CULTIVO CELULAR

Autor: ENSEÑAT WASER ROBERTO.
Año: 2004.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: INSTITUTO DE BIOINGENIERIA FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOINGENIERIA.

Resumen: En la presente tesis se han estudiado cuatro aspectos fundamentales y de importancia para la futura posible aplicación terapéutica de las células madre embrionarias. En primer lugar queda demostrado como durante el cultivo in vitro prolongado de las células madre embrionarias, y a pesar de mantener unas condiciones optimas para su expansión indiferenciada, estas células sufren cambios morfológicos asociados a variaciones genéticas por las cuales ven disminuido su potencial, derivando en un cultivo heterogéneo donde sólo unas pocas células se mantienen totalmente indiferenciadas y el resto queda parcialmente diferenciado o con una capacidad de diferenciación reducida, conforme a lo que puede observarse por los marcadores específicos de pluripotencialidad. En segundo lugar se muestra como mediante el uso de una construcción genética, que relaciona la expresión endógena de uno de los marcadores más específicos de las células madre embrionarias indiferenciadas, el OCT-4, con la expresión de la proteína verde fluorescente (eGFP), puede visualizarse fácilmente la composición y potencial de los cultivos de las células madre. Es más, pueden incluso seleccionarse aquellas células que, a pesar del cultivo prolongado, hayan mantenido su gran potencial diferenciador invariable. De esta manera se generan cultivos totalmente homogéneos con el mismo, o al menos muy parecido, potencial y propiedades como las que cabrían esperar de un cultivo celular recién generado o aislado. Estos cultivos mantienen dichas características invariables, a lo largo de los pases, de manera más eficiente que los cultivos comerciales y sin llegar a sufrir pérdidas de potencial. El uso de estas células modificadas con la construcción empleada más arriba, nos permiten describir de manera muy eficiente, los caminos seguidos por las células madre embrionarias durante el proceso de diferenciación in vitro, mediante la formación de agregados celulares en suspensión, denominados cuerpos embrionarios. Hemos podido así definir un punto temporal en el cual, las células madre embrionarias, en respuesta a la eliminación de aquellos factores necesarios para mantenerse indiferenciadas in vitro, reducen la expresión endógena de marcadores de indiferenciación, de una manera homogénea y sincrónica (indicando que entre las células son de gran importancia las comunicaciones intercelulares probablemente a través de uniones tipo GAP juntion). Esta fase, se correspondería con una preparación de las células, o dicho de otro modo, una sensibilización, para recibir posteriormente las señales necesarias para desencadenar su diferenciación. Estas señales hemos demostrado, que sólo aparecen espontáneamente en los cultivos en cuerpos embrionarios, inducidas por el cultivo en tres dimensiones, debido a la aparición de gradientes de factores. Esta fase de sensibilización, es reversible, de manera que si no aparecen las señales inductoras de diferenciación (como ocurriría en un cultivo adherente) las células recuperan la expresión inicial de marcadores de pluripotencialidad. De tal manera que ese punto, descrito a los seis días de cultivo se convierte en un muy interesante punto de inflexión en el cual, y por medio del uso de factores de transcripción o de factores de crecimiento, podríamos influir positivamente sobre la diferenciación, mejorando no solo el rendimiento del proceso sino además la homogeneidad, esto es, obtener cultivos de células diferenciadas donde predomine un solo tipo celular. Por último, se han cuantificado el número de células que quedan indiferenciadas tras la diferenciación espontánea, representando éstas el 15% del cultivo total. Hemos descrito como esta población no se compone sólo de células madre embrionarias indiferenciadas (lo cual ya supone un gran riesgo en terapéutica, por su capacidad de inducir tumores al ser inyectadas en animales) sino además hemos identificado una población celular nunca antes descrita, con propiedades tumorales, inductora de tumores monoclonales, que resiste a condiciones de cultivo muy restrictivas donde otras células desaparecerían o se diferenciarían. Estas células si bien de número reducido, dada su dificultad de eliminación por métodos tradicionales y a que siempre se generan, suponen un verdadero y gran riesgo para cualquier intento de aplicación terapéutica de productos celulares derivados de células madre embrionarias, y por lo tanto habrán de ser siempre tenidas en cuenta en cualquier protocolo de diferenciación.

Autor: PEÑA ARRANZ RAUL.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGIA.

Resumen: El presente trabajo de Tesis Doctoral tiene como finalidad profundizar en el conocimiento de los procesos que modulan el tráfico de proteínas entre el citoplasma y el núcleo. Para ello, estudiaremos el comportamiento de una de las proteínas cariofílicas más utlizadas en ensayos de transporte, la nucleoplasmina, estableciendo un modelo de transporte nucleocitoplásmico mediante su transfección in vivo en la línea celular de melanoma humano A375. La nucleoplasmina (Np) es la proteína descondensadora de la cromatina de los espermatozoides de Xenopus laevis, tras la fertilización del huevo de la rana, participando en importantes actividades biológicas como son la remodelación de los nucleosomas, la transcripción y la activación génica y la descondensación de cromatina. Para lograr este objetivo, se fusionó el cDNA de la Np, al extremo terminal de la proteína fluorescente GFP, creando el plásmido pGFP-Np, que fue transfectado de manera estable en dicha línea celular. Por otro lado, se transfectó establemente un plásmido para la expresión de la GFP en la misma línea celular. Como resultado se obtuvieron las líneas celulares A375 GFP, y A375 GFP-Np, que sirvieron de base para la tesis. La GFP-Np expresada de manera constitutiva in vivo resulta ser una proteína cariofílica, es decir de localización nuclear, aunque excluida de los nucleolos. Además, tras la fusión de la GFP, se mantiene la estructura pentamérica original de la Np, mantenida por las interacciones Np-Np y la proteína GFP-Np es capaz de interaccionar de manera correcta con todas las proteínas que lo hace la Np. Finalmente se comprueba que la GFP-Np es capaz de descondensar cromatina, al igual que la Np, debido a la fosforilación que sufre in vivo. En definitiva, el melanoma humano es capaz de interaccionar con la GFP-Np, modificarla y regular su función de igual manera que ocurre con la Np en los huevos y ovocitos de Xenopus. Asimismo, la expresión estable de esta proteína cariofílica de fusión en células humanas es un modelo válido para estudiar el transporte nucleocitoplásmico. La línea celular A375 GFP-Np es una herramienta válida y útil para el estudio de dicho mecanismo celular. Su utilización como modelo celular in vivo permitirá avanzar en la comprensión y entendimiento de este importante mecanismo de regulación celular.

