BIOLOGIA MOLECULAR, 7

Autor: TRIGUEROS FERNANDEZ CESAR.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se ha estudiado la potencialidad hematopoyética de los precursores más inmaduros presentes en el timo humano. Los resultados obtenidos demuestran de una forma integradora la secuencia de eventos madurativos que subyacen al desarrollo temprano de los linfocitos T. El empleo de una serie de estrategias experimentales nos ha permitido obtener información sobre la ogipotencialidad de los precursores más tempranos que colonizan el timo postnatal humano, y en concreto sobre los mecanismos que detrminan la diversificación de linajes hematopoyéticos (T/NK/DC). El estudio de los eventos que toman lugar en la diferenciación de las células de linaje T, nos han permitido identificar una serie de estadios de maduración, anteriores a la expresión de un complejo TCR (alpha/beta) en la membrana de los timocitos. El análisis detallado de todos los estadios identificados ha revelado un importante punto de control en la generación de células T maduras. Por otro lado una serie de abordajes moleculares y bioquímicos nos han permitido demostrar la implicación del complejo pre-TCR en dicho punto de control, además de haberse identificado a nivel bioquímico dicho complejo por primera vez en humanos.

Autor: GOMEZ GARCIA LOURDES.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El pHi alcalino se ha relacionado con la protección contra la aopotosis inducida por diferentes agentes genotóxicos como la radiación ionizante, la luz aultravioleta, agentes quimioterápicos, etc. En nuestro trabajo hemos comprobado que las células RN1a que se caracterizan por tener un pHi alcalino, son más resistentes a la luz UVC que las células control NIH3T3. En estas células la radiación induce mayores niveles de AP-1. En las células RN1a la luz UVC es capaz de inducir un incremento mayor en la expresión del mRNA de c-jun que en las NIH3T3, que se correlaciona con una mayor activación del promotor de c-jun. Demostramos que esta mayor activación se debe al incremento en la actividad de la quinasa que fosforila a c-jun (JNK). Esto podría justificar el mayor nivel de factores AP-1 unidos a sus elementos jun1 y jun2 del promotor de c-jun. Comprobamos que en la mayor activación de JNK por la luz UVC, parece estar implicada la actividad de la calpaína, una cisteína porteasa dependiente de calcio. En relación con el estudio de la regulación de la expresión de MKP-1 inducida por la luz UVC, comprobamos que depende de calcio y de la actividad de la p38 y de las PKCs dependientes de DAG, siendo PKCe una de las implicadas en el proceso.

Autor: GIL LOPEZ M. PILAR.
Año: 1998.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUIMICA .

Resumen: El interferón gamma es una citocina que promueve la defensa contra patógenos y células tumorales y que participa en un gran numero de procesos inmunopatológicos. La principal vía de señalización utilizada por el receptor del interferón gamma es la via JAK-STAT. Las proteínas Jakl, Jak2 y Statl son requeridas para la inducción de los efectos biológicos del interferón gamma. El principal objetivo del trabajo desarrollado en esta tesis es la comprobación de si la via JAK-STAT es la única implicada en la señalización del interferón gamma, o existen otros mecanismos mediados por esta citocina. Utilizando macrófagos derivados de médula ósea de ratones deficientes en Statl, y mediante técnicas substrativas (Representational Difference Analysis) y paneles de oligonucleotidos (GeneChip), he podido demostrar la existencia de genes regulados por el interferón gamma mediante un mecanismo independiente de Statl. Para posteriores estudios de la cinética de regulación a nivel de mRNA y de proteina he caracterizado la regulación mediante interferon gamma de 5 genes: la quimoquinas MIP-1alfa y MIP-1beta el receptor CXCR4, el enzima Arginasa y la citocina IL-1beta. La regulación de estos genes, aunque independiente de Statl, requiere la presencia del receptor (IFNgR) y JAK1.

