GENETICA HUMANA, 5

Autor: MONCALIANMONTES GABRIEL.
Año: 1999.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DPTO. BIOLOGIA MOLECULAR U DE CANTABRIA.

Resumen: El relaxosoma es el complejo nucleoproteíco necesario para un efectivo procesamiento del DNA en la conjugaciónbacteriana, presentándose en esta memoria de Tesis doctoral un estudio de los componentes del relaxosoma del plásmido R388, de la proteína acopladora TrwB y de la interacción entre ambos. En primer lugar se estudiaron las proteínas componentes del relaxosoma de R388 comenzando por la proteína accesoria TrwA. A partir de la construcción de un plásmido sobreproductor de TrwA se purificó para su estudio bioquímico, comprbándose su unió a dos sitios (sbaA y sbaB) en el oriT de R388 que activa la actividad de corte de RrwC y reprime la transcripción del operón trwABC. Un posterior análisis por medio de mutantes sirvió para la determianción de los aminoácidos de TrwA implicados en el reconocimiento de secuencias específicas en el orT. A continuación y para determinar cual era el sitio de uniónde TrwC al oriT se realizaron ensayos de footprinting de DNA con DMS y, por medio del tratamiento conpermanganato, se estudió la modificaicón sufrida por el DNA al unirse TrwC. Estos estudios de footprinting se realizaron también en presencia de otras proteínas como TrwA o IHF tanto en vitro como in vivo. Además, a pesar de nohaberse observado ningún efecto in vivo de IHF sobre la conjugación de R388, se comprobó que IHF se unían al oriT de R388, como sugería la presencia de una secuencia consenso para dicha unión. Además, se estudiaron las posibles implicaciones de esa unión. Por otro lado, la obtención por nuestro grupo de una proteína con la parte soluble de TrwB (TrwBAN70) facilitaba en gran medida su purificación y estudio. Partiendo de esta proteína y de la porteína mutante TrwB(K136T)AN70 se estudió la unión a ATP y su hidrólisis, la unión a DNA y la unión a otras proteínas. Estos datos nos dieron una idea de cómo es la interacción de TrwB con el relaxosoma. Además la proteína TrwBAN70 se cristalizó y se resolvió su estructura tridimensional.

Autor: GUILLEN DOMINGUEZ M. LUISA.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La cistinuria es un error congenito del metabolismo que se caracteriza por una hiperexcreción urinaria de cistina, lisina, arginina y ornitina debido a una alteración de un transportador de aminoácidos con el túbulo renal. Las manifestaciones clinicas de la enfermedad son debidas a la baja solubilidad de la cistina e incluyen infecciones urinarias recurrentes, cólicos e incluso pérdida de la función renal. En nuestra área geográfica, la Comunidad Valenciana, se ha estimado una incidencia alta de esta patología; 1 de cada 1887 recién nacidos muestra hiperexcreción urinaria de cistina. Ante la amplia disparidad de fonotipos observados en los pacientes cistinúricos, la nefrolitiasis de cistina se presenta como un problema de Salud Pública de dificil tratamiento y prevención. En esta Tesis se aborda el estudio de la cistinuria en la Comunidad Valenciana desde el punto de vista de la Epidemiología Genética y Molecular, analizado los factores de riesgo genéticos y ambientales, y su interacción en la etiología, distribución y tratamiento de la enfermedad. A partir de sujetos diagnosticados de cistinuria se contactó con el resto de miembros del árbo genealogico. A cada individuo se le realizó un análisis microscópico y bioquimico de la orina y un analisis de las diversas variantes del gen SLC3 A1, que habia sido asociado a cistinuria. Además, a través de un cuestionario se obtuvieron datos sobre variables estructurales, ambientales, sociodemográficas y antecedentes clinicos personales y familiares. El analisis estadistico , se realizó mediante pruebas paramétricas y no paramétricas, regresión logística,regresión lineal simple y multiple, y analisis factorial de componentes principales. La muestra estudiada incluia 45 pacientes cistinúricos, 42 familiares pertenecientes a 19 familias no emparentadas entre si, y 81 controles aparcados por sexo y edad. Primeramente se establecieron los valores de referencia para la excreción urinaria de aminoácidos en nuestra población, a continuación se puso a punto y se evaluó un método cromatográfico que permitiese cuantificar estos aminoacidos en orina y clasificr a los individuos cistinuricos. Los individuos clasificados como homocigotos mostraron un mayor riesgo de presentar las manifestaciones clinicas de la enfermedad que los heterocigotos tipo I y tipo no I. El estudio de mutaciones y polimorfismos en el gen SLC3A1 mostró una baja prevalencia, en nuestra área geográfica, de las mutaciones descritas en otras poblaciones. Se detectaron nuevas variantes genéticas asociadas a cistinuria. En cuanto al estudio de las diferentes variables ambientales recogidas, se valoró especialmente el tratamiento farmacológico recibido por los pacientes cistinúricos y la dieta del grupo de cistinúricos y familias. Posteriormente se realizó un analisis de asociación entre las variables genéticas y ambientales y las manifestaciones fenotípicas de la enfermedad, revelando la existencia de diferentes asociaciones. Por último se realizó un análisis de regresión linel múltiple con y sin terminos de interación para estimar los niveles de excreción urinaria de cistina en pacientes cistinúricos.

