BIOLOGIA MOLECULAR, 4

Autor: SANJUAN RODRÍGEUZ MIGUEL ANGEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La isoforma alfa de la diacilglicerol quinasa transloca a la membrana plasmática durante la activación de células T. Dicha translocación es capaz de fosforilar el diacilglicerol de la membrana plasmática que ha sido previamente generados por la acción de una fosfolipasa C. La modulación del DAG de la membrana plasmática llevada a cabo por DGK en este sistema conduce al control de la expresión de genes que responden a dicho segundo mensajero lipídicos entre ellos el antígeno de expresión temprana CD69. Durante el transcurso de esta tesis hemos generado una serie de mutantes entre los cuales una versión que se comporta como un dominante negativo sobre la enzima endógena y una versión constitutivamente activa, que junto con el uso de inhibidores específicos de la DGK nos han permitido demostrar que diferentes actividades DGK regulan la duración e intensidad del pol de DAG que ha sido generado por PLC. La DGK alfa presenta 3 dominios que han sido caracterizados funcionalmente. Determinándose dentro de ellos la región catalítica de la enzima y el dominio de interacción de esta enzima con la membrana plasmática. Además hemos determinado que el dominio de unión a calcio que presenta esta isoforma está regulando tanto la actividad como la localización de esta enzima.

Autor: GIL PAGÉS DIANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UAM.

Resumen: En la tesis se realiza una búsqueda de proteínas citoplásmicas con capacidad de asociación con el dominio intracitoplásmico de la molécula de CD3*. CD3* forma parte del receptor para el antígeno de las células T, el complejo TCR-CD3. Este receptor tiene como función la activación del linfocito T cuando ocurre el contacto con antígenos. La activación celular está mediada por los dominios citoplásmicos de las proteínas del CD3, mediante un motivo conservado a lo largo de la evolución denominado ITAM, que está presente en todas ellas. La caracterización de ligandos citoplásmicos nuevos para el dominio citoplásmicos de CD3* permite el estudio del mecanismo de activación del complejo TCR-CD3 y el descubrimiento de nuevos motivos implicados en la transmisión de señales del receptor diferentes de la secuencia ITAM. En concreto este trabajo ha demostrado que las proteínas nucleolina y Nck son ligandos de CD3* cuando el receptor contacta con estímulos. El estudio de estas interacciones ha permitido descubrir que el receptor sufre un cambio en su estructura necesario para el inicio de las señalización celular que conlleva la activación del linfocito T. Además se demuestra que CD3* contiene una secuencia de residuos de prolinas, independiente de motivos ITAM, que también resulta imprescindible durante el proceso de transmisión de señales y activación celular en el linfocito T.

Autor: VELASCO SAMPAYO ANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS "ALBERTO SOLS".

Resumen: Cot/Tpl-2 quinasa, homólogo de miembros de la familia de proteínas quinasa quinasa quinasas activadas por mitógeneos (MAP3K), se descubrió inicialmente por su capacidad de originar transformación celular. Durante la fase G1 del ciclo celular de linfocitos T hay una inducción del mRNA del proto-oncogen Cot, hecho que indicaría la posibilidad de un papel de la quinasa en la transición G1/S del ciclo celular de linfocitos T. Para estudiar el papel de Cot quinasa en la transición G1/S se utilizó la línea celular CTLL-2, la cual depende de IL2 para crecer. La expresión transitoria de Cot quinasa en estas células aumenta la síntesis de DNA inducida por IL2, mientras que la expresión del dominante negativo de esta quinasa reduce considerablemente la síntesis de DNA inducida por dicha citoquina. Por otro lado, el análisis del ciclo celular de células CTLL-2 que sobreexpresan Cot quinasa de forma estable sincronizadas en fase G1, indica que esta quinasa contribuye a la progresión a fase S. Además, Cot quinasa reduce los niveles del inhibidor p24 Kip1, mientras que los niveles de Bcl-XL no se ven afectados. Por otra parte, esta quinasa disminuye los niveles de expresión de mRNA de varios genes implicados en ciclo celular como el inhibidor p19 INK4d, las proteínas relacionadas con Rb, p130 y p107 y genes implicados en apoptosis como FasR y Bad. Otros genes como c-fos, Elk-1, Fyn o Granzima A, sin embargo, tienen aumentado sus niveles de mRNA por la actividad de Cot quinasa. Cot también aumenta los niveles de mRNA de E2F1, y además se correlaciona con un incremento en la actividad transcripcional de E2F. Dicho aumento se da de manera independiente a PI3K, actuando Cot de forma sinérgica con esta quinasa. Todos estos datos dan evidencias, por primera vez, de la regulación de distintos eventos de la progresión de la fase G1 por Cot quinasa.

Autor: MAYO MELCHOR M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El proteasoma es un complejo macromolecular responsable de la degradación de la mayor parte de las proteínas intracelulares. En el presente trabajo se ha abordado el papel del proteasoma en enfermedades neurodegenerativas como proteasa en la degradación de alfa-sinucleína, proteína implicada en la Enfermedad de Parkinson y en otras sinucleionpatías; y como autoantígeno en la Esclerosis Múltiple. El proteasoma 20S es responsable de la degradación de alfa-sinucleína tanto in vitro como in vivo, y no se requiere previa ubiqutilación. La alfa-sinucleína se comporta como un cis-degrón y de degrada por interacción directa con la subunidad C8 (alfa7) del proteasoma. Las variantes de alfa-sinucleína, A30P y A53T, presentes en formas familiares de Enfermedad de Parkinson se comportan como alfa-sinucleína silvestre respecto a la susceptibilidad a: degradación por proteasoma, fosforilación por las proteínas quinsas CKI, CKII, c-src y c-abl, y degradación por proteasoma previa fosforilación por las proteínas quinasas antes mencionadas. La vida media de alfa-sinucleína es bastante larga sugiriendo que in vivo su interacción con lípido de membrana y con otras proteínas previenen su degradación por proteasoma. La inhibición de la actividad del proteasoma in vivo conduce a la agregación citoplasmática de alfa-sinucleína, esta agregación mimetiza la situación que debe ocurrir en las sinucleinopatías. Todos estos resultados demuestran el papel central del proteasoma en la Enfermedad de Parkinson y en otras sinucleinopatías. El papel de proteasoma como autoantígeno en la Esclerosis Múltiple se demuestra por la presencia de anticuerpos anti-proteasoma (IgG e IgM), tanto en el suero (60%) como en el líquido cefalorraquídeo (80% en pacientes seropositivos) de estos pacientes. Se han mapeado dos epítopos lineales en las subunidades C2 (COOH-terminal) y C8 (región central) del proteasoma contra los que van dirigidos los autoanticuerpos contra estas subunidades. La respuesta anti-proteasoma es específica y aparece de forma temprana (primer brote) permaneciendo durante el curso de la enfermedad. La presencia de autoanticuerpos y de células T reactivas frente a proteasoma en pacientes con Esclerosis Múltiple son nuevos marcadores de esta enfermedad neurodegenerativa con posible utilidad clínica para el diagnóstico y/o pronóstico de esta enfermedad inflamatoria crónica.

