BIOLOGIA MOLECULAR, 6

Autor: FERNANDEZ LOZANO M. JOSE.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La mitramicina es un policétido aromático con actividad antibiótica y antitumoral sintetizado entre otras especies de Streptomyces argillaceus. En la estructura de la mitramicina existen tres grupos metilo que son transferidos durante su sintesis por metil transferasas. Dos de dichos grupos están unidos a la estructura policetídica en posicion 1´y 7. El objetivo de este trabajo fue la caracterización genética y funcional de los genes implicados en las dos metilaciones de la estructura policetídica de la mitramicina. Para ello se han estudiado dos regiones separadas de la ruta de biosíntesis denominadas zona I y zona II. En la zona I el análisis de la secuencia obtenida mostró la existencia de tres pautas de lectura abierta denominadas mtmZ,mtmA y mtmH. MtmZ, en base a las homologías con otras proteínas de las bases de datos podría ser una tioesterasa implicada en la separación de la cadena policetídica el complejo enzimático de la PCS una vez finalizada la síntesis. MtmA es una proteína con dos dominios funcionales: S-adenosilmetionina sintetasa y N5, N10-metilentetrahidrofolato reductada. MtmH mostró similitudcon S-adenosil homocisteína hidrolasas. Estos enzimas en el metabolismo primario participan en el ciclo de metilos activados, relacionados con la síntesis de metionina. Los genes mtmA y mtmH se inactivaron conjuntamente mediante reemplazamiento génico. En el mutante generado se sigue produciendo mitramicina lo cual indicó que los genes inactivados no son imprescindibles para la biosíntesis del antibiótico, sin embargo los niveles de producción de mitramicina en la cepa mutante son muy superiores lo cual sugiere un papel regulador de uno o ambos genes en la biosíntesis de mitramicina. En la zona II el análisis de la secuncia indicó la existencia de dos fases de lectura abierta completas denominadas mtmMI y mtmMII. La comparación de ambas proteínas en las bases de datos mostró similitud con metiltransferasas implicadas en la metilación de la estructura policetídica de diversos antibióticos. La inactivación independiente de ambos genes mediante reemplazamiento génico y el ensayo in vitro de la actividad de ambos enzimas demostraron su implicación en las metilaciones de la estructura policetídica de la mitramicina. MtmMI cataliza la metilación en la posición 4 del intermediario 4-demetilpremitramicinona para formar premitramicinona. MtmMII es la metiltransferasa responsable de la metilación de la posición 9 del intermediario 9-demetilpremitramicina A3 para originar premitramicina A3. A partir del mutante afectado en mtmMII se han aislado y caracterizado dos nuevos compuestos:7-demetilmitramicina y 9-demetilpremitramicina A3.

Autor: GUTIERREZ CIANCA M. PILAR.
Año: 1999.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El proto-oncogén Spi-1 es un factor de trasnceipciónperteneciente a la familia Ets. En nuestro trabajo nos planteamos estudiar el papel de Spi-1 en la proliferación, diferenciación y respuesta a interferón de células mieloides. Para ello elegimos el modelo de la línea celular K562, procedente de unpaciente conleucemia mieloide crónica LMC. Esta línea puede ser inducida a diferenciación eritroide, mielo-manocítica y megacariocítica para tratamiento con diferentes agentes,d e modo que nos permitió estudiar la regulaciónde spi-1 durante la diferenciación. Por otro lado el tratamiento de las células K562 con los interferones a, b y y induce parada proliferativa de las células sininducciónde diferenciación, lo que nos perimitó estudiar el papel de Spi-1 durante procesos proliferativos. Analizamos además la expresiónde spi-1 en muestras procedentes de pacientes con LMC en fase crónica y en crisis blástica. Para estudiar de una forma más directa el papel de Spi-1 en proliferación y diferenciación de células mieloides, obtuvimos transfechantes estables de Spi-1 en las K562. Las conlucisones de este trabajo son que Spi-1 parece estar implicado en procesos antiproliferativos de células mieloides, y que su sobreexpresión ectópica predispone a las células K562 hacia la diferenciación mielo-manocítica mientras que inhibe su diferenciación eritroide. Spi-1 es un factor regulador fundamental de la mielopoyesis.

