frente a PAM, especialmente en el caso del DC. Así mismo, el procesamiento histológico, en especial la fijación, influyen de manera considerable en la obtención de marcaje frente a este dominio. Por último, sólo algunos antisueros han detecatdo el PHM en las células B, por lo queda abierta la posibilidad de la presencia del PAM en las células de PP. Se ha confirmado la existencia de subpoblaciones de células productoras del enzima amidante en el páncreas de ratón adulto. Por un lado, prácticamente la totalidad de las células B y D (en algunos especímenes) presentan inmunorreactividad para el enzima, aunque con diferencias en la intensidad del marcaje. Por otro lado, tan sólo una subpobalción de las células A son PAM positivas. Estas subpoblaciones pueden representar poblaciones dinámicas en distintos momentos funcionales respecto de la producción de péptidos amidados. Los datos obtenidos mediante las técnicas inmunocitoquímicas y el Western blot indican la existencia en el páncreas de ratón de diversos tipos de enzimas PAM: mono y bifuncionales, integrales y solubles. Los resultados de Western blot e inmunocitoquímicos obtenidos en los tres tipos celulares sugieren diferencias bioquímicas entre los enzimas PAM. La localización subcelular de los dominios PHM y DC sugiere procesamientos diferentes del precursoor. Así, el PHM de las células A y B/D es reconocido siempre por antisueros diferentes, lo que puede corresponder a diferencias bioquímicas intercelulares del domonio. Además, se ha observado que la inmunorreactividad para el DC en las células A y D es yuxtanuclear en adultos y neonatos, lo que es compatible con la proteolisis del DC y la existencia de formas solubles del enzima en los granos de secreción. La tinción más débil y extendida del DC hallada en las células B indica más bien la co-existencia de formas solubles e insolubles en los gránulos de secreción. La inmunorreactividad frente a PAM se detecta desde el día 11 del desarrollo embrionario en el páncreas de ratón. No se han encontrado diferencias en la inmunorreactividad frente a PAM entre individuos prenatales, postnatales jóvenes y adultos en cuanto a la localización del PAM en los tres tipos celulares. Sí que se han observado diferencias en cuanto al patrón intracelular de distribución del marcaje frente al DC de extendido (en embriones) a perinuclear (Tras el nacimiento). Estos datos pueden reflejar un merno grado del procesamiento del PAM en el desarrollo. Dado que insulina, glucagón y somatostatina no son péptidos amidados, se etudió la presencia en estas células de péptidos reguladores amidados que pudieran dar una significación funcional a la presencia del PAM en páncreas. Tanto en adultos como en el desarrollo, se halló en los tres tipos celulares la expresión de al menos dos de los siguientes péptidos: adrenomedulina, PAMP, orexina A y gastrina.

Autor: BELLO GÓMEZ ROSARIO INÉS.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CAMPUS UNIVERSITARIO DE RABANALES.

Resumen: El objetivo general de la tesis fue estudiar la participación de las quinona reductasas extramitocondriales, NAD(P)H quinona oxidoreductasa 1 (NQO1) y NADH citocromo b5 reductasa (b5R), en la defensa celular frente al estrés oxidativo y en el control del crecimiento en células animales que se desglosa en los siguientes objetivos parciales: - Analizar el papel de NQO1 en la regeneración del tocoferol. - Estudiar la relación entre los niveles de quinona reductasas extramitocondriales y las ROS endógenas en función de la fase de crecimiento en células en cultivo así como su influencia en la resistencia frente a situaciones de estrés oxidativo agudo y crónico. - Estudiar la participación de la actividad reductasa de NQO1 en el mantenimiento del estado redox intracelular y en la regulación del crecimiento y muerte celular. A partir de la elaboración del trabajo se obtuvieron las siguientes conclusiones: * La forma reducida del tocoferol puede ser mantenida gracias a la actividad reductasas de NQO1. * Los niveles de NQO1, b5R y Coenzima Q10 dependen de la fase de crecimiento en células HeLa. Elevados niveles de NQO1 y b5R correlacionan con un mayor grado de resistencia al estrés oxidativo de células HeLa confluentes. * Las ROS tienen un papel modulador de los niveles de NQO1 y b5R que se ve influenciado por la densidad celular. En el estado confluente de las células HeLa se produce un descenso significativo de los niveles de peróxido de hidrógeno y superóxido. * La alternancia de periodos de exposición al peróxido de hidrógeno con periodos de recuperación permite la obtención de una línea celular que muestra una resistencia constitutiva al agente oxidante. Las células resistentes manifiestan unos niveles incrementados de quinona reductasas extramitocondriales. * La actividad NQO1 es necesaria para el mantenimiento de la viabilidad celular participando en la regulación del estado redox intracelular mostrándose además como un factor determinante en el funcionamiento del punto de restricción G1. La inhibición de la enzima favorece la progresión hacia la fase S en ausencia de suero e incrementa la apoptosis.

