BIOLOGIA MOLECULAR, 5

Autor: MATEO GONZALEZ CESAR.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROELEOQUÍMICA.

Resumen: En la presente tesis doctoral se han desarrollado nuevas técnicas que permiten controlar el grado de interacción (número de enlaces formados) entre sólidos preactivados y cada molécula de enzima adsorbida o inmovilizada covalentemente sobre los mismos. Por un lado, la intensidad de estas interacciones se han intentado maximizar para conseguir aumentar la estabilidad de relevantes enzimas industriales: estabilización de enzimas monoméricas por unión covalente multipuntual (estabilización de enzimas por rigidificación) o estabilización de enzimas multiméricas por inmovilización multisubunidades (estabilización o proteínas multiméricas). Por otro lado, en otros casos la intensidad de las interacciones enzima-soporte se han intentado minimizar para diseñar nuevos soportes a medida para optimizar técnicas de purificación de enzimas por cromatografía de afinidad. Además, fruto de las investigaciones realizadas se han desarrollado nuevos métodos de inmovilización covalente de enzimas sobre soportes activados con grupos epóxido, nuevos soportes activados con grupos epóxido, nuevos soportes para la inmovilización no distorisonante y reversible de proteínas (soporte polietilinimina), nuevos soportes muy selectivos para cromatografía IMAC, etc.

Autor: CARMONA DELGADO TERESA DE LOS ANGELES.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La inclusión de genes amiliolíticos en S.cerevisiae permite que este organismo pueda utilizar polisacáridos tan interesantes desde el punto de vista industrial como el almidón o la amilodextrinas. La expresión de estos genes se reprime por glucosa, metabolito producido en las fermentaciones industriales. Conocer el mecanismo por el que se realiza este efecto represor es basico tanto para conseguir evitarlo, como para entender el proceso por el que los organismos desarrollan una respuesta determinada ante una nueva condición ambiental. En este contexto se ha desarrollado el trabajo que se presenta, en el se ha estudiado la actividad promotora de dos genes amiololíticos, SWA1 y SWA2, de la levadura Schwanniomyces occideentalis en Saccharomyces cerevisiae. Se ha evaluado el efecto que sobre el gen SWA2 ejercen distintas fuentes de carbono, localizado las regiones implicadas en su regulación y analizado algunos de los factores que pueden implicados en ella. Parte de los resultados obtenidos por la licenciada se han incluido en un artículo ya publicado (Biochem J(1998) 329,65-71) y en otro que se encuentra en trámites para su publicacioni , y han dado lugar a numerosas comunicaciones a congresos nacionales e internacionales.

Autor: RODRÍGUEZ-BORLADO MARTÍNEZ LUIS.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Trabajos previos nos habían permitido aislar y caracterizar un mutante de la subunidad reguladora (p85) de la PI3K. Este mutante se asiló de infomas tímicos obtenidos tras irradicar con rayos X ratones SCID/SCID. Este mutante que pierde parte del dominio inter-SH2 y el dominio C-terminal SH2 es capaz de induir una más intensa activación de la subunidad catalítica de la PI3K de tipo IA (p110) y activar más intensamente el efecto de esta enzima AKT. La PI3K es una proteina con actividad lípido quinasa que ha sido implicada en múltiples respuestas celulares. Dentro de las tres familias de PI3K descritas solamante las pertenecientes a la familia de tipo I son capaces de producir un incremento rápido y transitoria de los productos PI3,4 P2 y PI3,4,5 P3, haciendo las ideales para los procesos tempranos de transmisión de señales. Diversos trabajos previos han demostrado in vitro la implicación de esta proteina en procesos de proliferación, diferenciación, migración y supervivencia. Con objeto de conocer la implicación de PI3K en los procesos de diferneciación tímica de los linfocitos T, así como el papel que juega en los procesos de activación de las células T y su homeostasis y valorar la relevancia de esta via de señalización en los procesos de transformación celular in vivo desarrollamos ratones transgénicos que expresaban el mutante p65 en los linfocitos T. El análisis fenotipicios de estos animales mostraban una disminución en el número de células CD4SP en el timo de los animales transgénicos. Estos se debía a un incremento en la migración de estas células desde el timo a la periferia. Así mismo, se producia un incremento de los linfocitos T CD4 en el bazo de los animales transgénicos cuando se comparo con los animales control. Aunque la presencia del transgén no altera la proliferación basal de las células T, disminuye los requerimientos antigénicos para proliferar en comparación con los animales salvajes. Un incremento en la actividad PI3K incrementa la supervivencia de las células T, lo que conduce a un acúmulo de células T con fenotipo de memoria tras una respuesta inmune. El acúmulo de estas células a lo largo de la vida del animal conduce al desarrollo de un procesos linfoproliferativo con infiltración de tejidos, entre los que cabe destacar el pulmón y el hígado, asi como a la activación de células B con la consiguiente liberación masiva de inmunoglobulinas y el desarrollo de un glomerulonefritis. Estos resultados ponen de manifiesto la implicación de esta enzima no solo en la migración de los timocitos desde el timpo a la perifeia sino en el control de la homeostasis de estas células. El análisis de ratones transgénicos par p65 en un fondo genético susceptible de sufrir el desarrollo de tumores nos reveló que p65 favorece la formación de tumores, acortando la vida media del animal hasta la mitad, demostrando el papel de esta enzima en los procesos de transformación celular, y como la vía de señalización inicidada por esta enzima juega un papel relevante en los procesos cancerígenos.

