BIOLOGIA MOLECULAR, 2

Autor: ESPINOZA NAVARRO OMAR RENÉ .
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El malatión es un insecticida organofosforado de amplio uso cuyo principal efecto tóxico agudo se debe a la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa. Sin embargo, poco se ha estudiado respecto a sus efectos crónicos entre los cuales se encuentran los efectos sobre la reproducción. La lombriz de tierra Eisenia foetida es un gusano segmentado (Annelida, Oligochaeta), que constituye un excelente modelo de organismo biocentinela para evaluar los riesgos tóxicos de xenobióticos en ecosistemas terrestres. El objetivo de este estudio es analizar los daños sobre el aparato reproductor de Eisenia foetida expuesta a malatión comerical 57%. Se utilizaron lombrices de tierra con clitelo desarrollado, las cuales fueron expuestas a dosis únicas subletales de 2/3, 1/3, 1/6 y 1/10 de la LD50 (LD50= 880 mg/kg de tierra). Las controles fueron regadas con agua potable. Cada grupo fue analizado al día 1,5,15 y 30 post-tratamiento. Los resultados observados en animales indican una reducción significativa de peso corporal en individuos tratados y enrrollamiento de la cola en el 100% de ellos. El recuento espermático muestra un aumento significativo a los 1 y 5 días, seguida de una disminución entre los 15 y los 30 días. El uso de la técnica del naranja de acridina, muestra un aumento significativo de espermatozoides metacromáticos anormales en animales tratados (fluorescencia de color rojo). El estudio histológico, con método tricrómico de Arteta, muestra que los núcleos de espermatogonias en vesículas seminales de animales tratados con maltaión, se encuentran hipercromáticos, sugiriendo apoptosis. El tratamiento con la técnica de bromo-deoxiuridina muestra un alza significativa de la proliferación celular entre los 5 y 15 días en individuos tratados. Con la técnica de TUNEL, se observa que los individuos tratados presentan mayor porcentaje de espermatogonias con quiebre en su ADN, sugiriendo apoptosis. Estos resultados nos permiten concluir que el malatión altera el comportamiento general de este organismo, elevando el grado de contractibilidad, caracterizado por cola enrrollada, además, de alterar en forma significativa el recuento y la calidad de sus espermatozoides, posiblemente alterando la conformación y estructura del ADN. Los cambios histopatológicos e inmucitoquímicos observados en este estudio, evidencian que a nivel de sistema reproductor masculino de lombrices, la administración de dosis únicas ubletales de malatión produce un importante efecto citotóxico. Dado que los pesticidas organofosforados son de amplio uso en agricultura, en casas y jardines, estos estudios alertan sobre el peligro potencial del empleo idiscriminado de oragnofosforados por sus posibles repercusiones en la Salud Pública.El uso de Eisenia foetida resultad ser un excelente modelo de especie biocentinela para registrar los cambios citotóxicos que se expresan como efectos sobre el crecimiento y la reproducción.

Autor: ESCUDERO CUADRADO LUIS M..
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: El trabajo de tesis, caracteriza un nuevo gen de Drosophila melanogaster, llamado charlatan (chn). Se desconocía por completo tanto la estructura como la función de chn, excepto que su falta de función afectaba a la diferenciación del sistema periférico embrionario de este insecto. Hemos encontrado una nueva línea EP (EPIL6), insertada cerca del origen de transcripción de chn, que cuando se sobreexpresa con diversas líneas GAL4 produce la aparición de macroquetas extra en el notum.chn codifica para un factor de transcripción tipo "dedo de zinc". El ARNm de chn aparece en el SNC y SNP embrionario. En el disco imaginal de ala, se expresa en los grupos proneurales, y está regulado positivamente por los genes proneurales achaete (ac) y scute (sc). Los niveles de Chn son más altos en el campo proneural y mayores aún en las CMOS visualizado con un anticuerpo contra Ch,. Hemos preparado, mediante una mutagénesis por escisiones imprecisas de un elemento P, el alelo chnECJ1, que posiblemente es una mutación nucla.chnECJ1 elimina y desorganiza elementos delSNP embrinario y con bja penetrancia suprime las quetas del notum. Los fenotipos embrionarios se rescatan grandemente al sobreexpresar chn. En el disco de ala, la expresión de UAS-chn produce la expresión ectópica de sc y la formación de muchas quetas extra. UAS-chn actúa sobre los "enhancers" proneurales de ac/sc, ya que in vivo puede activar distintas construcciones que poseen los "enhancers" del complejo achaete-scute (C-AS) dirigiendo la expresión del gen marcador lacZ. Clones homocigotos para chnECJ1 muestran un decrecimiento en la acumulación de Sc, y en la expresión de las construcciones DC-lacZ y LIII-TSM-lacZ. Hemos encontrado fenotipos similares al sobreexpresar una construcción de ARN inteferente de chn (UAS-chn).chn interacciona genéticamente con ac/sc. Hemos encontrado que la presencia de sólo una copia de ac/sc hace que la sobreexpresión de UAS-chni provoque una mayor desaparición de macroquetas. La acción de Chn parece que está mediada por su interacción directa con las secuencias cis-controladoras que regulan la expresión de achaete y sucte ("enhancers"), siendo el primer gen conocido que tiene esta función en Drosophila