Autor: FRANCH MARRO XAVIER.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAT DE BIOLOGÍA.

Resumen: El sistema traqueal de Drosophila es un buen modelo para el esudio de la migración celular. En esta tesi hemos utilizado este modelo para analizar dos nuevos aspectos que ayudan a entender el proceso de la migración. En primer lugar hemos analizado un nuevo papel de spalt en el desarrollo traqueal. Hemos visto que en embriones mutantes para sal el sistema traqueal presenta una duplicación de las ramas traqueales de la parte ventral. Consecuentemente la sobreexpresión de sal en todas las células traqueales reprime la identidad ventral. Estos resultados indican que la actividad de sal induce identidad dorsal en las células traqueales donde se expresa, regionalizando la placoda traqueal en el eje dorso-ventral. Esta función es independiente de la vía de transducción de señal Wnt/Wg que regula la expresión tardía de sal, sugiriendo que la expresión temprana de sal es suficiente para promover identidad dorsal a las células traqueales. Por otro lado hemos estudiado cuáles son los tejidos que estan rodeando a las tráqueas y que influencia tienen estos en el desarrollo del sistema traqueal. Mediante la generación de una línea recombinante hemos visualizado la morfología celular del sistema traqueal y hemos visto que el mesodermo es uno de los tejidos que está en contacto con las células traqueales. Hemos comprobado que mientras que el tronco dorsal, que migra en el eje anteroposterior, se abre camino entre poblaciones de mioblastos las ramas dorsal y laterales migran por espacios preexixtentes. Así hemos visto que el cuerpo graso otra estructura mesodérmica que se forma justo por debajo del tronco dorsal, es necesario para la formación de esta rama traqueal. La rama dorsal en canvio utiliza el surco que existe entre las poblaciones de mioblastos más dorsales y su configuración final en una sola columna de células parece estar relacionada con la disminución del tamaño del surco. Por otro lado las ramas laterales migran en aposición con las poblaciones de mioblastos más ventrales. Todos estos resultados sugieren que el desarrollo del sistema traqueal es un buen modelo que ilustra como la organogénesis no depende solamente de un programa genético sino también del desarrollo de los tejidos que lo envuelven.

Autor: DOMÈNECH GIMENO ANNA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El objetivo de esta Tesis es identificar nuevos genes de importancia relevante en el Síndrome de Down. La primera aproximación, en la que se implicaron varios miembros del grupo de investigación, fue la construcción de un mapa físico y transcripcional de una 3 Mb del cromosoma 21 (HSA21). Se llevó a cabo una selección de cDNA en la cual se identificó un nuevo gen del HSA21 (no caracterizado en esta Tesis). Posteriormente se cambió de estrategia i se llevó a cabo una aproximación in silico en la cual bases de datos de ESTs se compararon con secuencias genómicas del HSA21. El estudio prosiguió con un EST humano. El cDNA de 850 pb se asiló de mRNA de corazón y contiene una pauta de lectura abierta de 123 aa, y se le llamó KCNE2 debido a su similitud con el gen KCNE1 (una subunidad de canales de potasio). KCNE2 se expresa mayoritariamente en estómago; codifica una proteína N-glicosilada en dos posiciones y se inserta en la membrana celular con su extremo N-terminal dirigido hacia el exterior celular. En dos pacientes con sordera no sindrómica se encontró un cambio de nucleótido A22G que provoca el cambio de aa T8A, que produce la pérdida de un lugar consenso de N-glicosilación. Con el propósito de identificar nuevas subunidades de canales de potasio dependientes de voltaje, se hizo una búsqueda con el programa BLAST en las bases de datos de ESTs con las secuencias de KCNE1 y KCNE2. El estudio continuó con 8 ESTs la secuencia consenso de los cuales contenía una pauta de lectura abierta de 103 aa. El cDNA se asiló de mRNA de colon humano i tiene 1646 pb. Este nuevo gen recibió el nombre de KCNE3 debido a su similitud con KCNE1 y KCNE2, y se mapó en 11q13-14. KCNE3 se expresa en colon, intestino delgado, ovario y sangre periférica. Igual que los otros miembros de la familia, la proteína está N-glicosilada y se inserta en la membrana celular con su extremo N-terminal dirigido hacia el medio extrecelular. Se encontró el cambio T198C que provoca el cambio de aa F66L en el 15% de la población analizada. Los tres miembros analizados pueden considerarse genes parálogos dada su estructura genómica similiar, una identidad a nivel de aa muy elevada y una estructura proteica también similar; los tres son proteínas N-glicosiladas con la misma topología. Las diferencias entre ellos vendrían dadas por sus diferentes partrones de expresión y la capacidad de unir diferentes subunidades alfa, dando lugar a gran variedad de canales de potasio con características electrofisiológicas diferentes.

Autor: MATEO CALOGNE M. TERESA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA BIOQUÍMICA.

