BIOLOGIA MOLECULAR

Autor: MATURRANO HERNÁNDEZ ABELARDO LENIN.
Año: 2004.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE ALICANTE.

Resumen: En el presente estudio se han utilizado diversas técnicas para la caracterización de los microorganismos de las salinas de Maras, un ambiente hipersalino de los Andes de Perú. Se ha determinado la composición iónica de dichas salinas y se ha establecido el origen de las mismas. Mediante técnicas moleculares y de cultivo se logrado determinar la diversidad de organismos que habitan en estos ambientes. Desde el desarrollo de las técnicas moleculares, el estudio y caracterización procariótica de muestras ambientales, ya sea de ambientes acuáticos o terrestres se ha podido abordar de una forma mucho menos sesgada, pudiendo incluso facilitar la obtención en cultivo puro de los microorganismos mas relevantes del ambiente. En este estudio se aplican ambas técnicas, tanto para el estudio de organismos procariotas como eucariotas. Además, se ha realizado un estudio comparativo de las comunidades encontradas en las salinas de Maras con lo encontrado en otras partes del mundo. En general, los ambientes estudiados muestran características generales semejantes a la de otras salinas talasohalinas, pero conservan características propias como el cultivo de microorganismos mayoritarios del grupo Archea, obtenidas mediante el estudio de genotecas ambientales y la presencia mayoritaria de bacterias del grupo de las gamma Proteobacterias, que también logramoscultivar.También se ha logrado el aislamiento y caracterización de nuevos microorganismos que constituirían una nueva especie microbiana y se plantea la reclasificación de una especie y la formación de un nuevo género microbiano.

Autor: ABAD LLORET XAVIER.
Año: 2004.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD MEDICINA.

Resumen: Los microtúbulos que están implicados en una gran variedad de funciones celulares están formados por heterodímeros de alfa- y beta-tubulina. En el plegamiento del dímero de alfa- y beta-tubulina se han identificado diferentes cofactores implicados en el plegamiento y función de la alfa- y beta-tubulina, permitiendo comprender la integración de las dos rutas de plegamiento de tubulina, las cuales convergen de tal manera que el plegamiento de una requiere la presencia de diferentes cofactores y de la otra subunidad. El Cofactor C funciona como una GAP (GTP-asa Activating Protein) para la beta-tubulina dirigiendo la liberación del heterodímero del complejo alfa/beta/D. La primera parte de esta tesis se ha centrado en el estudio del cofactor C y del complejo p14/beta tubulina). Se han obtenido y purificado por afinidad anticuerpos específicos contra el cofactor C humano completo y contra el dominio carboxi-terminal del cofactor C murino. La expresión del cofactor C mediante la infección con baculovirus recombianantes da lugar a dos formas moleculares capaces ambas de activar la liberación del dímero de tubulina del supercomplejo C300. La diferencia entre ambas formas no es debido a una farnesilación, como sugieren los experimentos de MALDI-TOF ni a una fosforilación. La expresión del cofactor C tanto a nivel de RNA como de proteína se localiza principalmente en el testículo y está además temporalmente correlacionada su expresión con la de los isotipos de tubulina b3, a3/7 y cofactor A, coincidiendo su mayor aumento a nivel de expresión con el inicio de la expermiogénesis. La sobreexpresión del cofactor C en las células Hela no produce ninguna alteración fenotípica apreciable, por lo que no parece que el cofactor C, por sí solo, sea una proteína reguladora de los procesos de catástrofe de microtúbulos. Estudios en cultivos primarios muestran una expresión mayoritaria del cofactor C en neuronas. El dominio N-terminal del cofator C posee homología con la p14 en las zonas de interacción de la p14 con la beta-tubulina y parece ser esta la zona donde el cofactor C pudiera interaccionar con la beta-tubulina. Se han obtenido las condiciones necesarias para su cristalización y la resolución de su estructura se encuentra en estudio. Además la infección de baculovirus recombinantes portadores de los genes para el cofactor A humano y el isotipo beta5-tubulina de ratón resulta en la solubilización de la beta-tubulina mediante la formación del complejo con el cofactor A, pudiendose detectar en geles nativos de proteínas. Estos resultados posibilitarán la purificación de dicho complejo. Además en la segunda parte de la tesis también se estudió tau, una MAP (proteínas asociadas a microtúbulos) que influye en la estabilización de los microtúbulos y que está relacionada con la enfermedad de Alzheimer. Empleando el sistema de baculovirus para el estudio de tau y un mutante asociado a la FTDP-17, vimos que el sistema de baculovirus es hasta ahora el único sistema que permite obtener filamentos de tau análogos a los filamentos que se encuentran en los cerebros de pacientes con Alzheimer. La forma tauvlw relacionada con la FTDP-17 forma filamentos cuando se sobreexpresa en células Sf9 que recuerdan a los encontrados en el cerebro de pacientes con Alzheimer. El tratamiento con litio, inhibidor de la quinasa GSK3, hace que disminuya la cantidad de filamentos formados tras la infección de células Sf9 con baculovirus portadores del gen de tauvlw.

