BIOLOGIA MOLECULAR, 3

Autor: MARTÍN GONZÁLEZ JAVIER.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLÓGICAS.

Resumen: Esta tesis tien como objetivo describir en el papel de Cdk4 en el control del ciclo celular basándose en el estudio de dos estirpes de ratón cuyo genoma ha sido modificado en el gen de la quinasa Cdk4: el ratón Cdk4neo/neo (knockout funcional de Cdk4) y el ratón Cdk4R24C/R24C (knockin que expresa la quinasa mutante Cdk4R24C, insensible a los inhibidores de la familia Ink4). Cdk4 ejerce su función al inicio del ciclo celular dirigiendo la progresión de la célula a través de la fase G1 temprana del ciclo. El ratón deificiente en esta quinasa es viable pero muestra una reducción de tamaño de hasta el 50%, esterilidad total en las hembras y parcial en los machos, y desarrolla diabetes debido a una reducción en el número de células beta, productoras de insulina. El ratón R24C es fértil y de tamaño normal pero muestra hiperplasia de los islotes endocrinos pancreáticos. Se ha estudiado en detalle el fenotipo en células beta y se ha podido determinar que esta quinasa está dirigiendo el programa proliferativo de este tipo celular desde el desarrollo embrionario tardío, sin embargo no es necesaria para los procesos de neogenesis. También se ha descrito que las células beta son especialmente sensibles a las mutaciones en Cdk4 ya que no expresan Cdk6, una quinasa altamente relacionada estructural y funcionalmente con Cdk4. Un rescate genético de la diabetes de estos animales mediante reexpresión de Cdk4 en las células beta del ratón deficiente confirma estos hechos. Además la deficiencia causa defectos en el desarrollo de las células productoras de prolactina en la adenohipófisis y esto es la causa de la esterilidad en las hembras. Esto queda también demostrado al reexpresar Cdk4 en la adenohipófisis del ratón deficiente y restaurante la fertilidad. Sin embargo, aún recuperando en el entorno homornal en el ratón Cdk4neo/neo, este sigue exhibiendo la misma reducción el tamaño lo que permite adjudicar a Cdk4 un papel específico en el control de la homeostasis celular en el ratón. Se ha descrito también el comportamiento de los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) procedentes de estas estirpes a ser puestos en cultivo. Las conclusiones de este estudio señalan que la falta de Cdk4 supone un cierto retraso en la entrada en ciclo, aunque los MEFs deficientes en Cdk4 son capaces de proliferar. La mutación R24C confiere a los MEFs una ventaja proliferativa que se hace evidente en el ensayo de inmortalización ya que dicha mutación por sí misma resulta inmortalizante para los MEFs en cultivo. Se ha abordado un estudio del perfil de expresión génica a nivel genómico mediante la hibridación de arrays de DNA de alta densidad y se han analizado boionformáticamente los datos, los cuales señalan a la ruta de IGF-1R como la principalmente alterada por las mutaciones en Cdk4.

Autor: RODA NAVARRO PEDRO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL DE LA PRINCESA (UAM).

Resumen: La inmunidad natural resulta esencial para la defensa del organismo frente a infecciones, antes de que pueda desarrollarse la inmunidad adquirida. Las células NK constituyen uno de los componentes de esta inmunidad, y desempeñan un importante papel en la defensa del organismo frente a diferentes patógenos intracelulares, así como frente al desarrollo de tumores. De ahí la importancia del estudio de los receptores implicados en la regulación de la actividad de estas células. En este trabajo nos planteamos localizar nuevos genes humanos codificantes para receptores de la familia KLP, expresados en células NK. Utilizando la base de datos de ESTs ("Expressed sequence tag"), hemos localizado un gen homólogo a la familia génica Ly49 y otro homólogo a la familia génica Nkr-p1 que ha sido clonado y caracterizado en profundidad, y al que hemos denominado KLRF1. KLRF1 se localiza en el brazo corto del cromosoma 12 dentro del complejo génico "Natural Killer", y su estructura genómica coincide con la descrita en otros genes de esta superfamilia. El gen más próximo evolutivamente a KLRF1 es NKR-P1A. KLRF1 se expresa mayoritariamente en células "Natural Killer" (NK). El procesamiento del hnRNA produce tres mensajeros que hemos denominado KLRF1-s, KLRF1-s2 y KLRF1-s3. La proteína codificada por KLRF1 pertenece a la familia KLR conservando las características estructurales generales del grupo. La homología con el resto de miembros de la familia reside sólo en el CTLD, encontrándose en el dominio citoplasmático diferentes residuos de tirosina, serina y treonina potencialmente fosforilales. La molécula se expresa como una glicoproteína integral de membrana de tipo II, constituyendo un homodímero de 80 kD formado por dos subunidades de 40 kD unidas mediante puentes disulfuro. Además esta molécula se encuentra homogéneamente distribuida en la membrana de las células NK, aunque se redistribuye a la sinapsis durante le reconocimiento de blastos alogénicos activados con PHA. En el sistema estudiado, únicamente la isoforma KLRF1-s3 se expresa en la membrana plasmática.

Autor: VILA DEL SOL VIRGINIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Los macrófagos juegan un papel clave en la respuesta inflamatoria. Su activación por diversos estímulos, conduce a la secreción de diversas citoquinas pro-inflamatorias como el TNFalfa, así como a la producción de diversos mediadores inflamatorios como el óxido nítrico y las prostaglandinas. En este trabajo se ha estudiado la regulación de la inducción en respuesta a IFNgamma de diversos genes pro-inflamatorios: la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), la ciclooxigenasa 2 (COX-2) y el factor de necrosis tumoral (TNFalfa). Así, se ha encontrado que los factores reguladores de interferón IRF-1 e IRF-8, median la activación transcripcional de estos genes en respuesta a IFNgamma. Por otro lado, existe un segundo mecanismo de regulación por IFNgamma de la expresión de iNOS y COX-2, que implica una acción autocrina del TNFalfa endógeno producido en respuesta a IFNgamma. Por último, la IL-4 que es una citoquina anti-inflamatoria, se ha visto que modula negativamente la inducción de estos genes pro-inflamatorios a través de distintos mecanismos: por una parte, el tratamiento con IL-4 inhibe la expresión del factor IRF-8 mediante desestabilización de su ARNm y por otra parte, regula negativamente la expresión de TNFalfa, lo cual va a conducir a una inhibición posterior de iNOS y COX-2 en respuesta a IFNgamma. La inhibición de la producción de TNFalfa ocurre en dos fases: una temprana que implica la desestabilización de su ARNm y una fase tardía, en la que la IL-4 inhibe la actividad transcripcional del promotor de TNFalfa en respuesta a IFNgamma.