Autor: PARIS NOGAL RAQUEL.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMIA/FACULTAT CIENCIAS.

Resumen: Los glicoesfingolípidos, entre los que se incluyen los gangliósidos, han emergido como intermediarios en la señalización de estímulos extracelulares. La mitocondria juega un papel primordial en la organización de las señales que inducen muerte celular por lo que en esta tesis se ha valorado la interacción del gangliósido GD3 con la mitocondria y la secuencia de eventos que culminan en la muerte celular. Se ha demostrado que el efecto del gangliosido GD3 como lípido mediador de la muerte está determinado por su interacción con el complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial dando lugar a la generación de radicales libre que inducen la liberación de factores apoptogénicos desde la mitocondria. Éstos, a su vez, activan a la caspasa efectora 3 capaz de interaccionar con dianas celulares produciendo la muerte con apoptosis. El glutation mitocondrial juega un papel crítico en el control de la supervivencia celular a través de la modulación del estrés oxidativo inducido por los glicoesfingolípidos. El gangliósido, a su vez, es capaz de inactivar rutas de supervivencia como el factor de transcripción NF-kB. Debido a que la activación de NF-kB contribuye a la resistencia de las celulas tumorales a la terapia contra el cáncer en esta tesis se ha examinado el papel del gangliosido GD3 en la modulación de la respuesta de las células de hepatoblastoma humano, Hep G2, a la radioterapia y quimioterapia. El Gangliósido GD3 sensibiliza a las células tumorales frente a la terapia debido a un efecto dual. Por un lado, a través de la generación de radicales libres desde la mitocondria, activación del apoptosoma y activación de caspasa 3 y por otro, gracias a la inactivación de procesos de supervivencia como NF-kB, por lo que se posiciona al gangliósido GD3 como lípido adyuvante en la terapia del cáncer.

Autor: DIAZ MURILLO HUGO ALBERTO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CIB-CSIC - UAM.

Resumen: El análisis de la vejez en reproducción se ha desarrollado considerablemente en los últimos años; lo que se ha debido principalmente por su relación con la mantención de la capacidad fértil del individuo. En los mamíferos, la acción del tiempo tiene efectos muy diferentes en los machos que en las hembras. En estas últimas, sujetas a un complicado ciclo hormonal, al estado fértil desaparece aproximadamente en la mitad de su vida. El análisis de la vejez del gameto femenino, el oocito, es uno de los puntos más interesantes para llegar a conocer los sofisticados mecanismos que regulan los ciclos reproductivos y que permiten que cada especie tenga no sólo un ciclo sexual, sino un programa reproductivo establecido. Esta Tesis Doctoral está enfocada a conocer algunos de estos puntos, y en especial los cambios que ocurren en los oocitos de ratón debidos al envejecimiento tanto preovulatorio (que ocurre en el oviducto después de la ovulación), así como aquel que se produce por el paso de los años en el ovario. Los oocitos envejecidos mostraron una clara reducción de su fertilidad cuando se estudió este parámetro mediante la técnica de la fecundación in vitro. Los cambios más notables que aparecieron en estos oocitos envejecidos fueron: A,- Se observaron signos de apoptosis, la que se evidenció tanto como fragmentaciones del ADN, como también en alteraciones de la membrana plasmática. Estas últimas indicativas de una apoptosis temprana. B,- Una serie de anormalidades aparecieron también en los elementos que conforman el citoesqueleto citoplasmático de oocitos envejecidos y extraídos de hembras viejas. En estos casos, se apreció una alteración en el citoesqueleto de la corteza del oocito, fundamentalmente en los filamentos de F-actina. C,- Los análisis empleados para detectar la expresión de la proteína de estrés HSP70 mostraron los genes de esta proteína se expresaban particularmente en oocitos envejecidos en el oviducto. D,- Las observaciones realizadas en el microscopio electrónico también revelaron alteraciones en la morfología de estos oocitos. Fundamentalmente, se encontraron grandes cambios en la zona pelúcida, la cual en oocitos envejecidos aparecía dividida en dos regiones; y así tambien una serie de modificaciones en la distribución y características de los gránulos corticales. Como ambas estructuras tienen papeles fundamentales en el desarrollo de la fecundación, los cambios observados probablemente comprometen la viabilidad de este fenómeno. E,- A fin de renovar la fertilidad de los oocitos envejecidos o extraídos de hembras viejas se intentó regenerar, al menos en parte, su citoplasma, realizando microinyecciones de mitocondrias. Los resultados de esta tecnología, que es prácticamente inédita, no fueron del todo satisfactorios. Sin embargo, mostraron que los oocitos que contenían mitocondrias foráneas podían ser fecundados in vitro, y también de iniciar el desarrollo embrionario. En resumen, esta gama de alteraciones y probablemente otras, analizadas por otros autores o desconocidas, son las responsables del deterioro del gameto femenino y de las consecuencias que esto tiene sobre la fertilidad.