Autor: GARCÍA CAO ISABEL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: PARTE I. GENERACIÓN DE RATONES CON MAYOR DOSIS GÉNICA DE P53 El cáncer puede ser considerado como la consecuencia final de la acumulación de errores genéticos. El papel de p53 como supresor turmoal quedó demostrado por el hecho de que ratones que carecían de este gen se desarrollaban de forma normal pero presentaban tumores a una temprana edad. Nos propusimos llevar a cabo un abordaje distinto y estudiar si la introducción de copias adicionales de p53 consigue aumentar la resistencia frente al desarrollo tumoral. Para evitar una expresión desregulada de p53 generamos animales mediante transgénesis con BACs (Bacterial Artificial Chromosomes), que permiten incluir grandes insertos genómicos que contengan tanto el gen de interés como las regiones que controlan su expresión. Mediante la generación de animales y MEFs (mouse embryonica fibroblastas) que carecían de los alelos endógenos de p53 pero que protaban el alelo transgénico (p53(-/-)(tg/.)) pudimos comprobar que la copia transgénica era funcional. Al estudiar las respuestas mediadas por p53 frente a daño a DNA en animales que portan una copia adicional de p53 (p53(+/+)(tg/.)) comprobamos que existía un refuerzo de la vía de p53. Para comprobar si este refuerzo conduce a una mayor resistencia frente a la congresión tumoral llevamos a cabo protocolos de carcinogénesis química que mostraron que los ratones con tres copias de p53 presentaban una mayor resistencia a la aparición de tumores que ratones con dos copias de p53(p53(+/+). Debido al papel que p53 juega en senescencia celular y a su posible papel en el envejecimiento del organismo estudiamos el proceso de envejecimiento de estos ratones y patologías relacionadas. Los ratones que poseían tres copias de p53 no mostraron síntomas de envejecimiento prematuro en ninguno de los ensayos realizados. La contribución fundamental de este estudio es la demostración de que se puede aumentar la resistencia al cáncer de un organismo sin provocar efectos no deseados, como el envejecimiento prematuro. PARTE II. GENERACIÓN DE RATONES GENÉTICAMENTE DEFICIENTES EN PAR4 Par4 (prostate apoptosis response 4) fue identificado inicialmente en un screening realizado en células de cáncer de próstata no dependientes de endrógeno en el que se buscaban genes inducidos durante la apoptosis. Los estudios realizados en los últimos años revelan que Par4 juega un importante papel en enfermedades neurodegenerativas y cáncer. Par4 es capaz de mediar apoptosis de forma selectiva en células transformadas por el oncogén Ras (al interaccionar e inhibir a las isoformas atípicas de las PKCs y bloquear el eje PKC-IKK-NFkB) y no células normales, lo que la convierte en una mólecula con un alto interés terapéutico. Para estudiar el posible papel de supresor tumoral de Par4 decidismo generar ratones deficientes en este gen. El análisis de la supervivencia Par4+/+, Par4+/- y Par4-/- reveló que la falta de Par4 conducía a una reducción de la vida media del organismo y a la aparición de un amplio espectro de tumores en los tejidos en los que la expresión de Par4 es más elevada (pulmón, próstata, ovario, intestino, riñón). Para estudiar más en detalle su papel en supresión tumoral llevamos a cabo un ensayo de inducción de carcinomas de vejiga en el que los animales que carecían de ambos alelos de Par4 mostraron una mayor susceptibilidad al desarrollo de tumores frente a animales Par4+/+, apoyando el papel de Par4 como supresor tumoral. Conocer algo más sobre la regulación y función de Par4 en el organismo es de gran interés debido a su elevado potencial terapéutico (inhibiendo su función en enfermedades neurodegnerativas o potenciándola en procesos tumorales) y esta línea de ratones generadas es un buen modelo para el estudio del papel de Par4 in vivo.

Autor: CAVERO MARTÍNEZ SANTIAGO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBMSO-FACULTAD DE CIENCIAS (UAM).

Resumen: El transporte de metabolitos a través de la membrana interna mitocondrial es realizado por una serie de proteínas relacionadas pertenecientes a la superfamilia de los transportadores mitocondriales (MCF). Durante los últilmos años se han identificado varios miembros de esta familia en levaduras y seres humanos, incluyendo miembros de una subfamlia de transportadores mitocondriales dependientes de calcio (CaMCs), que presentan dominios de unión a calcio de tipo manos EF en sus dominios N-terminales. Aralar1 y Citrina son dos CaMCs humanos con una gran homología entre sí, y han sido recientemente caracterizados como isoformas del transportador mitocondrial de aspartato/glutamato (ACG), regulado por calcio en la cara externa de la membrana mitocondrial interna. Aralar1 y Citrina son los homólogos humanos de Agc1p, un miembro de la subfamilia CaMC en la levadura Saccharomyces cerevisiae (902 aa, ORF YPR021c), aunque su dominio N-terminal no presenta dominios de manos EF. Para investigar el papel fisiológico de Agc1p llevamos a cabo la disrupción del gen AGC1 en S.cerevisiae y estudiamos el mutante de disrupción resultante utilizando aproximaciones metabólicas convencionales así como resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C. Nuestros resultados proporcionan evidencias de que Agc1p es el transplantador mictocondrial de aspartato/glutamato en levadura. Juega un papel en el metabolismo del nitrógeno y en la síntesis de la ornitina en mitocondrial y es requerido para el funcionamiento de la lanzadera rédox de malato-asparatto en S.cerevisae, una lanzadera de NADH necesaria para el crecimiento de la levadura con acetato y ácidos grasos como fuente de carbono. Yn1083p, otro miembro de la subfamilia CaMC, es el homólogo en levaduras de los SCaMCs humanos (Short Calcium Binding Mitochondrial Carriers), cuya función de transporte es aun desconocida, y presenta dominios de manos EF en su dominio N-terminal. Utilizando un mutante de disrupción en el gen YNL083w, nuestros trabajos han demostrado que el transportador mitocondrial codificado por dicho gen está involucrado en una actividad del transporte neto de nucleótidos de adenina insensible a carboxiatractilósido. Por lo tanto, Yn1083p posee una actividad de transporte similar a la del transportador de ATP-Mg2+/Pi identificado en mitocondria de hígado de rata. Además, hemos demostrado que, en levaduras deficientes en las tres isoformas de la traslocasa de ADP/ATP, la disrupción del gen YNL083w resulta letal. Estos resultados proporcionan evidencias de que Yn1083p está involucrado en el transporte de nucleótidos de adenina en la mitocondria de la levadura D.cerevisiae.

Autor: REDONDO MULLER MAURICIO.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: DEPT. FARMACOLOGÍA BAXTER ONCOLOGY GMBH.

Resumen: La reducción del número de animales en investigación es un proceso continuo e inevitable, que viene marcado por un cambio en la sociedad de los países mas industrialmente desarrollados y ratificado por los legisladores tanto a nivel nacional como a nivel internacional por la promulgación de leyes cada vez mas restrictivas en el uso de animales con fines experimentales. A pesar de que hoy en día las técnicas de biología celular y molecular tienen un importante papel, el uso de animales continua siendo una referencia en el desarrollo farmacológico de una nueva sustancia. En el presente trabajo, se ha realizado el análisis y comparación entre modelos in vitro y ensayos in vivo, con los objetivos de determinar si los métodos in vitro pueden reproducir los resultados obtenidos in vivo, desarrollar un programa de desarrollo in vitro que permita predecir los mejores modelos a desarrollar in vivo, y evaluar la reducción en tiempo, materiales y número de animales utilizados. El poder predictivo de los modelos in vitro por separado es muy limitado, observándose un alto nivel de falsos positivos. La valoración conjunta y de forma relacionada de todas las técnicas in vitro realizadas, conduce a una significativa reducción del tiempo (48%), materiales (58%), y él número de animales (64%) en el desarrollo de un determinado proyecto, indicando que si bien no es posible sustituir el uso de aniamles si que lleva a una mejor relación costes/objetivos. Destacando el método de fibra hueca como el mas adecuado para la valoración del poder terapéutico en sustancias con un mecanismo de acción indirecto.