Autor: ANZOLA CABO MÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS U.P.V..

Resumen: El hepatocarcinoma (CHC) es uno de los tipos de tumores más importantes en el mundo, cuya etiología es muy variada. Varios genes supresores tumorales se ha visto que están relacionados con su desarrollo. En el presente trabajo se han analizado los genes supresores tumorales p53, p16INK4a y P14ARF, así como el gen detoxificador GSTP1, encontrándose alteraciones en todos ellos a lo largo de la evolución del CHC. Así, el gen p53 se ha visto que se encuentra alterado en estadios tardíos de la enfermedad y su actividad se ve influenciada por la presencia de los virus de la hepatitis B y C. Los genes p16INK4a y p14ARF se han encontrado alterados por diversos mecanismos, principalmente por hipermetilación de sus promotores, en los estadios tempranos y prenoplásicos de la enfermedad. El gen GSTP1 también se ha visto alterado epigenéticamente en estadios tardíos de la enfermedad. Así mismo, se ha comprobado que el tejido hepático es un campo de cancerización en el cual pueden surgir diferentes tumores con diferente clonalidad.

Autor: BASSY ALVAREZ OLGA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM.

Resumen: El factor de transcripción de la familia POU hPLA1/hOCT11, el cual presenta una gran homología de secuencia con los factores OCT1 y OCT2, se expresa selectivamente en tejido placentario humano, dando lugar a una proteína de peso molecular 48 KDa. En la presente tesis doctoral hemos analizado el papel de este factor sobre la regulación transcripcional del gen hcgbeta5, el cual se expresa casi exclusivamente en los trofoblastos de la placenta. Dentro de la región comprendida entre las posiciones -279/-258 del promotor del gen hegbeta5 existe un sitio de unión para factores POU, del tipo TIT1 consenso, el cual es reconocido in vitro por la proteína recombinante hPLA1. Asimismo, la sobre-expresión de este factor produjo un aumento significativo de la actividad promotora del fragmento -311/+103 del gen hcgbeta5, tanto en células placentarias (línea celular JEG3, donde el factor de transcripción hPLA1 se expresa a bajos niveles) como en células no placentarias (línea celular COS7, donde se detecta el mRNA de hPLA1). Sin embargo, nuestros resultados indican que el factor hPLA1/hOCT11 debe interaccionar con otros factores de transcripción ubiquos para ejercer su efecto transactivador, ya que al deleccionar la región -311/-280 desaparece dicho efecto. Probablemente este factor sea un miembro de la familia AP-2, ya que existe un sitio de unión para estos factores a sólo una base de distancia, en dirección 5', del sitio de unión hPLA1. Por otro lado, el factor hPLA1, al igual que OCT1 y OCT2, presenta una mayor afinidad por la secuencia octámero consenso que por la secuencia del tipo PIT1 consenso dimérica que se localiza en el promotor proximal del gen hcgbeta5. Todos estos resultados, en conjunto, sugieren que el factor de transcripción de la familia POU hPLA1/hOCT11 podría estar implicado en la activación de la expresión placentaria del gen de la subunidad beta de la hormona gonadotropina coriónica humana.

Autor: ÁLAMO RODRÍGUEZ DAVID DEL .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: Aunque los mecanismos por los cuales se especifican los destinos celulares respecto a los ejes dorsoventral o anteroposterior en el primordio de ala de Drosophila melanogaster se conocen con detalle, muy poco se conoce del desarrollo del eje proximodistal. En este trabajo analizamos la función de dos genes, vestigial (vg) y optomotor-blind (omb), en relación con la especificación del eje proximodistal del ala. Vg está considerado como el gen maestro del desarrollo del ala. Los alelos más fuertes de falta de función muestran una supresión completa del tejido ala tanto en las regiones proximales como en las regiones distales. La función de vg en el desarrollo de la región distal del ala ha sido analizada exhaustivamente tanto desde el punto de vista genético como desde el punto de vista molecular. En este trabajo presentamos evidencias de que vg actúa de forma no autónoma celular para dirigir el desarrollo de las regiones proximales del ala mediante la activación de los genes rotund (rn), nubbin (nub) y wingless (wg). Nuestros resultados predicen un mecanismo en dos fases en el que, primero, vg activa estos tres genes de forma no autónoma celular en la región proximal del ala y después wg induce proliferación celular en esta región. Se ha descrito que la actividad de omb es requerida en el borde dorsoventral del ala. Nuestros resultados sugieren que omb está implicado en el desarrollo proximodistal a través de su implicación en los mecanismos de señalización del organizador anteroposterior.omb se requiere de forma autónoma celular como mediador de algunas de las respuestas celulares dependientes, de Cecapentaplegic (DPP) en el ala. Concretamente, omb está implicado en la regulación transcripcional de vg.,spalt (sal) y trickveins (tkv), que habían sido descritos como genes diana de la vía de DPP. Proponemos un modelo en el que omb integral la vía de DPP en los mecanismos de especificación del eje proximodistal debido al requerimiento de WG para activar omb.

Autor: PEREGRIN ALVAREZ JOSE MANUEL.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: C.I.F.A. LAS TORRES Y TOMEJIL - ALCALÁ DEL RÍO (SEVILLA).