Autor: PENA ALONSO EMMA.
Año: 2001.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD.

Resumen: En el presente trabajo, profundizamos en los mecanismos celulares y moleculares implicados en la respuesta del nucleo neuronal, a los cambios dramaticos en la expresion genica que acompañan al estre celular, inducido por un agente antitumoral como es la adriamicina. La reorganizacion dinamica de los dominios nucleares implicados en la transcripcion, procesamiento de los RNAs y degradacion macromolecular juegan un papel fundamental en la respuesta de proteccion neuronal y recuperacion de las funciones nucleares asociadas a estrés celular. El factor de supervivencia de las neuronas motoras (SMN), en asociacion con otra proteina SIP-1, juega un papel fundamental en el ensamblaje de la maquinaria de "splicing", el "spliceosome" y por consiguiente, en la maduracion de los pre-mRNAs. Nosotros hemos observado que tanto el SMN como SPI-1 tienen un nivel de expresion muy elevado en las neuronas de los ganglios sensitivos y que ambas moleculas se localizan en los cuerpos de Cajal (CB), lo que sugiere su participacion activa en el "splicing" de pre-mRNAs en neuronas sensitivas, proceso que estaria mediado por los CBs. El desarrollo del presente trabajo, nos permitió observar que existe una reorganizacion de la maquinaria de "splicing", inducida por el estrés neurotoxica, que implica cambios en los niveles de expresion y distribucion espacial de los diferentes factores de "splicing". Ademas, nos permitio comprobar que los factores SMN y SPI-1 estan implicados en la respuesta de estrés neuronal. Otro aspecto importante, fue determinar la participacion de un miembro de la familia de las MAPKinasas, la JNK, en la respuesta de estrés neuronal. Pensamos que nuestro modelo de estrés neurotóxico en neuronas ganglionares, en el que se activa la via de la JNK, es adecuado para estudiar los patrones de expresion nuclear del enzima (JNK) y del sustrato (c-Jun) tanto en las formas activas como inactivas. La inhibicion de la transcripcion nucleolar inducida por la adriamicina, bloquea el ensamblaje de los CBs, pero induce la formacion de cuerpos nucleares densos claramente diferentes de los CBs, que probablemente tienen origen nucleolar.

Autor: CUCHILLO IBAÑEZ INMACULADA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DPTO FARMACOLOGIA, FAC. MEDIANA. U. AUTONOMA MADRID.