Autor: HIDALGO ALONSO ANDRES.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En esta tesis se ha estudiado la capacidad de la quimioquina SDF-La en la actividad de la integrina VLA-4 expresada en células progenitores hematopoyéticas, con el objeto de encontrar un mecanismo de interrelación entre ambas moléculas, dado el papel central de ambas en la hematopoyesis. SDF-la modula de manera rápida y transitoria la adhesión a ligandos de VLA-4 (FN-H89 y VCAM-1), tanto en células progenitoras (líneas y células CD34+ de médula ósea) como células de mieloma múltiple que expresaban el receptor de SDF-1, CXCR4, en superficie. El incremento de adhesión inducido por la quimioquina depende de la señalización a través de proteínas G heterotriméricas asociadas al receptor y, en la adhesión a FN-H89, de un citoesqueleto de actina intacto. Adicionalmente, SDF-la modula también la actividad de las integrinas a4b7 y VLA-5 en células hematopoyéticas. Finalmente, SDF-la produce la activación de las MAP quinasas y de Pyk2 en células progenitoras hematopoyéticas. En la segunda parte de la tesis se han caracterizado dos anticuerpos monoclonales (Acm) generados en el laboratorio que eran específicos de CD44 de raton. Estos anticuerpos, junto con otro Acm contra CD44 incrementan la adhesión de progenitores hematopoyéticos a cbelulas estromales de médula ósea cuando las células progenitoras se preincuban con los Acm antes de la adhesión. Este incremento de adhesión implica, al menos en parte, la activación de la integrina VLA-4 en las células progenitoras, ya que la preincubación con el Acm anti-CD44 MA-8, pero no con el Acm IM7.8.1, induce un incremento en la adehsión al ligando CS-1/FN de VLA-4 en estas células. Por último, el Acm IM7, pero no MA-8 contra CD44, inhibe considerablemente la hematopoyesis en cultivos a largo término tipo Dexter e induce la liberación de precursores CFU-GM al medio de cultivo. El Acm anti-integrinas a4 retrasa la mielopoyesis en estos cultivos, induce la liberación de progenitores al medio y retrasa el pico de liberación de éstos a la 4a semana..

Autor: NAVARRO ROS EUSEBIO.
Año: 1998.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: Mucor circinelloides es un hongo filamentoso que posee una ruta de síntesis de carotenos que se activa por la luz y cuyo producto final es beta-caroteno. En este trabajo se han aislado y caracterizado mutantes de la ruta de carotenogénesis, entre los que se encuentran mutantes afectados en cada uno de los genes estructurales cuyos productos intervienen en la transformación de famesil pirofosfato a beta-caroteno, y varios mutantes afectados posiblemente en genes reguladores, que tienen alterada la producción final de beta-caroteno en condiciones de oscuridad y/o luz. Se ha aislado un fragmento de DNA de Mucor cuya introducción en algunas estirpes del hongo provoca una acumulación de carotenos en la oscuridad, originando un fenotipo "consultivo". La transformación de Mucor con plásmidos que portan este fragmento produce estirpes con diferente intensidad de color, demostrándose que hay una relación entre el aumento de la intensidad del color de las estirpes transformadas y el aumento en el número de copias del plásmido que llevan. El fragmento de DNA que produce el fenotipo "consultivo" contiene un tramo abierto de lectura, truncado en su extremo 3', que cifra un producto con dominios estructurales presentes en proteínas reguladoras. La presencia de esos dominios y el efecto de la secuencia sobre la carotenogénesis de Mucor sugieren un papel regulador para el gen correspondiente, que se ha denominado crgA (gen regulador de la carotenogénesis). El gen crgA completo cifra una proteína de 535 aminoácidos. Entre los dominios estructurales de la proteína se encuentran un dominio RING-finger, tres regiones ricas en glutaminas, una región acídica, una posible señal de localización nuclear y un dominio de isoprenilación en el extremo carboxilo. Presenta una región promotora que posee características de promotores de hongos filamentosos y el inicio de la transcripción se produce 58 nucleótidos aguas arriba del posible comienzo de la traducción. La expresión del gen crgA se produce a un nivel basal en la oscuridad, y se ve estimulada por la luz. El efecto que produce sobre la carotenogénesis la introducción de diversas versiones truncadas de la secuencia crgA y de la versión completa, permite proponer un modelo para explicar la función nornal del gen crgA en la biosíntesis de carotenos. Según dicho modelo, la luz activaría la expresión del gen y de la propia proteína CrgA, que estaría presente, pero no activa, en la oscuridad. La forma activa de CrgA tendría un efecto activador sobre la carotenogénesis. La puesta a punto de un procedimineto eficaz para favorecer la integración de DNA exógeno en el genomio de Mucor, ha permitido la obtención de tranformantes en los que se ha sustituido la versión normal del gen crgA por una versión alterada, carente del dominio RING-finger. Estos transformantes presentan un fenotipo "constitutivo". La posibilidad de realizar sustitución génica en Mucor abre la vía a la obtención de mutantes crgA nulos que permitan estudiar con precisión la función normal del gen crgA..