Autor: VALCARCEL CUESTA MARIA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA.

Resumen: La endostatina es una molécula endógena que regula la quiescencia vascular e inhibe la angiogénesis tumoral porque bloquea la proliferación, migración y apoptósis de las células endoteliales. A pesar del importante conocimiento sobre sus efectos tumorales, se desconoce su mecanismo de acción sobre los estadios preangiogénicos y postangiogénicos que contribuyen a la colonización tumoral del hígado. El presente estudio se planteó para estudiar el efecto de la endostatina sobre el mecanismos pro-metastático de la inflamación microvascular inducido por el VEGF que deriva de células tumorales, a través de un modelo de colonización hepática por células del melanoma B16, dependiente de la adhesión a células endoteliales vía VCAM-1 inducida por TNF-alfa e IL-18. Así mismo, se estudió los efectos del VEGF y la endostatina sobre el potencial proadhesivo del melanoma vía VLA-4, y sus consecuencias sobre la retención microvascular hepática y la formación de metastásis. Por último el proyecto se centró en la actividad metastático y angiogénica del melanoma en el hígado de ratones tratados con endostatina, con particular atención a sus efectos sobre los mecanismos de migración proangiogénica endotelial y de los miofibroblastos preivasculares; y de proliferación y migración tumoral, inducidos por el VEGF. Los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento con endostatina durante la etapa de diseminación hepática del MB16 disminuyó, por una parte, la implantación y el desarrollo de metástasis a través de su efecto inhibidor sobre la retención microvascular de células tumorales circulantes. En este mismo escenario de implantación metastática, el VEGF también estimuló la adhesividad del MB16 al endotelio sinusoidal hepático a traveés de un mecanismo regulado por la activación de la integrina VLA-4 a través de TNFa inducido por IL-18. Por otra parte, la administración de endostatina recombinante durante la fase de crecimiento post-implantativo de la metástasis hepática del melanoma también tuvo efectos terapéuticos, que operaron tanto en los períodos del proceso metastático preangiogénico, como post-angiogénico. En conjunto, los resultados permitieron concluir que la endostatina inhibe los efectos prometastáticos de la inflamación, la angiogénesis y la proliferación y adhesión tumorales, inducidos por VEGF durante la metástasis hepática del melanoma. La interferencia de la respuesta celular al VEGF por la endostatina demuestra nuevas propiedades antitumorales de la endostatina que van más allá de sus efectos antitumorales como agente angiogénico.

Autor: RIAÑO IGLESIAS JORGE.
Año: 2003.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS AMBIENTALES.

Resumen: La mayor parte de los avances en el estudio de la vasculogénesis y la angiogénesis se han realizado en especies de mamíferos, dejando un pequeño papel para otras especies de vertebrados. Así, el único modelo de angiogénesis in vitro desarrollado en un teleósteo, la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), ha permitido avanzar en le estudio de la vasculogénesis en vertebrados inferiores. En el presente trabajo se ha ampliado el abanico de herramientas disponibles para el estuido de estos dos importantes procesos, realizando la clonación del principal regulador de la angiogénesis, el factor de crecimiento vasculo-endotelial (VEGF) de trucha arco iris. Asimismo, se ha realizado la clonación parcial de un fragmento del gen VEGFR-2, que codifica para el receptor principal del VEGF, y del factor derivado de plaquetas (PDGF-A). En el caso del VEGF, se han clonado dos formas moleculares, una de 122 aminoácidos y otra de 166 aminoácidos, producidas pro procesamiento alternativo del ARN mensajero. La proteína VEGF122 fue expresada en Escherichia coli y la proteína recombinante purificada a partir de los cuerpos de inclusión producidos. Para estudiar la actividad biológica de la proteína recombinante se realizaron estudios de expresión génica, mediante la técnica de transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), en las líneas celulares angiogénicas TSS y TPS-2 de O.mykiss estimuladas con VEGF122 recombinante. Los genes estudiados incluyeron: interleukina-1B (IL-1B), ciclo-oxigenasa 2(COX2), cadena B del MHC-II (MHC-IIB), y los del propio gen VEGF y de su receptor VEGFR-2. Como controles positivos de la expresión de estos genes en las líneas celulares, estos ensayos se realizaron también en presencia de los agentes estimulantes lipopolisacárido bacteriano (LPS) y el factor de la necrosis tumoral (TNF-a) recombinante de O. mykiss. Estos estudios han permitido concluir que las líneas celulares TSS y TPS-2 presentan poblaciones celulares heterogéneas entre las que destacan las células endoteliales y los monocitos/ macrófagos, además de demostrar que el VEGF122 recombinante obtenido presenta actividad biológica puesto que es capaz de inducir la sobre-expresión de distintos genes relacionados con la angiogénesis en ambas líneas.