Resumen: La finalidad de esta Tesis ha sido el estudio del papel que juegan las GTPasas de la familia Rho en la biosíntesis de la pared de Schizosaccharomyces pombe. Estas proteínas están conservadas evolutivamente y son necesarias para la organización del citoesqueleto de actina que, a su vez, es esencial para la biosíntesis de la pared celular. Hemos estudiado la ruta de señalización de Rho1p y Rho2p, y su interacción con otras proteínas implicadas en la biosíntesis de la pared celular de S.pombe como las quinasas Pck1p y Pck2p. Las proteínas de la familia Rho alternan entre una forma activa. Cuando están unidas a GTP, y una forma inactiva, cuando están unidas a GDP. La transición entre una conformación u otra es negativamente modulada por proteínas activadoras de la capacidad GTPásica (GAPs), que favorecen la hidrólisis del GTP a GDP, y juegan un papel fundamental en la especificidad de las funciones de Rho. También hemos descrito en este trabajo el gen denominado gpr1+ que codifica una proteína GAP de Rho1p. La sobreexpresión de gpr1+ causa una lisis celular rápida, y una disminución del 40% de la actividad (1,3)beta-D glucán sintasa, respecto de una estirpe silvestre. Por el contrario, células carentes del gen gpr1+ son viables y muestran un ligero fenotipo morfológico a 37º. La actividad (1,3)beta-D glucán sintasa de estas células está considerablemente incrementada. La sobreexpresión de rho1+ en células gpr1 es letal y cuasa un incremento de la actividad (1,3)beta-D-glucán sintasa mayor que el detectado en células silvestres que sobreexpresan rho1+. Gpr1p co-inmunoprecipita con Rho1p, y muestra actividad específica GAP sobre Rho1p tanto in vitro como in vivo. Grp1p participa en la regulación de la estabilidad de las proteínas quinasas Pck1p y Pck2p mediada por Rho1p. También juega un papel importante en la regulación del citoesqueleto de actina. La eliminación de los primeros 25 aminoácidos de la proteína Gpr1p corrige considerablemente el efecto letal debido a la sobreexpresión de Gpr1p. Por el contrario, la eliminación del extremo C-terminal, que contiene un posible dominio de unión a actina incrementa el efeto letal de Gpr1p.

Autor: OLMEDA CASADOME DAVID.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Beta-catenina es una proteína multifuncional implicada en al menos dos procesos esenciales: Adhesión célula-célula y señalización. En la adhesión intercelular, beta-catenina forma parte de los complejos de adhesión cadherina/cateninas que median interacciones homofílicas y dependientes de calcio entre células adyacentes. En señalización, beta-catenina y su ortólogo en Drosophila armadillo son parte fundamental de la vía de señalización de Wnt/Wingless, implicada en el establecimiento del eje dorso-ventral en Xenopus y en el establecimiento del patrón de segmentación en Drosophila. A su vez, se ha descrito que la señalización medidad por beta-catenina es capaz de inducir proliferación celular, inhibir la anoikis, o inhibir la parada en ciclo celular inducida por la exposición a rayos gamma en algunos sistemas celulares. Sin embargo, se ha descrito que beta-catenina induce parada en ciclo celular o apoptosis en ciertos contextos del desarrollo y en varios sistemas celulares. A fin de aclarar la regulación de beta-cetanina a lo largo del ciclo celular y su posible participación en el control del ciclo celular y la inducción de apoptosis, hemos analizado los niveles y la localización subcelular de beta-catenina a lo largo del ciclo celular y su relación con el producto del gen supresor APC (Adenomatous Polyposis Coli). Nuestros datos muestran que, en líneas celulares epiteliales, los niveles citoplasmáticos y nucleares de beta-catenina aumentan de forma escalonada a lo largo de la fase S del ciclo alcanzando su máxima acumulación en la fase G2/M, y descienden de manera abrupta una vez que las células progresan a una nueva fase G1. El análisis de la localización subcelular de beta-catenina y APC mostró un incremento de la localización citoplasmática y nuclear de ambas moléculas a lo largo de la fase S y G2 y la colocalización de APC con los centrosomas a lo largo de la fase M. Sorprendentemente, la sobreexpresión de una forma estable de beta-catenina, o la inhibición de la degradación de beta-catenina endógena en queratinocitos epidérmicos induce parada en ciclo celular en G2/M y la inducción de apoptosis, asociado a una fuerte inducción de p53 y p21CIP. Estos resultados apoyan la implicación de beta-catenina en el control del ciclo celular y la inducción de apoptosis durante la fase G2/M. Además, sugieren que los niveles de beta-catenina deben estar estrictamente regulados para que las células puedan progresar correctamente por el ciclo celular.

Autor: OLIVER VARA PAULA.
Año: 2000.
Universidad: ISLAS BALEARES.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIV. DE LES ILLES BALEARS (FAC. DE CIENCIAS).

Resumen: Las bases moleculares del sistema fisiológico de regulación del peso corporal han sido objeto de un intenso estudio en los últimos años. En Diciembre d e1994, el descubrimiento de la leptina, una hormona producida por tejido adiposo que refleja los niveles de grasa corporal y que forma parte del sistema de control de la ingesta, revolucionó la invaestigación de la obesidad. Hoy en día se sabe que la leptina es secretada no sólo por el tejido adiposo y que es una hormona con funciones más amplias que la de intervenir en el control de la homeostasis energética. La regulación de la eficiencia energética en las mitocondrias es otro punto de interés. En este sentido, el descubrimiento de nuevas protéinas desacoplantes (UCOs), con un patrón de distribución tisular más amplio que el de la bien conocidad termogenina o UCP1 del TAM, y su psoble papel termogénico, ha abierto nuevas posibilidades a la hora de considerar el control de la homeostasis energética. Interesantemente, la leptina y las UCPs están intrrelacionadas y comparten mecasnimos reguladores comunes. La leptina estimula el SNS, que es el principal regulador de la termogénesis en el TAM,y es capaz de estimular, además, la síntesis de UCPs. Por otra parte, esta estimulación del SNS produce una retro-inhibición den la expresión de leptina. En esta tesis se ha estudiado los cambios que tienen lugar en la expresión de los genes de la leptina y de las UCPs conla edad. De esta forma, se ha descrito que los distintos depósitos grasos presentan pautas de comportamiento diferentes en la expresión génica de la leptina durante el desarrollo. Esto resulta de interés pues es precisamente la distribución de la grasa corporal, y no la grasa total, la que se asocia más estrechamente a las complicciones médicas de la obsesidad. Debido a la descripción de la presencia de leptina esn estómago y su probable funcionalidad en humanos, descrita recientemente en nuesro laboratorio, el enfoque de nuestro trbajo se ha extendido a este tejido. Por tanto, se ha caracterizado el patrónontogénico de la leptina gástrica y su respuesta a la lactación, para contribuir al conocimiento del papel fisiológico de es ta hormona. Referente a las UCPs, la descripción de su ontogénesis en tejido adiposo puede ayudar al conocimiento de su función fisiológica, y permite sugerir un papel termogénico para la UCP3 en los tejidos adiposos blanco y marrón análogo al de la UCP1 del TAMy, problablemente, diferente de la UCP2. Otros aspectos tratados, en estudios in vivo e in vitro, se refieren a la regulación de dichos genes en el tejido adiposo. Se ha observado que es posible la estimulación simultánea de la expresión génica de las UCPs y de la leptina en algunos depósitos de tejido adiposo. Por otra parte, la estimulación simultánea de la expresión génica de la UCP1 y dela UCP2 en adipocitos marrones en cultivo sugiere una posible función termogénica común para ambas proteínas en el TAM.