Autor: MARTINEZ FERNÁNDEZ M. PILAR.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UNIVERSIDAD AUTÓNOMA) .

Resumen: El hueso es un tejido conectivo especializado que forma junto con el cartílago el sistema esquelético. Los tipos de células óseas son: osteoblastos, osteoclastos, células estromales osteoprogenitoras y osteocitos. Osteoblastos y osteoclastos son los encargados de los procesos de formación y resorción ósea, lo que constituye el proceso de remodelado óseo, altamente regulado por diversas hormonas como la vitamina D. Los osteoblastosson las células que van a sintetizar las proteínas de la matriz ósea, como son el procolágeno tipo I C, terminal, fosfatasa alcalina, osteocalcina, etc... Además, el osteoblasto responde a hormonas sistémicas como la vitamian D cuyo metabolito activo es el calcitriol ó 1,25 (OH52D3). Asi, el osteobasto tiene en el promotor de alguno de sus genes, como la osteocalcina, un elemento de respuesta a la vit. D(VDRE), que actúa a través de su receptor (VDR), que es un factor de transcripción dependiente de ligando. El objetivo es estudiar la influencia de la edad y la localización anatómica de la muestra en la proliferación, diversos marcadores del fenotipo osteoblástico (procolágeno, fosfatasa alcalina y osteocalcina), así como sobre el VDR utilizando explantes óseos en cultivo primario de sujetos metidos a artroplastias de cadera y rodilla de edades, 50,70 y mayores de 70 años. También se determinará la respuesta de estos al 1,25 (OH) 2D3, así como la relación existente entre la osteocalcina y el VDR como un factor clave en la pérdida de hueso con la edad. Los resultados indican que: 1,- La edad y la localización influyen sobre la diferenciación (los osteoblastos de sujetos mayores y de caderas están más diferenciados). 2,- La pérdida de hueso con la edad depende de la localización y se puede deber a cambios en la diferenciación (los osteoblastos de caderas de sujetos mayores están más afectados). 3,- La adición de 1,25(OH)2D3 produce una mayor diferenciación dada la disminución del procolágeno, y el aumento de la fosfatasa alcalina y osteocalcina, estando este hecho influenciado por la edad y la localización. 4,- Con la edad se produce una disminución en la osteocalcina en respuesta a esta hormona en osteoblastos de cadera de sujetos mayores. 5,- Los niveles basales de VDR varían con la edad y la localización. Así, los osteoblastos de caderas de sujetos mayores tienen menores de VDR, al igual que ocurre a nivel de osteocalcina. Parece haber una relación entre la osteocalcina y el VDR, concluyendose que la pérdida de hueso con la edad afecta más al hueso cortical.

Autor: GASCON ESCOBAR IRENE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Las proteinas SSBs constituyen un gran familia de proteinas cuya propiedad principal es la capacidad para unir DNA de cadena sencilla (ssDNA), desempeñando un papel fundamental en procesos básicos del metabolismo del DNA. El principal objetivo de esta Tesis fue llevar a cabo un análisis comparativo de las SSBs de los fagos de Baciullos o29, Nf y GA-1 con el fin de intentar establecer una correlación entre caracteristicas estructurales y comportamientos funcionales de estas proteínas. Las principales conclusiones obtenidas del presente estudio son: 1. La comparación de las secuencias aminoacidicas de las tres SSBs pone de manifiesto el alto grado de homologia existente entre las SSBs de o29 y Nf, y la divergencia de la SSB de GA-1. 2. Las tres SSBs presentan capacidad de union a ssDNA así como de desestabilizacion de helice, aunque se requiere una menor concentracion de la SSB de GA-1 que de las otras dos SSBs para obtener un mismo efecto. 3. Las SSBs de o29 y Nf sedimentan en posición de monómero tras centrifugación en gradientes de glicerol, mientras que la SSB de GA-1 sedimenta en la posición correspondiente a un complejo hexamérico. 4. Los parámetros termodinámicos de unión de las tres SSBs a ssDNA revelan que la SSB de GA-1 ocluye un sitio de unión en el ssDNA mayor que las otras dos SSBs y que su afinidad global por sDNA tambien es mayor. 5. La SSB de GA-1 produce una reducción en la longitud del ssDNA de 6 veces frente a la reducción de 2 veces de la SSB de o29. En ausencia de ssDNA la SSB de GA-1 forma filamentos de proteina de longitud variable, a diferencia de las SSBs de o29 y Nf que no forman estructuras de este tipo. 6. Las tres SSBs manifiestan diferentes comportamientos funcionales en sistemas de replicación de DNA in vitro que reproducen las condiciones de los IR generados in vivo durante la replicacion del DNA viral. -La SSB de GA-1 estimula la incorporacion de dNTPs por la DNA polimerasa de o29 con concentraciones de SSB muy inferiores a las de las otras dos SSBs, posiblemente consecuencia de su mayor afinidad global por el ssDNA(Keff) y tamaño del sitio de union (n). -La SSB de o29 es la unica de las tres capaz de estimular la velocidad de replicación tanto de su propia DNA polimerasa como de la DNA polimerasa de Nf, lo cual podria estar correlacionado con una disociacion mas dinamica del complejo nucleoproteico de esta SSB por delante de la DNA polimerasa en su avance, consecuencia de su menor constante intrínseca de union (k) con el ssDNA. 7. La caracterización de proteinas mutantes de deleción en la región N-terminal de la SSB de GA-1, rica en aminoácidos cargados, ha puesto de manifiesto la importancia de esta región para una correcta oligomerización de la SSB de GA-1 y el mantenimiento de su afinidad por ssDNA. Ambas capacidades condicionan, a su vez, la eficiencia del comportamiento funcional de esta SSB.