Resumen: La evolución de enzimas y rutas metabólicas ha sido objeto de intensos estudios. Sin embargo, hasta ahora estos trabajos previos sólo se han centrado en un pequeño número de familias de enzimas o rutas bioquímicas. En la presente Tesis se describe la distribución filogenética de todo el complemento metabólico conocido de Escherichia coli, utilizando un método basado en la comparación de secuencias frente a bases de datos taxón-específicas. La mitad de las enzimas metabólicas tienen homólogos en todos los dominios de la vida (Archaea, Bacteria y Eucarya), representando familias involucradas en algunos de los procesos celulares más importantes. Con la presente Tesis se demuestra, por primavera vez y de una forma exhaustiva, que el metabolismo se encuentra conservado a nivel de enzima. Además, el presente análisis sugiere que a pesar de la conservación de las secuencias y de la extensa distribución filogenética de las enzimas metabólicas, su agrupación en rutas bioquímicas es más variable de lo que previamente se pensaba. Por otro lado, descubrimos recientes en el análisis de genomas han mostrado que la predicción computacional de la función de las proteínas en genomas completos no está limitada únicamente a los métodos de homología de secuencias. Los métodos llamados "genome context" utilizan otra información de las secuencias de genomas completos para predecir la función de una proteína. Estas predicciones se obtienen mediante la detección de la similitud existente entre pares de proteínas "componentes" y proteínas "compuesto" (proteínas fusionadas). Puesto que la cantidad de proteínas "compuesto" se encuentra limitada en la naturaleza, hemos aumentado este conjunto de proteínas mediante la creación de proteínas fusionadas "artificialmente" a partir de pares de proteínas cuya interacción se ha demostrado experimentalmente. El objetivo es estudiar la extensión filogenética de las interacciones entre pares de proteínas mediante un incremento en las distancias filogenéticas utilizando un método automático. De esta forma, hemos detectado pares de proteínas "componentes" en ocho genomas completos. Nuestros resultados indican que las interacciones de proteínas no están conservadas a grandes distancias filogenéticas. Además, hemos comparado algunos de los métodos experimentales disponibles para la determinación de interacción de proteínas, con el objetivo de analizar la calidad de los datos disponibles en las bases de datos. Finalmente, nuestros resultados proveen un conjunto de predicción de genes asociados funcionalmente en ocho especies utilizando información experimental y se demuestra la aplicabilidad de los análisis de "fusión génica" en la genómica comparada de los fenómenos de interacción de proteínas.

Autor: AGIRRE ENA XABIER.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: TP53 es un gen supresor tumoral situado en el brazo corto del cromosoma 17 (17p13) implicado en el control del ciclo celular y la apoptosis. Este gen se encuentra inactivado en la mitad de los tumores humanos debido a mutaciones puntuales. En las neoplasias hematológicas esta frecuencia es inferior que en los tumores sólidos, sin embargo cuando están presentes son de gran valor pronóstico. En el caso concreto de la leucemia aguda linfoblástica (LAL), se ha observado una frecuencia de mutaciones del 2-3%. La diferencia en la frecuencia de mutaciones entre tumores sóliods y neoplasias hematológicas puede deberse en primer lugar a que realmente estas alteraciones no sean muy frecuentes en este tipo de enfermedades. En segundo lugar, puede deberse a que en la mayoría de los análisis de mutaciones realizados en neoplasias hematológicas únicamente se hayan estudiado los exones del 5 al 8 y a que las técnicas de detección de mutaciones utilizadas en los distintos estudios (fundamentalmente SSCP y secuenciación) no presentan la suficiente sensibilidad para el estudio de muestras neoplásicas (y en particular las hematológicas) en las que las moléculas normales pueden enmascarar la detección de las mutantes. En ocasiones la mutación es uno de los alelos del gen suele presentarse acompañado de la deleción del otro. Otro de los mecanismos que se ha propuesto para la inactivación de la expresión de determinados genes en el cáncer es la metilación de sus promotores. Normalmente esta alteración se observa en dinucleótidos simétricos CpG que se encuentran en regiones denominadas islas CpG, pero un estudio reciente ha demostrado la posibilidad de la metilación de las citosinas internas en los dominios CCWGG (siendo W=A ó T). A pesar de la gran cantidad de estudios realizados sobre TP53 en los procesos neoplásicos, no se tiene ninguna informaicón sobre esta alteración en su promotor. Con la finalidad de estudiar la frecuencia de inactivación del gen TP53 en pacientes con LAL recibidas en el momento del diagnóstico, se ha realizado: 1,- Rastreo molecular de mutaciones mediante la técnica de lexon-DGGE. 2,- Análisis de la deleción de alguno de los alelos del gen mediant FISH. 3,- Análisis de la metilación de su promotor. RESULTADOS El análisis de mutaciones realizado reveló la presencia de 19 patrones electroforéticos alterados en 15 de los 57 pacientes con LAL (26,3%, 15/57). Diez de los patrones alterados se detectaron en el fragmento B del exón 4, correspondiendo todos ellos al polimorfismo R72P. Otros tres patrones alterados se detectaron en la DGGE realizada para el exón 5. Los tres correspondían a una mutación con cambio de sentido, dos de ellos localizados en el codón 132 y uno en el codón 179 de p53. Otros tres patrones alterados correspondieron a un polimorfismo silencioso en el codón 213 codificado por el exón 6 de TP53. Los otros tres patrones se detectaron en la realización de la DGGE del lexon 10+1. Dos de ellos correspondían a una nueva mutación con cambio de sentido en el codón 366 de p53 (exón 10) y el último a la sustitución de una guanina por una adenina en el nucleótido 872 correspondiente al exón 1 no codificante (g872G-A). El análisis de mutaciones realizado, reveló 10,5% de mutaciones no silenciosas (6 muestras con mutación en 57 muestras analizadas). Esta frecuencia es mayor que la observada en otros estudios realizados en LAL (2-3%). Una de las causas de la mayor incidencia encontrada en este estudio puede deberse a la frecuencia de mutaciones detectadas fuera de la región frecuentemente estudiada. En este caso, el 50% de las mutaciones no silenciosas (3/6) se observaron fuera de los exones 5 al 8, presentando una frecuencia algo mayor que la observda en otros estudios (10-33%). El análisis de la metilación reveló la existencia de una hipermetilación en 8 de las muestras (32%, 8/5). En 2 de las muestras se observó que la metilación afectaba a todos los dominios estudiados, mientras que en 5 se observó metilación sólo en los dominios CCWGG. Sólo una de las muestras analizadas presentó metilación únicamente en el dinucleótido CpG. En 5 de las 8 muestras que presentaron un patrón demetilación de la región promotoras de TP53, se analizó la posible implicación de esta alteración en la expresión del gen mediante RT-PCR semicuantitativa. En todas ellas se observó una disminución de los niveles del mRNA. El análisis realizado mediante FISH, reveló la pérdida de uno de los alelos de TP53 en tres muestras de pacientes con LAL. En dos, la pérdida afectaba únicamente a la región de la localización del gen TP53 en 25% y 9% de las células respectivamente. En la otra muestra, se observó la pérdida completa de uno de los cromosomas 17 en 84% de las células analizadas. En otras tres muestras se observaron tres copias completas del cromosoma 17. CONCLUSIONES Teniendo en cuenta los tres tipos de alteraciones analizadas (mutaciones, hipermetilación del promotor y deleciones), se puede comprobar que TP53 se encuentra alterado en, al menos, el 33% de las LAL de nuestra serie. Esta frecuencia aumenta a un 40% (23/57) si tenemos en cuenta las 57 muestras analizadas (además de las 18 en las que el análisis fue completo, en otras 39 se realizó un análisis parcial). Entre los tres tipos de alteraciones, la metilación del promotor es la alteración más frecuente (32%) seguida de las mutaciones no silenciosas (10,5%) y de la deleción de uno de los alelos (7,5%). Por primera vez se ha demostrado la metilación delos dominios CCWGG en TP53 y, en general, en neoplasias humanas y que éstos contribuyen al control de la actividad promotora en células humanas y que pueden coloborar con la metilación de los dinucleótidos CpG en la regulación epigenética de distintos genes. Estos resultados indican que la metilación del promotor de TP53 es la causa más frecuente de inactivación de la función de p53 en LAL, frente a lo descrito previamente, ya que los estudios realizados hasta ahora señalaban a las mutaciones puntuales como las alteraciones más frecuentes que producen la inactivación de su función.