Autor: GARCIA GARCIA JOSEFA.
Año: 2000.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La proteína quinasa C(PKC) está implicada en transmisión de señales y participa en multitud de procesos como son la proliferación y diferenciación celular, la memoria inmunológica,la regulación de la transcripción y la modulación de canales liónicos y secreción. Hasta ahora se conocen once insoenzimas de mamímero distintas que se clasifican en PKC clásicas,nuevas y atípicas. Las primeras constan de un región reguladora formada por dos dominios conservados, C1, de unión de diacilgliceroles y ésteres de forbol, y C2, de unión de fofolípidos aniónicos y calcio, y una región catalítica, que engloba los dominios C3, de unión de ATP, y C4 de unión de sustrato. En las PKC nuevas el dominio C2 se antepone al C1 y presenta topología distinta, y en las atípicas desaparece. Se sabe que la PKC se activa por ésteres de forbol, las cuales son moléculas promotoras de tumores, y que se sabe que la PKC se activa por estéres de forbol, las cuales son moléculas promotoras de tumores y que está implicada en procesos de carcinogénesis.Recientemente se ha descubierto un agente fenólico denominado resveratrol que posee capacidad quimiopreventiva en las tres etapas principales de carcinogénesis y, en este sentido, se estudió su efecto sobre la actividad de la PKC y se comprobó que el revertrol provoca la inhibición de dicha actividad cuando está incorporado en vesículas compuestas de POPC y POPS. Mediante estudios de DSC y RMN se comprobó que este efecto inhibidor se debe a que el resveratrol modifica las propiedades de la membrana y hace que se estabilice la estructura de bicapa, lo cual se ha observado en otros inhibidores de la PKC y de otras enzimas de membrana. Las isoenzimas de PKC presentan localización subcelular y mecanismos de activación y función específicos de cada una de ellas, características subcelular y mecanismos de activación y función específicos de cada una de ellas, características que se deben fundamentalmente a los dominios C1 y C2,implicados en la unión de la PKC a la membrana, el cual es un proceso esencial para la activación de la misma. La principal diferencia entre los grupos de PKC clásicas y nuevas es el requerimiento de calcio por parte de las primeras para su unión a la membrana y activación, característica que reside en sus correspondientes dominios C2, siendo las clásicas dependientes de calcio, mientras que las nuevas no, de forma que dicho ión puede actuar como un mecanismo de activación especifico de un grupo de isoenzimas de PKC. Por todo ello, consideramos interesante estudiar la estructura básica de sandwuich beta con ocho cadenas antiparalelas interconectadas por bucles, que son los que proporcionan las propiedades particulares a cada proteína que los contiene. En este trabajo se determinó la estructura secundaria de los dominios C2 de la PKC alfa y de la PKC epsilón por espectroscopía de IR y se comprobó que ambos contienen un 60% de hoja beta, y se diferencian fundamentalmente en que el dominio C2 de la PKC epsilón presenta mayor porcentaje de hélice alfa y menor de estructura desordenada que el de la PKC alfa. Cuando posteriormente se resolvió la estructura cristalina del dominio C2 de la PKC epsilon, se comprobo que presenta un bucle entre las cadenas beta1 y beta2 más largo que el hallado en otros dominios C2, y que este bucle incluye un segmento de helice alfa, que es el que posiblemente contribuye a que este dominio C2, presente mas componente de helice alfa que el de la PKC alfa. Un hecho que indica que la tecnica de IR aporta datos fidedignos sobre la determinación de la estrucutra secundaria de proteínas es que los datos obtenidos por IR presentan una buena correlación con los datos cristalográficos. En el caso del dominio C2 de la PKC alfa, se determinó por IR un 60% de hoja beta, un 12% de helice alfa o bucles grandes, un 15% de giros beta y un 12% de estructura desordenada y bucles abiertos, valores muy parecidos a los datos cristográficos de 57,12,16 y 14% respectivamente. Para el dominio C2 de la PKC epsilón,por IR se determinó un 60% de hoja beta, un 21% de helice alfa o bucles grandes y un 19% de giros beta y, por cristalografia de rayos X. Se obtuvieron los procentajes de 54,20 y 20%,respectivamente. Por espectroscopía de IR se determinó, además, que ambos dominios presentan distinto comportamiento frente a las desnaturalización térmica, siendo más estable el de la PKC epsilón. Sin embargo, la unión de un fosfolípido aniónico como el ácido fosfatídico(PA) aumenta considerablemente dicha estabilidad en ambos casos. Curiosamente, se comprobó que la unión de este fofolípido al dominio C2 de la PKC alfa provoca un pequeño reordenamiento de su estructura secundaria, aumentando el componente atribuido a estructura desordenada o bucles abiertos a costa de disminuir el porcentaje de hoja beta, mientras que en el de la PKC epsión no provoca ningún cambio sustancial. La unión de calcio al dominio C2 de la PKC alfa no provoca, sin embargo, ningún cambio conformacional en su estuctura secundaria, aunque sí le confiere mayor estabilidad frente a desanaturalización térmica. Se comprobó, además, que la estabilidad del C2D246/248N-PKC alfa, un mutante del sitio de unión de calcio, es ligeramente superior a la del dominio tipo silvestre. Aunque la falta de unión de calcio por parte de este mutante provocó que se produjera desnaturalización termica, incluso en presencia de concentraciones saturantes de calcio. Por el contrario, en presencia de vesículas que contenían 100 mol1% de PA, la estructura secundaria de esta mutante se reorganizó de la misma forma que la del dominio tipo silvestre y, además, su estabilidad frente a la desnaturalización térmica también aumentó de forma similar a la del tipo silvestre. Todos estos datos indican que el dominio C2 de la PKC alfa podría interaccionar con fosfolípidos aniónicos por dos mecanismos diferente, uno dependiente de la presencia de calcio y otro independiente de dicho ión pero que necesita altas concentraciones de fosfolípido aniónico. Esto supondría la activación de una misma isoenzima por dos mecanismos distintos según las condiciones del medio. Por estudios de cristalografía y mutagénesis dirigida se demostró que, de forma similar a lo que ocurre en el dominio C2 de la PKC alfa, los bucles 1(beta1-beta2) y 3(beta5-beta6) del dominio C2 de la PKC epsilón están implicados en la unión de fosfolípidos aniónicos. De los cinco residuos de ácido aspártico que intervienen en la unión de calcio y PS en el dominio C2 de la PKC alfa, sólo se conservan dos en el dominio C2 de la PKC epsilón y, además, se comprobó que únicamente tienen una función estructural. Adicionalmente, se caracterizaron por mutagénesis dirigida varios residuos implicados en la unión de este dominio a la membrana, concretamente los residuos Trp23,Arg26 y Arg32 del bucle 1 Ile89 del bucle 3. En el caso del bucle 1, se demostró que se han de mutar los tres residuos descritos para producir una reducción significativa de la unión del dominio a la membrana, mientras que la mutación de un residuo hidrofóbico en el bucle 3 produce un efecto significativo. Con los datos obtenidos se propuso un posible mecanismo de unión a membrana en dos etapas en el que ocurriría una combinación de fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas. El bucle 1, que contiene residuos con carga positiva(Arg26 y Arg32) podría establecer una primera interacción electrostática con fosfolípidos cargados negativamente y, despues, el bucle 3,que contiene varios residuos hidrofóbicos(Ile89,Tyr91),podría establecer una interacción hidrofóbica y anclar el dominio en la membrana de una forma más estable. Además de la vía activación de la PKC alfa por la fosfolipasa C, se han buscado otras vías posibles que puedan actuar como alternativa de activación de las PKC alfa puede activarse directamente por el fosfatifilinositol 4,5-difosfato(PIP2) y cuál podría ser el mecanismo de activación. Curiosamente se observó que este fosfolípido interaciona con alta afinidad con el dominio C2 de esta proteína y que el mecanismo de activación es independiente de la presencia de calcio y de PS. Este efecto observado con el dominio aislado también se observó con la proteína entera, aunque la interacción con el PIP2 de forma independiente de calcio sólo ocurrió en determinadas condiciones, en presencia de DOG, ATP y de un sustrato como histona, lo que indica que la proteína necesita una conformación determinada por su unión a PIP2. Estos resultados apuntan a que podría existir una vía alternativa de activación de las PKC clásicas de forma independiente de calcio.