Autor: CASAÑA GARGALLO PILAR.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MATEMATICAS.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS BIOLOGICAS.

Resumen: La enfermedad de von Willebrand(EVW) es el trastorno hereditario de la coagulación más comun en el hombre, debido a deficiencias cuantitativas y/o cualitativas de una glicoproteína multimérica, el factor von Willebrand(FVW). Teniendo en cuenta los procedentes existentes, se asumió como hipótesis de trabajo que los estudios genéticos podían contribuir a conseguir diagnósticos más certeros, con la consiguiente repercusión en el consejo genético y en el tratamiento. Así pues, se propusieron los siguientes objetivos: confirmar la implicación del gen VWF en pacientes con sospecha clínica de EVW; valorar la aplicación de estos estudios en el diagnóstico de portadores; y contribuir al conocimiento de las bases moleculares y de los mecanismos etiopatogénicos de esta heterogénea enfermedad. Los estudios genéticos han confirmado la implicación del gen en la mayor parte de las familias estudiadas, demostrado por primera vez ligamiento significativo entre el gen VWF y la EVW tipo 1. La detección de 16 mutaciones diferentes, 9 de ellas no descritas previamente junto con los estudios indirectos, han constatado orígenes distintos e independientes de la EVW en la mayoría de los casos; sin embargo, determinados defectos podrían ser muy antiguos y estar dispersos en la población española. La mutación G1629R es candidata a causar EVW tipo 2A, debido a que probablemente confiere al FVW un aumento de susceptibilidad a las proteasas del plasma. Las mutaciones V1314D,R1341W y R1315C,A1437T que dan lugar tanto a ganancia como pérdida de la función de la proteína, reafirman la importancia del dominio A1 en la función fisiológica del FVW. Se ha obtenido ligamiiento del tipo 1 con la mutación T1156M que ejerce un posible efecto dominante negativo. La expresión diferencial de los alelos explicaría parte de la variabilidad fenotípica en una misma familia. No obstante, la simple ausencia de expresión de un alelo no es suficiente para desarrollar la EVW tipo 1 clásica. Otros factores fuera del locus del gen VWF pueden causar o contribuir a la manifestación del tipo 1,corroborándose la posible influencia del grupo sanguíneo ABO, especialmente entre los pacientes con deficientes más leves y/o penetrancia incompleta. El diagnóstico genético directo puede ser una opción para las variantes cualitativas, mientras que en las cuantitativas los estudios indirectos supondrían una alternativa para el diagnóstico de portadores, especialmente en los casos de alta penetrancia.

Autor: DURAN DOMINGUEZ MERCEDES.
Año: 1999.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FCA. MEDICINA, UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO.

Resumen: El sindrome del cromosoma X fragil(SXF) es el más frecuente de los que producen retraso mental familiar. Molecularmente se caracteriza por la expansiónd el triplete (CGG)n localizado en 5' del exón 1 del gen FMR1 descubierto en 1991 en el cromosoma X. Los pacientes con Sindrome X fragil presentan cara alargada, orejas grandes, macroorquidismo y un retraso mental (RM) que va moderado a severo. Es una enfermedad dominante, con penetrancia incompleta y cuya prevalencia es de aproximadamente 1:4000 varones y 1:8000 mujeres. El número de repeticiones CGG es polimórfico en población general y a partir de un cierto rango (46 o más) se vuelve inestable. Existen también unos marcadores polimórficos del tipo microsatélite colindantes al triplete CGG, como el DXS548 y FRAXAC2. Todos estos fragmentos de ADN se pueden estudiar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),de forma que uno de nuestros objetivos en esta Tesis fue el poner a punto una metodología rapida y eficaz para el diagnostico molecular del SXF, de tal forma que nos sirva para:a) descartar el SXF en pacientes con RM no filiado,b)averiguar el genotipo exacto de los individuos afectados, c) estudiar todos los individuos a riesgo de las familias X fragil y encontrar los portadores asintomáticos y d) prevenir el SXF por medio del Consejo Genético y del Diagnóstico Prenatal. Además con las tecnicas de PCR establecidas se ha intentado prevenir la aparicióndel SXF en población sin antecedentes de RM, asi como estudiar el origen de la mutacion en nuestra población. Se han estudiado un total de 438 muestras de individuos de 50 familiares, en las que se transmite el SXF, de las que se han separado 32 varones sin RM, no emparentados, como población control. Además se han estudiado otros 117 varos con RM, no emparentados, como población control. Además se han estudiado otros 117 varones con RM inespecifico y 93 de sus madres. Por ultimo se realizó un "screening" en 256 gestantes normales sin antecedentes de RM. Como conclusión de este trabajo podemos decir que hemos conseguido optimizar tecnicas "screening" y de cuantificación del triplete CGG en un rango inferior a 120 repeticiones, habiéndose introducido un Protocolo completo de trabajo en conjunción con las técnicas de Southern ya existentes, y con el apoyo de los métodos indirectos de los microsatélites. Hemos encontrado además que no es facil prevenir el SXF en población sin antecedentes de RM porque nuestro porcentaje de alelos CGG intermedios(45-55 repeticiones) es superior al descrito por otros autores y porque hemos averiguado que en la población X fragil existe una gran heterogeneidad. Por último, nuestros datos apuntan a que en población vasca autóctona, el SXF parece ser inexistente o cuando menos muy infrecuente.