Autor: PASCUAL LISARRI IRANZU.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Se ha estudiado el transporte de diferentes azúcares en el tubo digestivo de la langosta Locusta migratoria, y se ha detectado un posible transportador. Para la caracterización funcional se ha utilizado una técnica in vitro que permite medir la captación tisular del sustrato por radiactividad. La absorción de azúcares se produce en el digestivo medio, sobre todo en los ciegos gástricos, y presenta características funcionales más propias de transportadores tipo GLUT que de SGLT1. La galactosa, la glucosa y la 2-deoxiglucosa son captadas con una Km entre 2 y 4 mM. La fructosa es absorbida con una afinidad 7 veces menor, mientras que el alfa-metilglucósido no es absorbido por procesos de transporte. El transporte de azúcares no parece ser un transporte activo secundario, ya que no depende del gradiente electroquímico de iones Na+ o de otros iones como Cl-, K+ o Mg2+ y Ca2+, ni del pH. Tampoco el KCN 2mM afecta al transporte de azúcares. La florricina, potente inhibidor del SGLT1, lo inhibe ligeramente, mientras que la floretina, teofilina y citocalsaina B, inhibidores de transportadores tipo GLUT, ejercen una inhibición más marcada. La inyección de RNA poli A+ aislado de los ciegos gástricos en ovocitos de Xenopus laevis, da lugar a una entrada de galactosa 5 veces mayor que en los ovocitos no inyectados y que no es dependiente del NA+. Con el fin de detectar transportadores de azúcares de los ciegos gástricos, se utilizó la técnica de RT-PCR con cebadores degenerados. Se detectaron secuencias parciales de RNA mensajeros codificantes para posibles transportadores tipo GLUT. Mediante la técnica de RACE, se ha logrado una secuencia incompleta de 1946 nucleótidos con una región codificadora de 494 aminoácidos. La estructura secundaria de esta proteína presenta características estructurales y motivos de aminoácidos conservados en los transportadores facilitativos tipo GLUT. En resumen, se ha demostrado y caracterizado por primera vez transporte de azúcares en el digestivo medio de ortóptero Locusta migratoria y se ha identificado una secuencia nucleotídica que probablemente codifica para un transportador equilibrativo de azúcares.

Autor: AGUILERA GÓMEZ MARGARITA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El presente estudio se ha realizado con el objetivo de caracterizar bacterias con capacidad de subsistir y desarrollarse en los residuos tóxicos procedentes de la industria del aceite de oliva, como son el alpechín y alpeorujo. La obtención de aceite de oliva es un proceso de gran interés económico en nuestro país, y como alternativa biorremediadora de los residuos originados en dicho proceso, se seleccionaron cepas bacterianas con capacidad de producir recursos de interés biotecnológico como son los biopolímeros de tipo polisacarídico. La caracterización taxonómica polifásica de estas bacterias nos ha llevado a la descripción de una nueva especie dentro del género Paenibacillus denominada Paenibacillus jamilae ("jamila" palabra árabe que significa "el agua que corre de las aceitunas"). Dado el gran interés de los biopolímeros solubles en agua, nuestro estudio se ha centrado en la localización, identificación y caracterización del operón de biosíntesis del exopolisacárido (EPS) producido por Paenibacillus jamilae. Dicha especie es productora de biopolímero, que en estudios previos se había analizado a nivel de composición química y actividad biológica. Los genes que codifican para las enzimas implicadas en la síntesis, así como la polimerización y exportación del EPS están situados en el cromosoma bacteriano en una misma unidad policistrónica. Se les ha realizado un análisis bioinformático, asignándole funciones por homologías de secuencias con las ya descritas en las bases de datos y posteriormente corroboradas con un análisis enzimático funcional. Las actividades de las glicosiltransferasas, enzimas esenciales para la transferencia de los azúcares activados, que constituirán las unidades repetitivas en la estructura química del biopolímero (oligosacárido), son galactosiltransferasa, glucosiltransferasa y manosiltransferasa, junto a una epimerasa probable que aumenta la disponibilidad de substrato. Todas ellas están codificadas por la región central del operón. Los resultados obtenidos están en concordancia con la composición química cualitativa del polisacárido. El análisis transcripcional preliminar realizado nos ha permitido localizar una unidad transcripcional esencial completa, la presencia de promotores internos, zonas reguladoras delante de las enzimas responsables de la síntesis del polímero y un probable terminador transcripcional en el extremo 3' de una región genética que codifica una enzima que libera el oligosacárido de la molécula soporte o aceptora en la transferencia de moléculas activas de azúcares, la cual es necesaria durante todo el proceso de síntesis del biopolímero. Predecimos también con nuestro estudio, que los flancos 5' y 3' podrían codificar para enzimas y moléculas necesarias para la polimerización, transporte o exportación del EPS y para la regulación de su propia expresión. Con los resultados de este trabajo se establecen los conocimientos teóricos y experimentales necesarios para un futuro planteamiento de mejora biotecnológica de cepas bacterianas mediante ingeniería de polisacáridos, orientada a la biorremediación de alpechín y alpeorujo.

Autor: FERNÁNDEZ MORILLA MÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LEÓN.