Autor: TORRE MERINO M. PAZ DE LA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN: HOSPITAL 12 DE OCTUBRE.

Resumen: La interleuquina-6 (IK-6) es una citoquina que participa en los procesos inflamatorios desencadenados por el daño tisular. La reparación del tejido, subsecuente al daño, incluye la remodelación de la matriz extracelular (MEC) en el área dañada. Esta remodelación supone la degradación de los componentes de la matriz preexistente (por parte de las metalopretasas) y la síntesis de nuevas moléculas. No existían datos concluyentes sobre el papel de la IL-6 en la remodelación de la MEC. En este trabajo se analizó la regulación de una metaloproteasa, la colagenasa intersticial, por la IL-6 en cultivos de fibroblastos de rata de la línea Rat2. La IL-6 (20 ng/ml) aumentó la expresión del gen de la colagenasa intersticial de rata a partir de 6 horas de tratamiento y el máximo se alcanzó a las 24 horas. Igualmente la IL-6 aumentó la producción de colagenasa, de 60 Kda, y su secreción a los medios de cultivo. En paralelo al aumento de la expresión del gen hallamos que la IL-6 induce la actividad de un fragmento del promotor de la colagenasa de 2000 pares de bases. El análisis mutacional mostró que el sitio AP-1, situado entre las posiciones -19 y -42 en este promotor, determina la respuesta a la IL-6. La IL-6 aumentó el grado de unión del factor AP-1 a su secuencia consenso. Cuando se analizó el papel de la IL-6 en la regulación de las proteínas que forman el factor AP-1 hallamos que la IL-6 induce los ARNm de c-Jun y c-Fos, la actividad de sus promotores y los niveles intracelulares de estas dos proteínas. Asimismo el tratamiento con la IL-6 supuso un aumento de los niveles de c-Jun fosforilado en la serina-63. Esta fosforilación determina la actividad del factor AP-1 y está mediada por la quinasa N-terminal de Jun (JNK). Paradójicamente la IL-6 no indujo la actividad JNK. Cuando se valoró la participación de otras quinasas de serina/treonina como PKC, PKA 6 quinsas dependientes de clamodulina, hallamos que tampoco están implicadas en el efecto de la IL-6 sobre la expresión del gen de la colagenasa. EL tratamiento con IL-6 inhibió la actividad fosfatasa 2A. Esta fosfatasa de serina/treonina ha sido implicada en la defosforilación de c-Jun. La pérdida de actividad del enzima, en las células tratadas con IL-6, no fue debido a cambios en la concentración intracelular de la fosfatasa ni en su localización subcelular. La IL-6 indujo la fosforilación en tirosina de la subunidad catalítica de la fosfatasa; esta fosforilación reversible en tirosina es un conocido mecanismo de regulación negativa de la actividad fosfatasa 2A. Como conclusión del trabajo postulamos que la IL-6, a través del bloqueo de la fosfatasa 2A, provoca un aumento de fosforilación del factor c-Jun y, por tanto de la actividad transcripcional del factor AP-1, siendo este factor el responsable de la inducción del gen de la colagenasa intersticial de rata por la IL-6.

Autor: SALERO COCA ENRIQUE LUIS.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La proteína ApoE esta implicada en el transporte y metabolismo de colesterol y triglicéridos. En el Sistema Nervioso Central (SNC), ApoE participa en una serie de funciones vitales como es el aporte y mantenimiento de la membrana celular, limpieza de productos hidrofóbicos del medio, protección frente estímulos oxidativos, estabilización del citoesqueleto, control de crecimiento axonal, así como en procesos de plasticidad sináptica y regeneración neuronal en respuesta a daño cerebral. También se ha demostrado que tiene un papel importante durante el desarrollo embrionario en la diferenciación celular y organogénesis de diferentes tejidos. Alteraciones en la estructura, así como los niveles de ApoE constituyen un factor muy importante de susceptibilidad de padecer la enfermedad de Alzheimer (EA). El cerebro es el órgano en el que se produce mayor cantidad de ApoE después del hígado. Las principales células del cerebro productoras de ApoE son los astrocitos. Sin embargo, poco se conoce acerca de los mecanismos de regulación de este gen en estas células, a pesar del papel tan importante que esta proteína desempeña en el SNC. En este sentido en el laboratorio nos propusimos estudiar el mecanismo de regulación transcripcional del gen APOE. La región proximal del promotor de APOE constituye una de las regiones de mayor interés funcional pues es una zona extremadamente rica en secuencias regulatorias descritas en muchas líneas celulares. Por esta razón, nos planteamos investigar la región proximal del promotor del gen de APOE en células de astrocitoma como modelo celular para estudiar la regulación en la síntesis de ApoE en el cerebro, así como intentar identificar factores de transcripción responsable de la regulación específica de este tipo celular. En este trabajo se identificaron tres factores de transcripción: Zic1, Zic2 y USF1 que se unen a cuatro sitios de la región proximal del promotor de APOE, dos de estos sitios de la región proximal del promotor de APOE, dos de estos sitios se localizan dentro de la región URE1 (Zic-BS2 (-136/124) y Zic-BS3 (-185/-174), otro se localiza adyacente a esta región (Zic-BS1 (-65/-54) y otro más esta en la región URE3 (USF1-Bs4 (-101/-91)). La secuencia de unión de Zic1 y Zic2 indican una cierta ambigüedad en la secuencia reconocida, no obstante, pequeños cambios en los sitios de esta secuencias conllevan a la perdida de la interacción de estos factores con el ADN. De esta manera se ha establecido la presencia en los tres sitios de unión de Zic de la secuencia CTG seguida de una región rica en GC. Con respecto a USF hemos identificado una variante de la secuencia consenso E-box la cual varía de la secuencia consenso con la excepción del nucleótido 97 (A - T), sin embargo, la secuencia puede verse como igual a la consenso con la inclusión de los tres nucleótidos centrales CTC. Los factores Zic1, Zic2 y USF1 pueden modular la actividad transcripcional del promotor de APOE cuando se expresan ectópicamente. En el caso de las proteínas Zic no solo son capaces de estimular la actividad transcripcional en construcciones artificiales, sino también estimulan el gen endógeno observándose un aumento en la cantidad de ARNm y en los niveles de ApoE en las líneas estables Zic1-U87 y Zic2-U87. La expresión constitutiva de las proteínas Zic1 y Zic2 en células de astrocitoma humano induce importantes cambios en la expresión génica observándose al menos 51 genes en el caso de las células que sobreexpresaban Zic1, mientras que en las que sobreexpresaban Zic2 se observó un cambio en 57 genes.