Autor: ARMENGOL ROSELL GEMMA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Durante muchos años la citogenetica ha sido el unico metodo disponible para analizar los cambios geneticos en los tumores. A pesar de esto, los estudios cariotipicos estan a menudo obstaculados por problemas tecnicos y metodologicos. En el año 1992 se describio una nueva estrategia, que se conoce como hibridación genómica comparada(CGH), y que identifica en un solo experimento aquellas regiones que se hayan amplificado (indicadoras de oncogenes), asi como regiones deleccionadas (indicadoras de genes supresoresde tumores). En esta tesis se han estudiado 37 muestras de tumores de la familia Ewing(ET), ocho xenografts de tumores pancreaticos y siete metastasis de tumores pancreaticas originadas en los ratones. En todas las muestras se ha aplicado la CGH. En los ET se han detectado ganancias recurrentes del brazo largo del cromosoma 1(minima region comun 1q21-q22),y ganancias de los cromosomas 8 y 12, asi como ganancia de 7q y 6p2,1-pter y perdida de 16q. Estas regiones podrían contener genes importantes en el desarrollo y/o progresion de los ET. Mediante Southern blot se ha detectado la amplificacion de dos genes, FLG i SPRR 3, localizados en 1q21. Ademas, mediante un analisis estadistico se ha observado que las ganancias de 6p estaban asociadas a un peor pronostico. Tambien se ha desarrollado una nueva estrategia, la CGH con mezclas de DNAs de diferentes muestras del mismo tipo tumoral. Esta tecnica permite detectar en un unico experimento las alteraciones presentes en la mayoria de las muestras. En el presente estudio se ha demostrado la eficacia de este metodo con numerosas muestras(14-28) de seis tipos tumorales diferentes, que previamente se habian estudiado individualmente. En los tumores pancreaticos se han detectado ganancias en los cromosomas 8(8q24),15(15q25-q26),16,20q y 19q, y perdidas en los cromosomas 18(18q21)6(6q21 y 6q24-qter), 13(13q21) y 10(10q 14-pter), en orden decreciente de frecuencia. Los estudios de perdidas alelicas en 10p14-pter no han permitido una delimitacion mas exacta de la region afectada, ya que todos los casos con perdida por CGH han mostrado perdidas alelicas para todos los loci informativos. Las regiones cromosomicas 8q24 y 15q25-qter se han estudiado con mas detalle por hibridación in situ fluorescente y Southern blot. El estudio de los oncogenes MYC en 8q24 y FES y IGF1R en 15q25-qter ha mostrado, en general, un bajo nivel de amplificación. Podria ser que solo unas pocas copias extra de estos genes fuesen suficientes para tener efectos en la tumorigenesis pancreatica o bien que fuesen otros genes localizados en estas regiones los que realmente estarian amplificados y los que jugarian un papel importante en la carcinogenesis pancreatica. Por otro lado, se ha observado una fuerte relacion clonal entre las metastasis estudiadas y los tumores originarios implantados en los ratones. Todas las metastasis tenian las mismas alteraciones que los implantes y, además, nuevas alteraciones que podrian contener genes relacionados con la progresion metastatica del carcinoma de pancreas. La mayoria de estas alteraciones adicionales ya estaban presentes en los subclones del implante, pero no en proporcion suficiente como para ser detectadas por CGH.