Resumen: Las vinilglicinas son enol-eter aminoácidos derivados de ácido aspártico producidas por diferentes bacterías. En este grupo de compuestos se encuentran: la metoxivinilglicina producida por Pseudomonas aeruginosa, la rizobitoxina producida por Bradyrhizobium japonicum y Burkolderia andropogonis y la aminoetoxivinilglicina producida por la bacteria del suelo Streptomyces sp. NRRL 5331. Entre sus propiedades se encuentra la capacidad de inhibir la biosíntesis de etileno en las plantas, lo que les hace sumamente interesantes en la agroindustria como productos naturales para retardar la maduración de frutas y verduras, así como el marchitamiento de las flores, en sustitución de los productos químicos altamente contaminantes que se utilizan con estos fines (diaminoazida, ésteres de hidroxiquinolina ..). Además, presentan una actividad antimicrobiana importante sobre determinados microorganismos por se análogos estructurales de la cistationina, lo que les hace inhibidores de la biosíntesis de metionina. Puesto que las vinilglicinas derivan del ácido aspártico y algunos autores han propuesto a la homoserina como intermediario esencial en la ruta de biosíntesis de rizobitoxina, se clonaron y se secuenciaron los genes hom, thrB y thrC de Streptomyces sp. NRRL 5331 implicados en la ruta específica de biosíntesis de treonina, es decir, en la conversión del aspártico-beta-semialdehído en homoserina, esta en homoserina fosfato y finalmente esta última en treonina respectivamente. A continuación, los tres genes fueron interrumpidos y tras el análisis de la producción de AVG (aminoetoxivinilglicina) en las cepas obtenidas se propuso a la homoserina como precursor también de la AVG, ya que en el momento que el gen hom deja de ser funcional, desaparece la biosíntesis de AVG, no siendo así cuando la ruta se interrumpe en pasos posteriores. Así mismo, el análisis de la producción de otros aminoácidos por parte de la cepa NRRL 5331 reveló la existencia de un acúmulo natural de lisina y se comprobó mediante bioensayo con AVG comercial que este aminoácido antagoniza el efecto de dicho compuesto, así, se propueso este acúmulo como un mecanismo de defensa desarrollado por la cepa. Estudios de regulación de la ruta de biosíntesis de treonina demostraron que: la enzima Hk juega un papel importante como enzima clave en dicha regulación siendo fuertemente inhibida por metionina y treonina, y que la lisina reprime la transcripción de los genes hom-thrC, los cuales mediante estudios de interrupción del posible ARNm bicistrónico se demostró que se transcribían conjuntamente y de manera independiente al gen thrB. Complementariamente, se han obtenido indicios tras experimentos de hibridación y de reemplazamiento génico que en esta cepa existen dos genes asd (implicado en la obtención de aspártico-beta-semialdehído a partir de aspartil fosfato), lo cual ya es un hecho en determinadas especies de estreptomicetos (S.coelicolor y S.avermitilis).

Autor: LORENZANA VEGA LUIS MIGUEL.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.

Resumen: Se han identificado 6 nuevos genes dentro de un fragmento de ADN EcoRI-PvuI de 6,5 kilobases situado corriente arriba del gen car perteneciente a la agrupación de biosíntesis de ácido clavulánico. Los dos primeros genes han sido denominados cyp y fd respectivamente, dada la alta similitud de las proteínas deducidas con este tipo de proteínas de otros organismos. Ambas proteínas forman una unidad funcional junto con una NADPH-ferredoxina oxidorreductasa, cuyo gen no esta presente dentro del fragmento EcoRI-PvuI, y que en conjunto forman el sistema citocromo p450 hidroxilasa. La interrupción del gen cyp provoca la pérdida de la capacidad de biosíntesis de ácido clavulánico, sin embargo no se ha podido determinar el punto de actuación de este sistema dentro de la ruta biosintética de ácido clavulánico. El tercer gen, denominado orf-12 codifica una proteína que presenta similitud con la proteína LpqF de Mycobacterium tuberculosis, de función desconocida. La inactivación de este gen afecta negativamente a la producción de ácido clavulánico. La proteína deducida del cuarto gen, orf-13, muestra similitud con permeasas de membrana, y aunque no se ha determinado su papel dentro de la biosíntesis de ácido clavulánico, podría estar implicado en el transporte de intermediarios de la biosíntesis de ácido clavulánico. El quinto gen, orf-14, cuya proteína deducida muestra homología con acetiltransferasas. La inactivación de este gen mediante interrupción génica afecta a la producción de ácido clavulánico, quedando esta disminuída a un 25% de la producción de la cepa silvestre. El último gen, orf-15, codifica una proteína que muestra similitud con proteínas extracelulares que unen oligopéptidos. En Streptomyces coelicolor este tipo de proteína esta encargada de captar oligopéptidos señal que controlan procesos como la esporulación y la producción de antibióticos. La proteína deducida de orf-15 muestra máxima similitud con la proteína deducida de orf-7, cuyo gen esta situado dentro de la agrupación génica de biosíntesis de ácido clavulánico. La inactivación de este gen conlleva la pérdida de la capacidad de producción de ácido clavulánico, alanilclavama y de esporulación. Este hecho apoya la existencia de un mecanismo de regulación común del metabolismo secundario y la diferenciación en Streptomyces clavuligerus. La inactivación de orf-7, gen homólogo de orf-15 provoca la pérdida de producción de ácido clavulánico, pero no afecta a la producción de alanilclavama ni a la esporulación. Esto indica que, a pesar de su homología, la función de orf-7 y orf-15 es diferente. También se ha demostrado la implicación de las proteínas codificadas por orf-7 y orf-15 en el transporte de péptidos.

Autor: MUÑOZ ADELANTADO ESTEFANÍA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GRANADA Y ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN.