Autor: DIAZ MARTINEZ VICENTE.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: En este trabajo se describe la primera aproximación experimental encaminada a la aplicación de una recombinasa perteneciente a la familia de resolvasas/invertasas a la manipulación controlada de genómas eucariotas. Actualmente sólo se dispone de el sistema cre/loxP derivado del bacteriófago P1 perteneciente a la familia Int. Los datos presentados en esta memoria demuestran que la proteína procariota recombinasa beta puede ser expresada de forma estable y funcional en líneas celulares eucariotas, presentando una gran avidez por el compartimento nuclear y localizándose mayoritariamente en regiones heterocromatínicas. La actividad de la recombinasa beta es capaz de actuar tanto sobre sustratos episómicos como integrados en cromatína y de forma adicional se ha demostrado que la sobreexpresión moderada de la proteína recombinasa beta es compatible con la viavilidad celular. Por encima de unos márgenes parece inducir efectos nocivos. El trabajo también recoge el desarrollo y análisis preliminar del primer modelo de aplicación in vivo. Se han desarrollado líneas de ratones transgénicos que continen integradas en su genóma un número variable de copias de una construcción sustrato y otras líneas transgénicas que sobreexpresan la recombinasa beta específicamente en el timo. Los resultados obtenidos tras el cruce de ambos tipos de animales transgénicos no han permitido, por el momento, demostrar la funcionalidad del sistema in vivo. Asumimos que el principal problema deriva de la integración de los transgenes en zonas transcripcionalmente inactivas, y en consecuencia el trabjo recogido en esta memoria ha abierto nuevas posibilidades de análisis.

Autor: GARCIA MARTIN ANGEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Se ha estudiado el papel de la citoquina TNF sobre la activación del linfocito T. Esta mediación se produce a través del factor NF-kB, siendo esencial la activación de la proteína c-Rel. Esta activación se produce por la fosforilación de su dominio de transactivación, siendo esencial la fosforilación del residuo de serina 471. El dominio de transactivación de c-Rel se compone de dos regiones: la región 540-588, necesaria para la actividad transcripcional y fuertemente fosforilada en condiciones basales; y la región 422-540, donde residen las propiedades fosforilables. Son esenciales los residuos de serina 455, 461, 464, 470, 471 y 473. Por otro lado participa la fosforilación de los residuos 492, 494, 509-512, 514 y 519, aunque esta fosforilación no es esencial. En la ruta de activación de c-Rel por TNF participan las proteínas PI3-K y PKCz, de modo que las dianas de actuación de ésta última son los residuos de serina 461 y 492-494, no obstante PKCz no fosforila directamente a c-Rel. Por otra parte, la activación de c-Rel por TNF está implicada en mecanismos de supervivencia celular frente a la apoptosis inducida por el propio TNF.

Autor: CIPRES BLANCO ANGEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA, CSIC.