Autor: ENGEL LÓPEZ ELISABETH.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El alendronato y el etidronato son dos fármacos de la familia de los difosfonatos, ampliamente utilizados en el tratamiento de enfermedades metabólicas óseas en las que existe un incremento en la reabsorción ósea, como la osteoporosis y la enfermedad de Paget. Aunque su uso está muy extendido, no se conoce exactamente el efecto que tiene este fármaco sobre los osteoblastos (células formadoras de hueso) y la comunicación existente entre estas células y los osteoclastos (células destructoras de hueso). Hemos realizado un estudio in vitro para valorar el efecto de estos dos fármacos en la síntesis de IL-6 e IL-11, dos citocinas producidas por los osteoblastos e implicadas en la reabsorción ósea. La osteoporosis se caracteriza por un aumento en la pérdida de masa ósea debido a un desequilibrio entre la formación de hueso (llevada a cabo por los osteoblastos) y la reabsorción (llevada a cabo por los osteoclastos). Las dos citocinas ejercen su efecto incrementando la actividad de los osteoclastos maduros en la destrucción de hueso. Se realizó la hipótesis de que el efecto inhibidor de los fármacos podía ser debido a la represión de la síntesis de estas dos citocinas por los osteoblastos. Después de testar los dos fármacos durante 24 horas con las células en cultivo y cuantificar la síntesis de IL-6 e IL-11 por enzimoinmunoensayo y la expresión del RNA mensajero de las dos citocinas por Northern Blot, los resultados indicaron que ninguna de las concentraciones testadas de alendronato (10-7 a 10-12 M) ni de etidronato (10-4 a 10-9 M) regulaba la síntesis de las dos citocinas. Parece ser que esta no es la vía a través de la cual actúan los difosfonatos, ya que en ningún caso se observó una disminución de la síntesis de las dos citocinas. Estos resultados nos conducen a pensar que si existe un efecto indirecto de los difosfonatos sobre la reducción de la reabsorción ósea a través de los osteoblastos no sea debida a la inhibición de factores implicados en la reabsorción sino a la estimulación de factores protectores del hueso (como la osteoprotegerina)

Autor: PINA PASCUAL PILAR.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La isquemia miocárdica aparece cuando el aporte de oxígeno al corazón es insuficiente para cubrir sus necesidades metabólicas. La reinstauración del flujo sanguíneo es indispensable para evitar la muerte de las células miocárdicas sometidas a isquemia severa. Sin embargo, aunque la reperfusión se efectué precozmente, en pacientes con síndrome coronario agudo y elevación del segmento ST no evita, generalmente, la muerte de una proporción variable de miocitos isquémicos. Parte de los miocitos que mueren como consecuencia de un episodio de isquemia transitoria lo hacen en el momento de la reperfusión; y su muerte puede ser evitada con intervenciones aplicadas en ese momento. Este fenómeno se conoce como daño letal por reperfusión y los mecanismos responsables del mismo dependen en parte de la corrección rápida de la acidosis intracelular (paradoja del pH). Aunque la hipercontractura constituye un mecanismo fisiopatológico muy importante en la muerte celular por reperfusión, en los últimos años se ha propuesto que pueden existir mecanismos de daño letal por reperfusión independientes de la hipercontractura. Las mitocondrias, en particular mediante el desarrollo de la transición a la permeabilidad, podrían participar activamente en el daño letal inmediato por reperfusión asociado a la normalización de los acidosis intracelular. El presente trabajo se dirigió a estudiar el mecanismo molecular responsable del efecto beneficioso de la glicina, un aminoácido citoprotector, en el daño celular por isquemia/reperfusión, y su posible interacción con la aparición de la transición a la permeabilidad mitocondrial. Se utilizaron cultivos de cardiomiocitos adultos (células HL-1) y mitocondrias aisladas de corazón de rata. Los cultivos de cardiomiocitos HL-1 sometidos a isquemia simulada presentaron durante la reoxigenación una muerte celular aguda independiente de hipercontractura y de tipo necrótico, que se asoció a la normalización del pH. La adición de glicina durante la reoxigenación previno completamente, y de manera dosis-dependiente, la muerte celular por necrosis asociada a la normalización del pH. El efecto protector de la glicina no se relacionó con la modificación del pH o del Na+ intracelulares, con la prevención de la activación de enzimas de degradación ni con la activación de sus receptores de membrana. Sin embargo, la glicina previno el desarrollo de edema mitocondrial aisladas de corazón de rata sometidas a isquemia simulada y posterior reoxigenación, o a un protocolo de sobrecarga de Ca2+ bajo condiciones normóxicas. La eficcia de la glicina para prevenir la transición de la permeabilidad mitocondrial fue similar a la de la CsA, un potente inhibidor de la apertura del PTPm. Mediante técnicas de esepctroscopia de RMN se observó una reducción significativa del contenido intracelular de glicina durante la reoxigenación, fenómeno que se revertía cuando los cardiomiocitos se reoxigenaban en presencia de glicina extracelular. En conjunto, estos resultados demuestran que el efecto protector de la glicina durante la reoxigenación está relacionado con la inhibición de la apertura del PTPm, y que la depleción de la concentración intracelular de glicina que se produce durante la isquemia/reoxigenación aumenta la vulnerabilidad de las células miocárdicas a la muerte celular por necrosis durante los primeros minutos de reoxigenación por mecanismos independientes de la hipercontractura. Los resultados obtenidos sugieren la participación de la transición de la permeabilidad mitocondrial en este tipo de muerte celular y describen por primera vez el efecto inhibitorio de la glicina sobre el poro de transición de permeabilidad mitocondrial.