Resumen: En nuestro laboratorio se ha descrito el primer intrón del grupo II del orden Rhizobiales, inicialmente encontrado en la cepa GR4 de S.meliloti. Este intrón presenta unas características a nivel de estructura primaria y secundaria que le hacen diferente de los intrones móviles del grupo II hasta ahora descritos. En este trabajo de Tesis Doctoral hemos llevado a cabo estudios sobre la presencia y distribución del intrón RmInt1 en la cepa tipo de S.meliloti 1021, así como diversos estudios ecológicos para conocer el comportamiento y dinámica de RmInt1 en poblaciones naturales de S.meliloti. Hemos analizado la presencia de RmInt1 en otras especies bacterianas y hemos ensayado la capacidad de movimiento fuera de su hospedador natural S.meliloti. Para comprender el mecanismo de dispersión de este elemento dentro de la misma especie e incluso entre especies distintas hemos llevado a cabo estudios para la caracterización molecular del mecanismo de movimiento del intrón. Por último, hemos analizado in vitro las actividades bioquímicas del intrón RmInt1. Los resultados más significativos se resumen a continuación: La cepa tipo de S.meliloti 1021 presenta en su genoma seis copias de intrones del grupo II: 1 copia completa de SMb21477 y 1 copia truncada (SMb21167) (clase IIC), 1 copia e SMa1875 (no clasificado) y 3 copias de RmInt1 (clase IIB3). El intrón RmInt1 parece carecer de movilidad autónoma en el genoma de 1021. La dispersión del intrón RmInt1 en poblaciones naturales de aislados de S.meliloti ocurre tanto asociada a la transposición del elemento compuesto ISRm2011-2::RmInt1 como de forma independiente. Esta dispersión autónoma de RmInt1 se realiza mediante los procesos de homing y transposición ectópica. La cepa 5D19 de S.adhaerens es portadora de una única copia de RmInt1 insertada en una nueva secuencia de inserción, ISRm10-3. Podría tratarse de un evento de transferencia génica horizontal desde bacterias del género Sinorhizobium, probablemente desde S.meliloti. El intrón RmInt1 presenta la capacidad de moverse en fondos genéticos de diferentes especies bacterianas del orden Rhizobiales distintas de S.meliloti, tales como S.medicae, S.teranga, R.leguminosarum, R.tropici, A.tumefaciens y A.rhizogenes. La proteína codificada por el intrón (IEP), posee actividad maturasa para realizar el splicing del intrón, siendo necesaria en este proceso la presencia de ambos componentes de las partículas de robinocleo-proteína (ARN del intrón e IEP). La IEP presenta, además, la capacidad de realizar transcripción reversa (actividad RT) sobre sustratos exógenos y endógenos, cuando se encuentra formando parte activa de las partículas de ribonucleoproteína. El ARN del intrón RmInt1, componente de las partículas de ribonucleoproteína, puede cortar la cadena sentido de sustratos de ADN de cadena doble y sustratos de ADN de sencilla en el sitio preciso de inserción del intrón. Las partículas de ribonuceloproteína derivadas de RmInt1 no poseen la capacidad de cortar la cadena antisentido de sustratos de ADN de doble cadena, lo que conforma la predicción teórica de la ausencia del dominio ADN endonucleasa de la IEP. Esta característica unida a la mayor eficiencia de corte en la cadena sentido de sustratos cortos de AND de cadena dobel sugiere una capacidad limitada del intrón RmInt1 para desenrollar el ADN. Las RNPs derivadas del intrón RmInt1 son capaces de promover el splicing reverso del intrón en la cadena sentido de sustratos de ADN de cadena doble, así como en sustratos de ADN de cadena sencilla, reconociendo la secuencia diana específica para la inserción del intrón.

Autor: ALVAREZ TALLADA VICTOR.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MALAGA.

Resumen: En el presente trabajo se describe la búsqueda de nuevos genes implicados en la regulación del ciclo celular eucariota. Para ello, se ha usado una genoteca de sobrexpresión para identificar inhibidores de la división. Entre los genes aislados, además de funciones desconocidas, se encuentran inhibidores previamente caracterizados y genes implicados en diversas funciones como síntesis y degradación proteica, metabolismo del RNA, estructural del nucleolo, citoesqueleto y glicolisis. De entre ellos, se presenta la caracterización del bloqueo producido por un mutante incompleto en la enzima fosfogructoquinasa 1 (Pfk1), enzima clave en la regulación de la ruta glicolítica, que puede revelar una novedosa conexión entre metabolismo y ciclo celular. Esta proteína interacciona física y genéticamente con la enzima clave en la regulación de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (Acetil CoA Carboxilasa, Cut6). Un alelo termosensible y un mutante incompleto de esta enzima generan un fenotipo de bloqueo idéntico al producido en el caso de Pfk1, observándose en ambos casos defectos en cariocinesis y citocinesis por interferencia en funciones de citoesqueleto, como desregulación de los niveles celulares de gamma tubulina. Estos datos sugieren la existencia de un complejo en el que participan Pfk1 y Cut6 necesario para el progreso del ciclo celular.

Autor: BORRELL PAGES MARIA.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: HOSPITAL VALL D'HEBRON.

Resumen: En primer lugar se caracteriza el SITAC (Similar to TACIP18), una nueva proteína con dominios de interacción proteína-proteína del tipo PDZ. SITAC fue clonada en virtud de su homología con otra proteína con dominios PDZ anteriormente aisladas en el laboratorio, TACIP18/Sintenina. A pesar de su elevado grado de identidad, estas proteínas unen dianas distintas: TACIP 18 une el dominio citoplasmatico del factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), un ligando del receptor del EGF, y SITAC une al antígeno L6, que pertenece a la familia de las tetraspaninas. En segundo lugar se estudia el papel del shedding (un tipo de proteólisis limitada que libera el dominio extracelular de proteínas de transmembrana) de ciertos ligandos de la familia del EGF. Mediante la utilización de técnicas de biología molecular y celular se muestra que el shedding del TGF-alfa es crítico, no sólo para regular la producción del factor de crecimiento soluble, sino también para controlar la actividad juxtacrina de la forma de transmembrana del factor de crecimiento. Del mismo modo, el shedding es también crítico para el desarrollo de tumores en modelos preclínicos y, más aún, TACE, la metaloproteasa responsable del shedding del TGF-alfa se encuentra muy sobreexpresada en tumores de mama humanos mientras que otras metaloproteasas de la misma familia no lo están. Esto convierte a TACE en una prometedora diana terapéutica para futuras terapias anti-tumorales.

Autor: YUSTE YUSTE LAURA.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA .
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA.

Resumen: Los factores de crecimiento participan en la comunicación intercelular, promoviendo procesos como diferenciación, proliferación y muerte celular programada, necesarios para el desarrollo embrionario y en el organismo adulto. Las Neuregulinas son factores de crecimiento sintetizado mayoritariamente como formas transmembrana; la actuación de proteasas específicas en su ectodominio provoca la liberación del factor maduro soluble, que activará receptores localizados en la superficie de las células diana. Esta comunicación es crucial para el desarrollo del corazón, el sistema nervioso y la glándula mamaria. Alteraciones en la comunicación mediada por estas moléculas puede provocar procesos tumorales, como la sobreexpresión del receptor ErbB2 o la producción de Neuregulinas por células de mama, que se han observado en tumores de mama. Por todo ello, en este trabajo se plantearon como objetivos analizar los determinantes estructurales, los mecanismos moleculares y las actividades proteásicas que inducen el procesamiento de Neuregulinas ancladas a membrana, y comparar la capacidad mitogénicas asociada a la sobreexpresión de ErbB2 o a la producción de Neuregulinas en células de carcinoma de mama, analizando rutas de señalización activadas en ambos casos. Los resultados obtenidos nos llevan a las siguientes conclusiones: El procesamiento de Neuregulinas transmembrana tiene lugar en el dominio nexo extracelular y, probablemente en la región transmembrana; la longitud del dominio nexo dicta la velocidad de procesamiento de estas moléculas, que es inducido por activadores de la PKC; la metaloproteasa TACE interviene en el procesamiento de Neuregulinas transmembrana. También constatamos que la producción y/o presencia de Neuregulina modifica profundamente la señalizacion en células MCF7, derivadas de carcinoma de mama, aumentando los niveles de proliferación, con un efecto más potente que la sobreexpresión de ErbB2. El anticuerpo monoclonal 4D5, utilizado en terapia antitumoral, inhibe la proliferación de células MCF7 que producen Neuregulina y no tiene efecto en estas células cuando sobreexpresan ErbB2.