Autor: LIMON MIRON M. CARMEN.
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: Esta tesis se ha centrado en el estudio de quitinasas del hongo micoparásito Trichoderma harzianum CECT 2413,concretamente las quitinasas Chit33 y Chit42. Se clono y secuencio el gen que codifica a la quitinasa Chit33. La regulacion del gen chit33 se etudio tanto mediante analisis de la secuencia del promotor como mediante analisis de northern y se comparó con la del gen chit42. Estos genes se reprimen en presencia de altas concentraciones de glucosa, glicerol o N-acetil-glucosamina. Y se desreprimen principalmente en hambre de carbono o nitrogeno. Con el fin de estudiar la posible función morfogenética de estas quitinasas se estudió si las quitinasas Chit33 y Chit42 eran capacez de complementar la mutación en la quitinasa de Saccharomyces cerevisae. Por otro lado se analizó la superexpresión de Chit33 y Chit42 eran capaces de complementar la mutación en la quitinasa de Saccharomyces cerevisae. Por otro lado se analizó la superexpresión de Chit33 y Chit42 en T.harzianum con el fin de determinar si estas quitinasas tienen función antifúngica, así como obtener cepas para el control biológico de fitopatógenos. Las cepas resultantes mostraron mayor capacidad antagónica frente a Rhizoctonia solani Por último, se han obtenido quitinasas híbridas mediante la fusión a Chit42 de un dominio de unión a quitina (ChBD) de una quitinasa de tabaco y un dominio de unión a celulosa (CBD) de una celulasa de Trichodema reesei. Las proteínas resultantes mostraron mayor afinidad por quitina incluso en condiciones de pH extermo o con altas concentraciones de sales que Chit42. Además, también son capaces de degradar sustratos insolubles en mayor medida. Por tanto, estas enzimas podrían emplearse para la degradación de quitina insoluble producida por industrias alimentarias.

Autor: ALEJO HERBERG ALI.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .

Resumen: Se presenta en esta tesis el estudio de la proteína pB318L del virus de la peste porcina africana (VPPA), que es homóloga a preniltransferasas. Se ha analizado la actividad de una forma recombinante purificada de esta proteína así como de la proteína pB318L expresada durante la infección, clasificándola como una geranilgeranilpirofosfato sintasa (GGPPS). Este es el primer enzima de este tipo de origen viral descrito. Se ha determinado la expresión y localización subcelular de esta proteína durante la infección de células en cultivo con el VPPA, demostrando que se trata de una proteína integral de membrana asociada a las membranas precursoras de la envuelta interna de los viriones. Esto sugiere un papel de este enzima en la morfogénesis del VPPA. Los estudios con inhibidores de prenilación de proteínas y la existencia de un gen del VPPA que codifica una proteína con un motivo de prenilación que se geranilgeranila in vitro, han permitido proponer una posible función del geranilgeranilpirofosfato producido por la GGPPS del VPPA en la prenilación de proteínas durante la infección.

Autor: PIQUERAS MARTIN RAQUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Como parte del proceso adaptativo frente al ataque patogénico, las plantas han desarrollado una amplia variedad de respuestas de defensa, entre las que cabe destacar la reacción hipersensible, desarrollada en las interacciones incompatibles. Mediante la técnica del "differential display", identificamos dos ADNs de Arabidopsis thaliana, designados ap33A y ap43A, cuya expresión se inducía tras la infección con la bacteria incompatible Xanthomonas campestris pv. campestris (147). La secuencia de ADNs completos correspondiente al fragmento ap43A codifica para una proteína con dos dominios quinasa, mientras que la secuencia del fragmento ap33A codifica para una proteína con elevada homolgía con proteínas centrinas de distintos organismos. La expresión de ambos genes se induce en respuesta a la infección de bacterias tanto incompatibles como compatibles, siendo más rápida la inducción del gen ap33A en el primer tipo de interacción, mientras que la inducción del gen ap43A resulta ser bastante inespecífica, induciendose igual, independientemente del tipo de interacción planta-patógeno que se establece. Decidimos centrarnos en estudiar más en profundidad las características de expresión del gen ap33A; así vimos que la expresión del gen se activaba en respuesta al tratamiento con ácido salicílico, y compuestos inductores de la síntesis de especies de oxígeno activo, así como en respuesta a la herida. El papel de la proteína AP33A en la respuesta de defensa vegetal se investigó en plantas transgénicas de tabaco y Arabidopsis en las que la expresión del ADNc ap33A está dirigida por las secuencias reguladoras del promotor del virus del mosaico de la coliflor. El análisis de la respuesta de las plantas transgénicas obtenidas, frente a la infección por bacterias y virus incompatibles, así como en respuesta al tratamiento con un compuesto inductor de la síntesis de especies de oxígeno activo, reveló que el número de células necrosadas tras los tratamientos citados, era significativamente menor en las plantas transgénicas, que en las plantas control.