Autor: ORDAS LOPEZ M. CAMINO.
Año: 2000.
Universidad: VIGO.
Centro de lectura: CIENCIAS .

Resumen: Las especies del genero Perkinsus han sido asociadas con mortalidades de moluscos bivalvos en todo el mundo, incluyendo Galicia. La histopatología de la infección por Perkinsus en almeja fina, babosa y japonesa, asi como el ciclo de vida del parásito in vivo, fue muy similar a aquella descrita para Perkinsus sp. En otros moluscos bivalvos. Asociada a la presencia del parásito siempre detectamos una fuerte infiltración hemocitaria por parte del hospedador. Para estudiar más en profundidad la respuesta defensiva de la almeja fina infectada por Perkinsus, medimos seis parámetros inmunes en animales muy infectados según la prueba de diagnóstico estándar para Perkinsus, el RFTM, y comparamos los resultados con aquellos obtenidos a partir de animales no infectados. Todos los tratamientos siguieron la misma tendencia en las dos réplicas del experimento, lo cual sugiere un condicionamiento del sistema defensivo de la almeja fina debido a la presencia de Perkinsus. Para disponer de una fuente continua y homogénea del parasito, establecimos y optimizamos cultivos in vitro del mismo. La morfología del aislado en cultivo determinada por microscopía óptica y electronica resultó similar a la descrita para Perkinsus marinus in vitro. Sin embargo, la secuenciación y comparación de una región genómica de unas 1800 pares de bases demostró la gran diferencia existente entre el organismo en cultivo y las demás especies del genero Perkinsus. El análisis filogenético basado en el gen 18S situa al protozoo en cultivo en el límite entre los animales y loshongos, dentro del grupo de los Mesomycetozoa. Mediante análisis de restricción confimamos la presencia tanto de Perkinsus como del organismo en cultivo en aislados de hipnosporas obtenidos de branquias sometidas a la prueba del RFTM. Esto demuestra la falta de especificidad de esta tecnica y su invalidez para el diagnóstico de Perkinsus. Estos resultados nos llevaron a identificar el organismo en cultivo como un nuevo protozoo al que denominamos Pseudoperkinsus tapetis. Por último, y dado que los productos secretados por los patógenos están muy relacionados con su virulencia, estudiamos los productos extracelulares de P.tapetis in vitro. Estos productos de secreción inhibieron la actividad enzimática mayoritaria de los productos secretados por P.tapetis fue la fosfatasa ácida. Por otra parte, los productos extracelulares de P. Tapetis tenían una elevada actividad proteásica, al menos en parte de la clase serina dependientes de calcio y muy alcolofílicas. El perfil de proteasas de P. Tapetis resultó ser totalmente distinto del descrito para P.marinus in vitro.

Autor: URTASUN ALONSO RAQUEL.
Año: 2000.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE LA UN. NAVARRA.

Resumen: Las proteínas AE (el inglés Anion Exchager) constituyen una familia de glicoproteínas de membrana que median el intercambio de los aniones Cl:/HCO3; dicho intercambio es electroneutro y tiene lugar con independencia de sodio. Hasta el momento se han identificado cuatro miembros de la familia AE: AE1,AE2, AE3 yAE4, que vienen codificados por genes distintos y específicos. La caracterización de los genes AE en humanos, ratón y rata, promete ser muy útil para estudios comparativos. De hecho, en estas tres especies ya se han clonado y caracterizado los genes de Ae1 yAE3. La organización molecular del gen AE2 (SLC4A2), también se ha descrito en humanos y rata. En estas dos especies, el gen AE2 dirige su transcripción a través de promotores alternativos que dan lugar a distintas isoformas con un patrón específico de tejido, de manera similar pero no igual en estas dos especies. En este trabajo se muestra el clonaje yla organización molecular del gen AE2 de ratón. Dicho gen contiene 23 exones y 22 intrones expandiéndose en 17 Kb aproximadamente. Además, al igual que suortólogo en ratas y humanos, también presenta promotores alternativos que dan lugar durante la trasncripción aisoformas truncadas en su extremo N-terminal. Concretamente, secuencias que se soplan dentro del intrón 2, funciona como promotores alternativos de las isoformas truncadas AE2b1 y AE2b2, y secuencias solpantes dentro del intrón 5 funcionan como promotores alternativos para los transcritos AE2c1 y AE2c2. Cada una de estas variantes tiene un primer exón alternativo especifíco, mientras que el resto de los exones son comunes a la forma completa (el trancrito AE2a). La diversidad existente en el extremo 5' de dichos transcritos, conlleva a diferencias en el extremo N-terminal de las proteínas codificadas. En cuanto a las regiones promotoras de AE2 de ratón así como el patrón de expresión en tejido de sus isoformas, en general presentan mayor semejanza con estos mismo en rata que con humanos.