Autor: GUTIERREZ ENRIQUEZ SARA ILIANA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se elaboró una biomonitorización de pacientes tratados con yodo-131 con el objetivo de determinar el potencial riesgo genotóxico de la exposición terapéutica a este radioisótopo. Dicho estudio se llevó a cabo a través de la evaluación, en linfocitos de sangre periférica, de los siguientes marcadores citogéneticos: las binuclueadas con micronucleos(BNMN), los intercambios entre cromátidas hermans (SCE) y las roturas en la molécula del DNA(a través del ensayo del cometa). Para lograr este objetivo se desarrollaron dos tipos de analisis: una longitudinal, donde el grupo expuesto era analizado previamente a tratado con yodo-131 varios años antes del estudio se comparó con un grupo control. De la evaluación de los resultados obtenidos con el biomarcador de BNMB, tanto en los estudios longitudinales como en el transversal, se estableció que la terapia con el 131I inducía daño cromosómico inestable: roturas y pérdidas cromosómicas. Además, en el grupo de pacientes de hipertiroidismo, las BNMN se inducían en función de las distintas actividades de yodo-131 administradas. Asimismo, el daño cromosómico inestable inducido por la radiación ionizante puede ser detectado en los linfocitos de los pacientes expuestos al cabo de un año, y posiblemente, entre 1 y 3 años después de la terapía con el radionúclido. Por otro lado, teniendo en cuenta que un aumento de las alteraciones cromosómicas puede estar relacionado con un aumento del riesgo de sufrir complicaciones de tipo genético a largo plazo, debido a la inducción de BNMN por parte de la terapia con yodo-131. Con relación a los resultados obtenidos mediante el estudio de la frecuencia de SCE, la radiación ionizante de baja LET generada por la emisión del radioisótopo yodo-131, internamente incorporado en los pacientes, no induce aumentos en los niveles de SCE, lo que refuerza el concepto de que la radiación ionizante es un débil inductor de SCE. Por último, los resultados que se obtuvieron con en el estudio del nivel de roturas de la molécula del DNA, indicaron que la radioterapia con yodo-131 no inducía roturas de simple cadena del DNA que se pudieran detectar al cabo de 7 días de la exposición con el ensayo del cometa. La alta variabilidad interindividual que se detectó de la longitud del cometa sugiere, que antes que el ensayo del cometa puede ser aplicado a los estudios de biomonitorización se debe primero caracterizar las condiciones óptimas del ensayo.

Autor: VIDAL TABOADA JOSÉ MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: EDFC.

Resumen: Como parte de un esfuerzo internacional para generar mapas físicos y caracterizar genes del cromosoma 21 humano, el trabajo de la presente tesis doctoral se ha centrado en la caracterización de la región del cromosoma 21 humano entre el marcador CTL5 y el gen SH3BGR, dentro de la región conocida como DCR-2 (Down Syndrome Critical Región-2). Se generado un mapa físico basado en cóntigos de clones cósmidos y de clones PACs cubriendo completamente la región y que ha permitido la obtención de los clones genómicos necesarios para poder secuenciar la región. Se ha generado un mapa de restricción de alta resolución que permite calcular distancias entre los marcadores y los genes presentes en la región. El mapa físico de alta resolución generado tiene un tamaño aproximado de 560 Kb. La obtención de este mapa físico ha permitido generar un mapa de transcripción que ha permitido localizar 5 genes presentes en la región (DSCR2, DSCR7, HMG14, WRB y SH3BGR) así como 34 clones cDNAs que pueden estar fomando parte de nuevos genes localizados dentro de la región. Se han aislado y caracterizado las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de dos nuevos genes en la región (DSCR2 y DSCR7). Se ha caracterizado el patrón de expresión de ambos genes en tejidos adultos y embrionarios humanos, así como la expresión en diferentes líneas celulares humanas. Por último, se ha aislado y caracterizado los genes homólogos en ratón de los genes DSCR2 y SH3BGR y se ha estudiado su patrón de expresión en tejidos adultos y embrionarios de ratón.

Autor: NAVIO MARCO M. TERESA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA UAM.

Resumen: La enfermedad del Paget (EP) es una enfermedad metabólica ósea de etiología poco conocida. Se estima que su prevalencia es del 2-3% de la población su distribución mundial es irregular y presenta focos geográficos en que ésta es elevada. Se ha documentado que el 15 al 40% de los pacientes con EP tienen una historia familiar positiva de enfermedad y los familiares en primer grado de estos pacientes tienen un riesgo siete veces mayor de padecer la enfermedad que los controles. Incluso se ha propuesto que la existencia de un tipo de EP familiar. Aunque se etiología no es bien conocida, esta tendencia a la agregación familiar sugiere la existencia de factores genéticos. Así,la hipótesis más acepta en la actualidad combina la acción de agentes desencadenantes en individuos genéticamente predispuestos. Un estudio genético ha identificado que el gen que condiciona la osteolisis expansiva familiar (OEF), entidad similar a EP, se localiza una región del cromosoma 18 (18q21,1-22) del genoma. En un estudio, realizado en una familia anglosajosa, se ha identificado ligamento genético significativo entre este gen y la EP, lo cual apoya que la OEF sea una variante de esta enfermedad. El propósito principal de este trabajo es investigar la posible existencia de ligamento genético entre la región del cromosoma 18q21,1-q22 y la EP familiar en nuestro medio. Para ello se estudiaron 6 familias con miembros afectos de EP un seguimiento en el Servicio de Reumatología del Hospital Ramón y Cajal. El total de individuos estudiados ha sido de 89, de los cuales 25 estaban afectos de EP. Se hizo cuantificación de fosfatasa alcalina y estudio radiológico de confirmación en los casos. Se aislóADN de ls muestras sanguíneas y se realizó el tipado con microsatélites polimórifcos por amplificación con PCR del ADN genómico. Posteriormente se realizó análisis de ligamiento a dos puntos y multifactorial por el método estadístico lod scroe. Se acepta que no hay ligamiento genético si la suma de lod scores es inferior a -2. Se ha evidenciado que no existe ligamiento genético entre la enfermedad, en las familias estudiadas, a lo largo del intervalo genético propuesto para la OEF. El estudio se ha completado con el estudio de regiones candidatas y un rastreogenético completo de todo el genoma. Como resultado, este trabajo demuestra que el gen de susceptibilidad a la EP propuesto no es el responsable de la enfermedad en familias españolas e indica que existe heterogeneidad genética no alélica lo cual demuestra al existencia de uan segunda localización genética de la enfermedad.