Autor: OLAZABAL OLARREAGA ISABEL M..
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: 1.- La expresión del RPRL induce un incremento de la proliferación de células BMGE, sugiriendo un contacto con componentes de la matriz extracelular. La estimulación con PRL causa un aumento adicional de la proliferación celular mediante interacciones intracelulares con proteínas de señalización. 2.- La PRL activa los promotores de Beta-caseína y de AP-1 y su acción es transmodulada por glucocorticoides. La hormona induce la unión a ADN del complejo AP-1, y concretamente del factor c-Jun. Dicha activación está medida, en parte, por la actividad de la enzima JNK. La transmodulación de los glucocorticoides es sinérgica en el caso de Beta-caseína y antagónica en el caso de AP-1. El efecto antagónico es mediado por una inhibición de la JNK, que causa una disminución en el contenido de c-Jun en los complejos AP-1. 3.- La relación estructura/función del receptor de PRL en la proliferación celular y activación de AP-1 es mediada por la homodimerización del RPRL-L y las interacciones de la Caja-1 y la tirosina distal del receptor. 4.- La PRL activa Src en células epiteliales de glándula mamaria. Src se asocia constitutivamente al RPRL-L por medio de la Caja V o X, pero no requiere ni la Caja de prolinas, ni la tirosina distal del RPRL. A su vez los mutantes de delección de los dominios SH2 y SH3 de Src no se asocian al RPRL, o lo hacen con menor afinidad. Nuestros datos sugieren que Src media en la activación lactogénica inducida por PRL y en la transducción de señal de las interacciones del RPRL con proteínas de la matriz extracelular.

Autor: LAAYOUNI HAFID.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSITAT AUTONOMA DE BARCELONA.

Resumen: Se elaboró un mapa físico del genoma de Drosophila buzzatii basado en maracadores moleculares polimórficos: Random Amplified Polymorphic DNAs (RAPDs) y Sequence Tagged Sites (STSs). Se ensayaron 83 cebadores aleatorios de 10 nucleótidos, de los cuales 44 produjeron 144 RAPDs polimórficos y reproducibles.Estos RAPDs fueron hibridados in situ sobre los cromosomas politénicos de D. Buzzatii. Un total de 73 RAPDs cartografiaron en una posición única, 35 hibridaron en 2 o más posiciones, y 36 RAPDs no produjeron señal de hibridación detectable. La mayoría de los marcadores obtenidos (68%) cartografiaron enlso cromosomas 2 y 4. La distribución de los RAPDs conel cromosoma 2 resultó ser aleatoria, mientras que en el cromosoma 4 se detectó una agrupación mayor a de lo esperado por azar. Uno de los RAPDs cartografió cerca del punto de rotura proximal de la inversión 2z3 y fue hibridado in situ sobre las ordenaciones 2st y 2jz3. Los resultados indican que este marcador no está incluido en el segmento invertido, aunque pudo detectarse que el punto de rotura distal de la inversión 2z3 no coincide con el descrito previamente. Se obtuvieron un total de 38 STSs, que representan un valor agregado de 27,982 pb con un contenido G+C promedio del 41,5%. Estos STSs fueron comprados con las secuencias descritas de las bases de datos, observándose similitudes significativas en 15 casos. Estas secuencias mostraron un parecido elevado con genes previamente descritos en Drosophila, o con genes descritos en otros taxones, siendo posible inferir homología para dos de ellas. La búsqueda de pautas abiertas de lectura (ORFs) reveló la presencia de regiones codificadoras pertenecientes a hipotéticos genes no descritos hasta el momento. La comparación de la localización citológica de los STSs y de las secuencias con las cuales mostraron similitud, confirmó la conservación de las homologías cromosómicas postuladas y permitió sugerir la posible localización de algunos genes que no habían sido cartografiados en D.Melonogaster. Se secuenciaron tres de los RAPDs que no produjeron señal de hibridación detectable. El análisis de sus secuencias nomostró ninguna característica particular que pudiera explicar la ausencia de señal de hibridación. Una de estas secuencias presenta un ORF largo y otros indicios que sugieren que forma parte de una región codificadora.

Autor: CASERO MARTIN M. CARMEN.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS.

Resumen: En una primera parte del trabajo se describe el estudio del promotor del gen Actina 403(PrAct403) de Artemia cuya expresión está inducida durante el desarrollo embrionario. Se identificó una zona esencial para la actividad promotora situada entre los nucleótidos -176 y 122. El Elemento de Respuesta a Suero(SER), parcialmente incluido en esa región, esta implicando en el control de la actividad de PrAct403 en células en cultivo. El Factor de Respuesta a Suero (SRF) de las células en cultivo se une a este SER y regula el promotor al ser activado por las vías dependientes e independientes de TCF. Ensayos de retardo con extractos de quistes y nauplias indican la existencia en Artemia de un factor capaz de unirse al SER de PrAct403. Al sospechar que este factor podía ser un SRF, se intentó clonar el posible homólogo en Artemia, tal como se describe en la segunda parte del trabajo. Por rastreo de genoteca y por PCR anclada, se aislaron 2 clones cuya secuencia resulta en un cDNA que codificaria una proteina (SRFArt) muy similar a factores SRFs de otras especies. La expresión del mensajero de SRF Art no varía durante el desarrollo. Mientras, la actividad de unión de extractos nucleares al SER, que refleja posiblemente la cantidad y/o actividad de la proteína SRFArt, aparece muy disminuida en quistes comparado con nauplias de Artemia. Esto sugiere una regulación traduccioal y/o post-traducional del factor durante el desarrollo. La expresión del mensajero se detecta únicamente en los tejidos de origen ectodérmico. Por otra parte, el gen Actina 43 se expresa en los mismos tejidos que el mensajero de SRFArt, por lo que SRFArt podría estar implicado en procesos de diferenciación de tejidos ectodérmicos en Artemia y podría regular la expresión de genes como Actina 403. En una tercera parte se presenta un estudio funcional de SRFArt sobreexpresado en celulas de mamifero. SRFArt reprime en la actividad del promotor PrAct403 con un SER intacto, posiblemente debido a una interferencia en las rutas de activación del SRF endógeno. Sin embargo, SRFArt activa el promotor con un SER mutado, mostrando así la capacidad del SRF de Artemia para mediar la activación transcripcional en celulas de mamifero. Por otro lado se muestra que los mecanismos de activación del factor están conservados ya que SRFArt media la respuesta a suero por vías dependientes e independientes de TCF.