Resumen: En la memoria presentada se ha estudiado cuáles de los diferentes dominos del receptor de IL-2 son responsables de la activación de las señales tempranas que regulan proliferación y supervivencia celulares. En este sentido se demuestra como en un mutante de truncación de la cadena del receptor de IL-2 que conserva 115 aa en su parte ctoplasmática, esta citoquina induce una señal de supervivencia, que depende de la actividad PI3K, en ausencia de proliferación. En cambio, el receptor nativo genera una señal de supervivencia que es independiente de esta activida, demostrando que existen dos rutas redundantes y no dependientes que regulan este proceso. Este hecho se confirma con el estudio de otro mutante del receptor de IL-2 que también induce supervivencia y no proliferación. Este mutante regula este proceso de un modo independiente de la actividad PI3K, presentando en este caso activación de STAT5 sugiriendo que esta señal también es capaz de regular supervivencia celular por sí misma. Además los estudios realizados demuestran como el bloqueo de cualquiera de estas dos señales tempranas conlleva la pérdida de proliferación inducida por la IL-2. Por último, se estudia el denominado mutante acídico del receptor de IL-2 demostrando que, en contra de lo creído hasta el momento, este mutante es capaz de producir activación de src-quinasas, siendo esta actividad necesaria para la proliferación inducida por la IL-2. Así mismo, se demuestra que este mutante posee una activación constitutiva de la PI3K asociada a la cadena del receptor del IL-2 regulable por IL-2. Esta activación constitutiva puede explicar el hecho de la ventaja proliferativa que presentan las células que expresan el mutante acídico respecto las que expresan el receptor nativo. Para finalizar se presentan datos que muestran como las actividades PI3K y src-quinasa son capaces de regular el promotor de c-myc.

Autor: HERRERA GONZALEZ DE MOLINA ELOISA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: - El acortamiento telomérico en ratón muestra una correlación directa con la suervivencia del organismo. Los ratones que carecen del gen que codifica para el RNA de la telomerasa en un fondo genético con los telómeros cortos, exhiben un fenotipo más acusado y más temprano que los ratones que tienen una longitud telomérica inicial más larga. - El cierre del tubo neural durante el desarrollo embrionario es uno de los procesos más sensibles al acortamiento telomérico. El acortamiento teolomérico crítico durante este proceso puede desencadenar defectos en el embrión tales como asimetría bilateral del cerebro o defectos en el cierre del tubo neural. - En ausencia de telomerasa, el ratón desarrolla un fenotipo similar al de envejecimiento prematuro en los órganos relaccionados con una proliferación celular masiva tales como sistema digestivo, sistema inmune y la línea germinal. - Ratones que carecen de actividad telomerasa y que tienen telómeros cortos muestran un incremento en la aparición de neoplasias, principalmente en los órganos que también mostraban defectos proliferativos tales como el sistema inmune, digestivo y línea germinal. - En ratones salvajes la elongación del telómero que tiene lugar durante la formación de los centros germinales después de una inmunización se debe a la activación de la telomerasa, ya que estos ratones deficientes en telomerasa no muestran tal alargamiento de la longitud telomérica. - El acortamiento del telómero afecta a la capacidad de formación de los centros germinales en los bazos de ratón en respuesta a inmunización. - El acortamiento telomérico que sufren los esplenocitos de las células de ratones sin telomerasa provoca un defecto en la respuesta humoral como reacción a un antígeno. - Las células de bazo derivadas de ratones sin telomerasa de las últimas generaciones que han sido inmunizados muestran una longitud telomérica comparable a la de los ratones salvajes, sugiriendo la activación de un mecanismo de elongación del telómero alternativo a la telomerasa en ratones que tienen los telómeros críticamente cortos.

Autor: LARA ARNAUD BEATRIZ.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: El trabajo presenta la caracterización molecular y funcional de la proteína FtsW de Escherichia coli, recientemente descrita como esencial en la división celular de la bacteria. Concretamente, se ha analizado "in vitro" la actividad transglicosilasa de PBP3, enzima responsable de la síntesis del peptidoglicano septal, en presencia de FtsW, demostrándose la ausencia de polimerización. Se ha detectado una interacción entre FtsW y el lípido II, utilizando en la síntesis del peptidoglicano, por lo que se produce que la función de FtsW es translocar dicho precursor a través de la membrana interna para su utilización por PBP3. Por otra parte, se ha determinado la topología de la proteína en la membrana mediante la construcción de fusiones con el gen de la fosfatasa alcalina. El modelo propuesto consiste en seis segmentos transmembrana y dos bucles solubres situados a ambos lados de la membrana. Además, se sugieren distintas regiones implicadas en el interacción con el precursor lipídico.

Autor: LORZ LOPEZ CORINA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: LAB NEFROLOGIA FUNDACION JIMENEZ DIAZ.