Autor: AGUDO DE BLAS PALOMA .
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: Las estatinas, reducen los lípidos plasmáticos, pero además, parecen poseer otros efectos que inciden sobre la patogenia del proceso aterosclerótico. HIPÓTESIS. Las estatinas deben tener efectos significativos sobre el comportamiento de las células que participan en el desarrollo de la placa de ateroma. Dichos efectos pueden diferir en cada tipo celular y para cada estatina. OBJETIVOS 1,- Conocer los efectos que diferentes estatinas tienen "in vitro", sobre el comportamiento celular (Adherencia, movilidad, proliferación e inducción de apoptosis). 2,- Conocer si tales efectos son células-dependientes o estatina-dependiente. MATERIAL Y MÉTODOS Células humanas: fibroblastos, musculares lisas de aorta, monocitos y células de endotelio vascular. Estatinas: atorvastatina (ATV), cerivastatina (CRV), lovastatina (LV), pravastatina (PRV), y simvastatina (SV). Técnicas: Cultivo de tejidos, para estudiar (Adherencia, movilidad, cinética de crecimiento e inducción de apoptosis). TUNEL, fluorescencia con naranja a acridina/bromuro de eetidio y DAPI oara estudiar apoptosis. Faloidina- fluorescencia e inmunofluorescencia para el estudio de la actina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La Dl50 fue diferente para cada célula y cada estatina. La menor, para todas las células, fue para la CRV (96 ng/ml) y la mayor para la PRV en monocitos (98.000 ng/ml). Todas inhibieron la proliferación e indujeron apoptosis en todas las células. Las células más sensibles fueron las endoteliales y las menos los monocitos y fibroblastos. La reducción de la movilidad fue significativa (p

Autor: CARRACEDO DEL RÍO BEGOÑA.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.

Resumen: En peces, no hay prácticamente modelos de cultivo de células endoteliales y aunque se ha descrito su aislamiento y cultivo a muy corto plazo en algunas especies, sólo se ha descrito angiogénesis espontánea in vitro en peces, en cultivos a largo plazo de pronefros de O.mykiss y usando la línea de estroma TPS, derivada de un subcultivo de pronefros de esta especie. El objetivo de esta tesis es el desarrollo de modelos experimentales, con el fin de tratar de obtener líneas celulares angiogénicas y perfeccionar las condiciones de cultivo para obtener angiogénesis espontánea in vitro de una forma más controlada en O. Mykiss. Hemos obtenido dos nuevas líneas celulares de trucha arco iris; una del estroma del pronefros que denominamos TPS-2 y otra del estroma de bazo denominada TSS. Ambas carecen de actividad hematopoyética per se, pero la línea TPS-2 es capaz de favorecer la hematopoyesis cuando se cocultiva con suspensiones alogénicas de pronefros. La línea TPS-2 está formada principalmente por células epitelioides y un menor número de células fibroblásticas y gigantes, lo que la distingue de la línea TSS, en la que predominan las células fibroblásticas sobre los otros tipos. Por sus características, esta línea contiene diversas poblaciones del estroma hematopoyético del pronfefros, con predominancia de las células endoteliales. La línea TSS está formada por al menos dos tipos celulares entre las que predominan las células epitelioides, es débilmente adherente al plástico, aunque las células se adhieren fuertemente entre ellas, crece de forma distintiva, formando grupos celulares y trabéculas, y presenta el fenómeno de inhibición por contacto. Por estas características, junto con su alta capacidad endocítica y marcaje positivo para la lectina UEAI, se asemeja a líneas de células endoteliales, especialmente del tipo de las células sinusoidales. Hemos demostrado que la técnica de cultivo a corto plazo en Matrigel, desarrollada para inducir anigoénesis in vitro con células o líneas celulares endoteliales de mamíferos, puede aplicarse en estas dos nuevas líneas celulares de trucha arco iris como un sistema estandarizado para llevar a cabo ensayos angiogénicos.