Autor: ARAGONES LOPEZ JULIAN.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL DE LA PRINCESA. Sº DE INMUNOLOGIA.

Resumen: La respuesta celular a la falta de oxígeno constituye un elemento indispensable para el desarrollo de diversos procesos fisiopatológicos como es el caso del desarrollo embrionario o la progresión tumoral. Esta respuesta incluye la inducción de un programa de transcripción mediada por el factor de transcripción HIF-1. Algunos de los genes inducidos por este factor de transcripción en respuesta a hipoxia son: el factor de crecimiento endotelial denominado VEGF el cual media la neovascularización y posterior reoxigenación de focos hipóxicos; el factor de crecimiento para progenitores eritroides denominado eritropoietina, el cual media el aumento en eritrocitos en el flujo sanguineo lo cual resulta en un aumento en la capacidad de transporte de oxígeno a los tejidos. En nuestro trabajo nos propusimos determinar los mecanismos intracelulares implicados en la regulación de HIF-1. En este sentido demostramos que la hipoxia induce la acumulación intracelular de diacilglicerol en paralelo con una marcada elevación en el nivel de acido fosfatidico dependiente de la actividad diacilglicerol guinesa. El bloqueo de dicha actividad elimina la actividad transcripcional dependiente de HIF-1. Por otro lado uno de los efectos esperados producidos por la hipoxia es la disminución en la especies reactivas de oxígeno. En este sentido los agentes antioxidantes han sido considerados como agentes que mimetizan la hipoxia ya que dichos agentes se caracterizan por eliminar especies reactivas de oxígeno. En nuestro trabajo demostramos que el tratamiento de la linea celular mieloide U-937 con el agente antioxidante PDTC induce el programa de transcripción dependiente de AP-1 el cual media la inducción de la molecula de adhesión CD11c/CD18.

Autor: MARTINEZ DIAZ FRANCISCO JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Es admitido que las hormonas esteroideas ejercen un rápido efecto en varios tipos celulares. Este efecto difiere del clásico mecanismo de acción de las hormonas esteroideas que implican una modulación directa sobre la transcripción mediante receptores nucleares; existe un nuevo tipo de receptores localizados en la membrana plasmática de la célula que utilizan calcio como segundo mensajero. La progesterona presente en el luido folicular y en el cumulus oophorus ejerce un efecto no genómico sobre el espermatozoide humano, provocando la apertura de canales de calcio en la membrana plasmática, fosforilando proteínas en residuos de tirosina y desencadenando la exocitosis del contenido acrosomial, requisito indispensable para que el espermatozoide pueda fecundar el ovocito. El mecanismo de transducción de señales, el papel de los canales calcio y la fosforilación de proteínas en residuos de tirosina, han sido el objetivo del presente estudio utilizando progesterona y sus hidroxi-derivados como principales estimuladores de las citadas vías de transducción. Se ha observado que la unión de la progesterona a su receptor(s) de membrana activa una proteína tirosina-quinasa que se autofosforila con un peso molecular de 95Kd y siendo el mecanismo de acción independietne de calcio. Se ha usado el inhibidor para tirosinas-quinasas genisteína, siendo efectivo en el modelo celular de estudio. Se ha cuantificado la acción de los diferentes esteroides en la modulación de la reacción acrosómica del espermatozoide. Se ha cuantificado la fosforilación de proteínas y la asimilación de calcio así como la vitalidad y la reacción acrosómica de las muestras tras los tratamientos con progesterona y sus 11-hidroxiderivados. En la tesis realizada se ha examinado cómo la sustitución en el carbono 11 de la progesterona con un grupo hidroxilo y con las conformaciones alfa y beta se estimulaba la fosforilación en tirosina. Ambos hidroxi-derivados fueron más efectivos que la progesterona en la fosforilación en restos de tirosina; aún a pesar de que el 11-alfa-hidroxiderivado fue un débil agonista en la producción del influjo de calcio. En medios de cultivo con calcio, la actividad del agonista 11-alfa-hidroxiderivado fue más debil que progesterona y el 11-beta-hidroxiderivado; usando genisteína, la actividad de este agonista fue completamente abolida, mientras que la actividad de los otros dos agonistas fue inhibida sólo parcialmente usando genisteína. En constraste, en medios de cultivo libres de calcio, el 11-alfa-hidroxiderivado fue el agonista más fuerte de los tres testados, y el efecto de los tres esteroides fue completamente abolido por genisteína. Estos datos demuestran que diferentes motivos estructurales de las moléculas esteroídicas son responsables de la estimulación de la fosforilación en tirosina y de la producción de flujo de calcio, respectivamente. La síntesis de agonistas selectivos permitirá el desarrollo de nuevos agentes farmacológicos para el tratamiento de patologías dependientes de esteroides.#