Autor: NAVASCUES ORTEGA JOAQUIN.
Año: 2003.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El estudio analiza las bases celulares del proceso de diferenciación inducida por dexametasona de la línea celular UR61, derivada de las células PC12, atendiendo particularmente a la neuritogénesis, diferenciación catecolaminérgica y dinámica de los cuerpos nucleares. En este estudio demostramos que el proceso de neuritogénesis detectadno la actina cortical en las neuritas y conos de crecimiento y utilizando microscopia electrónica de barrido. Las neuritas contienen el factor de supervivencia de las neuronas motoras (SMN) y el mRNA de la B-actina, cocentrándose ambos en los conos de crecimiento. Esta observación sugiere que hay una traducción importante del mRNA de la B-actina en los conos de crecimiento. La neuritogénesis se asocia con translocación nuclear de GR y expresión de tirosina hidroxilasas. A nivel nuclear, la diferenciación comporta cambios en el número y composición de los cuerpos de cuerpos de Cajal (CBs) y géminis. Así, los CBs de las células indiferenciadas concentran coilina, pero carecen de SMN. La diferenciación comporta un incremento global de la expresión de SMN y su reclutamiento progresivo en CBs y su agregación en cuerpos géminis. La sobrexpresión de SMN-GFP promueve la colocalización de coilina y SMN en los CBs y, paradojicamente, no induce la formación de géminis. Hemos demostrado por vez primera la ultraestructura de los cuerpos géminis cuya morfología y composición molecular es claramente distinta de la de otros cuerpos nucleares. La inhibición de la exportación nuclear de snRNAs en las células UR61 con LEPB reduce la formación de CBs e induce la proliferación de géminis. Similares efectos fueron registrados con el tratamiento con los inhibidores de la metilación MTA y AdOx. Estos datos indican que tanto la inhibición de la exportación de snRNAs y, consecuente la reimportación nuclear del as snRNPs ensambaldas en el citoplasma, como la inhbición de la metilación de la coilina son factores esenciales para la formación de los CBs, mientras que los géminis son cuerpos residuales de escasa entidad funcional. Finalmente, hemos analizado la distribución nucleoplasmática y en cuerpos nucleares de SUMO-1 en las célulasUR61. Hemos caracterizado la morfología ultrastructural de los cuerpos SUMO-1 positivos. También hemos demostrado que los cuerpos SUMO-1 reclutan sustratos de conjugación con SUMO-1 tales como proteína PML y, esencialmente, dos factores de transcripción directamente implicados en la diferenciación de las células UR61, c-Jun y GR. Además en experimentos de transfección con SUMO-1 activo GFP hemos demostrado que es esta forma activa de SUMO-1 (carece de los 4 últimos aa del extremo C terminal) la que se concentra en los cuerpos SUMO-1. Nuestros resultados sugieren que reclutamiento en cuerpos nucleares de proteínas SUMOyladas juega interviene en la regulación de la concentración nuclear de los factores de transcripción citados.