Autor: MURILLO CARRETERO M. ISABEL.
Año: 2002.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Resumen: El óxido nítrico (NO) es un mensajero intercelular con múltiples funciones en el sistema nervioso. Entre ellas, se ha descrito que el No es antiproliferativo en diversos tipos celulares. En el cerebro adulto de mamíferos existe formación de nuevas neuronas a paritr de neuroblastos, que se encuentran principalmente en 2 zonas, hipocampo y zona subventricular (SVZ). No se conocen los mecanismos que regulan la neurogénesis del cerebro adulto, pero se sabe que, en la SVZ, los neuroblastos aumentan su proliferación en respuesta al factor de crecimiento epidémico (EGF). Resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio mostraban que, en fibroblastos de ratón EGFR-T17 que sobreexprean en su membrana el receptor de EGF (EGFR) humano, el NO era capaz de inhibir este receptor por un mecanismo independiente de cGMP. Por tanto, hemos establecido la hipótesis de que en los neuroblastos de la SVZ, el NO actúa como regulador negativo de la proliferación a través de su interacción con el EGFR. Para demostrarlo, hemos empleado la línea celular de neuroblastoma humano NB69 como modelo experimental. Las células NB69, al igual que los neuroblastos de la SVZ, expresan beta-III-tubulina y otras proteínas marcadoras de neuronas, y poseen en su membrana el EGFR. En presencia de EGF, las células NB69 aumentaron su proliferación un 200% aproximadamente con respecto a células control, cultivadas en ausencia de factores de crecimiento; el mayor índice de mitosis se obtuvo con un medio de cultivo suplementado con suero al 15%. Los donantes de NO SNAP, DEA-NO y DETA-NO inhibieron la proliferación de las células NB69 de forma dependiente de la concentración utilizada, y por mecanismos independientes de cGMP. No obstante, las células cultivadas en presencia de EGF eran más sensibles al efecto citostático del NO que aquellas cultivadas con suero o sin factores de crecimiento. Al analizar, mediante Western blotting, el grado de activación del EGFR en ausencia y presencia de donantes de NO, observamos que los donantes inhibían la autofosforilación y activación del receptor de forma dependiente de la concentración utilizada y el tiempo de preincubación con el donante. Esta inhibición revertía de forma espontánea después de varias horas. A continuación, determinamos que el NO inhibía de forma directa al EGFR mediante una reacción de S-nitrosilación de cisteínas en la proteína del receptor. Las células NB69 expresaban óxido nítrico sintasa (NOS), pero solamente cuando habían sido cultivadas en presencia de suero; al inhibir la actividad NOS en estas condiciones de cultivo, había un incremento pequeño pero significativo de la división celular, indicando que el NO producido de forma endógena tenía una función reguladora de la proliferación en las células NB69. Para investigar si el mecanismo de acción del NO en las células NB69 operaba también in vivo en la SVZ, aislamos precursores neuronales de esta área y estudiamos el grado de activación del EGFR en ausencia y presencia de donantes de NO. Observamos que el NO inhibía la autofosforilación y activación del receptor, indicando que el mecanismo de acción del NO descrito para las células NB69 podría operar también in vivo, regulando la neurogénesis en la SVZ.

Autor: PATA IGLESIAS CARMEN.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El estroma humano procedente de poblaciones celulares de médulas óseas (MO) de donantes sanos, es el sustrato utilizado habitualmente como microambiente estándar para estudiar "in vitro" la funcionalidad de los progenitores hematopoyéticos humanos. Una alternativa a la utilización de MO normales es la utilización de líneas celulares de estroma que sean capaces de soportar la hematopoyesis humana. En el presente trabajo intentamos comprobar si el estroma murino FMBD-1 tiene la misma capacidad del estroma normal humano para sustentar la hematopoyesis humana tanto normal como patológica. Se realizaron CLP en dos etapas y en paralelo estableciendo la capa de estroma con células de MO de donantes sanos y con la línea murina FMBD-1. Se realizaron segundos inóculos con: 55 productos de aféresis, 17 MO normales, 39 MO de pacientes con SMD y 12 MO de pacientes con LMC Ph(+) en el momento del diagnóstico. Los cultivo se valoraron por la producción de progenitores granulomonocíticos (CFU-GM) y células mononucleadas (CMN) al sobrenadante. El ánalisis de los CLP realizados mostró que la cantidad total y semanal de CMN y CFU-GM fue significativamente superior en los cultivos establecidos sobre estroma normal humano. Los progenitores inmaduros estudiados mediante CLP sobre estroma FBMD-1 se correlacionaron significativamente con los progenitores analizados mediante otras metodologías; ensayos Delta (r=0,976; p= 0,001) y células CD34+ analizadas por citometría de flujo (r=0,690; p=0,010). No encotramos correlación entre los resultados obtenidos cuando se utiliza humano. En los pacientes con LMC, las células Ph(+), analizadas por FISH, disminuyeron progresivamente tras el CLP con un comportamiento similar con ambas capas. En conclusión, el estroma humano promueve de forma más eficaz la proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas. Sin embargo, el estroma FBMD-1 parece ser más útil para estandarizar la metodología de los CLP al introducir menor variabilidad en los resultados.

Autor: YUSTA BOYO M. JOSÉ.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Durante los primeros estudios del desarrollo embrionario, una proporción variable de células neuroepiteliales tienen la capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciarse a neuronas, astrocitos y oligodendrócitos, indicando que son células madre neurales. En el presente trabajo hemos aislado, y caracterizado células madres locales, en el bulbo olfativo de ratones embrionarios (E12,5 -E14,5). El 99,2% de estas células expresaron la proteína nestina y proliferaron extensivamente en cultivo durante al menos 5,5 meses. Mediante la técnica del análisis clonal demostramos la capacidad de una única célula de originar neuronas (TuJ1 positivas), astrocitos (GFAP) positivos y oligodendrocitos (O4 positivos), indicando que son multipotentes. Al menos el 90% de las células proliferativas expresaron IGF-I, (pro)insulina y sus receptores; estos factores de crecimiento colaboraron con el EGF y el FGF-2 esimulando proliferación de las células madre neurales. Sin embargo, las células procedentes de ratones Igf-I-/- proliferación de forma similar que las de ratones Igf-I+/+. En condiciones de diferenciación, las células madre de bulbo olfativo originaron mayoritariamente neuronas (52%), seguido de astrocitos (26%) y oligodendrocitos (4%). La diferenciación y supervivencia de estas células fue dependiente de IGF-I exógeno. Además, los porcentajes de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos fueron menores en los cultivos de células madre de ratones Igf-I-/- comparados con los procedentes de ratones Igf+/+. Por otro lado, la ausencia de IGF-I endógeno originó una alteración en el número y disposición de neuronas mitrales en su capa correspondiente. Con el fin de estudiar la posible inducción de la expresión de Tbr-1, factor de transcripción expresado por las neuronas mitrales, por el IGF-I utilizando la técnica de RT-PCR en células en cultivo. Tras la retirada de los mitógenos, las células madre de bulbo olfativo expresaron Tbr-1, después de 10 horas en cultivo, las células tratadas con IGF-I presentaron una tendencia al aumento en la expresión de Tbr-1 comparado con los tratamientos control. En los cultivos de células procedentes de ratones Igf-I-/- e Igf+/+ no observamos diferencias en la expresión de Tbr-1. Sin embargo, mediante hibridación in situ, observamos una alteración en el número y distrubición de células que expresan Tbr-1 en la capa mitral y la plexiforme externa de ratones carentes de IGF-I. Para estudiar los mecanismos de acción del IGF-I utilizamos la técnica de infección mediante construcciones retrovirales. Un 94% de las células madre de bulbo olfativo fueron infectadas con una construcción retroviral que contenia la GFP, estas células fueron altamente proliferativas y mantuvieron la capacidad de diferenciarse a neuronas y glía. La sobreexpresión de PTEN no originó grandes cambios en la proliferación de células madre de bulbo olfativo, aunque disminuyó el número de neuronas. Finalmente, las células madre de bulbo olfativo tienen la capacidad de sobrevivir y diferenciarse después de ser transplantadas en el cerebro in vivo, pero no generaron tejido hematopoyético.