Autor: PEÑA DIAZ JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A reductasa constituye uno de los puntos claves de regulación en la ruta de síntesis del mevalonato, precursor de isoprenoides esteroídicos y no esteroles. Se ha demostrado que estos compuestos son esenciales para el crecimiento y desarrollo del parásito protozoo Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas. Para llegar a un mayor conocimiento de la regulación e importancia biológica de esta enzima, el trabajo realizado en esta tesis, ha consistido en: a) el análisis y caracterización del gen en Trypanosoma cruzi, demostrándose que el gen tiene una secuencia de 1305 pb, es de copia única, se localiza en un cromosoma de unas 2.1Mb y se transcribe dando lugar a un mRNA de 2.2kb. La proteína para la que codifica este gen tiene una secuencia deducida de 435 aminoácidos, estando altamente conservada con respecto al dominio citosólico de otras HMGRs eucariotas. b) establecimiento de actividad HMGR en T. cruzi, comprobándose que está presente en estos parásitos y que se asocia a una fracción soluble obtenida por centrifugación diferencial. c) el desarrollo de un sistema de expresión heterólogo de la enzima de T. cruzi en células de E.coli y purificación de la proteina recombinante. d) estudios de reemplazamiento génico, que dieron como resultado la aparición de mutantes con nuevos elementos extracromosómicos que incorporan copias del gen sin lograrse mutantes que caracieran del gen salvaje. e) el desarrollo de un sistema de expresión homólogo, para poder llevar a cabo estudios de localización intracelular de la enzima y de sensibilidad del parásito a inhibidores competitivos de la HMGR, estatinas. Los resultados mostraron la sobreexpresión de la enzima del orden de 4 veces, los parásitos mutantes presentan resistencia aumentada a la lovastatina y simvastatina. f) estudios de localización intracelular de la enzima HMGR de T. cruzi mediante permeabilización con digitonina, e inmunolocalización por inmuno fluorescencia indirecta y microscopia electrónica, poniendo estos de manifiesto que la enzima aparece asociada de forma mayoritaria a matriz mitocondrial. La importancia de la compartimentalización observada en estos estudios podría explotarse, dadas sus diferencias con el resto de los eucariotas, para el diseño de fármacos específicos que inhibieran la síntesis de isoprenoides mitocondrial lo que podría suponer una nueva estrategia en el desarrollo de un tratamiento de la enfermedad de Chagas y otras causadas por tripanosomátidos.#

Autor: RODRIGUEZ DE LAS PARRAS ESPERANZA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La triquinelosis es una parasitosis producida por un nematodo filiforme perteneciente al género Trichinella, que afecta tanto al hombre como a multitud de animales carnívoros. En estado adulto vive en el intestino delgado de sus hospedadores y en estado larvario se enquista en la musculatura de éstos. El hombre adquiere la enfermedad al consumir carne cruda o poco cocinada de los animales parasitados. Esta nematodosis constituye un serio problema de salud pública en nuestro país, prueba de ello es la continua aparición de brotes, así como las reiteradas denuncias de su amplia extensión en la naturaleza. Una de las prioridades en el control de esta parasitosis es el establecimiento de técnicas de diagnóstico específicas y sensibles. Hasta ahora la detección de esta enfermedad se ha realizado mediante procedimientos parasitológicos y serológicos, que en muchos casos no cumplen las condiciones de especificidad y sensibilidad que se precisan. En los últimos años se han llevado a cabo grandes avances en el aislamiento y purificación de antígenos de interés diagnóstico para su posterior utilización en el laboratorio. De todos ellos parece que los antígenos de superficie, excreción-secreción y algunos somáticos son los más firmes candidatos. Una alternativa a la purificación bioquímica de estas moléculas que supone tiempo y grandes cantidades de material parasitario, es la utilización de técnicas de biología molecular para la clonación de dichas moléculas. Por este motivo nos proponemos en esta tesis abordar el diagnóstico serológico de la triquinelosis mediante el aislamiento, purificación y posterior caracterización de antígenos recombinantes a partir de una genoteca de cDNA de larvas L1 de Trichinella spiralis, construída en el vector de expresión -ZAP y cribada con sueros de conejos hiperinmunes obtenidos por inmunizaciones repetidas con los componentes purificados de superficie de larvas musculares de T.spiralis. Por otro lado, dada la existencia en España de dos especies del género Trichinella: T.spiralis y T.britovi, ambas responsables de la triquinelosis en nuestro país y la necesidad de disponer de un procedimiento de diagnóstico rápido y seguro que nos permita diferenciar ambas poblaciones entre sí, y del resto de las especies descritas: T. nativa, T. nelsoni y T. pseudospiralis, nuestro segundo objetivo es la caracterización de las diferentes especies del género Trichinella mediante la técnica Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Técnica basada en la amplificación del DNA, que a partir de cebadores de secuencia arbitraria y pequeñas cantidades de DNA permite, bajo determinadas condiciones de trabajo, detectar variación genética entre poblaciones próximas y de clasificación incierta.#