Autor: CAYON GÓMEZ AMALIA M..
Año: 2003.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La EHNA es una enfermedad caracterizada por la presencia de esteatosis, infiltrado inflamatorio y fibrosis en grado variable, presentando una histopatología muy similar a la observada en la hepatopatía alcohólica. A pesar que en los últimos años se ha avanzado de forma significativa en el conocimiento de la patogenia de la EHNA, los mecanismos patogénicos responsables del daño hepatocelular de esta entidad no están totalmente dilucidados. Por otro lado, los factores que determinan la progresión desde la esteatosis hepática simple al desarrollo de fibrosis y fenómenos necroinflamatorios solo se conocen de forma parcial. El objetivo fundamental de este proyecto es analizar la influencia de algunas citocinas proinflamatorias y profibrogénicas en la progresión de la esteatosis a EHNA. De este objetivo general analizaremos: 1,- Características clínicas, biológicas e histológicas en la esteatosis y en la EHNA en los pacientes con obesidad mórbida. 2,- Implicación del TNF alfa en el desarrollo de la EHNA, expresión génica del TNF alfa y sus recptores en tejido hepático y en grasa en individuos obesos, y los niveles plasmáticos en pacientes obesos y sujetos sanos no obesos. 3,- Expresión génica de citocinas profibrogénicas en el hígado: TGF beta 1 y CTGF, su relación con el desarrollo de la EHNA y de fibrosis hepática. 4,- Estudiar el papel de la leptina en los mecanismos fibrogénicos de la EHNA, debida a que esta incrementa en los pacientes con obesidad mórbida, analizaremos los niveles séricos y la expresión de la leptina y su receptor por el tejido hepático. Lo analizaremos en un grupo de 90 pacientes obesos que ingresaron en el Hospital Marqués de Valdecilla para someterse a cirugía bariátrica. Hemos observado: 1,- Las características clínicas de la EHNA en los enfermos obsesos es muy poco relevante, las pruebas de función hepática son normales o discretamente elevadas. 2,- La mayoría de los pacientes presentan esteatosis moderada o severa y los pacientes con EHNA presentan inflamación leve o moderada, presentando fibrosis tan solo un tercio de los pacientes y siendo esta en general leve o moderada. 3,- En los enfermos con EHNA asociada a la obesidad mórbida, se ha demostrado una sobreexpresión del ARNm del TNF alfa y su receptor TNFRI en tejido hepático y graso, sugiriendo que la síntesis local del TNF alfa y su receptor TNFRI es uno de los factores que determina el desarrollo de la EHNA. La expresión del TNFRII similar en todos los pacientes sin establecerse relación con la ENHA. 4,- Los niveles séricos del TNF alfa y sus receptores son más elevados en RII es similar en todos los pacientes obesos con y sin EHNA respecto a los controles sanos no obesos siendo independiente del desarrollo de la EHNA. 5,- Los pacientes obesos con EHNA muestran una sobreexpresión a nivel hepático de citocinas profibrogénicas: TGF beta y y CTFG siendo superior en los pacientes con fibrosis moderada o severa. 6,- Los pacientes obesos con y sin EHNA tienen niveles séricos de leptina más elevados que los sujetos sanos o obesos, presentan expresión del receptor de la leptina y no muestran expresión de la leptina en el hígado.

Autor: RODRÍGUEZ ESTEBAN CONCEPCIÓN.
Año: 2003.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En este trabajo de Tesis doctoral se analizan las bases moleculares responsables del establecimiento de la asimetría izquierda-derecha durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. Se estudian 3 especies diferentes: el ratón, el pollo y el pez zebra. La autora demuestra que Nodal juega un papel relevante en la determinación de la asimetría izquierda-derecha. La expresión de Nodal se encuentra a su vez regulada por Notch y se caracterizan dos sitios funcionales de interacción con Notch en el promotor del gen nodal. Asimismo, se caracteriza la dinámica de la expresión génica y las interacciones entre genes relevantes de la vía de Notch durante el establecimiento de la asimetría izquierda-derecha. Con todo ello, se elabora un modelo matemático que revela la existencia de una red genética que explica la activación de Notch en el lado izquierdo del embrión. Por último, se establce que la activación de Notch en el lado izquierdo del nodo es dependiente de una acumulación temporal de calcio extracelular regulada por la actividad de la enzima H+/K+-ATP asa.