Autor: MÉNDEZ FERNÁNDEZ OLGA .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: En un grupo de tumores de mama se decició estudiar si la pérdida de función de la proteína Bax podía ser debida a la existencia de mutaciones frameshift. Los resultados obtenidos sugieren que en cáncer de mama, las mutaciones del gen bax no serían críticas para la carcinogénesis y el proceso de progresión tumoral. Este tipo de mutaciones sólo se han detectado en tumores con inestabilidad de microsatélites, por lo tanto decidimos estudiar cual era la incidencia de este tipo de alteración en nuestro grupo de tumores, encontrando que un 11,6% era inestables. La inestabilidad detectada quedó delimitada a las secuencias que afectaban a dinucleótidos, no se encontró ninguna alteración en las secuencias de mononucleótidos analizadas. Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre la existencia de inestabilidad de microsatélites y la pérdida de apoptosis observada en los tumores. La mayor supervivencia celular resultado de la pérdida de apoptosis podría favorecer la existencia de este tipo de alteración en los tumores. Para corroborar si la pérdida de apoptosis se podía asociar a la existencia de inestabilidad de forma genérica en los tumores de mama, se decidió estudiar si la sobreexpresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL era capaz de inducir un acúmulo de alteraciones genéricas, y el efecto que las mismas podían tener sobre el proceso de progresión tumoral. Al analizar el daño genómico en las líneas transfectadas con respecto a la línea parental, los transfectantes con genes antiapotóticos tenían un GDF mayor que los transfectantes en el gen control Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis era capaz de inducir un aumento en el número de alteraciones genéticas detectables por AP-PCR, contribuyendo así a la inestabilidad genética que caracteriza a las células tumorales. El análisis filogenético de las líneas transfectadas, con respecto a la línea parental indicaba que los transfectantes con genes antiapoptóticos tenían un parentesco más cercano, originado por una mayor similitud de las alteraciones genéticas, mientras que las alteraciones de la línea control presentaban un mayor grado de divergencia. El análisis de los resultados mediante un programa de clusters mostraba la presencia de 3 zonas donde el tipo de alteraciones presentes en las líneas transfectadas con los genes antiapoptóticos y con el gen control son divergentes. Al analizar el GDF de las diferentes variantes tumorales y metastáticas, tomando como referencia las líneas derivadas de la generación anterior los resultados indicaban que a medida que avanzaba el proceso de progresión tumoral, el número de alteraciones genéticas detectadas iba en aumento, tanto a nivel de tumores como de metástasis. Este aumento de inestabilidad se correlaciona con una mayor capacidad tumorigénica y metastática de las líneas celulares. Sin embargo, las variantes celulares con mayor capacidad tumorigénica y metastásica no son las que presentan un mayor número de alteraciones. Estos resultados indicarían que sólo una parte de las alteraciones detectadas son responsables del fenotipo tumoral y metastático. Por lo tanto quizá las alteraciones detectadas en el control son más aleatorias y sin repercusión biológica, mientras que la sobreexpresión de moléculas antiapopotóticas da de entrada una ventaja de crecimiento, con lo cual la célula es capaz de progresar con un menor numero de alteraciones genéticas, pero de mayor efectividad biológica. El daño genómico de las metástasis con diferente organoespecificidad mostraba un comportamiento diferencial, tanto en relación con el número como la naturaleza de las mismas, en función del órgano de origen. Finalmente, decidimos estudiar si la organoespecificidad de las metástasis podía ser debida a cambios en la expresión génica. Estos estudios se hicieron utilizando la técnica de microarrays. Una vez hecho el análisis estadístico se determinaron genes asociados a actividad metastática, que serían aquellos genes que aparecían diferencialmente expresados en las cuatro variantes metastásicas analizadas. También se identificaron los genes cuya expresión se modificaba conjuntamente en las dos metástasis ganglionares, y aquellos cuya expresión diferencial se asociaba a la presencia de metástasis ósea.

Autor: ALCAIDE ALONSO PILAR.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA", CSIC-UAM.

Resumen: Trypanosoma cruzi es el protozoo parásito causante de la enfermedad de Chagas. En los primeros pasos tras la infección, y coincidiendo con la fase aguda de la enfermedad, se produce un fuerte inmunosupresión que sirve al parásito para evadir la respuesta inmune y permanecer en el hospedador infectado. Existe un mecanismo inmunosupresor Óxido Nítrico dependiente que implica la aparición en el bazo de células Gr1/Cd11b+productoras de NO en respuesta a TNF y a IFN-gamma. Además existen mecanismos alternativos que implican una fuerte inhibición de la producción de IL-2 que colabora en la falta de respuesta proliferativa a mitógenos observada tras la infección. AgC10, una mucina de T.cruzi, inhibe la activación temprana de linfocito T y como consecuencia de ello la activación transcripcional del promotor de IL-2 a través de casi todos sus elementos de respuesta. Esto lleva a una fuerte inhibición de la producción de IL-2. AgC10 además tiene un efecto desactivador de macrófagos en respuesta a LPS, inhibiendo las vías de activación de éste que llevan a la producción de TNF y COX-2. Ambas moléculas se encuentran reguladas fuertemente a nivel de estabilidad de mensajero, nivel que está inhibido por AgC10. AgC10 tiene efecto inhibidor por las tres MAPKs. Por último, AgC10, de naturaleza glicosilada similar a los ligandos de L-Selectina, interfiere en las funciones tanto de transducción de señales como de adhesión llevadas a cabo por esta molécula.