Autor: ANDIÓN IBÁÑEZ ESTHER .
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: Nuestro estudio se ha basado en los astrocitomas, la neoplasia cerebral más frecuente SNC. En concreto se ha centrado enl os astrocitomas de alto grado, grupo donde incluyen los pacientes con menor supervivencia y mayor resistencia al tratamiento. Uno de los tratamientos que parecen resultar más efectivo son los agentes alquilantes donde se incluyen las nitrosureas (como el BCNU) y las tetrazinas. El mecanismo que más eficazmente repara dichas lesiones y por tanto responsable en gran medida de la resistencia tumoral es una enzima denominada MGMT (metilguanina-metiltransferasa). Entre sus mecanismos de inactivación podemos encontrar la metilación de su promotor y la regulación de su expresión por parte del gen TP53. Hemos analizado la metilación del promotor del gen MGMT mediante MSP (PCR específica de metilación), la expresión de su mensajero por PCR en tiempo real y de su proteína mediante inmunohistoquímica en una serie de 50 pacientes con astrocitomas de alto grado. La metilación del promotor de MGMT disminuye la transcripción y la traducción en líneas celulares, aunque no lo hemos podido demostrar en biopasias humanas por la contaminación con células normales. Además, es uno de los principales mecanismos de inactivación de dicho gen y aumenta de manera significativa la supervivencia de pacientes con astrocitomas de alto grado tratados con agentes alquilantes. Por otro lado, las mutaciones puntuales es uno de los mecanismos de inactivación del gen TP53 en astrocitomas de alto grado y no se correlaciona con la expresión de su proteína. Tampoco es un factor pronóstico de utilidad en la supervivencia de estos pacientes.

Autor: VILLAR BÉCARES JOAQUÍN.
Año: 2002.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD.

Resumen: Se ha descrito que la expresión de la deshidrogenasa de 17beta-hidroxiesteroides tipo 8 (17-beta HSD tipo 8) está disminuida en modelos murinos de la forma autosómica recesiva del riñón poliquístico (ARPKD). Ya que el esclarecimiento del mecanismo de control de la expresión de esta enzima podría ayudar a entender los desequilibrios que se producen en la ARPKD, en este trabajo hemos analizado el promotor del gen de la 17beta-HSD tipo8 humana, hHSD17B8, también llamado HKE6. La determinación del sitio CAP se ha realizado por primer extensión y ha mostrado dos sitios principales de inicio de la transcripción en las posiciones -30 y -154 del gen. El extremos 5' del gen, que carece de caja TATA, pero posee numerosos posibles sitios de unión para factores de transcripción, tiene actividad promotora en células HepG2 y CV-1. Aunque esta actividad es más eficaz en las células HepG2, la región comprendida entre los nucleótidos -75 y +36 del gen es suficiente para que se produzca la transcripción en ambos tipos celulares. Esta región contiene dos cajas CCAAT de las que al menos una, situada en la posición -44, es imprescindible para la transcripción del gen. En extractos proteicos nucleares de células HepG2 imprescindible para la transcripción del gen. En extractos proteico nucleares de células HepG2 ambas cajas CCAAT interaccionan de forma específica con el factor de transcripción C/EBPbeta. A pesar de ello, el tratamiento con IL-6 no modifica la actividad del promotor en células HepG2. En estas células la región comprendida entre los nucleótidos -260 y -75 del gen, que contiene posibles elementos de unión para los factores de transcripción Sp1, SREBP-1 y Ap1, se comporta como un enhancer. Aunque el 25-hidroxicolesterol no modifica la actividad del promtor en células HepG2, el 17beta-estradiol incrementa dicha actividad. Este incremento, que se manifiesta incluso en el promotor mínimo se produce a través de las cajas CCAAT.

Autor: MALLORQUI FERNÁNDEZ M. GORETTI.
Año: 2002.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: D. BIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE GIRONA Y INST. BIOLOGÍA MOLECULAR DE BARCELONA-CSIC.