Autor: LADRÓN BORONAT NÉSTOR.
Año: 2003.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Rhodococcus equi es una bacteria Gram + incluída en el grupo de los actinomicetos. Es un patógeno intracelular que infecta a varios animales domésticos, principalmente a ptoros y cerdos, y también al hombre, dónde se presenta como patógeno oportunista. Produce bronconeumonías purulentas y enteritis en potros. En humanos causa una infección pulmonar similar a la tuberculosis. En esta tesis se ha realizado una caracterización del gen choE de R.equi que codifica la colesterol oxidasa, proteína membranoactiva que es un importante factor citolítico de esta bacteria. Por mutagénesis sitio-específica en el gen choE se han construido varios mutantes sin actividad colesterol oxidasa. Estos mutantes se obtuvieron por intercambio alélico y para ello fue necesario poner a punto una serie de herramientas genéticas en R.equí consistentes en varios marcadores de selección, un sistema de transferencia de DNA eficiente y un método de recombinación homóloga. Para analizar el papel de la colesterol oxidasa en la virulencia de R.equi se realizaron ensayos de infección en macrófagos murinos J774A.1 y en células epiteliales Caco-2 y también en ratones BALB/c. Por otra parte, se ha desarrollado un sistema de identificación de R.equí por PCR usando como diana el gen choE. Este sistema, ensayado en un total de 165 cepas de R.equi y de otras especies relacionadas filogenéticamente, nos ha permitido asignar al taxón R.equí la cepa ATCC 21387, clasificada previamente como Brevibacterium sterolicum. Además se ha podido discriminar varias cepas pertenecientes a otras especies que habían sido identificadas en origen erróneamente como R.equi.

Autor: DIAZ PRADO SILVIA M. .
Año: 2003.
Universidad: A CORUÑA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La levadura Kluyveromyces lactis es una alternativa a la levadura tradicional Saccharomyces cerevisiae debido a sus aplicaciones industriales y a su utilización como modelo en estudios de biología molecular, entre ellos la glucólisis y la respiración mitocondrial. Ambas levaduras son aerobias facultativas pero difieren en su metabolismo respiro-fermentativo ya que en condiciones aerobias S. cerevisiae es preferentemente fermentadora y K. lactis es predominantemente respiradora. Esta diferencia existente en la capacidad respiratoria se ha relacionado con múltiples factores, entre ellos el efecto Crabtree y la represión catabólica de genes que intervienen en la cadena respiratoria mitocondrial. Para explicar las bases moleculares de la elevada capacidad respiradora de la levadura K. lactis frente a la levadura S. cerevisiae, para explicar, también, la conexión existente entre los elevados niveles de actividad de la ruta de las pentosas fosfato en K. lactis y la necesaria actividad de una cadena respiratoria y además para poder aportar nuevos datos que permitan explicar mecanismos alternativos para la reoxidación mitocondrial de los coenzimas, en la presente tesis doctoral se realizó un estudio exhaustivo de dos genes que codifican para un enzima de la ruta de la glucólisis y para una proteina de la cadena respiratoria mitocondrial que son claves en el metabolismo respiro-fermentativo de la levadura K. lactis. Tras realizar el aislamiento, caracterización y estudio de la regulación transcripcional de ambos genes, se observó que el gen KlFBA1 se comporta como el homólogo de S. cerevisiae en lo referido a la regulación transcripcional sin respuesta a la fuente de carbono, choque térmico a altas temperaturas, daño oxidativo y falta de nutrientes. Sin embargo, tampoco responde a otras regulaciones operativas en el gen de S. cerevisae: falta de calcio, choque térmico a bajas temperaturas o fase estacionaria. Para el caso del gen KlNDI1, se pudo comprobar que presenta una menor expresión en condiciones de fermentación, lo cual ya se ha comprobado para otros genes de otras levaduras respiradoras. Este gen, KlNDI1, no está regulado por choque térmico, por estrés oxidativo ni por limitación de nitrógeno. Esta diferente regulación de ambos genes, KlFBA1 y KlNDI1, podrían explicar al menos en parte las diferencias existentes en el metabolismo respiro-fermentativo de ambas levaduras, S. cerevisiae y K. lactis.