Resumen: La muerte de células tubulares es el único parámetro histológico que se correlaciona con el grado de insuficiencia renal durante el fracaso renal agudo (FRA). Sin embargo los mecanismos moleculares de la muerte del epitelio tubular renal son desconocidos. La comprensión de estos mecanismos puede llevar al diseño de nuevas estrategias terapéuticas en pacientes con insuficiencia renal, una situación clínica con enormes implicaciones económicas y sociales. Hemos estudiado la expresión de proteínas reguladoras de la muerte celular durante el FRA y hemos investigado, en células tubulares cultivadas, cuáles son los agentes responsables de los cambios observados in vivo, las consecuencias funcionales de esos cambios y posibles maniobras terapéuticas. Durante el FRA y en la nefritis intersticial crónica se producen localmente en el riñon citoquinas letales, como TNF y FasL. Además, en el FRA la expresión de proteínas de muerte celular de la familia Bcl2 está alterada , aumenta la proteína proapoptótica Bax, disminuye la proteína antiapoptótica Bcl2 y se producen cambios heterogéneos en la expresión de BclxL: algunas células tubulares pierden la expresión de BclxL mientras que otras, probablemente las que luego regeneran los túbulos, tienen una expresión aumentada de esta proteína protectora. En células tubulares epiteliales cultivadas comprobamos que los factores de supervivencia del suero evitan la muerte celular, y su ausencia crea un microambiente intracelular, caracterizado por un bajo cociente BclxL/Bax, que favorece la muerte por apoptosis y predispone a la apoptosis inducida por citoquinas letales y nefrotoxinas también disminuyen la expresión de la proteína antiapoptótica BclxL. Al explorar las posibles consecuencias terapéuticas de estos hallazgos, observamos que la sobreexpresión de BclxL protege al epitelo tubular de la apoptosis inducida por citoquinas letales y nefrotoxinas. Por el contrario, la inhibición de caspasas evita la morfología de apoptosis causada por fármacos nefrotóxicos pero no evita la muerte celular. Estos hallazgos sugieren que fomentar la expresión de BclxL puede ser un objeto terapéutico para evitar la muerte del epitelio tubular en el tratamiento del FRA y de la atrofia tubular crónica. Lfas es una de las principales citoquinas que regulan la apoptosis. En este trabajo demostramos que el riñón sano murino y de rata sintetiza la citoquina letal LFas, siendo el epitelio tubular la principal fuente de esta citoquina. Durante la inflamación renal aparece síntesis de novo de Lfas en el glomérulo. Las células tubulares en cultivo expresan LFas y son relativamente resistentes a la apoptosis inducida por esta citoquina. El LFas sintetizado por las células epiteliales tubular posee actividad biológica y resulta letal para linfocitos, lo que sugiere que la expresión de LFas por las células tubulares podría ser un mecanismo de defensa frente a la fibrosis e inflamación renal. Sin embargo, durante el daño renal aumenta la expresión tubular de Fas, lo que puede convertir al túbulo de "verdugo" en "víctima" y puede colaborar en la pérdida de masa tubular.

Autor: MARTINEZ GUITARTE JOSE LUIS.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La secuencia telomérica de C. Thummi tiene 176 pb. Otra característica del telómero de C. Thumi es su capacidad de activarse por choque térmico. A través del estudio de la organización telomérica se han buscado las posibles bases moleculares del fenómeno de activación. Inicialmente se ha completado la descripción del fenómeno de activación telomérica además de caracterizarse una población no inductora. El estudio de la organización telomérica se ha realizado por medio de una minigenoteca obtenida por microclonaje del telómero derecho del cromosoma III, por análisis de restricción sobre ADN genómico y por PCR. Esta aproximación ha dado como resultado una nueva variante de la secuencia telomérica y la observación de que cada variante es dominante en un telómero. Por último, se ha detectado la presencia de un elemento de respuesta a choque térmico (HSF). Este elemento es capaz de unir el factor específico de choque (HSF) in vitro. Su presencia es condición necesaria pero no suficiente para la activación telomérica.

Autor: MEDINA SANABRIA DIEGO LUIS.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En este trabajo hemos estudiado el control de la proliferación de las células FRTL-5 por TSH y somatostatina (SS). Así, hemos demostrado que estas células expresan SS y que esta expresión está regulada transcripcionalmente por la TSH. Mediante ensayos funcionales con medios condicionados de células FRTL-5 tratadas con TSH, hemos demostrado que estas células producen SS y que el bloqueo con anticuerpos específicos, de este péptido, incrementa la capacidad estimuladora de la proliferación de la TSH presente en el medio condicionado. Por otro lado, el tratamiento con TSH+SS induce una parada en la fase G1 del ciclo. Este efecto, parece estar mediado por el inhibidor de CDKs p27Kipl. Así, la TSH regala negativamente los niveles de esta proteína y la SS es capaz de revertir este efecto. El análisis de la expresión de los receptores que median la respuesta a la SS, demostró que las células FRTL-5 sólo expresan el SSTR2. En líneas tiroideas tumorales (FRT) y transformadas (K-ras-FRTL-5) la respuesta a la SS está alterada. Aunque las dos líneas expresan el receptor tipo 2, sólo las células K-ras-FRTL-5 son sensibles al tratamiento con SS. En conjunto los resultados sugieren la existencia de un bucle de regulación autocrina que controla la proliferación celular tiroidea y que podría estar alterado en los procesos tumorales. Para profundizar en los mecanismos de acción de la TSH y la SS sobre la proliferación de las células FRTL-5, analizamos las rutas de transducción de señales y los genes del ciclo celular implicados en este proceso. Los resultados demuestran que la TSH incrementa la expresión de la HMGCoA-reductasa, un enzima esencial en la síntesis de isoprenoides. Paralelamente, la TSH incrementa los niveles de RhoA en extractos de proteína de membrana de células FRTL-5. Además, la TSH aumenta los niveles de ciclina D1 y E, de CDK2 y de Rb. Igualmente, esta hormona favorece la formación de los complejos ciclina E-CDK2. Contrariamente, la SS inhibe la formación de estos complejos. Usando inhibidores específicos, observamos que, la inhibición de la PKA, de la PI3K y de la HMGCoA-reductasa, pero no la inhibición de las MAPKs, bloquea la proliferación mediada por TSH causando una parada en la fase G1. La SS afecta a la acción de la TSH inhibiendo la activación de la AC. Los resultados sugieren que la proliferación de las células FRTL-5 en respuesta a la TSH implica la activación de la ruta de la cAMP/PKA y de la PI3K. Estas rutas estimulan la expresión de genes del ciclo celular como ciclina E, CDK2 y Rb. Además, la TSH regula negativamente los niveles de p27Kipl y activa RhoA, que podría ser responsable de la degradación de p27Kipl. Por último la SS inhibe la proliferación de las FRTL-5 mediada por la TSH inhibiendo la actividad de la AC.