Resumen: En esta tesis doctoral se presentan seis articulos cientificos. En ellos se expone un estudio sobre la homeostasia del Ca2+ celular y la exocitosis en las celulas cromafines. La celula cromafin deriva embriologicamente de la cresta neural y se comporta como una forma altamente especializada de neurona noradrenergica. Por ello, la celula cromafin se ha empleado como modelo del acoplamiento estimulo-secrecion, en el cual un incremento del Ca2+ citosólico activa la exocitosis. Describimos la funcion de las organelas intracelulares en la distribuicon del Ca2+ citosolico y en la secrecion, asi como el efecto de los productos secretados sobre la señal de Ca2+ citosólico. En el comienzo, mostramos, por primera vez, que el Ca2+ que entra a traves de los canales dependientes de voltaje es capaz de activar el mecanismo de CICR(Ca2+-induced Ca2+release). El CICR libera Ca2+ del reticulo endoplasmico y amplifica la señal de Ca2+. El reticulo endoplasmico regula ademas la señal secretora gracias al CICR. Por otra parte, demostramos que las mitocondrias son capaces de captar concentraciones de Ca2+ de hasta casi niveles milimolares, y liberarlo, sin que ello repercuta en la viabilidad celular. Ademas, la tasa de la captacion de Ca2 de la mitocondria se hace patente a partir de una concentracion de Ca2 citosólico de 5 uM. La mitocondria, a traves de su regulacion de la homeostasia del Ca2, controla el nivel de secrecion que se produce tras un estimulo. De esta manera, evita una activacion excesiva de procesos dependientes de Ca2+, como el desemblaje de la actina o la activacion la protein-kinasa C. Finalmente, detallamos que la secrecion de las celulas cromafines en cultivo se encuentra polarizada, al igual que en su situacion in situ, y que los productos de secrecion, se pueden unir a sus auto-receptores y modular la difusion de la señal de Ca2+ citosolico.

Autor: MILUD ELMEZOGHI MUHEEBA.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Resumen: En la presente Tesis Doctoral se ha realizado un estudio comparado de la retina humana y porcina, en el que ha descrito la distribución de las neurotrofinas y sus receptores. Asimismo, se ha estudiado si las celulas ganglionares de la retina de cerdo mantienen la expresion de las neurotrofinas y sus receptores in vitro. Como resultados más relevantes se han encontrado una gran similitud en la expresion de las sustancias estudiadas en las retinas humana y porcina. Con respecto a los estudios in vitro, todas las sustancias estudiadas que se expresan en las celulas ganglionares in vivo tambien se expresan in vitro, a excepcion del receptor p75 que no se expresa en las celulas.

Autor: YUNTA GONZÁLEZ MÓNICA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: La presente tesis aporta datos científicos novedosos acerca de las funciones fisiológicas en las que está implicado el antígeno CD53. Tales funciones son activación de las rutas de señalización intracelular correspondientes a las quinasas activadas por mitógenos (MAPK), en diversas líneas celulares, tanto linfoides como epiteliales. Asimismo se describe la expresión del antígeno CD53 en células mesangiales de riñón de rata y el papel que dicho antígeno tiene como inductor de la síntesis de ADN en estas células. Por último, se describe el papel del antígeno CD53 como protector frente a la apoptosis ocasionada por la falta de suero en un linfoma B de rata.

Autor: MINGUET GARCÍA SUSANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: La disección y estudio de los procesos de neoformación en el entorno embrionario pueden revelar cuestiones críticas sobre la regeneración tras el daño patológico en el adulto, proporcionando así nuevos protocolos terapéuticos alternativos a la sustitución tisular. Por todo ello, entender las condiciones celulares y factores moleculares críticos de los órganos embrionarios, interesa en la idea de intentar mimetizar o recapitular la ontogenia del desarrollo temprano en la regeneración de los tejidos adultos. En este trabajo se caracteriza una población de progenitores bipotenciales hepáticos, presente desde los estadios más iniciales del desarrollo del órgano en ratón y cuya diferenciación a hepatocitos y células biliares puede ser reproducida en modelos in vitro. Aunque el enfoque de este trabajo es puramente experimental, no se escapa su potencial en el desarrollo ex vivo de células hepáticas normofuncionales y capaces de ser utilizadas en una eventual terapia de sustitución hepática.

Autor: RIVAS GONZÁLEZ MARCOS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: En este trabajo hemos estudiado la actividad transcripcional de DREAM (Downstream Regulatoy Element Antagonist Modulator) sobre genes específicos de tiroides utilizando para ello la línea de células foliculares tiroideas FRTL-5. Hemos demostrado que tiroglobulina (Tg) es un gen diana de DREAM y hemos estudiado su promotor para investigar el mecanismo molecular de la represión transcripcional ejercida por este factor. DREAM se une al promotor de Tg en una región que se solapa con el sitio de unión de los dos principales activadores de la expresión de Tg: TTF-1 y Pax-8. Además, DREAM se une simultáneamente con TTF-1 a esta región e interacciona con ambos factores mediante una interacción proteína-proteína directa. Al analizar distintos mutantes de DREAM, comprobamos que el efecto represor de este factor depende de dos dominios de tipo "Leucine-Charged Domains" (LCD). Para poder identificar otros posibles genes diana de DREAM, generamos clones estables de la línea FRTL-5, que sobreexpresan la forma silvestre de DREAM o un mutante de los dominios LCD. La caracterización de estos clones nos permitió observar que TTF-1 y Pax-8 también son genes diana de DREAM. Por lo tanto, proponemos un modelo de regulación del promotor de Tg en el que DREAM actúa a través de dos mecanismos distintos: 1,- Alterando la capacidad de transactivación de TTF-1 y Pax-8. 2,- Reprimiendo la expresión de ambos factores. La actividad de DREAM sobre sus genes diana está regulada por calcio y por cAMP/PKA mediante dos mecanismos diferentes e independientes. Sin embargo, la vía cAMP/PKA, activada por la TSH, parece ser más relevante que la vía del calcio en el control de la regulación del promotor de Tg por DREAM.