Autor: VALDÉS LÓPEZ FRANCISCO.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Los hepatocitos fetales de rata tratados con TGF-beta sufren un proceso de muerte celular programada. Sin embargo, no todas las células culminan dicho proceso de apoptosis, aproximadamente un 50% de las células sobreviven. Este fenómeno es coincidente con una serie de transformaciones fenotípicas y morfológicas que recuerdan una transición epitelio mesénquima (EMT). En este trabajo demostramos que el TGF-beta es capaz de desencadenar un proceso de EMT en hepatocitos fetales de rata. Este proceso también ocurre cuando se incuban los hepatocitos en presencia de suero-fetal bovino. Hemos aislado las dos subpoblaciones que ejecutan dicho proceso y las hemos denominado TBT-FH (TGF-beta treated fetal hepatocytes) y ST-FH (serum treated fetal hepatocytes). Ambos tipos de células presentan niveles aumentados de vimentina y una alta expresión de Snail, con ausencia de expresión de CK-18 y Cadherina-E. Ambas neceistan mitógenes para crecer, y aunque mantienen la respuesta a TGF-beta en términos de inhibición del crecimiento, son insensibles a la apoptosis mediada por este factor. Dicha resistencia es coincidente con altos niveles de Bcl-X y de la forma activa de AKT. Además pierden la expresión de factores de transcripción específicos de tejido hepático como HNF-4 y HNF-1beta y expresan OV-6, una proteína que se ha relacionado con células progenitoras de hígado. En resumen, estas células son refractarias a los efectos apoptóticos del TGF-beta, debido a la capacidad de este de inducir la vía de PI 3-K/AKT en los hepatocitos fetales en cultivo primario, por un mecanismo independiente de la síntesis de proteínas pero dependiente de uan tirosina quinasa y además muestran características propias de progenitores hepáticos y de células de carcinoma hepatocelular.

Autor: HERNÁNDEZ DOMÍNGUEZ ROSARIO.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La organización mundial de la salud considera la diabetes tipo 2 como una epidemia global y por ello se están realizando grandes esfuerzos de investigación encaminados a prevenirla y al desarrollo de nuevos fármacos que impidan la progresión en la misma. El primer defecto que ocurre es una resistencia generalizada a la acción de la insulina, impidiendo la capacidad de glucosa por los tejidos periféricos, que en condiciones fisiológicas responden a dicha hormona pro tener receptores para la misma y expresar el transportador de glucosa dependiente de insulina GLIT4. Dicho transportador se encuentra en compartimentos de membrana intracelulares, desde donde se transloca a la membrana plasmática en respuesta a insulina. Las rutas de señalización de la insulina que participan en dicho proceso no están totalmente establecidas: la vía de la PI3-K ha demostrado ser necesaria pero no suficiente y otras vías paralelas han sido recientemente propuestas. En eta tesis demostramos que en los adipocitos marrones, un modelo sensible a la acción de la insulina, por debajo de PI3-K, Akt, PLCgamma y PKC* desempeñan un papel importante en la mediación de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática en respuesta a insulina. El transporte de glucosa en tejidos insulino-dependientes también puede estar regulado por cambios en la expresión génica del transportador GLUT4. En los adipocitos marrones el tratamiento crónico con insulina es capaz de aumentar la expresión génica de GLUT4 a nivel transcripcional de manera dependiente de PI3-K/Akt y además ese aumento se correlaciona con un aumento en el transporte de glucosa. Por parte, el tratamiento conjunto de insulina con dexametasona produce un efecto sinérgico sobre el transporte de glucosa como consecuencia de la activación del promotor de GLUT4 a través del factor de transcripción C/EBPalfa. Además del estudio de las vías de señalización implicadas en el transporte de glucosa insulino-dependiente desde un punto de vista fisiológico, hemos querido reproducir un modelo de resistencia a insulina con el fin de estudiar si estaba afectado este proceso. Uno de los principales factores de riesgo que constribuyen al desarrollo de resistencia a insulina es la obesidad, siendo el TNF-alfa el nexo de unión entre ambas patologías. El TNF-alfa activa Smasas produciendo ceramidas, que podrían ser un mediador celular de algunos de los efectos biológicos del TNFalfa. En este sentido, hemos demostrado que el mecanismo por el que las ceramidas producen resistencia a la insulina en dipocitos marrones es porque mantienen Akt en un estado inactivo y defosforilado, impidiendo su función fisiológica en la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática. Rosiglitazona es actualmente utilizada como un fármaco para el tratamiento de la diabetes tipo 2 aunque su mecanismo de acción no está del todo claro. En esta tesis proponemos un posible mecanismos de acción a través de la mejora de la sensibilización a la insulina a nivel del receptor de insulina y de la vía de señalización de insulina IRS-2/PI 3-K/Akt produciendo un aumento en la translocación de GLUT4 y en el transporte de glucosa. Además Rosigilitazona fue capaz de revertir la resistencia a insulina inducida por TNF-alfa restaurando completamente el transporte de glucosa insulino-dependiente en los adipocitos marrones fetales.