Autor: ZUDAIRE RIPA M. ISABEL.
Año: 1999.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El cancer de mama es la segunda causa de muerte en los paises industrializados tras las enfermedades cardiovasculares. A pesar de los numerosos estudios llevados a cabo en esta neoplasia, es necesario todavia la caracterización de buenos marcadores pronósticos que permitan de forma más precisa la evolución de las pacientes. En este sentido, las tecnicas de citogenética han contribuido enormemente a aumentar el conocimiento de la biologia del tumor. El objetivo de esta tesis ha sido la caracterización de las alteraciones cromosómicas presentes en una serie de 70 carcinomas de mama de tipo ductal invasivo. La asociación entre los marcadores citogenéticos y la supervivencia e incidencia de recidivas de las pacientes, asi como la asociación con determinados factores anatomopatológicos nos permitiría identificar nuevos marcadores con un posible valor pronóstico. La tecnica utilizada para ello ha sido la técnica de Hibridación Genómica Comparada. Fue necesario modificar el protocolo tradicional de esta técnica para obtener resultados satisfactorios en el análisis de tejidos incluidos en parafina. Se obtuvieron resultados satisfactorios en 57 de las 70 muestras seleccionadas (81,4%). Considerando conjuntamente todas las alteraciones descritas en un mismo brazo, las ganancias detectadas con mayor frecuencia afectaron a 8q (63,1%), 17q (45,6%), 1q (38,6%), 20q (26,3%), 11q (21%) y 6q (17,5%) y las perdidas más frecuentes fueron en 16q(21%), de Xp y Xq (19,3%), 13q(17,5%), 11q(15,7%) y 8p (15,7%). En el estudio de supervivencia, las ganancias en 1q y 11q13 se mostraron significativamente asociadas a una mayor incidencia de recidivas de las pacientes. Algunas de las alteraciones citogenéticas descritas se asociaron significativamente con rasgos de buen pronostico; por ejemplo,las perdidas en 16q fueron más frecuentes en tumores sin infiltración ganglionar, positivos para la expresión de receptores de estrógenos y que manifestaban sobreexpresión de Bc1-2. La sobreexpresión y amplificación de ERBB-2 se ha asociado a un peor pronóstico en los pacientes de cancer de mama. Además, ha resultado ser un buen factor predictivo de la respuesta a determinados tratamientos. El análisis conjunto de la sobreexpresión de la proteína, mediante IHQ y la amplificación del gen, mediante FISH, ha permitido caracterizar de forma más precisa la expresión de esta proteina en algunas de las muestras de nuestra serie. Aunque son necesarios estudios en series mayores, los resultados obtenidos en este trabajo confirman la conveniencia de considerar la determinación citogenética de las alteraciones presentes en el tumor como un posible factor pronóstico que colabore en el conocimiento de la evolución clínica del tumor.

Autor: PURROY VAZQUEZ JESUS.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA .

Resumen: LA CISTINURIA ES UNA ENFERMEDAD HEREDITARIA DEBIDA AL TRANSPORTE DEFECTUOSO DE CISTINA Y AMINOACIDOS DIBASICOS EN EL TUBULO RENAL. ES UNA ENFERMEDAD GENETICAMENTE HETEROGENEA EN LA QUE HASTA AHORA SE HAN VISTO IMPLICADOS DOS GENES:SLC3A1 (EN EL TIPOI) Y SLC 7A9 (EN EL TIPO NOI). SLC3A1 ESTA DIVIDIDO EN 10 EXONES A LO LARGO DE 45 KB EN 2P16.3. SE HAN DESCRITO DIVERSOS SITIOS DE UNION A FACTORES DE TRANSCRIPCION PERO NO SE CONOCE EL PAPEL QUE PUEDAN TENER EN LA REGULACION DEL GEN. HEMOS PUESTO A PUNTO UN METODO DE DETECCION DE GRANDES DELECIONES MEDIANTE POR MULTIPLEX CUANTITATIVA, GRACIAS AL CUAL HEMOS DETECTADO UNA DELECION QUE INCLUYE EL EXON 10 Y UNA QUE INCLUYE LOS EXONES 2 AL 10- HEMOS DETECTADO ENTRE UN 71% Y UN 54% DE MUTACIONES EN ALELOS DE TIPO I EN NUESTRA POBLACION. HEMOS CLONADO UNA CONSTRUCCION QUE HA DE SERVIR PARA LA CONSTRUCCION DE UN RATON KNOCK OUT PARA LOS EXONES 2 Y 3 DE SLC3A1, LO QUE DARA LUGAR A UNA PROTEINA TRUNCADA. HEMOS CARACTERIZADO LA PROTEINA asCAT, CODIFICADA POR SLC7A10, Y HEMOS VISTO QUE TRANSPORTA AMINOACIDOS NEUTROS PEQUEÑOS SEGÚN SE HA DESCRITO PARA EL SISTEMA asc.