Autor: SERRANO GOMICIA JUAN ANTONIO.
Año: 2000.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Esta tesis se centra en el estudio del ciclo del glioxilato en Haloferax volcanii, un organismo halófilo del Dominio Archaea. Este es primer estudio sobre esta ruta metabolica en un organismo de este Dominio. Se detectaron altas actividades de las dos enzimas clave de esta ruta (isocitrato liasa y malato sintasa) en extractos celulares de Hf.volcanii solo cuando se uso acetato (C2)como fuente de carbono. Esto demuestra que el ciclo del glioxilato funciona en este organismo, y que existe un mecanismo de regulacion de la actividad de estas enzimas. Se demuestra por primera vez la existencia de esta ruta en un organismo del dominio Archaea. Se purificaron ambas enzimas con un grado de pureza suficiente para obtener la secuencia de aminoácidos N-terminal de ambas. Ambas enzimas poseen un marcado carácter halofílico y termofilico, sobre todo malato sintasa, con un optimo de temperatura para la actividad en el rango de 50 60 ºC y, con un 50% de la actividad maxima a 80ºC. Los genes de isocitrato liasa y malato sintasa son cotranscritos en una sola molecula de mRNA, que solo incluye estos dos genes. Este mRNA es sólo transcrito cuando Hf.volcanii crece con acetano como fuente de carbono. Estos datos demuestran que los genes de isocitrato liasa y malato sintasa estan organizados en una estructura tipo operón en el genoma de Hf.volcanii y que su transcripción esta regulada según las necesidades celulares. Se comprobó que la región anterior al gen de isocitrato liasa es un promotor, y que este es más activo cuando el acetato es la fuente de carbono.

Autor: SANCHEZ HORMIGO ANGELA.
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA BASICA Y APLICADA.

Resumen: El GHRP-6 (hexapeptido liberador de GH) forma parte de una nueva familia de compuestos sinteticos que estimulan la liberacion de GH tanto in vivo como in vitro en diversas especies. Datos recientes indican que el GHRP-6 utiliza receptores y rutas intracelulares de señal que difieren de los empleados por el factor hipotalamico primario GRF(factor liberador de GH). En el presente estudio, hemos investigado el efecto del GHRP-6 y del GRF sobre las celulas somatotropas porcinas cuantificando la secrecion de GH y los niveles de ARNm de dicha hormona, asi como los segundos mensajeros implicados en la respuesta secretora a ambos peptidos. Nuestros resultados demuestran que el GHRP-6, al igual que el GRF, ejerce un efecto directo,especifico y rapido sobre las celulas somatotropas, porcinas estimulando la secrecion y la sintesis de GH. Ademas, la accion conjunta de GHRP-6 y GRF sobre la somatotropa porcina produce una estimulacion aditiva de la secrecion de GH. Por otro lado, el GHRP-6 activa varias rutas de segundos mensajeros en las celulas somatotropas porcinas, siendo fundamental la participacion del sistema de los fosfatidos de inositol/fosfolipasa C/proteina quinasa C en su efecto estimulador. Por su parte, la ruta adenilato ciclasa/AMPc/proteina quinasa A es imprescindible para que el GRF ejerza su accion estimuladora sobre la secrecion de GH y para su interaccion aditiva con el GHRP-6. En resumen, nuestros resultados demuestran que las celulas somatotropas presentan un complejo sistema de respuesta a diferentes factores, tanto hipotalamicos como sinteticos, los cuales pueden actuar a traves de multiples mecanismos intracelulares, comunes y especificos, para ajustar la secrecion de H a los requerimientos fisiologicos concretos.

Autor: CANICIO BARDOLET JUDITH.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: EN ESTA TESIS SE HA IDENTIFICADO UNA VIA DE SEÑALIZACION MIOGENICA INDUCIDA POR IGF-II. EL ESTUDIO REALIZADO DEMUESTRA QUE LA ISOFORMA P85-P110 DE LA FOSFATIDILINOSITOL 3-QUINASA (PI 3-K) ES UN ELEMENTO ESENCIAL EN ESTA VIA Y SE HA ESTUDIADO EL PAPEL DE VARIAS PROTEINAS IMPLICADAS EN SEÑALIZACION INTRACELULAR PARA IDENTIFICAR CUALES SON LOS ELEMENTOS EFECTORE DE PI 3-K EN LA SEÑALIZACION MIOGENICA INDUCIDA POR IGF-II. EN PRIMER LUGAR SE HA ESTUDIADO LA FUNCION DE LA QUINASA P70 S6 EN ESTA VIA MIOGENICA UTILIZANDO LA RAPAMICINA. ESTOS ESTUDIOS HAN DEMOSTRADO QUE LA QUINASA P70 S6 NO ES NECESARIA PARA LA DIFERENCIACION MIOGENICA DE CELULAS DE MUSCULO ESQUELETICO DE RATA (L6E9), DE RATON (SOL8), O HUMANAS. SIGUIENDO CON EL OBJETIVO DE ELUCIDAR CUALES SON LAS PROTEINAS SEÑALIZADORAS DE LA VIA MIOGENICA IGF-II/PI 3-K, SE HA ESTUDIADO EL PAPEL DEL FACTOR DE TRANHSCRIPCION NF-KAPPA-B(NF-KB) Y DE LA SINTASA DEL OXIDO NITRICO (NOS). ESTE ESTUDIO DESCRIBE QUE A LAS 24 HORAS DE DIFERENCIACION CON IGF-II SE PRODUCE UNA ACTIVACION DE NF-KB. ESTA ACTIVACION SE CORRELACIONA CON UNA INDUCCION DE LA EXPRESION DE LA NOS INDUCIBLE (INOS) Y DE LA ACTIVIDAD NOS, O PRODUCCION DE OXIDO NITRICO. SE HA DEMOSTRADO QUE AMBOS PROCESOS SON DEPENDIENTES DE ACTIVACION NF-K-B, Y NECESARIOS PARA LA DIFERENCIACION DE LAS CELULAS DE MUSCULO ESQUELETICO. EN ESTE TRABAJO SE DEMUESTRA QUE LA L-ARGININA, COMO SUSTRATO DE LA NOS, ES CAPAZ DE MIMETIZAR EL EFECTO DE IGF-II EN LA MIOGENESIS: LA L-ARGININA, COMO SUSTRATO DE LA NOS, ES CAPAZ DE MIMETIZAR EL EFECTO DE IGF-II EN LA MIOGENESIS: LA L-ARGININA INDUCE (EN AUSENCIA DE IGF-II) LA PRODUCCION DE OXIDO NITRICO Y LA DIFERENCIACION DEL MUSCULO ESQUELETICO TANTO BIOQUIMICA COMO MORFOLOGICA. SE HA ESTUDIADO EL MECANISMO DE ACTIVACION DE NF-KB DURANTE LA MIOGENESIS INDUCIDA POR IGF-II, Y SE HA DEMOSTRADO QUE REQUIERE LA FOSFORILACION DE LOS RESIDUOS DE S-32 Y S-36 DE LA PROTEINA INHIBIDORA DE NF-KB(IKB). ESTA TESIS DESCRIBE QUE EL COMPLEJO DE LAS QUINASAS IKB-KINASE (IKK) (RESPONSABLE DE LA FOSFORILACION DE IKB) SE ACTIVA EN LA VIA MIOGENICA DESCRITA A 24 HORAS DE DIFERENCIACION CON IGF-II. ESTA TESIS DEMUESTRA QUE IKK-ALPHA, PERO NO IKK-BETA, ES NECESARIA PARA LA DIFERENCIACION DE LAS CELULAS DE MUSCULO ESQUELETICO INDUCIDA CON IGF-II. FINALMENTE, SE HA ESTUDIADO EL PAPEL DE LA QUINASA NIK (NK-KB INDUCING KINASE) EN ESTA VIA Y SE HA DESCRITO QUE LA ACTIVIDAD NIK SE INDUCE A 24 HORAS DE DIFERENCIACION CON IGF-II. ADEMAS SE HA DEMOSTRADO QUE LA SOBREEXPRESIÓN DE UNA FORMA CONSTITUTIVAMENTE ACTIVA DE NIK ES SUFICIENTE PARA INDUCIR SEÑALES MIOGENICAS.