Resumen: Las dos proteínas estudiadas en este trabajo (ECP o RNasa 3 y RNasa 1N7) pertencen a la superfamilia de la RNasa A y resulta especialmente interesante su aplicaicón potencial en la terapia y/o diagnóstico del cáncer. Además de su capacidad ribonucleolítica, ECP presenta otras actividades, tales como la antibacteriana, helmintotoxicidad o citotoxicidad contra células y tejidos de mamíferos. Para la RNasa 1 de tipo pancreático expresada por las células endoteliales humanas también se ha descrito una función defensiva. La RNasa 1N7, en cambio, no presenta este tipo de acciones biológicas, aunque es relevante su menor afinidad frente al inhibidor específico de ribonucleasas en relación con otros miembros de la familia. ECP y RNasa 1N7 se han cristalizado mediante la técnica de difusión de vapor en gota colgante, y se han determinaod sus estructuras tridimensionales (3D) con el método del reemplazo molecular. Para el refinamiento de estas estructuras se han usado datos hasta 1,75 y 1,90 A respectivamente. Ambas estructuras exhiben el plegamiento típico alfa+beta que caracteriza a todos los miembros de la superfamilia de la RNasa A. Sin embargo, las diferencias que muestran en comparación con la estructura de otras RNasas permite explicar, de un lado, la baja actividad ribonucleolítica de estos enzimas y, de otros, sus peculiaridades funcionales.

Autor: OCAÑA FUENTES AURELIO.
Año: 2002.
Universidad: REY JUAN CARLOS.
Centro de lectura: CIENCIAS DE LA SALUD.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. DE LA SALUD.

Resumen: La diabetes mellitus y las enfermedades cardiovasculares encabezan las causas de morbilidad y mortalidad en España así como en el resto de los países occidentales. Las principales complicaciones que aparecen en las personas con diabetes son las complicaciones cardiovasculares. Éstas no sólo se presentan con mayor frecuencia en la población diabética sino que, además, la edad de presentación es mucho más temprana, su evolución es más rápida y cursan con mayor severidad que en las personas sin diabetes. Tanto la ECV como la diabetes son enfermedades poligénicas y multifactoriales, es decir, que aparecen como consecuencia de una compleja interacción entre factores ambientales y una base genética en la que se encuentran alteraciones en un gran número de genes. Estas alteraciones genéticas son debidas a cambios aleatorios en la secuencia del ADN que dan lugar a la aparición de distintos alelos en la población y que en definitiva se traduce en la existencia de varias isoformas para una proteína, que si bien no tienen porque producir ninguna afectación funcional a la proteína pueden aportar un mayor esfuerzo metabólico al organismo que en presencia de un marco ambiental desfavorable, facilite la aparición y desarrollo de la enfermedad. La culminación del proyecto genoma junto al desarrollo en las técnicas de la biomedicina efectuadas en los últimos años han permitido, si bien no distinguir estas isoformas, si distintiguer los alelos que las codifican identificando los cambios en las secuencias del ADN y, en definitiva, permitir una correlación entre cambios en la secuencia con determinados estados fisiopatológicos (Asociación Genética) como la enfermedad cardiovascular. Por definición, un cambio en la secuencia es considerado como polimorfismo cuando se presenta en más del 1% de la población. Una vez conocida la frecuencia de aparición de un alelo en una determinada población con enfermedad cardiovascular se compara con su frecuencia en la población sana. Si el alelo en cuestión es significativamente más frecuente en el grupo con ECV estamos ante un marcador genético de riesgo de dicha enfermedad, que si bien, no supone un diagnóstico de certeza a desarrollar la enfermedad cardiovascular, revela si se presenta una mayor propensión a desarrollar la enfermedad. La presente memoria describe un estudio de polimorfismos en el ADN como marcadores de variantes alélicas de múltiples genes candidatos de riesgo cardiovascular, para genotipar en una muestra de personas con diabetes, que están siendo controlados muy estrechamente desde el punto de vista sanitario por el Grupo de la Sociedad Española de Diabetes para el estudio de la Nutrición. Para ello se estimó la prevalencia de los alelos y distribución de genotipos de varios genes que son de gran interés en la prevención de la aparición y desarrollo de la enfermedad caridovascular en las personas con diabetes, como son: Los polimorfismos en la Apolipoproteína E (E2, E3 y E4), en la Proteína de Transferencia de Ésteres de Coleterol (Taq I B y I405V) y de la Apolipoproteína A I (-75 y +83) relacionados todos ellos con el metabolismo y transporte lipídico. Los polimorfismos 55 y 192 de la Paraoxonasa, relacionados con la función endotelial. Los polimorfismos de la Enzima Convertidora de Angiotensina (inserción/delección) del Receptor 1 de Angiotensina II (A1166C) y del Angiotensinógeno (M235T) relacionados con el Sistema Renina-Angiotensina. Y los polimorfismos en la Metilén Tetrahidrofolato Reductasa (C677T), en la Cistationina Beta Sintasa (inserción/delección) y Metionina Sintasa (A2757G) relacionadas con el metabolismo de la homocisteína. Además, correlaciona el genotipo establecido experimentalmente con parámetros bioquímicos y clínicos asociados a las diferentes manifestaciones cardiovascular. Con ello se pretende determinar la contribución del componente genético en la aparición de enfermedades cardiovasculares y prevenir la morbilidad y mortalidad cardiovascular en la población con diabetes estudiada.