Autor: PASTOR CARRILLO NURIA M..
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR.

Resumen: En los últimos veinte años se ha propuesto la posibilidad de que las topoisomerasas de ADN estuviesen implicadas en la reparación del daño causado en el ADN por radiación inizante. La presente Tesis nos muestra la existencia de una modulación de la actividad Topo I y II como consecuencia del daño en el ADN producido por rayos X. Las variaciones de las actividades Topoisomerasas no se corresponden con variaciones de la cantidad de la enzima, sino que se debe a modificaciones postraduccionales y a una focalización de la enzima presente. Nuestros resultados muestran que la bisdioxopiperaxina ICRF-193 no es un inhibidor catalítico limpio de la Topo II como se describió en un principio, sino que es capaz de provocar daño en el ADN, muerte celular y endorreduplicación cromosómica. Por otro lado, el Bufalin aún no siendo un inhibidor catalítico como tal, provoca la inhibición de la enzima sin inducir daño en el ADN. Nuestros resultados muestran que la presencia del inhibidor bufalin interfiere en la reparación del daño en el ADN provocado por rayos X. Su inhibición prolonga el tiempo necesario para reparar dicho daño. De todo ello se deduce que las Topoisomerasas, o al menos la Topo II, parecen jugar sin lugar a dudas un papel, ya sea directo o indirecto, en los procesos celulares de reparación el daño en el ADN provocado por radicación ionizante.

Autor: ARANDA CALLEJA M. VICTORIA.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El intercambiador de aniones 2 humano expresa tres isoformas diferentes, una de ellas expresada ubicuamente y dos transcritas alternativamente en hígado y riñón, que difieren asimismo en sus extremos amino-terminales. En este trabajo se propuso determinar la actividad intercambiadora y la localización de estas isoformas en hepatocitos donde previamente se había propuesto que el intercambiador de aniones 2 participaba en la secreción biliar de bicarbonato en el polo apical de estas células polarizadas, en contraste con su papel homeostático en la membrana bsaolateral de otros tipos celulares. Para estudiar las características de cada isoforma de AE2 por separado, se diseñaron y contruyeron vectores de expresión para cada isoforma fusionada en su extremo carboxi-terminal a la proteína verde fluorescente GFP. También se puso a punto un modelo de transfección y repolarización de hepatocitos primarios de rata, en el cual se determinó que las tres isoformas recombinantes expresadas por los vectores construidos se localizaban en el polo apical mediante un mecanismos parcialmente dependiente de microtúbulos, en constraste con la localización observada en una línea celular polarizada derivada de riñón, las células MDCK. El mecanismo de direccionamiento a la membrana canalicular se estudió por transducción de hígado intacto usando inyección hidrodinámica de los plámidos de expresión de las isoformas de AE2, y resultó ser un proceso indirecto con un paso intermedio de inesrción en la membrana basolateral. Estos resultados indican que las tres isoformas de AE2 comparten su localización en membrana en las células polarizadas donde se expresan, y que ésta localización es específica de tipo celular, de forma que en hepatocitos las tres isoformas se dirigen al polo apical donde podrían participar en la secreción biliar de bicarbonato. Asimismo, en este trabajo se realizó un estudio comparativo preliminar sobre la actividad de cada isoforma de AE2 por separado, por transfección estable con los vectores de expresión de AE2 en células HEK293. Estas células carecen de actividad intercambiadora cloro/bicarbonato endógena, por lo que la medida de la actividad desplegada por las líneas celulares creadas que expresan constitutivamente cada isoforma de AE2 se utilizó para evaluar el intercambio llevado a cabo por cada isoforma. Los resultados indican que en este modelo la actividad de las isoformas AE2a y AE2b1, es significativamente mayor en condiciones basales que la de las isoforma AE2b2, mientras que en condiciones de estimulación con AMPc, un agonista de la secreción biliar de bicarbonato, las isoformas alternativas no modifican significativamente su actividad, en contraste con AE2a, la isoforma principal, que aumenta su actividad en un 53,1%.