Autor: NIETO GUTIÉRREZ MARÍA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CNB/CNIO.

Resumen: Se ha realizado un estudio de la sensibilidad a drogas quimioterapéuticas en ausencia del supresor de tumores p53, centrando el análisis en la droga 5-aza-2' -deoxicitidina. El estudio se ha realizado en fibroblastos embrionarios de ratón y se ha extendido a células de crecimiento tumoral in vivo mediante xenotranasplante en ratón. Se ha encontrado que la ausencia de p53 confiere sensibilidad al tratamiento, lo que puede ser de gran utilidad a la hora de aplicar tratamientos quimioterapéuticos con la 5-aza-2'-deoxicitidina. Por otro lado se ha estudiado el papel de la proteína Ris1 como participante de la respuesta celular al estrés oncogénico mediado por Ras (senescencia inducida por Ras). Se ha generado un ratón deficiente en la proteína para llevar a cabo un estudio in vivo, así como modelos celulares de ES Ris1-/- y MEFs Ris1-/- para complementar con estudios in vitro. Se ha encontrado que los ratones Ris1 son viables y al los 5 meses de edad no presentan propensión a formar tumores. A su vez, la ausencia de la proteína Ris1 no evita la senescencia inducida por Ras, pero altera significativamente la respuesta celular a dicho oncogén, puesto que los niveles de p19ARF, principal mediador de la cascada de señalización, experimentan un aumento muy inferior al que se observa en células WT.

Autor: MALKI MOUSTAFA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La aplicación de técnicas de ecología molecular al estudio del río Tinto nos ha permitido conocer el nivel de diversidad procariota del mismo y avanzar un modelo de su funcionamiento. La coexistencia en el sistema de zonas óxicas y anóxicas permite desarrollar estudios sobre la influencia de las mismas en la microbiología del hierro y su implicación no solo en el funcionamiento del sistema sino también en la historia geomicrobiolgica de la tierra y en otros sistemas planetarios. En la caracterización de las dos zonas aerobia y anaerobia del río Tinto se ha considerado de gran interés profundizar en el conocimiento del papel de Acidiothiobacillus ferrooxidans capaz de oxidar el hierro en presencia de oxígeno y reducirlo utilizando azufre elemental como fuente de energía en condiciones anaerobias, con el fin de comprender su papel en el funcionamiento del sistema y refinar el modelo de funciones generales del mismo.

Autor: TORROJA FUNGAIRIÑO CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El gradiente morfogenético de Hedgehog (Hh) interviene en muchos procesos de formación de patrón durante el desarrollo de órganos tanto en Drosophila como en vertebrados. Patched (Ptc), el receptor de Hh, controla la difusión y la señalización de Hh. En esta tesis se describen dos mutantes de Ptc, PtcS2 y Ptc14, que tienen defectos en señalización y secuestro respectivamente. PtcS2 tiene una mutación puntual en el dominio sensible a esteroles (SSD) que induce la activación de los genes diana de manera independiente de ligando. Este mutante muestra una actividad dominante negativa impidiendo la represión de Smoothened (Smo), un efector positivo de la señalizaicón de Hh. A pesar de su fenotipo dominante negativo en señalización, PtcS2 puede internalizar y secuestrar Hh. Por un ensayo de complementación hemos encontrado un mutante de Ptc,ptc14, que no bloquea la difusión de Hh ya que tiene afectada la endocitosis. Sin embargo, este mutante es capaz de controlar la expresión de los genes diana como la proteína silvestre. Nuestros estudios muestran que Ptc limita la difusión de Hh internalizándolo a través de Vesículas Cubiertas de Clatrina por un mecanismo dependiente de Dinamina. Esta internalización no se requiere par la correcta transucción de la señal. Además, en este mutante, ptc14, y en aquellos que no producen proteína, Hh todavía se localiza en endosomas en las células receptoras, lo que sugiere la existencia de un segundo mecanismo de endocitosis de Hh independiente de Ptc. Sin embargo, este segundo mecanismo no conduce a la degradación de Hh.