Autor: ABAJO LLAMERO RICARDO DE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: Buscando genes regulados por hormona tiroidea en estriado, se asiló Rhes (Ras homolog enriched in striatum), que también se expresa en otras regiones del encéfalo, y en menor medida, en el tiroides. El análisis de la secuencia del ADNc y de la proteína que de ella se deduce, muestra una alta homología con las proteínas de la familia Ras, presentando los dominios de unión e hidrólisis de GTP y la secuencia de localización subcelular CAAX en el extremo carboxilo terminal. En nuestros ensayos hemos encontrado que Rhes se localiza en la membrana plasmática y que une GTP en mayor medida que H-Ras. Para definir la función de Rhes hemos analizado su capacidad de regular algunas de las vías de transducción de señales clásicas de Ras. Rhes no es capaz de activar la vía MAPK por si solo, aunque coopera con H-Ras en la activación de esta vía y en la formación de focos. Así mismo, une y activa a PI3K. La proteína que mayor homología presenta con Rhes es Dexras, cuya expresión está regulada por dexametasona y que junto con Rhes constituye una nueva subfamilia dentro de la familia Ras. El homólogo humano de Dexras, llamado AGS1, regula la señalización desde receptores con siete dominios transmembrana a proteínas Gi. Nosotros hemos encontrado que Rhes inhibe la activación de GS desde el receptor Beta2-adrenérgico y el receptor de la TSH. La acción de Dexras y Rhes modulando la actividad de receptores transmembrana acoplados a proteínas G heterotriméricas, es un nuevo paradigma de acción de proteínas pertenecientes a la familia Ras.

Autor: GONZÁLEZ SUÁREZ EVA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CNB; CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Los telómeros son estructuras de DNA y proteínas que constituyen el final de los cromosomas eucariotas. Tienen una función protectora esencial para la estabilidad celular pues evitan que los extremos cromosómicos sean confundios con roturas de Dna. La telomerasa es un reversotranscriptasa que sintetiza repeticiones teloméricas di novo. La mayor parte de las células primarias y de los tejidos somáticos carecen de actividades telomerasa de modo que sus telómeros se acortan con las divisiones celulares. Por debajo de una longitud mínima los telómeros pierden su funcionalidad dando lugar a una inestabilidad cromosómica que compromete la viabilidad celular. Las células tumorales poseen altos niveles de actividad telomerasa que les permiten proliferar indefinidamente. Los ratones deficientes en telomersas con telómeros cortos muestrasn defectos en tejidos altamente proliferativos como consecuencia de una menor proliferación celular y una menor tasa de apoptosis. En esta tesis se estudia la susceptibilidad tumoral de este modelo de ratón. Los resultados obtenidos demuestran que los telómeros cortos actúan como potentes inhibidores tumorales. Además hacen a las células más sensibles al tratamiento con agentes genotóxicos. Por otra parte, la ausencia de telomerasa incluso en presencia de telómeros largos disminuye la incidencia tumoral, sugiriendo la existencia de funciones adicionales de la telomerasa ademas de la elongación telomérica. En esta tesis se describen también la obtención y caracterización de un modelo de animales transgénicos con altos niveles de expresión de telomerasa en diversos tejidos: los animales K5-mTert. Nuestros resultados muestran que la sobreexpresión de telomerasa no modifica significativamente la longitud telomérica ni la estructura de los tejidos a edades tempranas. Sin embargo, la presencia de altos niveles de telomerasa favorece la proliferación celular tras el tratamiento con ésteres de forbol y la cicatrización de heridas así como la incidencia tumoral tras carcinogénesis química. Los animales K5-mTert muestran con la edad un aumento en la incidencia de lesiones preneoplásicas y neoplásicas que incide negativamente en su supervivencia. En contraste presentan una menor incidencia de lesiones seniles. Con objeto de averiguar la posible cooperación entre altos niveles de telomerasa y las mutaciones en p53 los animales K5-mTert fueron obtenidos en fondos heterocigotos y nulos para p53. El patrón de supervivencia de estos animales y la incidencia tumoral reveló que la sobreexpresión de telomerasa coopera con la ausencia de p53 generando una mayor cantidad y variedad de tumores espontáneos. Nuestros resultados demuestran la importancia que una correcta regulación de los niveles de telomerasa supone para el balance entre cáncer y envejecimiento del organismo y sugieren la existencia de funciones adicionales de la telomerasa independientes del mantenimiento de los telómeros.

Autor: DÍAZ PORTUONDO EMILIANO ENRIQUE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: El crecimiento demográfico que ha tenido lugar en las últimas décadas, ligado al desarrollo acelerado de la industria, ha conllevado a la generación de elevados volúmenes de aguas residuales que hay que depurar. Entre las técnicas de tratamiento de las aguas residuales, el reactor anaerobio de flujo ascendente con manto de lodos (UASB), representa actualmente una de las alternativas de mayor aceptación. Sin embargo, aunque el proceso tecnológico es bastante conocido y los parámetros operacionales están bien establecidos, los conocimientos acerca de la diversidad microbiana y la estructura del lodo granular, que se desarrolla en estos reactores, es todavía limitada. En este trabajo se han utilizado las técnicas moleculares (FISH, extracción de ADN y ARN, clonaje y DGGE) y las técnicas de microscopía electrónica de barrido y transmisión, para determinar la diversidad microbiana, su ubicación y el papel que desempeña en el sistema. El lodo granular objeto de estudio presenta una gran variedad de gránulos con diferentes propiedades físicas (forma, tamaño, color, estructura y densidad(, siendo los gránulos grises con forma elipsoidal y estructura de multicapas los más abundantes. Estos presentan una distribución especial donde las bacterias forman colonias en la periferia del gránulo, mientras que las arqueas se situaron siempre en las zonas más internas. El porcentaje de microorganismos activos es menor del 10%. Las bacterias detectadas por FISH pertenecen mayoritarias a las proteobacterias, bacterias sulfatorreductoras, sintrofobacterias y bacterias Gram-positivas de alto y bajo contenido en G+C. Entre las arqueas predominan los géneros Methanosaeta y, en menor proporción Methanosarcina, si bien también aparecen algunas arqueas del orden Methanobacteriales. Los resultados obtenidos por clonación y DGGE, confirman la presencia los géneros Methanosaeta, Methanosarcina y Methanospirillum. Sin embargo solo se detectaron arqueas activas de los géneros Methanosaeta y Methanosarcina. En el caso de las bacterias, correspondían a los Phyla Proteobacteria, Nitrospira, Deferribacteres, Firmicutes, Cloroflexi y Proteobacteria. Se estudió el proceso de formación y desarrollo de la biopelícula anaerobia y se utilizó como base para proponer una teoría de granulación, la cual se fundamenta y propone la difusión como el fenómeno que gobierna el crecimiento granular y la actividad microbiana.