Autor: BARRALLO GIMENO ALEJANDRO.
Año: 1998.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: Los receptores opioides son las dianas endógenas de las sustancias opiáceas y de los péptidos opioides y han sido ampliamente estudiados en mamíferos, dada su evidente utilidad terapéutica en el control del dolor. Sin embargo, su presencia no ha sido totalmente establecida en vertebrados inferiores, aunque existen datos que apuntan a su existencia incluso en invertebrados. Por ello, como objetivo de este trabajo se propuso caracterizar por técnicas farmacológicas y moleculares los posibles receptores opioides en un teleósteo, el pez cebra (Danio rerio). Como resultado de este trabajo se han identificado dos genes con alta homología con los receptores opioides de mamíferos ZFOR1 presenta un 66% de identidad con el receptor opioide delta. La estructura genómica de este gen es muy similar a la de los receptores opioides delta de roedor y humano, con uniones exón-intrón que se han conservado filogenéticamente. La transfección de su cDNA en una línea celular permitió la caracterización de sus propiedades farmacológicas, confirmando su naturaleza como receptor ipioide, aunque su clasificación dentro de los tipos tradicionalmente considerados no ha sido totalmente establecida. Se identificó un segundo gen, ZFOR2, que presenta un 74% de homología con el receptor opioide mu de mamíferos y cuya estructura genómica es muy similar a la de éstos, aunque a diferencia de los receptores opioide mu de mamíferos ZFOR2 carace del cuarto exón, que se ha implicado en procesos regulatorios. La expresión de estos dos genes se ha estudiado mediante hibridación in situ en el sistema nervioso del pez cebra, observando patrones de expresión ampliamente solapantes, aunque con zonas de expresión diferencial. En general, la expresión de estos genes se puede correlacionar con la observada para los distintos receptores opioides en el cerebro de mamíferos. Por último, se analizaron los sitios de unión para sustancias opiáceas en membranas de tejido encefálico de pez cebra, observándose al menos dos tipos de sitios de unión distintos, confirmando la hetereogeneidad de receptores opioides obtenida por técnicas moleculares..

Autor: PONS PONS JOAN.
Año: 1998.
Universidad: ISLAS BALEARES .
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS .

Resumen: Las 35 especies/subespecies analizadas del génro Pimelia de Péninsula Ibérica, Baleares, Marruecos e Islas Canarias muestran 7 familias distintas de DNA satélite (DNAsat). Cada especie presenta una sola familia de DNAsat y la sunidades repetitivas de las familitas descritas presentan dos regiones realtivamente conservadas, una de 185 pb yotra de 125 pb, con una similaridad del 60-86%, lo que sugiere su origen común. Según su similaridad se puede dividir en dos grupos: el primero formado por las familias PIM357, PIM533 y PIM705 y el segundo integrado por PIM502 PIM509, PIM512 y PIM515. Las unidades monoméricas de todas las familias presentan una movilidad electroforética retardad. Esta movilidad anómala se ha explicado por la curvatura del DNA causada por los bloques de A-3 distribuidos en fase en la unidad monomérica. La función del DNAsat estaría relacionada con la condensación de la heterocromatina y el posicionamiento de los nucleosomas. En Pimelia, la selecciónparece favorecer las unidades monoméricas que inducen curvatura y un soleonoide con superhélice levógira, independientemente de la secuencia o la longitud de la unidad monomérica. Las secuencias monoméricas de la familia PIM357 muestran un patrón de sustitución nuclotídico espontáneo y simétrico para ambas cadenas,familiar al descrito para psedogenes de mamiferos. Este patrón de sustitución tiende a incrementar el porcentaje de A+T de las secuencias. Cada especie del género Pimelia evidencia una evolución concertada de sus secuencias monoméricas con una variación nucleotídica intraspecífica baja (2-7%), similar a las descritas en otros tenebriónidos. Sin embargo, las especies canarias (familia PIM357) presentan una variación mayor (15-19%) debido a la coexistencia de variantes de secuencias distintas en una proporción apreciable, las cuales muestran una compartimentalización cromosómica. La familia PIM357 muestra un patrón de evolución gradual de sus secuencias según el modelo de molecular drive propuesto por Dover (1982). Las otras familias podrían explicarse tanto por un patrón de evolución "saltatorio" como por una evolución gradual muy rápido. La familia de DNAsat PIM357 posee una tasa de sustiución nucleotídica moderada (3,8 x 10-8 sustiuciones/posición/año). Esta tasa es similar a la descrita en la familia de DNAsat ATOC180 de Drosophila y a la tasa estimada para las secuencias de COI de las mismas especies. Se observa evidencias de la acción de diferentes mecanismos de intercambio no recíproco relacionados conla homogeneización y fijación del DNAsat: la conversión génica y el entrecruzamiento desigual. El DNAsat de Pimelia es inforamtivo como marcador taxonómico y fologenético. Las filogenias basadas en COI y DNAsat dan unos resultados similares mostrando un origen monofilético de las especies que presentan la misma familia de DNAsat.