Autor: BEJARANO LEÓN FERNANDO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Autor: ALDAZ CASANOVA SILVIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Autor: LAVADO JÚDEZ ALFONSO JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La tirosinasa es la enzima clave en la síntesis de la melanina. La expresión del gen de la tirosinasa está controlada por una región controladora de locus. Se ha realizado el análisis fenotípico, genómico y bioquímico de los ratones mutantes extreme dilution mottled. Estos animales presentan un fenotipo hipopigmentado debido a la alteración de la región controladora de locus del gen de la tirosinasa, y a una mutación puntual C1220T que da lugar a una tirosinasa que se glicosila mal y se retiene en el retículo endoplásmico. Existen diferentes ratones transgénicos con distintas variantes del gen de la tirosinasa. Se han establecido cultivos primarios de melanocitos procedentes de estos ratones. La ausencia de la tirosinasa genera un síndrome denominado albinismo, caracterizado por una serie de anomalías del sistema visual. La expresión ectópica del gen de la tirosina hidroxilasa en las células del epitelio pigmentado de la retina ha permitido corregir las anomalías visuales asociadas a los individuos albinos.

Autor: CASTÁN GARCÍA PABLO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: En este trabajo se han obtenido estirpes mutantes mediante la inserción en el gen recA de Thermus thermophilus del cassette de resistencia a kanamicina, así como mediante la deleción de la secuencia comprendida entre las dos dianas BglII del gen recA. La obtención se llevó a cabo aplicando por primera vez en Thermus un sistema de selección negativa con dideoxinucleótidos. El análisis de dichos mutantes reveló que la inactivación del gen recA conlleva un elevado descenso de la viabilidad en T.thermophilus, que se acentúa según se suceden las rondas de cultivo y que la inactivación del gen recA y la subsiguiente pérdida de viabilidad se ven acompañadas de un incremento muy grande de la tasa de mutación expontánea a medida que se suceden las rondas de crecimiento. Este incremento detectado tanto sobre marcadores endógenos (cambios del fenotipo) como sobre indicadores exógenos (genes reporteros), es dependiente de la temperatura de incubación y parece ser el que motiva la pérdida total de viabilidad al cabo de varios reinóculos como consecuencia de la acumulación expontánea de daños sobre el DNA. De la misma manera, la competencia natural de la especie se mantiene en la estirpe mutante recA, lo que indica que RecA no es requerido para la transformación. Si bien el material transformado en el mutante no sufre reorganizaciones, indicando una disminución apreciable de la tasa de recombinación. También se han obtenido estirpes mutantes mediante la inserción en el gen slpA de Thermus thermophilus del cassette de resistencia a kanamicina, así como mediante la deleción del cassette y de la secuencia sustituida por éste, utilizando por primera vez en Thermus un sistema de selección negativa con ampicilina. El estudio de ambos mutantes ha revelado que la región líder 5'UTR del mRNA de slpA actúa estabilizando la vida media del mensajero, viéndose compensada su pérdida por un incremento en el nivel de trasncripción del gen. Así mismo, la pérdida de la región 5'UTR supone la pérdida del control transcripcional dependiente de crecimiento al alcanzarse la fase estacionaria, dando lugar a la sobreproducción del complejo capa S -membrana externa con respecto a la envolutra subyacente y generando los cuerpos multicelulares con membrana externa común. También se ha definido la presencia de un espacio funcionalmente análogo al periplasma en Thermus, su homología con el periplasma de las bacterias Gram-negativas ha sido probada mediante la sobreexpresión en él de una proteína periplásmica y la posterior purificación en forma activa de elevadas cantidades de proteína concentrada. Por último, se ha desarrollado un protocolo de detección no radiactiva de la interacción RNA/proteína, validando su utilidad mediante la definición de la región responsable de la interacción entre SlpA y su propio mRNA.