Autor: PEREZ SANCHEZ CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (AUTONOMAS).

Resumen: En nuestro laboratorio, analizando genotecas de hígado fetal y de cerebro humano, hemos descubierto un nuevo factor de transcripción de la familia fork-head al que hemos denominado FHX. Este factor se expresa almenos en dos isoformas: FHX.L Y FHX.S, de 574 y 526aminoácidos respectivamente. Los primeros 512 aminoácidos son comunes a ambas isoformas que sólo se diferencian en sus regiones C-terminales. FHX se une al ADN de forma específica reconociendo secuencias que se ajustan al consenso 5'a/t A/c a A/g T/c. A A A C/t A 3', compatible con la secuencia consenso de unión a factores fork-head. FHX también es capaz de unirse de forma específica a ciertas secuencias que no son compatibles con el consenso mencionado, lo que implicaría una mayor versatilidad en su reconocimiento de secuencias. Para este reconocimiento y unión específica no es necesaria la región de FHX equivalente a la región W2 del dominio fork-head. FHX se expresa en numerososo órganos humanos adultos aunque su expresión no llega a ser ubicua. Su nivel de expresión varía de unos órganos a otros. En la línea germinal masculina, FHX se expresa en estadios meióticos y su ARNm no se detecta en espermatogonias en proliferación ni en espermatozoides. Además FHX comienza a expresarse en el desarrollo embrionario de ratón antes del día 14.5 de gestación. En este estadio FHX ya se expresa en todos los órgandos donde se expresará en el adulto. Tanto FHX.L como FHX.S tienen un efecto activador de la transcripción siendo FHX.L la isoforma de mayor pontencial activador. Transfecciones de células Hep3B y NIH3T3 sugieren que este efecto es independiente de tipo celular.

Autor: VALIN GARCIA ALVARO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: La proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) es un factor producido por los osteoblastos, con acciones similares a las de la PTH sobre el remodelado óseo, al menos en los efectos mediados a través de su región N-terminal. Por otra parte, la región C-terminal de la PTHrp no homóloga con la PTHrp no homóloga con la PTH, que contiene el epítopo 107-111 (osteostatina), es un potente inhibidor de la resorción ósea. En el presente trabajo, hemos investigado los efectos del posible fragmento de la PTHrP(107-139), que contiene la osteostatina, sobre la función osteoblástica en cél. de osteosarcoma de rata de fenotipo osteoblástico UMR106 y en cél. osteoblásticas de hueso trabecular humano (hOB), con diferente grado de diferenciación. Nuestros estudios demuestran que tanto la PTHrP(107-111) como la PTHrP(107-139) son antiproliferativas e inhiben la actividad fosfatasa alcalina, un marcador de diferenciación osteoblástica, en ambos tipos. Estos efectos parecen venir mediados a través de la estimulación de la vía proteína quinasa C y no por la proteína quinasa A. Además este fragmento de la PTHrP es capaz de estimular la movilización de Cai2+ a través de canales de calcio dependientes de voltaje. El fragmento C-i terminal de la PTHrP es capaz de modular la activación de la señal de Cai2+, así como la de la PKA, generada por PTHrP N-terminal. La expresión del protooncogen c-fos, implicado en los procesos de diferenciación osteoblástica, fue estimulada por la PTHrP(107-139) de un modo rápido y transitorio. Así mismo, la actividad del factor de transcripción AP-1, del cual forma parte el c-fos, también fue estimulada tras la adición de la PTHrP C-terminal en células UMR 106.

Autor: COUSINOU RODRIGUEZ MERCEDES.
Año: 1999.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA BASICA Y APLICADA.

Resumen: La biotransformación de diversos xenobióticos presentes en los ecosistemas marinos está catalizada por enzimas inducibles. Esta respuesta permite su uso como biomarcadores tempranos de contaminación ambiental. Este estudio se ha centrado en el citocromo P4501A ( CYP1A) como respuesta de fase I frente a xenobióticos orgánicos y en la metalotioneína (MT) que refleja la contaminación por metales pesados. La alta homología existente entre las secuencias de ambos genes en diferentes especies de peces, permitió diseñar oligos degenerados para amplificar por PCR secuencias de cFNA de CYP1A y MT en dos especies de peces; Sparus aurata ( dorada) y Linza aurata (lisa). La obtención de fragmentos de cFNA específicos de ambos genes por RT-PCR y susecuenciación, permitió el diseño de oligo específicos para conseguir por RACE-PCR cDNAS completos que han sido clonados y secuenciados. A partir de estas secuencias se diseñaron nuevos oligos específicos que permitieron amplificar fragmentos de 149pb y 163 pb respectivamente en MT y CYP1A.Los niveles de los correspondientes mRNAs se han medido por transcripción inversa acoplada a PCR (RT-PCR), seguida de separación por tamaño de los amplicones en un secuenciador de DNA y su cuantificación con el software "GeneScan". Se han construido patrones internos, con 6pb más en los cDNAs correspondientes, que permiten su cuantificación por PCR competitiva. Esta metodología se ha validado por exposición a contaminación modelo, b-naftflavona y CdC12. Como referencia, se ha utilizado la actividad EROD,ELISA y "Western", activación de 2-AA o determinación de metalotioneínna.