Autor: PUIG ROSELL PERE.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: En esta tesis se analiza la relación de las mutaciones en el gen K-ras con el cáncer pancreático y colorrectal. Para el análisis se utilizan varias técnicas con diferente sensibilidad. Los resultados de la tesis están estructurados en cuatro bloques. 1,- En el primer bloque se estudia la contribución de las técnicas analíticas moleculares en el diagnóstico de cáncer de páncreas mediante el estudio de material obtenido por punción con aguja fina. Se compara el diagnóstico molecular con el de la citología temprana y se estudia cual se acerca mas al diagnostico final del paciente. 2,- El segundo bloque aborda el estudió mutacional indirecto de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático. Para éste análisis se usa el ADN libre plasmático como fuente de material tumoral. 3,- En el tercer artículo se describe un nuevo método que es espcialmente valioso cuando se aplica a metrial difícil de analizar por las otras técnicas. Se trata de un método en el que se simplifican etapas de manera que el análisis de muestras como las fecales se hace más corto, más fiable,más sensible y con un rendimiento de amplificación claramente superior. 4,- Aquí se aplican los tres métodos de RFLP/PCR al diangóstico de cáncer colorrectal mediante el estudio de material fecal procedente de pacientes sintomáticos. La técnica con mejores resultados es la que se describió en el tercer trabajo de la tesis y se puede utilizar en el diagnóstico molecular de cáncer colorrectal debido a la gran concordancia obtenida entre el material fecal y el tejido tumoral.

Autor: TORRALBA CABEZA MIGUEL ANGEL.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: En este trabajo se presenta el estudio clínico y molecular de la Enfermedad de Gaucher en los pacientes pertenecientes a veinte familias españolas, cuyas muestras fueron remitidas para estudio a la Fundación Española para el Estudio y Terapéutica en la Enfermedad de Gaucher en 1995 y 1996. El estudio llevado a cabo consta de tres partes bien diferenciadas: una primera parte en la que se ha realizado la identificación del 95% de las mutaciones del gen de la betaglucocerebrosidasa (GBA), contribuyendo a su mejor conocimiento con la identificación de dos nuevas mutaciones y el descubrimiento de otras previamente descritas. Una segunda parte, llevada a cabo en el laboratorio de Neurogenética del Dr. Pastores de la Universidad de Nueva York, donde se expresan cada una de las mutaciones anteriormente detectadas y se comparan las actividades residuales obtenidas con el DNA salvaje del GBA. Y una tercera parte en la que se realiza una correlación estadística entre el genotipo encontrado en los pacientes y el fenotipo final expresado. La Introducción ha sido realizada tras una amplia revisión bibliográfica y se exponen los aspectos clínicopatológicos, genéticos y moleculares más relevantes de la Enfermedad de Gaucher. En Material y Métodos se detalla en primer lugar el Material con todos aquellos aparatos, reactivos y productos químicos utilizados. Los Métodos se han expuesto iniciando el fundamento de cada una de las técnicas para luego explicar el procedimiento a seguir para realizarlas. Los Resultados se inician con el estudio detallado de la muestra, posteriormente, la identificación de mutaciones y el análisis de la expresión de cada una de ellas, para finalizar con un estudio estadístico de la correlación genotipo/fenotipo. El trabajo termina con la Discusión y las Conclusiones que de este estudio han derivado.

Autor: FERNANDEZ FERNANDEZ ISABEL.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La caracterización o el tipado de sangre, semen y otros fluidos corporales ha sido utilizada con fines forenses desde hace más de 50 años, pero en la última década, con los avances de la tecnología del ADN, es cuando se hace posible el estudio de la variabilidad humana y por tanto su individualidad biológica. En esta tesis se han estudiado varios polimorfismos mini y microsatélites de ADN para conocer sus frecuencias genéticas en la población vasca y compararlas con otras poblaciones caucasoides y no caucasoides. Además se ha realizado un estudio en manchas de semen y en mezclas: células vaginales, semen para conocer el comportamiento de otros sistemas polimórficos de ADN en casos de agresiones sexuales.

Autor: ORELLANA ALONSO CARMEN .
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Se ha estudiado una serie de tumores infantiles del sistema nervioso de distintos subtipos histológicos (25 PNET, 23 astrocitos, 17 neuroblásticos, 6 ependimarios y 4 tumores de nervio periférico). Se obtuvieron muestras de DNA de tejido tumoral y constitucional (sangre periférica). Se amplificaron los fragmentos de los genes y marcadores polimórficos que interesaba caracterizar mediante PCR. Se resolvieron en geles de poliacrilamida y tinción con nitrato de plata. Los resultados obtenidos apuntan hacia la existencia de un gen supresor de tumores en 17p, implicado principalmente en PNET, con una localización distal al marcador D17S5, probablemente subtelomérica. La presencia de un isocromosoma 17q podría ser un factor de mal pronóstico mientras que la pérdida aislada de 17p podría ser de buen pronóstico. Las alteraciones del cromosoma 1 fueron frecuentes en los tumores neuroblásticos, algunos casos presentaron una pérdida de heterozigosidad en esta región, alteración que se asoció a un mal pronóstico, mientras que otros casos presentaron desequilibrio alélico compatible con la duplicación de este brazo cromosómico. Las mutaciones del gen TP53 son poco frecuentes en estos tumores. Las pocas mutaciones detectadas probablemente sean originadas por mecanismos endógenos de mutación. Se describe la presencia de un punto caliente de deleción entre los codones 235 y 244 de dicho gen.