Autor: PEÑA DEL RIVERO MARCOS DE LA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Se ha identificado una cepa no sintomática (CChMVd-NS) del viroide del moteado clorotico del crisatemo. El analisis de clones de cDNA de dicha cepa ha demostrado que son muy similares a los obtenidos de cepas CChMVd-S, aunque otras eran completamente nuevas. Bioensayos en crisantemo mostraron que cDNAs de CChMVd-NS eran infecciosos y no sintomaticos. Mediante mutagenesis dirigida se comprobó que la substitución UUUc por GAAA era suficiente para provocar el cambio de fenotipo sintomatico a no sintomatico. Este determinante de patogenicidad el primero de esta clase identificado en un viroide de ribozimas de cabeza de martillo, se localiza en un tetrabucle dentro de la conformacion ramificada predicha para el RNA del CChMVd. Además, el analisis de la heterogeneidadde secuencia encontrada en variantes del CChMVd confirma la existencia de dicha conformacion in vivo, lo que demuestra que la estructura secundaria de tipo varilla no es un paradigma universal para los viroides. Tambien se realizo un estudio detallado de este determinante de patogenicidad mediante mutagenesis dirigida, bioensayos y analisis de la progenie resultante. A diferecia de lo observado en otros RNAs, el tetrabuble GAAA caracteristico de cepas CChMVd-NS no fue funcionalmente intercambiable por tetra bucles de la familia UNCG, lo que sugiere que este motivo esta conservado mas por razones de secuencia que de estructura. En muchos casos, los cambios introducidos terminaron dando lugar a una infeccion sintomatica, aparecio el tetrabucle GAAA de forma mayoritaria en la progenie de las plantas infectadas que ademas mostraron un fenotipo asintomatico. Estos resultados revelan la existencia de dos picos de eficacia para el tetrabucle (UUUC y GAAA). Co-inoculaciones con variantes de cepas (CChMVd-S y NS), mostraron que solo cuando esta ultima se encuentra en un exceso de 100 o 1000 veces, las plantas permanecen asintomaticas, confirmando la mayor eficacia biológica de la variante sintomatica y explicando la ausencia de expresion de sintomas observada previamente en expermentos de proteccion cruzada. La heterogeneidad de secuencia encontrada en variantes CChMVd-S y NS apoya la exitencia invivo de una de interaccion pseudonudo que ha sido propuesta entre dos bucles de este viroide. Por ultimo, aunque estudios previos han definido un centro catalitico conservado en la mayoria de las ribozimas de cabeza de martillo naturales, se desconoce el porque algunas presentan ciertas desviaciones respecto al consenso. Se ha estudiado esta cuestion valiendose del CChMVd, cuya ribozima de cabeza de martillo de polaridad positiva presenta una A extraña (A10) entre las posiciones A9 y G10.1. Hasta la fecha, no se ha examinado el efecto de inserciones en esta posición sobre la cinetica de la ribozima de cabeza de martillo. Se combrobo que A10 causa un descenso moderado en la constante de velocidad de corte en trans respecto la ribozma de cabeza de martillo (+) del CChMVd sin dicho residuo, mientras que las substituciones A10--->y A10 --->G10 tuvieron efectos negativos importantes. Por el contrario, la sustitucion A10--->U10 indujo un aumento de la constante de velocidad de hasta 3 veces. Como A10 ocupa un lugar singular e indispensable en la conformacion global del CChMVd tal y como se revelo mediante bioensayos, estos resultados sugieren que algunas ribozimas se desvian del consenso debido a que ciertos residuos estan implicados en funciones distintas a la del autocorte.la incorporacion de U10 en una ribozima de cabeza de martillo modelo tambien causó un incremento similar en la constante de velocidad, aportando informacino para una comprension mas profunda de los requerimientos estructurales de la ribozima de martillo asi como para el diseño de ribozimas mas eficientes.

Autor: GARACÍA MEDIAVILLA M. VICTORIA .
Año: 2001.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA, UNIVERSIDAD DE LEÓN.

Resumen: La beta-ciclodextrina (beta-CD) es un compuesto que forma complejos de inclusión con una gran variedad de moléculas, especialmente con los ácidos biliares y los esteroles. En este estudio hemos investigado el efecto de la beta-CD sobre el metabolismo y la secreción de ácidos biliares en ratas hipercolesterolémicas. Para ello, se utilizaron ratas macho de raza Wistar, repartidas en cuatro grupos que recibieron durante 6 semanas: dieta control, dieta con un 2% de colesterol, dieta con un 2% de colesterol y un 2,5% de beta-CD, y dieta con un 2% de colestero, y un 5% de beta-CD. La dieta enriquecida con colesterol indujo hepatomegalia que estuvo acompañada por una menor secreción biliar de colesterol, fosfolípidos y ácidos biliares. La adición beta-CD en la dieta normalizó la secreción biliar de lípidos. Además, cuando se comparó con la dieta con colesterol añadido, la beta-CD disminuyó significativamente la concentración plasmática de fosfolípidos y la relación molar hepática de colesterol libre/total, incrementó la excreción fecal de ácidos biliares y aumentó la actividad colesterol 7alfa-hidroxilasa y la cantidad de su ARNm. La beta-CD al 5% también redujo la concentración plasmática de triglicéridos. La adición de beta-CD en la dieta no fuez capaz de revertir el efecto causado por el colesterol sobre la actividad HMG-CoA reductasa hepática, si bien indujo la expresión de su gen. En conclusión, la adición de beta-CD a una diera enriquecida con colesterol provca una disminución de lípidos biliares, aumentando la síntesis y la excreción de ácidos biliares y normalizando la secreción biliar de lípidos.

Autor: PALOMEQUE RODRIGUEZ CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se ha aislado el gen pab1 de S.pombe, que codifica para una proteína esencial de la familia de proteínas de unión a poli-A. La sobrexpresión de la proteína Pab1 en S.pombe provoca una defecto en el ciclo celular a 25ºC, mientras que a 35ºC estas células mueren. El fenotipo de muerte celular causado por la sobrexpresión de Pab1 a 35ºC, es idéntico al causado por el gen proapoptótico Bak de mamífero en S.pombe, definido como apoptosis en esta levadura. Por lo tanto se puede concluir que el exceso de Pab1 causa apoptosis en las condiciones descritas anteriormente. Durante este proceso de apoptosis, la levadura degrada su DNA cromosómico y paralelamente aumenta el contenido de DNA mitocondrial. Este aumento en el DNA mitocondrial no está acompañado de un incremento en el número de mitocondrias. Además de la alta temperatura, tanto el etanol como la formamida inducen apoptosis en las células que sobrexpresan Pab1, por lo que este fenómeno se asocia a la respuesta general a estrés de la levadura. Por otro lado, el hecho de que una misma modificación genética pueda interferir en el ciclo celular e inducir apoptosis sugiere que ambos procesos comparten mecanismos comunes. La proteína Cdc2 es esencial para el proceso de apoptosis dependiente de Pab1 al igual que la chaperona Hsp91, posiblemente por su papel en el control de Cdc2. La sobrexpresión de PAB1 de humano en S.pombe cuasa el mismo efecto apoptótico que la proteína endógena, indicando que este gen podría ejercer este mismo efecto en sus propias células.