Autor: LATASA SADA M. UJUE.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: La S-adenosilmetionina (AdoMet) es el principal donante de grupos metilo en el metabolismo celular, participa en la síntesis de poliaminas y es precursor del glutation en el hígado. La síntesis de AdoMet, a partir de la metionina y el ATP, está catalizada por la enzima metionina adenosiltransferasa (MAT). En mamíferos hay dos genes que codifican para la enzima MAT:MAT1A, que se expresa principalmente en el hígado adulto, y MAT2A, expresado en todas las células del organismo, así como en el hígado fetal, y que reemplaza al gen MAT1A en la transformación neoplásica del hígado. Las propiedades cinéticas y reguladoras de los productos de ambos genes determinan el contenido celular de AdoMet, siendo éste mayor cuando el gen expresado es MAT1A. La síntesis de AdoMet está alterada en el hígado cirrótico humano, así como en diferentes modelos experimentales de daño hepático. La administración de AdoMet a pacientes cirróticos y a roedores en modelos de daño hepático y de carcinogénesis química, mejora el curso de la enfermedad o previene el desarrollo de tumores, aunque los mecanismos moleculares de estos efectos no son del todo conocidos. Esta tesis evalúa la implicación de mecanismos epigenéticos (metilación del DNA y acetilación de histonas) en el control de la expresión específica de tejido de los geneds MAT1A y MAT2A, así como la expresión de éste último en los hepatocitos en proliferación. Por otra parte se describe cómo la AdoMet puede regular procesos esenciales en la biología del hepatocito, como son la expresión génica, la diferenciación y la proliferación celular.

Autor: GONZÁLEZ MARTÍNEZ M. TERESA.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTADE DE MEDICINA.

Resumen: La mayoría de los tumores humanos Tb-/- expresan p16+/+; a pesar de ello, las células no detienen el ciclo sino que proliferan, a diferencia de lo que ocurre en células Rb+/+. En esta tesis se utiliza un modelo de células de ratón carentes del gen Rb en las que se sobreexpresa p16Ink4a, utilizando el método de infección retroviral. Se analiza el mecanismo de acción de ese inhibidor y se verifica que actúa de forma semejante a como lo hace en células Rb+/+ en dos aspectos: A,- Se une e inactiva complejos ciclina D/cdk4. B,- Redistribuye p27Kip1 hacia complejos ciclina E/cdk2 disminuyendo la actividad del mismo. Además, frente a lo que hasta ahora se había establecido para células Rb-/- el ciclo celular de este modelo se ve afectado por la sobreexpresión de p16Ink4a, mostrando una fase G1 prolongada cuando las células entran en el ciclo desde G0. Respecto a los cambios moleculares observados se encuentra que: A,- Hay una regulación negativa del gen y la proteína de ciclina A durante la transición G1/S en células que provienen de fase G0. B,- Falta una forma de fosforilación de la proteína p130. C,- Se regulan positivamente los niveles proteicos de p27Kip1 en células en G0. Los niveles finales de este último inhibidor, p27kip1, son resultados de una menor transcripción y una mayor traducción del mismo, mediada esta última a través de la región 3'UTR de su ARNm. Se demuestra que los efectos sobre el ciclo y sobre ciclina A son dependientes de los mayores niveles de p27Kip1 durante G0.

Autor: JAIME JOVANI M. ISABEL.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En los organismos pluricelulares, la progresión por el ciclo celular esta regulada por la actividad de una familia de serina-treonina quinasas, las quinasas dependientes de ciclina o CDKs. Para ser activas, las CDKs deben asociarse a ciclinas. En cada etapa del ciclo celular se activa un complejo ciclina-CDK especifico. Además de la union a ciclina, la actividad de las CDKs tambien esta regulada mediante reacciones de fosforilacion/defosforilacion, en las que juega un papel muy importante CDC25A. Esta fosfatasa defosforila CDK2 en complejo con ciclina E y A. Otro punto importante de regulación de los complejos ciclina-CDK es la unión de proteinas inhibidoras. Existen dos familias de inhibidores de CDKs: familia ink4 y familia Cip/kip. La proteina p21 pertenece a esta última. Descrita inicialmente como inhibidor de CDKs, posteriormente se ha visto que inhibe la actividad de los complejos ciclina E/A-CDK2 pero activa los complejos ciclina D-CDK4/6. La regeneración hepática inducida por hepatectomia parcial constituye un buen modelo de estudio del ciclo celular. El hígado de un animal adulto consta principalmente de hepatocitos, celulas que no se dividen. Tras una hepatectomia parcial, lo que supone la extraccion del 70% de masa hepatica, las celulas restantes se activa a proliferar, entran en el ciclo celular. Los objetivos de esta tesis han sido los siguientes: 1.Determinación del papel de p21 y p27 en la actividad de los complejos CDK2 in vivo durante la regeneración hepatica en la rata. 2.Análisis de la asociación de p21 y p27 a los complejos CDK2 durante la regenacion hepatica en la rata. 3.Regulacion de la actividad CDK2 in vivo en la regeneración hepática de ratones knockout de p21.

Autor: PAULES BLAZQUEZ ANA BELEN.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UB).

Autor: GUERRERO LOPEZ ROSA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: La respuesta celular a la vitamina D3 depende de los niveles circulantes de este metabolito y de la concentración de su receptor, ya que cualquier alteración en los niveles de estos receptores modificaría la sensibilidad de las células para responder a la hormona, alterando finalmente la expresión de todos los genes controlados por la misma. En el hueso y a través de sus receptores situados en los osteoblastos, esta hormona regula la actividad osteoblastica y osteoclastica. Resulta de gran interés estudiar la regulación de los niveles de VDR en los osteoblastos, no sólo por us propia hormona, sino tambien por otros compuestos que se sabe que regulan de modo heterólogo, como son los glucocorticoides, y que estan directamente implicados en el desarrollo de diversas patologias oseas como la osteoporosis secundaria. En esta tesis hemos tratado de profundizar sobre aspectos no conocidos en su totalidad de la regulación del receptor de la vitamina D3. Por otra parte, se ha estudiado la regulación heteróloga del receptor producida por dos glucorticoides: uno natural, la hidrocortisona o cortisol y uno sintético, el deflazacort, cuyas modificaciones estructurales le han hecho mas soluble y con menores efectos secundarios sobre el metabolismo óseo. Es de gran interés conocer no coló como estos glucocorticoides afectan los niveles de los receptores de la vitamina D3 sino tambien si el deflazacort produce un efecto diferente que la hidrocortisona sobre estos receptores, pudiendo asi aportar mas luz sobre los mecanismos implicados que hacen al deflazacort un glucocorticoide menos perjudicial que la hidrocortisona sobre el metabolismo óseo.