Autor: RAMIREZ PARRA ELENA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" CSIC-UAM.

Resumen: El factor de transcripción E2P, cuya actividad se regula esencialmente por su unión a Rb, controla la expresión de genes implicados en la transición G1/S y la repliación del DNA en células de mamíferos y Drosophila (Dyson, 1998). Al comienzo de nuestro trabajo no se había identificado ningún homológo de la proteína E2F en plantas, y por lo tanto, se desconocía si este mecanismo también operaba en la célula vegetal. En esta Tesis Doctoral, hemos obtenido datos sobre identificación, clonación y caracterización del cDNA (TmE2F) que codifica un homólogo E2F de trigo (Triticum monococcum) y que interacciona con el homólogo Rb en plantas, ZmRb1 (RBR). También presentamos datos sobre la clonación del cDNA (TmDP) que codifica el homólogo DP de trigo, como pareja heterodimérica de TmE2F. TmE2F y TmDP son los primeros miembros de la familia de factores de transcripción E2F identificados en plantas. Por último, hemos estudiado la interacción del complejo TmE2F/TmDP con secuencias de DNA presentes en promotores de genes potencialmente regulados en G1/S. Nuestros estudios preliminares apoyan la idea de que los mecanismos moleculares básicos de regulación de la transición G1/S basados en la ruta Rb/E2F en animales y plantas están funcionalmente conservados. Además, la disponibilidad del factor E2F/DP proporciona nuevas herramientas de trabajo, que junto con el análisis genómico de plantas modelo (A. Thaliana, arroz) permitirán la identificación de genes regulados por E2F/DP y ayudarán a entender como se regula el crecimiento y el desarrollo de la planta.

Autor: SANZ RODRIGUEZ FRANCISCO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS (C.S.I.C).

Resumen: La integrina VLA-4 media la adhesión de células de mieloma al estroma de médula ósea de mieloma múltiple (MM). La región CS-1 de fibronectina (FN) y VCAM-1 constituyen los principales ligandos de VLA-4 y ambos se expresan en el estroma de MM. La región H1, que está presente en todas las isoformas de FN, constituye un sitio de unión adicional para VLA-4. Utilizamos los fragmentos de FN, FN-H89, FN-H0, que contienen la región CS-1 y H1, o sólo la región H1, respectivamente, así como una forma soluble de VCAM-1 (sVCAM-1), para caracterizar las vías de adhesión mediadas por VLA-4. Las células CD38highCD45RA de médula ósea de mieloma múltiple (MM), y las líneas celulares derivadas de mieloma, NCI-H929, IM-9 y RPMI8226, se adhirieron específicamente, a diferentes niveles, a FN-H89, FN-H0 y a sVCAM-1, y su adhesión dependiente de VLA-4 fue aumentada por el anticuerpo monoclonal anti-1 TS2/16, el cual aumenta la afinidad y la avidez de las integrinas VLA-1. Asimismo la función de VLA-4 sobre células NCI-H929 fue aumentada por TS2/16 durante su adhesión al estroma de MM. La integrina 4 7 medió una pequeña proporción de la adhesión de líneas celulares derivadas de mieloma a FN-H89, principalmente bajo la activación de la integrina con Mn2+. Todos estos datos indican que las células de mieloma utilizan las vías adhesión VLA-4/CS-1/FN, VLA-4/H1/FN y VLA-4/VCAM-1 para mediar su adhesión al estroma de MM, y sugiriendo que la actividad adhesiva de esta integrina puede ser modulada, haciendo posible que estas células se adhieran en mayor grado a estos ligandos de VLA-4, lo cual podría influir en la localización de las células de mieloma en la médula ósea. La quimioquina SDF-1 desarrolla su función tras unirse a su receptor CXCR4. En este trabajo hemos demostrado que las células CD38highCD45RA- de médula ósea de MM y líneas celulares derivadas de mieloma expresaban CXCR4 y mostraban una respuesta quimiotáctica moderada hacia SDF-1. Asimismo, esta quimioquina produjo un aumento rápido y transitorio de la adhesión de células de mieloma mediado por VLA-4 a CS-1/FN y VCAM-1, el cual fue inhibido por toxina pertúsica y citocalasina D, indicando la implicación de vías de señalización acopladas a proteínas Gi y un citoesqueleto intacto. La modulación por SDF-1 de la adhesión de células de mieloma mediado por VLA-4 podría contribuir al tráfico y localización de estas células en el microambiente de la médula ósea. TGF-1 es una citoquina multifuncinal que regula una gran cantidad de procesos celulares como proliferación y diferenciación celular, adhesión y migración y reparación de tejidos. TGF-1 produjo un aumento rápido y transitorio de la adhesión y linfocitos de sangre periférica (población total y linfocitos T seleccionados), así como de las líneas celulares MO7e, U937, K562-4 y JY, mediada por VLA-4 a CS1/FN y sVCAM-1, el cual fue inhibido por Citocalasina D. TGF-1 también produjo un rápido y transitorio aumento de la polimerización de F-actina y de la actividad de las GTPasas Rho y Rac, coincidiendo con los tiempos de estimulación por TGF-1 de la adhesión mediada por integrinas 4, indicando la posible implicación de vías de señalización de las GTPasas Rho y un citoesqueleto intacto.