Autor: ANTA ESCUREDO ALBERTO.
Año: 1998.
Universidad: PAIS VASCO .
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La identificación de un cadáver o unos restos humanos con frecuencia supone una tarea complicada debido a que el elevado deterioro existente dificulta en gran medida el trabajo. Dentro del proceso identificativo, el diagnóstico del sexo supone una información muy valiosa tanto para la práctica forense como para el estudio antropólogico de poblaciones antiguas, cuevas sepulcrales etc. Los dientes, por sus características fisicoquímicas, tienen la propiedad tras la muerte del individuo de mantenerse íntegros durante su exposición a un amplio rango de circunstancias, que normalmente contribuyen a la descomposición y pérdida de los tejidos blandos y esqueléticos. Por todo ello, en este trabajo se pretende establecer un procedimiento de identificación sexual de los individuos basado en el análisis odontométrico y génetico de los dientes. Por medio de los diámetros coronarios mesiodistales y vestíbulolinguales se elaboran unas funciones discriminantes con el objeto de estimar el sexo con una fiabilidad determinada. Del mismo modo, se ha utilizado la pulpa dental con fuente de ADN, el cual permite la búsqueda de secuencias Y-específicas. Con el empleo de ambos métodos, se pretende minimizar las dificultades y acceder así a una serie de situaciones en las que por separado cada una de las técnicas hubiera encontrado serios problemas para mostrarse efectiva en la identificación.

Autor: CARRILLO DELGADO ESMERALDA ESPERANZA.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: El interés de nuestra investigación se ha centrado en la detección en sangre periférica de la enzima tirosinasa mediante la Reacción de la Transcriptasa Inversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa en 58 pacientes diagnosticados con melanoma cutáneo. Para ello hemos utilizado diferentes técnicas: - Selección de los primeros para amplificar la enzima tirosinasa se llevó a cabo mediante el programa OIGO 1000 DNA. - Las muestras procesadas fueron: ganglios linfáticos de pacientes con MC de estadio III, como controles positivos, muestras de sangre sin evidencia de enfermedad, como controles negativos y muestras de sangre de pacientes diagnosticados de melanoma en diferentes estadios. - El procesamiento de extracción de ARN de muestras de sangre, se utilizaron dos procedimientos: el primero basado en la obtención de ARN a partir de monocitos y en el segundo a partir de linfocitos. - Para cuantificar la cantidad de ARN se utilizó un espectrofotómetro de ultravioleta a una densidad óptica entre 260nm y 280nm. El chequeo del ARN se realizó mediante electrofóresis en un mini gel de agarosa al 1%. - La síntesis de ADNc se realizó mediante transcriptasa reversa. - La PCR se realizó con primers para la * * * actina que fue usada como control y primers específico para el gen de la tirosinasa. La visualización se realizó mediante electrofóresis. - Por último realizamos el análisis estadístico mediante el programa informático de epidemiología SPSS (versión 8.0). Los resultados obtenidos han sido los siguientes: - Los primers M1 y M2 correspondientes a los exones 1 y 3 del gen de la tirosinasa son los más específicos para la detección de células de melanoma en sangre periférica con una Tm de 55grados C. - La extracción de ARN a partir de un pellet de linfocitos de muestras de sangre se presenta como el mejor procedimiento para la amplificación mediante PCR del ADNc de la tirosinasa. - La positividad de la prueba de la PCR para la tirosinasa se correlaciona con el estadio clínico de la enfermedad, el grosor del tumor, y el sexo siendo más frecuente en los hombres que en las mujeres. No presentando dependencia con la formaclínico-histológica ni con la localización del tumor. - El análisis mediante PCR de la presencia de la tirosinasa se presenta como un método adecuado para evaluar la evolución de los melanomas. - El interferon alfa-2b es capaz de negativizar la PCR mejorando el pronóstico de la enfermedad.