Autor: CARVALHO PINTO CARLA EPONINA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Autor: GÓMEZ FERRERÍA M. ANA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: FOXJ2 es un factor de transcripción que regula la expresión génica tanto durante el desarrollo como en numerosos tejidos del individuo adulto. En esta tesis se abordó el estudio de los dominios importantes para la actividad de FOXJ2. Este factor presenta una señal de localización nuclear bipartita foramda por dos regiones: NLS.N y NLS.C, en los extremos del dominio fork head. FOXJ2 incluye tres dominios de transactivación: el dominio DI, el dominio PHQ y el dominio AB, rico en residuos ácidos. Hemos visto también que esta proteína se fosforila en Ser172 y en Ser197, si bien la mutación de estos residuos no afecta a la actividad transcripcional de FOXJ2 en las condiciones ensayadas. La región -35/+90 del gen de FOXJ2 presenta actividad promotora. Los sitios de unión de Sp1 en posición +41/+51 y en posición +68/+82 son necesarios para la actividad basal del promotor de FOXJ2. Sp1 activa dicho promotor a através de estos sitios.

Autor: ESTELLA SAGRADO CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM "SEVERO OCHOA".

Resumen: El gen btd posee un papel importante en el desarrollo de distintos segmentos cefálicos. Se ha propuesto que interacciona con orthodenticle y empty spiracles para especificar los segmentos antenal, intercalar y mandibular. A 60 kb de btd se encuentra D-Sp1, un gen muy similar a btd con funciones parcialmente redundantes en el desarrollo del sistema nervioso periférico y de la cabeza. La expresión que ambos genes poseen en los primordios de los discos imaginales ventrales en el embrión ha sido descrita pero ha sido analizada funcionalmente. En este trabajo demostramos una función hasta ahora desconocida y redundante para btd y D-Sp1. Ambos genes son necesarios para el desarrollo de los pirmordios imaginales ventrales, activando a los genes necesarios para su formación. Anteriormente se había descrito que el primordio de antena necesita de la función de btd, pero nada se había estudiado acerca de los primordios torácicos. La función de btd/D-Sp1 no sólo se restringe al periodo embrionario, ya que poseen un papel en el crecimiento imaginal de los apéndices ventrales (pata y antena). Además, demostramos que la proteína Btd es capaz de inducir el mecanismo genético necesario para la formación de estos apéndices cuando se expresa ectópicamente en la larva.

Autor: PALACIOS GARCÍA DANIELA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOQUÍMICA.

Resumen: La metilación de citosinas en dinucleótidos CpG es la principal modificación epigenética en mamíferos. El objetivo general de esta tesis fue estudiar el papel que juega esta modificación en la activación inicial de genes durante el desarrollo. Para ello utilizamos como modelo la activación de genes específicos de sangre en células madre hematopoiéticas (HSC) y la expresión de miogenina durante el desarrollo en ratón. Con excepción de las islas CpG, el ADN en células somáticas está altamente metilado. Sin embargo, hasta el momento no se conoce el estado basal desde el cual se activan regiones con una densidad baja de CpGs en células madre. Mediante secuenciación genómica tras el tratamiento con bisulfito sódico hemos demostrado que varias regiones reguladoras de genes hematopoiéticos se activan simultáneamente desde un estado desmetilado en el menos una subpoblación de HSC. Por el contrario, el promotor del gen específico de músculo miogenina se encuentra completamente metilado en casi todos los clones analizados, aunque en un 8% de ellos los tres CpGs alrededor de los sitios de unión de factores de transcripción se encuentran sin modificar.Sin embargo, no hemos detectado expresión de miogenina en HSC. Durante el desarrollo en ratón el promotor de miogenina se encuentra generalmente metilado en somitas posteriores de embriones de e9.5 (que todavía no expresan el gen), y se desmetila en las somitas más anteriores. La desmetilación de los tres CpGs alrededor de los sitios de unión de factores de transcripción es completa en músculo esquelético de ratones neonatos. Dicha desmetilación parece ser previa a la activación del gen, ya que el número de clones sin modificar en somitas anteriroes es mayor al número de células que expresan migoenina. El promotor de miogenina es hipersensible a nucleasas en células musculares C2C12 diferenciadas, y no se requiere la unión del factor Myf5 es necesario para la expresión del gen. Por otro lado, la mutación de los sitios de unión para proteínas de las familias MEF2 y Six reduce notablemente la formación del sitio de hipersensibilidad (HS). La metilación in vitro del promotor disminuye fuertemente el número de células capaces de formar un sitio HS, aunque en aquellas que se forma el sitio es completamente activo. En conjunto nuestro resultados apuntan a un papel de la metilación del ADN en restringir la activación inicial de genes hasta el momento adecuado del desarrollo.