Autor: CASTEL GIL SUSANNA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: El melanoma cutáneo humano es uno de los cánceres más agresivos y mortales que existen una vez llegada la fase metástasis. Actualmente, se intenta establecer terapias novedosas que tienen como diana antígenos asociados a la progresión del melanoma maligno. Uno de estos antígenos es la integrina alfavbeta3, altamente expresada en el melanoma cutáneo humano y considerada como diana preferencial. En esta tesis doctoral se utilizaron dos antagonistas de la integrina alfavbeta3, para la caracterización de su funcionamiento in vitro en células de melanoma humano: un anticuerpo monoclonal contra la subunidad-alfav-, el mAb 17E6 desarrollado por el Laboratorio de Bioinvestigación, Merck Farma y Química, SA (Barcelona, España) y el pentapéptido cíclico Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal o cyclo-RGDfV MET, desarrollado en Merck KgaA (Darmstadt, Alemania. Previamente al inicio de este estudio se había caracterizado su afinidad por las diferentes integrinas alfav, su capacidad de bloquear la adhesión de diferentes líneas de melanoma y carcinoma y de reducir el tamaño de tumores in vivo. El presente estudio trata de comprobar si estos antagonistas también tienen la capacidad de inducir la desadhesión de las células de melanoma humano una vez formadas las uniones célula-matriz extracelular (ECM) y determinar qué mecanismos estarían implicados. Los resultados obtenidos demuestran que tanto el mAb 17E6 como el péptido cRGDfV MET inducían la desadhesión de las células de malenoma humano sobre una matriz de vitronectina (VN), en un proceso dosis- y temperatura- dependiente. La desestabilización de la unión alfavbeta3-VN inducida por los antagonistas provocaba la deslocalización de la integrina alfavbeta3 de las adhesiones focales (Fas) y su redistribución por la membrana celular. Además, la acción de los antagonistas inducía el desensamblaje de las Fas y la consecuente deslocalización de las proteínas que las forman así como del citoesqueleto de actina. Tanto la integridad del citoesqueleto de actina como de la arquitectura molecular de las Fas son necesarias para que se pueda producir la acción de los antagonistas, ya que su desestructuración con drogas específicas inhibe por completo la desadhesión inducida por los antagonistas de la integrina alfavbeta3. El tratamiento con estos antagonistas induce un incremento transiente en la concentración de Ca2+ intracelular en las células de melanoma segundos después de su aplicación, indicando que la transducción de señal mediada por Ca2+ intracelular es uno de los mecanismos iniciales implicados en la desadhesión inducida por los antagonistas. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que este incremento de Ca2+ intracelular implica mayoritariamente la afluencia de Ca2+ extracelular y la liberación de Ca2+ del retículo endoplasmático via PLCgamma-InsP3, en un proceso dependiente de tirosinas quinasas. En el último apartado de esta tesis doctoral se caracterizaron los procesos mediante los cuales estos dos antagonistas podían ser internalizados por las células de melanoma. Así, los resultados obtenidos indicaban que mientras que el péptido cRGDfV MET era endocitado de manera no específica e independiente de la integrina alfavbeta3 por las células de melanoma, el mAb 17E6 seguía una internalización mediada por receptor, internalizándose conjuntamente con la integrina alfavbeta3. Consecuentemente, el mAb 17E6, pero no así el péptido cRGDfV MET, reduce el número de integrinas alfavbeta3, funcionales en la superficie de las células de melanoma, ya que se une de manera estable a la subunitat alfav e internaliza el heterodímero.