Autor: GARCÍA BERROCAL BELEN.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La hemocromatosis hereditaria es la anomalía hereditaria metabólica más frecuente en el mundo occidental. Las manifestaciones clínicas de la hemocromatosis hereditaria son consecuencia de la acumulación de hierro en diferentes órganos debido a un exceso de absorción a nivel intestinal por un mecanismo no bien conocido hasta el momento. En 1996 se caracterizó el gen HFE, responsable de la mayoría de los casos de esta enfermedad. Dejando a parte mutaciones descritas en pacientes aislados, parece que principalmente los individuos homocigotos para las mutaciones C282Y y H63D, o los individuos portadores heterocigotos para las dos mutaciones, tienen verdadero riesgo de desarrollar la enfermedad. En nuestro trabajo hemos analizado el gen HFE en pacientes diagnosticados de hemocromatosis hereditaria o con signos bioquímicos de alteración del metabolismo férrico, con el fin de determinar la incidencia de las diferentes mutaciones ya conocidas en nuestra población y caracterizar posibles nuevas mutaciones de este gen asociadas con esta enfermedad. El estudio del gen HEF se llevó a cabo amplificando mediante PCR los diferentes exones del gen, realizando digestiones con enzimas de restricción, SSCP y secuenciación. Nosotros hemos estudiado 34 individuos con alteraciones del metabolismo férrico, y 42 familiares de estos pacientes; 14 de ellos eran portadores homocigotos para la mutación C282Y, 8 eran portadores homocigotos para la mutación H63D, ninguno era portador heterocigoto para los dos mutaciones, aunque si lo eran algunos de los familiares. Los 12 pacientes restantes no poseían ninguna de las mutaciones conocidas por lo que llevamos a cabo el estudio completo de los seis exones del gen HFE y de los tres exones del gen que codifica la b2-microblobulina, no encontrando ninguna alteración que justificase la enfermedad. El gen HFE es altamente polimorfo. En nuestro trabajo contribuimos a la caracterización de esta variabilidad genotípica describiendo un nuevo polomorfismo en el exón 6 del gen.

Autor: SÁNCHEZ VALDIVIESO ENRIQUE ALEJANDRO.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Con el fin de caracterizar fenotipos que puedan asociarse con un aumento del riesgo de padecer cáncer de mama hemos estudiado 6 polimorfismos descritos en el gen TP53 y un polimorfismo del gen HER-2, en 186 pacientes con cáncer de mama y en 52 individuos sin cáncer. Para el estudio de la mutación TP53 13964GC asociada al cáncer de mama familiar estudiamos a 51 pacientes con cáncer de mama y "probablemente alto riesgo hereditario" y a 63 pacientes con cáncer de mama sin antecedentes familiares de cáncer de mama. Solo encontramos diferencias estadísticamente significativas en la distribución del genotipo homocigoto para el alelo portador de la inserción en el polimorfismo del intrón 3 (+ 16 bp en posición 11951), más frecuente entre pacientes con cáncer de mama que entre controles. En el polimorfismo del codón 47 (Pro>Ser) confirmamos la escasa frecuencia de presentación: sólo un caso portador del alelo A2 en heterocigosis que supone el primer caso en que se describe éste polimorfismo en Caucásicos. No hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas entre pacientes y controles en los polimorfismos del intrón (8545 T>A), codón 72 (347 Arg>Pro), intrón 6 (13494 A>G) e intrón 7 (T>G a 20 bp 3' ex7) del gen TP53, o en el codón 655 (Ile>Val) del gen HER-2. Cuando comparamos los resultados entre las variables clínico-biológicas se observó cierta relación entre el tamaño tumoral y el homocigoto A1/A1 del intrón 7 así como asociaciones entre los receptores hormonales y los genotipos A1/A2 del intrón 1 y A2/A2 del codón 72. Confirmamos la asociación entre la mutación TP53 13964GC y el desarrollo de cáncer de mama en varones así como de cáncer de mama bilateral en mujeres, pero descartamos que sea exclusiva de agrupaciones familiares ya que demostramos por presencia en el cáncer de mama esporádico. Finalmente, estudiamos la translocación (8;11) (p12;q13) que supone la fusión de los genes HRG y DOC-4, en los 120 tumores mamarios malignos. No encontramos, por el método de Southern, patrones anormales de bandas que pudieran asoicarse con la presencia de la translocación. Pensamos que la gamma-Heregulina, el producto de ésta translocación, es un fenómeno exclusivo de la línea celular MDA-MB-175 en que fue descrita, y no representa una alteración recurrente en cáncer de mama.