Autor: SANZ IBAYONDO CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La apoptosis o muerte celular programada es un proceso evolutivamente conservado y genéticamente regulado, que lleva a la eliminación autocontrolada de la célula, sin inducir respuesta inflamatoria. Se caracteriza por una condensación de la cromatina nuclear, y del citoplasma, una compactación de los orgánulos celulares con la consiguiente reducción del tamaño de la célula y la formación de prolongaciones citoplásmicas que terminarán estrangulándose y formarán los cuerpos apoptóticos que serán fagocitados por macrófagos. Puede iniciarse por una gran variedad de señales extracelulares como la deprivación de factor de crecimiento, una alteración producida en el ADN o distintos tratamientos como alucocorticoi des o quimioterapia. Estas señales de muerte llevan a la activación de proteasas, conocidas como caspasas, responsables de los cambios morfológicos característicos de la apoptosis, que provocarán finalmente la muerte de la célula. El proceso está regulado por genes de la familia de Bc1-2. En el sistema hematopoyético, la muerte celular por apoptosis mantiene la homeostasis tisular, eliminando células que se han desarrollado de manera defectuosa o aquéllas que han cumplido su programa de diferenciación. Los genes implicados en apoptosis más relevantes en el sistema hematopoyético son Bcl-2 y Bcl-xL como lo han demostrado los estudios de los ratones "knockout" de estos genes. El ratón deficiente en Bcl-2 muere a las pocas semanas de vida mostrando inestabilidad en el comportamiento linfoide y el ratón deficiente en Bcl-xL muere intrauterinamente y se observa apoptosis masiva en el sistema hematopoyético en desarrollo.#

Autor: VALLVÉ TORRENTE JOAN CARLES.
Año: 1999.
Universidad: ROVIRA I VIRGILI.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA.

Resumen: En este estudio se han analizado los efectos de los ácidos grasos, de diferentes productos de oxidación de estos ácidos grasos y de la Darglitazona (DGZ) sobre la expresión del receptor CD36 en macrófagos THP-1 y en macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM). Paralelamente, también se han determinado los efectos citotóxicos. Los resultados de este estudio indican que los ácidos grasos que se pueden encontrar en la dieta son capaces de regular in vitro la expresión del receptor CD 36 tanto en macrófagos THP-1 como en HMDM, por mecanismos que implican un aumento de los niveles de RNAm de este gen. De esta manera los ácidos grasos pueden influir en diferentes procesos que participan en la arteriosclerosis. De los resultados de este trabajo también se deduce que los ácidos grasos insaturados (AGI) (oleico, linoleico, AA, EPA yDHA) a concentraciones fisiológicas producen un aumento más grande en la expresión del CD 36 que los ácidos grasos saturados (AGS) (láurico, mirístico, palmítico, y esteárico). Entre los AGI, los efectos sobre la expresión del CD36 aumentan con el grado de insaturación.Así los ácidos grasos polinsaturados AGPI de la familia 3 (EPA y DHA) son los que má aumentan la expresión del CD36. En relación a los productos derivados de la oxidación de los AGI, los aldhidos saturados (hexanal y malondialdhido) también aumentan significativamente los niveles del RNAm del receptor CD36, mientras que los insaturados (2,4-decadienal y 4-hidroxinonenal) la disminuyen. LA DGZ también aumenta la expresión del CD36 y produce efectos aditivos cuando se incuba en combinación de diferentes ácidos grasos. En cuanto a la citotoxicidad, no hay diferencias entre los diferentes ácidos grasos, mientras que para los aldhidos, los insaturados presentan una citotoxicidad mucho más elevada que la de los aldhidos saturados.

Autor: VIDAL TORRES M. PILAR.
Año: 1999.
Universidad: ROVIRA I VIRGILI .
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA Y C. DE LAS SALUD.