Autor: ESTEBAN GAMBOA ANDRÉS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UAM.

Resumen: Los efectos metabólicos ejercidos por la leptina en tejidos extraneurales presentan cierta controversia, habiéndose descrito acciones "similares a las de la insulina" y acciones "anti-insulina". En la primera parte de este trabajo, estudiamos la posible modulación a corto y largo plazo de la gluconeogénesis por leptina. La leptina no modificó a corto plazo la gluconeogénesis a partir de lactato, ni el estado de activación de la piruvato kinasa L (PK-L), ni los niveles de fructosa 2,6-bifosfato (F-2,6-P2), en hepatocitos aislados de rata. Sin embargo, esta citokina fue capaz de antagonizar la reducción de la gluconeogénesis provocada por la insulina, aunque de nuevo sin provocar cambios en el estado de activación de la PK-L ni en los niveles celulares de F-2,6-P2. Por otro lado, el tratamiento de hepatocitos cultivados a largo plazo con leptina aumentó la gluconeogénesis desde lactato, así como los niveles de mRNA y la actividad de la glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa). Además, la leptina antagonizó la reducción ejercida por la insulina sobre la gluconeogénesis y también sobre los niveles de mRNA y de actividad de la fosfoenolpiruvato carboxikinasa (PEPCK) y de la G6Pasa. No obstante, en hepatocitos cultivados tratados con dibutiril-AMP cíclico, la leptina sólo fue capaz de antagonizar la reducción en los niveles de mRNA de la PEPCK y de la G6Pasa causada por la insulina de un modo transitorio. Este efecto transitorio de la leptina pareció deberse a la coincidencia temporal de dos fenómenos: un aumento en la vida media de ambos mRNAs por la presencia conjunta de leptina y de insulina en el medio de incubación, y la rápida desaparición de estos mRNAs en los hepatocitos cultivados, independientemente de la variable ensayada. En la segunda parte de este trabajo, nos propusimos estudiar las vías de señalización responsables de la inducción de la expresión del mRNA de la glucokinasa (GK) por insulina, en hepatocitos cultivados. Así, observamos que la vía de señalización dependiente de la Pl 3-Kinasa es absolutamente necesaria para la inducción del mRNA de la GK por insulina. La vía de señalización dependiente de las p42/p44 MAPKinasas también participa en este proceso, si bien con un papel secundario y complementario. Además, la p70 S6Kinasa también está implicada, al menos en parte, en la inducción del mRNA de la GK por insulina. Por otro lado, el tratamiento de los hepatocitos con SB203580, inhibidor de la p38 MAPKinasa, provocó un efecto bifásico -inhibidor o potenciador- sobre la inducción del mRNA de la GK por insulina. Este efecto bifásico del SB 203580 parece deberse a la modulación opuesta de las vías de señalización dependientes de la Pl 3-Kinasa y de las p42/p44 MAPKinasas. Así, el efecto inhibidor ejercido por el SB203580 sobre la inducción del mRNA de la GK por insulina tuvo lugar cuando este agente bloqueó completamente la señalización de la insulina a través de la vía Pl 3-Kinasa/PKB, o bien cuando suprimió parcialmente la señalización a través de la vía Pl 3-Kinasa/PKBalfa sin modificar el grado de fosforilación/activación de las p42/p44 MAPKinasas modulado por insulina. Por el contrario, el SB203580 amplificó la inducción del mRNA de la GK ejercida por la insulina cuando este agente potenció el aumento de la fosforilación/activación de las p42/p44 MAPKinasas en respuesta a insulina, manteniendo una señalización -total o parcial- a través de la vía Pl 3-Kinasa.

Autor: MARÍN CAÑA M. CRUZ.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Estudios previos del laboratorio se han centrado en el análisis de los genes contenidos en la región haploletal del cromosoma X de Drosophila, así como en el estudio de la función biológica de dicha región. En este trabajo centramos nuestra atención en los mecanismos moleculares que involucran a la función haploletal, y más específicamente en el estudio del mecanismos de regulación transcripcional de uno de los genes contenidos en esta región, la TnI. El estudio in vivo de las regiones genómicas físicamente responsables del fenómeno haploletal demuestra que no existen elementos reguladores en cis que puedan explicar dicho fenómeno. Por otro lado, el análisis de regiones genómicas adyacentes demuestra que dos regiones reguladoras, proximal y distal, son responsables de la expresión de la TnI a lo largo del desarrollo. Cada región responde de forma independiente a factores de transcripción miogénicos, generando patrones de expresión idénticos, que concuerdan con la expresión de TnI en musculatura somática, visceral y cardiaca. La disección de la región reguladora distal indica la existencia de módulos que definen dominios espacio-temporales específicos. Los estudios funcionales revelaron que al menos tres factores de transcripción: Biniou, Tinman y Mef2 actúan en la expresión de TnI. El estudio in vivo de los sitios de unión identificados para MEF2, en la región reguladora distal, indica que este factor de transcripción regula la expresión de la TnI en musculatura somática. Los niveles normales de expresión en embrión y adulto son generados por efectos sinérgicos entre tres sitios de unión a MEF2, si bien en larva su acción conjunta es necesaria pero no suficiente para alcanzar la expresión total. El estudio del mecanismo de transcripción se realizó a partir de mutantes que presentan reordenamiento en las regiones reguladoras. Los resultados indican que ambas regiones son requeridas en la regulación transcripcional de la TnI y que su actividad conjunta proporciona los niveles totales de transcripción, necesarios para la viabilidad y fisiología normal del organismo. A su vez, los estudios genéticos muestran efectos de transvección en la modulación de la transcripción de este gen. Finalmente, el análisis de las regiones reguladoras de otros genes musculares sugiere que podrían tener un mecanismo de regulación análogo. Del mismo modo, el estudio en genes de TnI de otras especies sugiere que puede tratarse de un mecanismo de regulación conservado a lo largo de la evolución