Autor: GARCIA PALMER HECTOR.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE LA UAM.

Resumen: La señalización por la ruta de la B-catenina se encuentra alterada en prácticamente todos los cánceres de colon. Los análogos no hipercalcémicos de la vitamina D3(1a,25(OH)2D3) son drogas con posible acción sobre este tipo de neoplasia. Nosotros mostramos que estos compuestos promueven la diferenciación de celulas de carcinoma de colon humano, SW480, que expresan el receptor de la vitamina D(VDR) (SW480-ADH), mientras que no tienen efecto sobre la sublínea SW480-R o la línea metastasica SW620, que han perdido la expresión de VDR. 1a,25(OH)2D3 induce la expresión de E-cadherina y otras proteinas de adhesion intercelular (ocludina, ZO-1,ZO-2, vinculina). Este tratamiento tambien provocó el aumento progresivo de la resistencia transepitelial (TER) en las celulas SW480-ADH, indicando la adquisicion de uniones ocluyentes funcionales. La actinomicina D bloqueó completamente la inducción de E-cadherina, mientras la cicloheximida mostro una fuerte inhibición. Por otro lado, el tratamiento con 1a,25(OH)2D3 indujo 1,8 veces la trascripcion de la construccion con 1,1 kb del promotor del gen humano de la E-cadherina. Sin embargo, la vida media del mRNa de la E-cadherina no se vio afectada por la 1a,25(OH)2D3, en celulas SW480-ADH. Todo ello indica que probablemente la 1a, 25(OH)2D3 induce la expresión de E-cadherina por un mecanismo transcripional que requiere la sintesis de proteinas de novo. La 1a,25(OH)2D3 promueve la translocacion de B-catenina, placoglobina y ZO-1 desde el núcleo y el citoplasma a la membrana citoplasmatica, inhibiendo probablemente asi su actividad transcripcional. El VDR activado por su ligando es capaz de competir con el TCF-4 por su union a B-catenina. De acuerdo con ello, observamos que el TCF-4 es capaz de boquear la actividad transcripconal del VDR, y que por el contrario,la B-catenina es capaz de potenciar la inducción por 1a, 25(OH)2 D3 de un VDRE consenso. En consecuencia, observamos que 1a,25(OH)2D3 reprime los genes diana de B-catenian/TCF-4: c-myc, PPAR , Tcf-1 y CD44, mientras que induce ZO-1. Tres análogos de la vitamina D con bajo efecto hipercalcémico, MC903, KH1060 y EB1089, actualmente utilizados en varios ensayos clínicos contra diversas neoplasisas, fueron capaces de inducir los mismos efectos que la 1a, 25(OH)2D3 sobre la celulas SW480-ADH. Los tres compuestos indujeron E-cadherina, inhibieron la actividad B-catenina/TCF-4, y promovieron la diferenciación morfológica y la re-localización de B-catenina en estas células, mientras que no tuvieron ningun efecto sobre las lineas SW480-R y SW620 defectivas en VDR.

Autor: SANTIAGO MARTIN BEGOÑA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS. UNIV. AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: En este estudio se analiza la tasa de proliferación y apoptosis en secciones cutáneas de pacientes con ES, así como la regulación de la apoptosis que presentan fibroblastos de ES y normales en cultivo en respuesta a diferentes estímulos proapoptóticos. Los datos que se presentan demuestran que hay proliferación de fibroblastos dérmicos en secciones de piel de ES y de controles inflamatorios a diferencia de lo que se ve en la piel normal. Además, se observa una ausencia de apoptosis en los fibroblastos de las lesiones esclerodérmicas mientras que en otras lesiones inflamatorias sí se detectan fibroblastos apoptóticos. In vitro, los fibroblastos de la ES se caracterizan por una suceptibilidad normal a la apoptosis inducida por inhbidores de proteín-Kinasas, la deprivación de suero o el taxol, y una menor susceptibilidad a la estimulación de Fas. Los fibroblastos de ES mostraron una regulación anormal de las proteínas de la familia Bcl-2, consistente en una disminución de la relación Bax/Bcl-1-BclKL lo que indica una tendencia anti-apoptótica. La inhibición de la expresión de Bcl-2 con oligunucleótidos antisentido normalizó la susceptibilidad a la apoptosis de los fibroblastos de ES.

Autor: SANZ HERMIDA CRISTINA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UAM.

Resumen: La clásica cuestión de las alteraciones de la estructura nucleosomal asociadas a la actividad transcripcional constituye un problema de interés general, sobre el cual el nivel de información disponible depende, en cierta medida, del sistema transcripcional que se considere. En el caso de la transcripción de los genes ribosómicos por RNA Pol I, especialmente mediante la aplicación del PGRA se ha podido establecer que la transcripción conlleva la disrupción de la estructura nucleosomal, ofreciendo dicha técnica un gran potencial de análisis de la cromatina ribosomal en diferentes situaciones metabólicas. De esta forma se ha determinado por primera vez en células de insectos dos tipos de cromatina ribosomal; una nucleosomal y otra no nucleosomal, además, para un tipo celular concreto, la proporción de genes ribosómicos con cromatina abierta respecto a cerrada (s/f), no varái significativamente durante el desarrollo larvario ni en situaciones de inhibición transcripcional, aunque hay un moderado incremento en situaciones de activación transcripcional. Por el contrario, esta relación varía considerablemente dependiendo del tipo celular que se considere, pudiéndose correlacionar con la actividad metabólica del tejido, referida a síntesis de proteínas. La presente Tesis también se planteó como una exploración en el campo de la organización de la cromatina utilizando como modelo experimental las células politenizdas de larbas de Chironomus y el PGRA como abordaje experimental. La elección de este modelo se basa, en gran medida, en las características singulares de unas estructuras presentes en los cromosomas politénicos de las glándulas salivales conocidas como Anillos de Balbiani. Utilizando la técnica citada, se ha podido determinar, que en los BRs la actividad transcripcional altera la estructura nucleosomal, manifestándose por un incremento de la accesibilidad del psoraleno al ADN. El patrón de hibridación obtenido tras la aplilcación del PGRA difiere del obtenido en el sistema ribosomal, y que además dicho patrón pudiera reflejar la situación transcripcional heterogénea de las cromátidas que conforman los BRs.