Resumen: El género Chrysosporium Corda (hifomicete) comprende aproximadamente 60 especies, mayoritariamente cosmopolitas, geófilas, queratinofílicas, mesófilas y saprófitas. Algunas especies son patógenas oportunistas produciendo infecciones sistémicas y localizadas en el hombre y los animales. La taxonomía del género Chrysosporium está basada fundamentalmente en criterios morfológicos y fisiológicos (Carmichael, 1962; Dominik, 1967; Oorshot, 1980 Chabasse, 1988 sigler et al.,1997). Los objetivos establecidos en la presente tesis son los siguientes, investigar y determinar las posibles relaciones filogenéticas existentes entre Chrysosporium spp. Y entre éstas y otros géneros morfológicamente relacionados, determinar las conexiones existentes entre Chrysosporium spp. Y sus posibles telemorfos y evaluar los criterios más útiles para caracterizar taxonómicamente al género Chrysosporium. La aportación de está tesis al conocimiento del género Chrysosporium basada en los objetivos anteriormente formulados es la siguiente. La incidencia del género Chrysosporium en los sendimentos fluviales del litoral catalán es muy elevada (95,8%), siendo las especies que se describen como patónenas oportunistas las que se presentan con mayor incidencia. Se describen cinco nuevas especies, se propone la sinonimización de cuatro y se establece la conexión anamorfo-teleomorfo en dos. Además, se propone la transferencia de tres especies de Chrysosporium a otros géneros y también la exclusión de una especie del género Uncinocarpues. Todas estas propuestas están basadas en estudios morfológicos, fisiológicos y moleculares. La filogenia obtenida del análisis de la región ITS1-5 8S-ITS2 revela que el género Chrysosporium es claramente polifilético. Los caracteres morfológicos y fisiológicos que mejor correlacionan con la filogenia inferida son: la capacidad enzimática, el tipo del peridio, la morfología de los apéndices peridiales y la ornamentación y forma de las ascosporas. Los caracteres morfológicos que definen a la fae asexual han demostrado ser poco útiles en taxonomía.

Autor: LIGOS FERNÁNDEZ JOSÉ MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: En este trabajo se describre el clonaje y caracterización de una nueva proteína serina/treonina kinasa de ratónn (Ligos et al., 1998), denominada mPKL12 (proteín kinase expressed in day 12 fetal liver; número de acceso en la base de datos de secuncias de nucleótidos EMBL AJ005790), así como su homólogo humano (94% identidad, AJ005791). PKL12 representa el primer miembro de un nueva subfamilia de Ser/thr kinasas cracterizados en vertebrados. El análisis de expresión del gen mPKL12 en distintos tejidos de ratón y la expresión del gen y de la proteína mPKL12 en líneas celulares murinas, demustran que su expresión es prácticamente ubiuca.Se han generado antisueros de conejo capaces de detectar la proetína mPKL12 por técnicas de Western blot, inmunofluorescencia indirecta e inmunoprecipitación. Haciendo uso de dichos antisueros se ha determiando la localización subcelular de la proteína mPKL12 endógena y sobreexpresada de forma exógena en fibroblastos de ratón. En este trabajo se presentan datos sobre la capacidad transformante de la proteína mPKL12 cuando se sobreexpresa en fibroblastos de ratón NIH3T, así como las alteraciones producidas sobre contactos focales y fibras de estrés de actina en estas células por las sobreexpresión de la kinasa. El posible papel de la proteína mPKL12 en las vías de control del citoesqueleto celular y la posible relación entre sucapacidad transformante y el control del citoesqueleto son discutidas. Análisis de dos híbridos nos han permitido identificar dos proteínas que iteraccionan con mPKL12. Estas proteínas son la proteína mDRG1 (Develpmentally Regulate GTP-binding protein 1), una proteína caracterizada con anterioridad (Sakuza et al., 1992a) y la proteína mSIP16 (STK16 Interacting Protein), una proteían no descrita anteriormente y sin similitud signficativa con ninguna proteína incluida en las bases de datos. En el trabajo se demuestran las interaccion in vitro e in vivo de la proteína mPKL12 con la proteína mDRG1 y la interacción in vitro de mPKL12 con mSIP16. A su vez, se muestran datos sobre el posible papel biológico de estas interacciones.

Autor: BOU TORRENT JORDI.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA, MOLECULAR DE BARCELONA CID-CSIC.

Resumen: SE HAN AISLADO DOS CDNAS DE SOLANUM RUBEROSUM SSP ANDIGENA QUE CODIFICAN PARA GIBERECINA (GA) 3B-HIDROXILASA. SE HA DEMOSTRADO LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA ASOCIADA AL CLON DE CDNA STGA30X1 EL ANALISIS SOUTHERN MUESTRA QUE LA GA 3B-HIDRO-XILASA ESTARIA REPRESENTADA EN PATATA I TOMATE POR UNA FAMILIA GENICA DE 2 O 3 GENES. EXISTE DIFERENTE ESPECIFICIDAD DETENIDO DE LOS DOS CLONES AISLADOS. STGA 30X1 SE EXPRESA EN ESTOLONES NO INCLUIDOS PARA LA TUBERIZACION PERO NO EN ESTOLONES INDUCIDOS, INDICANDO QUE PODRIA TENER UN PAPEL REGULADOR DE LA TUBERIZACION SE HAN OBTENIDO TRANSGENICAS DE SOBREEXPRESION (1) CONSTITUITIVA, (2) ESPECIFICA DE HOJA Y TEJIDO VERDE, Y (3) ESPECIFICA DE TUBERCULO, MIENTRAS (1) Y (2) PRESENTAN UN MAYOR ALARGAMIENTO DEL TALLO, LAS (3) SON IGUAL DE ALTA QUE LAS PLANTAS CONTROL. EN CUANTO A LA TUBERIZACION LS (1) Y (2) TUBERIZAN ANTES QUE LAS CONTROL, MIENTRAS QUE LAS (3) TUBERIZAN MAS TARDE. ESTO INDICA UN EFECTO DE TRANSPORTE DIFERENTE ENTRE GAS.