Autor: SAN ANTONIO FELIPE BELÉN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Se ha caracterizado el papel de la PKC como factor de supervivencia de linfocitos T. Esta quinasa es capaz de generar señales que protegen de muerte celular mediada por TNF-alfa pero no por Fas. Esta función anti-apoptótica de PKC parece estar mediada por su capacidad de activar NF-kB. La transcripción del gen de IL-2, un factor clave en la activación del linfocito T, esta regulada negativamente por PKC. Este efecto aparece asociado a una inhibición de la función transcripcional del factor AP1. Por el contrario, PKC, potencia la actividad de otros factores clave en el control de la producción de IL-2, como NFAT y NF-kB. Se han caracterizado algunos de los mecanismos moleculares implicados en la activación de NFAT y NF-kB por PKC. Así, PKC incrementa la capacidad transcripcional intrínseca de c-Rel y NFAT1 y coopera con señales de activación T. Produciendo una activación máxima de ambos factores. La proteína MAPKKK Cot/TPl-2 incrementa la capacidad transactivadora de NFAT1 y c-Rel, cooperando en su acción por PKC. La presencia de una forma dominante negativa de PKC inhibe la activación mediada por Cot/Tpl-2, indicando que PKC es un efector de Cot en este sistema. Estas dos proteínas parecen formar parte de una nueva ruta de transducción de señales, dos de cuyas dianas serían los dominios de transactivación de NFAT1 y c-Rel. La regulación de la función transcripcional de NFAT1 por PKC implica una interacción directa entre ambas proteínas y la fosforilación de NFAT1 en su región amino terminal, donde se localiza el dominio de transactivación acídico, por PKC Cot/Tpl-2 potencia la actividad quinasa de PKC sobre NFAT1. La inducción transcripcional de C-Rel se produce por un mecanismo indirecto.

Autor: LOPEZ ARNALDOS TOMAS.
Año: 1999.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En esta tesis se han establecido cultivos celulares a partir de frutos inmaduros de fresa caracterizando su crecimiento apareciendo modificaciones en la pigmentación y textura de los callos. Los cultivos celulares presentaron una aculumación de compuestos fenólicos máxima durante las primeras etapas de la fase de crecimiento exponencial, se han identificado (+)-Catequina y 1-O-cumaroil-B- D-glucosa. Se determinaron los niveles de ácido ferúlico soluble, con un máximo contenido que coincide temporalmente con los máximos niveles del 1-O-feruloil-B-D-glucosa y de la actividad B-glucosidasa. La B-glucosidasa de callo de fresa fue capaz de hidrolizar in vitro al éster con la consiguiente formación de ácido ferúlico libre. Al final de la fase de senescencia se produce una disminución del contenido de ácido ferúlico libre, coindicente con un aumento de la concentración de ácido ferúlico ligado a la pared celular. Se ha puesto a punto un método de medida de la activiad B-glucosidasa basado en el método clásico de hidrólisis del P-nitrofenil-B-D-glucósido empleando A-ciclodextrina. La actividad B-glucosidasa en las primeras fases del crecimiento del callo se debe a la presencia de un grupo de isoenzimas básicas, mientras que en las fases postexoponencial y de senescencia es debida a isoenzimas de carácter ácido. La actividad polifenoloxidasa presentó niveles máximos al final de la fase de crecimiento exponencial y coincidente con la disminución de los niveles de (+)- catequina soluble. Esta actividad enzimática se debe a la expresión de isoenzimas con punto isoeléctrico en torno a 7. El pardeamiento generalizado del callo senescente puede deberse a productos de oxidación enzimática de la (+)- catequina. La actividad peroxidasa alcanzó un máximo en la fase exponencial de crecimiento. La actividad peroxidasa específica frente al ácido ferúlico presentó un máximo en la fase de senescencia. En la fase de senescencia se produce una reducción en el número de isoenzimas, expresándose únicamente las de mayor punto isoeléctrico y un grupo de isoenzimas de carácter ácido. Las isoenzimas básicas y ácidas han sido purificadas mediante técnicas cromatográficas. La actividad peroxidasa básica se debe principalmente a una isoenzima de punto isoeléctrico 9.2 y peso molecular de 32.7 KDA y la ácida, a la presencia mayoritaria de dos isoenzimas con puntos isoeléctricos alrededor de 4.5 y pesos moleculares de 36,5 y 34,5 KDA. La actividad peroxidasa básica mostró una gran labilidad. La adición de seroalbúmina bovina, ion CA2+ y hematina mantuvo la actividad enzimática durante dilatados periodos de tiempo. El cálculo de las constantes de velocidad con ácido ferúlico como sustrato reveló que las isoenzimas de carácter ácido utilizan más eficazmente a este sustrato que las de carácter básico. Puede concluirse que son las isoenzimas ácidas las principales responsables de los procesos de endurecimiento de la pared celular catalizando la formación de puentes diferuloilo entre distintas cadenas de polisacáridos estructurales.