Autor: ALVAREZ CALLEJAS NURIA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA UCM.

Resumen: Las prostaglandinas son importantes mediadores en la fisiología hepática, gástrica, reproductiva, renal, cardiovascular y pulmonar. Su síntesis se encuentra alterada en procesos inflamatorios, sepsis, cáncer, enfermedad de alzheimer y otras situaciones patológicas. De forma resumida podemos destacar: * La COX-2 se expresa en hepatocitos fetales (HF) estimulados con LPS o citoquinas pro-inflamatorias tanto a nivel de proteína como a nivel de mRNA. Los hepatocitos adultos (HA) no expresan COX-2 cuando son tratados en idénticas condiciones. Esta respuesta de COX-2 a los estímulos decrece después del nacimiento y desaparece en hepatocitos post-nasales. * Los factores de transcripción de la familia de los C/EBPs, que se unen principalmente al sitio NF-IL6 en el promotor de COX-2, tienen una importancia significativa en la expresión de COX-2 por LPS en HF y células AT3F. Los HF y las células AT3F tienen niveles importantes de C/EBP, el cual está ausente en las células adultas, mientras que la isoforma predominante en los hepatocitos adultos es el C/EBPalfa. La presencia de elevados niveles de C/EBPalfa, es en parte responsable de la no inducibilidad de COX-2 en el hepatocito adulto. * Las PGs producidas por COX-2 tras la HP tienen un papel regulador en el proceso regenerativo del hígado. En animales con NS-398 o animales COX-2, los niveles del antígeno nuclear de proliferación celular están disminuidos y aumentan los niveles de p27KPI indicando que cuando se inhibe COX-2 hay un retraso en la proliferación celular. La expresión de COX-2 en hígado regenerante está en relación con la disminución en los niveles de C/EBPalfa y el incremento en la expresión d eC/EBPbeta y C/EBP. * El tratamiento de cultivos primarios de HF con citoquinas pro-inflamatorias, LPS y HGF promueve la expresión de COX-2 y la síntesis de PGs. Bajo estas condicines las formas activas de las metaloproteasas MMP2 y MMP9 se liberan al medio extracelular, proceso que se inhibe cuando la síntesis de PGs se suprime farmacológicamente con inhibidores de COX-2. Por otro lado, los inhibidores de la proteína quinasa A, p38 MAP quinasa, Pl3K y NF-kB disminuyen la liberación de MMPs en respuesta a PGE2 indicando la participación de múltiples vías en el proceso.

Autor: LORENZO ÁLVAREZ ELISA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA.

Resumen: En esta tesis doctoral se pretendía identificar agentes inductores de apoptosis en células endotelilales para diseccionar los mecanismos y genes implicados en la cascada apoptótica. Así como estudiar mecanismos de transducción de señales y factores de transcripción implicados en la respuesta del endotelio vascular a la activación por VEGF. Estos objetivos nos han dirigido al análisis de los mecanismos por los que la droga quimioterapeútica Doxorrubicina induce apoptosis en células endoteliales y, al estudio del papel de los factores de transcripción NFAT y AP-1 en la activación de células endoteliales por VEGF. Los resultados obtenidos fueron que la droga quimioterapeútica Dox indujo apoptosis en células endoteliales subconfluentes por un mecanismo dependiente de p53 e independiente de CD95, que requiere de la activación de la cascada de caspasas y de la ruta mitocondrial. Así mismo Dox reguló la expresión del gen apoptótico CD95 a través de la activación del factor de transcripción p53. Otro efecto encontrado fue que VEGF no protegía a las células endoteliales de la apoptosis inducida por Dox, aunque estaba implicado en las señales de activación vascular, que implican la activación de las MAP quinasas ERKs y p38, pero no de JNK/SAPK. VEGF también indujo la traslocación nuclear de NFATc2 y la activación transcripcional de los factores de transcripción AP-1 y NFAT en células endoteliales. Así mismo, VEGF indujo la expresión de TF y Cox-2 por un mecanismo sensible a CsA y, a través de la activación de NFAT. Por un lado, la inducción de la expresión de CD95 y el efecto preferencial de esta droga por las células endoteliales que están proliferando sugieren la posibilildad de que la actividad antitumoral de Dox "in vivo" se produzca por un mecanismo antiangiogénico. Por lo tanto, el uso combinado de drogas quimioterapeúticas con inhibidores de p53 como PFT-alfa, puede suponer la eliminación de parte de los efectos secundarios originados, pero a su vez también puede eliminar el potencial efecto antiangiogénico de Dox "in vivo". Por otro lado, la identificación de NFAT y AP-1 como factores de transcripción que cooperan para transcribir genes en respuesta a VEGF, y la implicación de NFAT en angiogénesis puede ayudar a localizar dianas terapeúticas para regular diferentes procesos angiogénicos.

Autor: MORALES CAMARZANA MÓNICA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA).

Resumen: En esta Tesis se estudia diferentes aspectos relacionados con la replicación y transcripción del genoma del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV), un virus RNA de polaridad positiva perteneciente a la familia CALICIVIRIDAE. Este virus no crece en cultivos celulares lo que ha limitado el avance en el conocimiento de la biología molecular de este virus y en sus mecanismos de replicación en particular. Por este motivo se abordaron diferentes objetivos que nos permitieran conocer los mecanismos de replicación del virus. Para ello se estudiaron y caracterizaron los RNAs encapsidados en las partículas virales. Además se estudio el papel de la VPg, proteína unida convalentemente al RNA viral, en la traducción de los RNAs virales del RHDV y en su infectividad. También se utilizó la RNA polimerasa del RHDV producida en el sistema de baculovirus y en bacterias para estudiar la replicación del RNA viral y el mecanismo de síntesis del RNA mensajero subgenómico.