Autor: FALCON PÉREZ JUAN MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La proteína vacuolar Ycf1p (Yeast Cadmium Factor) está implicada en la resistencia a Cd2+ y a otras sustancias tóxicas que son conjutadas con glutation en Saccharomyces cerevisiae. Pertenece a la familia de transportadores ABC (ATP Binding Cassette) que incluye proteínas humanas como CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Transmembrane Regulator) y MRP1 (Multidrug Resistance-associated Protein). El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el estudio de las relaciones estructurales y funcionales de la proteína Ycf1p. En una primera aproximación se crearon mediante mutagénesis dirigida veintidós mutaciones únicas en residuos conservados de los dominios de unión a nucleótidos (NBD1 y NBD2), transmembrana (TMD2) y regulador (R) de la proteína. La caracterización de los mutantes ha llevado a la identificación de residuos esenciales para la biogénesis (Ile711, Leu712, Phe713, Glu927 y Gly1413), para la función (Gly663, Gly756, Asp777, Gly1306 y Gly1311) y para la regulación (Ile840, Tyr855, Ala910 y Arg1143) de Ycf1p. Una segunda aproximación ha consistido en el análisis de supresión intragénica de cinco mutaciones localizadas en los dominios NBD1 (G663V, G756D y D777N) o NBD2 (G1306E y G1311R) e implicadas en la unión y/o hidrólisis de ATP. Todos los revertientes de los mutantes G663V, G756D, G1306E y G1311R resultaron ser reversiones de la mutación primaria a la secuencia silvestre. En cambio se han aislado trece mutaciones supresoras de la mutación D777N localizadas en los dominios: TMD1 (V5431I y F565L), TMD2 (A1003V, A1021T, A1021V, N1027d, Q1107R, G1207D, S1212L y W1225C), NBD1 (S674L) y NBD2 (R1415G). Esta localización demuestra la interacción física y/o funcional de NBD1 con los otros tres dominios.La caracterización de los mutantes supresores indica que el mecanismo de supresión implica una alteración en la especificidad de sustrato.

Autor: LOPEZ FANARRAGA MONICA .
Año: 1998.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La parte experimental de esta tesis estudiará la regulación de la expresión y modificaciones postraduccionales del isotipo beta6 de la beta-tubulina. La beta6 tubulina es una proteína citosquelética exclusiva de neuronas que contribuye fundamentalmente en los cambios dinámicos que regulan la plasticidad neuronal desde la fase de neuroblasto a neurona madura. Con la ayuda de un anticuerpo desarrollado frente a un péptido sintético, el presente estudio demostrará que la expresión de la beta6 tubulina en su forma no fosforilada y soluble es el primer cambio detectable que ocurre a lo largo de ladiferenciación del linaje neuronal. La incorporación de la beta6 tubilina en los microtúbulos del neuroblasto y su posterior y fosforilación resultará en importantes modificaciones citosqueléticas que conducirán al citoesqueleto axonal a la estabilidad y, como consecuencia, a la pérdida de plasticidad neuronal.

Autor: SILVA RIVERA M. TERESA.
Año: 1998.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: La Eritropoyetina (Epo) es un factor de crecimiento específico de la serie eritroide. Los eritroblastos inmaduros dependen de la acción de Epo para su proliferación y supervivencia y existen datos contradictorios sobre su papel en la diferenciación. Epo se une a su receptor específico (R-Epo), y el receptor activado transduce señales fundamentalmente a través de la activación de la quinasa Jax2 y el factor transcripcional Stat5. En este trabajo mostramos que epo mantiene la viabilidad de los eritroblastos regulando la expresión de bcl-xL y bcl-2, dos genes de supervivencia muy representados en el sistema hematopoyético. Además, la sobreexpresión de Bcl-xL protege a las células de la apoptosis inducida por la ausencia de Epo, y permite que se diferencien en ausencia del factor. Stat5 es el factor que se une al promotor de bcl-x e induce su transcripción en respuesta aEpo. También mostramos que en la Policitemia Vera, patología donde los eritroblastos son independientes de Epo, la expresión de Bcl-xL está desregulada y esta expresión constitutiva de Bcl-XL contribuye de manera significativa al mantenimiento de la viabilidad de los progenitores eritroides en ausencia de Epo.