Autor: CASADEVALL FUSTE CARME.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Autor: MARTINEZ PASARELL OLGA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: El síndrome de Turner (ST). o monosomía del cromosoma X, es la anomalía de los cromosomas sexuales más frecuente en la especie humana, con una incidencia en concepciones clínicamente reconocidas del 1,3%. Debido a la elevada frecuencia de casos de origen paterno (del 70 al 80%), nos propusimos analizar las anomalías numéricas de los cromosomas sexuales en los espermatozoides de padres de pacientes con ST para estudiar la etiología de esta anomalía cromosómica. Con el fin de lograr este objetivo, primero pusimos a punto la técnica de obtención de pronúcleos de espermatozoide humano y su análisis por técnicas de FISH multicolor (artículo 1). Para la obtención de pronúcleos utilizamos una modificación de la técnica de metafases de espermatozoide humano (Martin 1983; Benet y col. 1986), que consiste en cultivar los ovocitos de hámster polipenetrados en medio de cultivo con colcemid. El colcemid inhibe la formación del huso, por lo que los ovocitos se mantienen bloqueados en estadio de metafase II mientras que los espermatozoides progresan hasta el estadio de pronúcleo. Ello hace posible diferenciar, de forma sencilla, el pronúcleo masculino del de hámster, y analizar los anomalías numéricas del espermatozoide en éste estadio por técnicas de FISH. Después de poner a punto la técnica de pronúcleos, quisimos comprobar si existía una selección cromosómica de los espermatozoides según la movilidad y capacidad fecundante (artículo 2), y así elegir la metodología más adecuada para el estudio de los espermatozoides de padres de pacientes con ST. Utilizando FISH multicolor, comparamos las frecuencias de disomía y diploidía de los cromosomas sexuales en pronúcleos, espermatozoides móviles y espermatozoides no seleccionados, sin encontrar diferencias significativas. Estos resultados indican que una selecciónpor movilidad y por capacidad fecundante no implica selección cromosómica, por lo que decidimos realizar el estudio de la aneuploidía de los cromosomas sexuales de padres de pacientes con ST en extensiones de espermatozoides procedentes de todo el eyaculado. La determinación del origen parental de la ST se realizó mediante la amplificación por PCR de 5 marcadores polimórficos del cromosoma X en una serie de 14 pacientes con cariotipo somático 45,X (artículo 3), dos de las cuales eran gemelas monocigotas concordantes para la ST (artículo 4). Al mismo tiempo, amplificando 3 marcadores del cromosoma Y, procedimos a la detección de posibles mosaicos de baja frecuencia para descartar los casos de origen mitótico comprobado. Usando ést metodología detectamos dos pacientes con mosaico (14,3%), y determinamos que, de las 12 pacientes restantes, el 75% presentaban un origen p paterno de la anomalía. Después de seleccionar los casos de origen paterno, procedimos al estudio de las anomalías numéricas de los cromosomas sexuales en los espermatozoides de cuatro padres de ST y ocho individuos control por FISH multicolor (artículos 4 y 5). Se observó un incremento significativo en las frecuencias de disomía XY de los de los cuatro padres de ST con respecto a los donantes control (0,20-0,22% vs. 0,11%; p

Autor: RENEDO GANCEDO MONICA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Se identifica el agrupamiento génico "NKC" en el brazo corto del cromosoma 12 humano. Se procede a realizar tras un mapa citogenético, un mapa físico a partir de yac's solapantes. Posteriormente se adquiere una gran resolución con la utilización de diferentes genotecas de BACs. El mapa finalmente posee un tamaño físico de 2Mb, dentro del cual quedan establecidas las diferentes distancias entre los genes que lo componen. Consta de 16 genes, 5 ESTs y 42 STSs. Consta de una resolución de 20Kb por marcador y, finalmente servirá como sustrato para la secuenciación de toda esta región genomica en el proyecto genoma humano..

Autor: ICHASO JIMENEZ NATALIA.
Año: 1998.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: El gen TRKC, que codifica el receptor de alta afinidad de la neutrofina 3, juega un papel fundamental en la diferenciación y mantenimiento del sistema nervioso, y durante el desarrollo cardiaco. Al igual que ocurre con los genes de otros receptores tirosina quinasa, TRKC podría presentar translocaciones cromosómicas o mutaciones puntuales que se asociaran a cáncer o a otras patologías humanas. Para facilitar la búsqueda de alteraciones que pudieran afectar a este locus, en el presente trabajo se ha caracterizado su organización genómica. Nuestros resultados muestran que el gen TRKC humano abarca más de 100 kb y consta de 20 exones, incluyendo dos que codifican insertos alternativos presentes en los dominios extracelular y tirosina quinasa, y otros dos que codifican la cola carboxilo terminal presente en la isoforma truncada de este receptor. El análisis de la región 5' ha revelado la ausencia de secuencia TATA, la presencia de una isla CpG, así como la presencia de sitios reconocidos por factores de transcripción que se expresan en tejidos neuronales y/o cardiacos. Se muestran también varios polimorfismos presentes en este gen, y la existencia de un nuevo cDNA de TRKA que codificaría un receptor truncado no descrito hasta el momento. Además, se describe por primera vez la presencia de alteraciones estructurales del gen TRKC en una neuropatía, lo que demuestra la importancia del estudio de este gen en este tipo de enfermedades. El conocimiento de la estructura genómica y el de las secuencias implicadas en el procesamiento de los exones del gen TRKC que aporta este trabajo es importante, no sólo para una mejor caracterización de las alteraciones detectadas hasta el momento, sino también porque facilitará la tecección de nuevas anomalías de este gen en diferentes situaciones patológicas.#