Autor: SAMPER RODRÍGUEZ ENRIQUE.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BITECNOLOGÍA.

Resumen: LOS TELOMEROS SON UNAS ESTRUCTURAS NUCLEOPROTEICAS EN LOS EXTREMOS DE LOS CROMOSOMAS EUCARIOTICOS. EN ESTA TESIS DOCTORAL SE HAN EVALUADO LAS CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN DE: 1,- LA TELOMERASA 2,- KU86 3,- DNA-PKCS Y PARP-1 EN RATONES DEFICIENTES (KNOCK-OUT) PARA ESTAS PROTEÍNAS. EN ESTE ESTUDIO SE HA LLEGADO A LAS SIGUIENTES CONCLUSIONES 1,- La actividad telomerasa no es necesaria para la inmortalidad espontánea ni para la transformación celular por la expresión de las oncoproteínas E1A-HrasV12, en fibroblastos embrionarios de ratón. En ambas situaciones, la ausencia de telomerasa aumenta la inestabilidad cromosómica y favorece la aparición de mecanismos ALT. 2,- Los fenotipos de los ratones mTerc -/- son más severos en ratones mTerc -/- de fondo genético Bl/6, que en ratones mTerc -/- de fondo mixto BL/6-129Sv, debido a la menor longitud y heterogeneidad telomérica del fondo Bl/6. Esto indica que el número de generaciones de ratón que se puede obtener en ausencia de telomerasa es proporcional a la longitud de telómeros de la cepa. 3,- Se ha comprobado que la reconstitución de la actividad telomerasa en ratones G4 mTerc-/- es suficiente para alargar los telómeros críticamente cortos, prevenir la inestabilidad cromosómica y rescatar in vivo todos los fenotipos de los animales G4 mTerc-/-. Este estudio demuestra la aplicabilidad de la telomerasa en tratamientos de patologías debidas a un acortamiento telomérico crítico. 4,- La proteínas Ku86 tiene funciones esenciales para la protección telomérica. Las células primarias de Ku86-/-, muestran un alargamiento telomérico y presentan una alta frecuencia de aberraciones citogenéticas. Concretamente, la ausencia de Ku86 promueve la aparición de fusiones teloméricas y un gran número de roturas cromosómicas. 5,- La proteína DNA-PKcs también es necesaria para la función telomérica, aunque las células DNA-PKcs-/- tienen telómeros de longitud normal. Las células primarias DNA-PKcs-/- presentan un fenotipo menos acusado de disfunción telomérica que las células Ku86-/-, lo que explica la menor severidad del fenotipo de los ratones DNA-PKcs-/- comparados con los ratones Ku86-/-. Por otro lado, se ha demostrado que los ratones Scid, deficientes en DNA-PKcs, presenta un fenotipo drástico de alargamiento telomérico y, por tanto, no son equivalentes a los ratones DNAPKcs-/-. 6,- Los ratones PARP-1 *A-/- presentan telómeros de longitud y función normal. Estos ratones muestran un ligero aumento de las aberraciones cromosómicas que pueden ser el resultado del papel de PARP-1 en la reparación del daño al DNA.

Autor: PANTOJA CASTRO CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: En el trabajo presentado en esta memoria, hemos analizado la senescencia prematura y mecanismos implicados en esta respuesta, en fibroblastos embrionarios de ratón. Hemos encontrado que el supresor de tumores p19 Arf es esencial para la respuesta antiproliferativa inducida por la expresión de oncogén Ras. La expresión de RasV12 produce un aumento en la expresión de p19 Arf, provocando a su vez la estabilización de p53, que induce la parada del ciclo celular. Hemos analizado el papel de p21Cip1 en la inmortalización y en la senescencia prematura inducida por Ras oncogénico, empleando fibroblastos embrionarios deficientes en p21Cip1. Hemos observado que p21Cip1 no es importante en estos procesos, ya que, como las células Wild-type (o silvestres), las células p21-/- entran en senescencia y requieren mutaciones adicionales para inmortalizarse, que generalmente afectan a p53, p16Ink4a ó p19Arf. Estas células responden a la expresión de RasV12 acumulando p53 y p16Ink4a, lo que produce una disminución del crecimiento. De acuerdo con esto, las células deficientes en p21Cip1 son resistentes a la transformación neoplásica producida por RasV12. Hemos examinado el estado funcional de p19Arf en las células derivadas de ratones deficientes en los exones 2 y 3 del locus INK4a/ARF. El interés de este estudio radicaba en que aún no se había determinado inequívocamente la funcionalidad de p19Arf en estas células, que son usadas para múltiples estudios. Hemos encontrado que estas células expresan un transcrito formado por el exón 1beta de p19Arf y por el exón 4 de otro gen, NTp16 (ver más adelante). La regulación de este transcrito quimérico ARF-NTp16 es normal, pero no hemos podido detectar la proteína. Estos resultados sugieren que las células INK4a/ARF-/- no conservan la funcionalidad de p19Arf. Hemos encontrado un gen, al que hemos denominado NTp16 (Next-To-p16), que se localiza en dirección 3' respecto al locus INK4a/ARF, lo que le da un papel como posible supresor de tumores. La expresión de este gen se ve afectada por la deleción de los exones 2 y 3 de locus INK4a/ARF. Con el objeto de descubrir nuevos mecanismos implicados en la senescencia, hemos caracterizado los cambios en la expresión génica producidos por las divisiones celulares. En concreto, hemos comparado el perfil de expresión de fibroblastos embrionarios de ratón con pocas o con muchas divsiones celulares, mediante el uso de microarrays de cDNA. Hemos encontrado que la acumulación de divisiones celulares induce la represión de la mayoría de los genes sometidos a imprinting analizados, y hemos denominado a este fenómeno, GRIM (General Repressión of Imprinted Genes). También, hemos visto que es necesaria la división celular para que este proceso se produzca, ya que no ocurre en células a las que se les impide dividirse. Datos preliminares indican que este proceso está asociado a la metilación de los promotores correspondientes y que también ocurre en tumores.