Autor: MORENO SALAS M. BELEN.
Año: 1997.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGIA Y GENETICA PROGRAMA DE DOCTORADO: FISIOLOGIA, BIOQUIMICA Y GENETICA MICROBIANAS .

Resumen: En el presente trabajo se ha puesto a punto una técnica de transfección transitoria rápida, sencilla y fiable para el estudio de la apoptosis. Este método, ha permitido el estudio del efecto de distintos miembros de la familia de Bc1-2 en la apoptosis causada por: la Dexametasona, el etopósido, la activación inadecuada del receptor antigénico o la activación de Fas. Los experimentos realizados han permitido concluir que en las líneas celulares de los linfocitos T de ratón, existen al menos dos rutas distintas de señalización de la apoptosis, ya que proteínas de la familia de Bc1-2 son capaces de inhibir la apoptosis inducida por los glucocorticoides y por otros agentes citotóxicos, pero no la inducida por la activación del receptor de las células T o la mediada por Fas. Por otro lado, los inhibidores específicos de la apoptosis mediada por Fas, no tienen apenas efecto sobre la apoptosis inducida por los compuestos citotóxicos. Estos resultados, obtenidos con las líneas celulares de las células T de ratón, se repitieron al utilizar las células T normales, tanto de ratón como humanas, lo que refuerza la hipótesis de la existencia de distintas rutas de apoptosis, en los linfocitos T.

Autor: VELASCO RAMÍREZ M. CARMEN .
Año: 1997.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El enquistamiento del ptotozoo ciliado hipotrico Histriculus cavicola conduce a la formación de un quiste de resistencia. Este proceso está regulado mediante incrementos en la dosis génica de las moléculas-gen codificantes de péptidos estructurales de la pared quística y también a nivel transcripcional. Los incrementos en las cantidades de ADN de las moléculas implicadas y del ADNr se deben a sobrereplicación selectiva de las mismas. Esta replicación tiene lugar fuera de las fases S del ciclo celular y está directamente ligada al proceso de desarrollo. Por otro lado, los genes de tubulina y actina no sufren variaciones en sus dosis génicas aunque sí incrementos en los niveles de sus respectivos transcritos. Por último, los genes de chaperoninas pertenecientes al grupo de las CCTs y el gen de poliubiquitina aumentan los niveles de sus transcritos correspondientes indicando este su activa participación en el proceso de enquistamiento.

Autor: NUSSPAUMER DA COSTA GRETEL.
Año: 1995.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Las proteínas P1/P2 forman parte del tallo ribosómico en la subunidad mayor del ribosoma. Las proteínas P1 se regulan diferencialmente en condiciones en las que la falta de mas proteínas P2 impide su unión al ribosoma. En estas condiciones las proteínas son muy inestables y se degradan rapidamente. Se han identificado las señales responsables de la degradación de la proteína P1 beta. Estas dependen de secuencias localizadas en los 5 primeros aminoácidos de la proteína y de la fosforilación del extremo carboxilo. La interacción de una proteína P1 con una del grupo P2 estabiliza la primera indicando que estas proteínas asocian también en el citoplasma cuando no se unen al ribosoma. La degradación no se produce por ninguna de las vías clásicas de degradación descritas en levadura, por lo tanto existe una proteasa específica para la degradación de las proteínas P1. La vía de señalización TOR controla la expresión de las proteínas P1/P2 en fase estacionaria, estos datos indican que las proteínas P1/P2 además de su función estructural también actúan como factores de traducción.

Autor: ORTEGA SEDANO M. ASUNCIÓN.
Año: 1994.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: En el presente trabajo se ha estudiado, en primer lugar, la expresión de tres diferentes isoformas de actina durante el desarrollo embrionario de Artemia. Los mRNAs de dos de estas isoformas se encuentran presentes en el quiste y su expresión se induce ligeramente en estadios tempranos del desarrollo. El incremento principal se observa, sin embargo, entre las 6 y las 16 horas de desarrollo aunque las cinéticas de acumulación de los dos mRNAs son diferentes. Estos dos mRNA corresponden a las isoformas denominadas Act 211 y Act403, caracterizadas como isoformas citoplásmicas mediante ensayos de hibridación in toto. El mRNA de la tercera isoforma no se expresa en el quiste induciéndose su expresión después de las 10 horas de desarrollo. Este mRNA corresponde a la isoforma Act 302, que presenta una expresión tisular específica de músculo, según se ha determinado también mediante ensayos de hibridación in toto. Posteriormente se han aislado clones genómicos que contienen los genes completos de estas tres isoformas de actina. El gen de la Act 211 tiene un tamaño de 14,7 Kb y está constituido por 4 exones. El gen de la Act 302 es menor, 10.5 Kp pero, sin embargo, está formado por 6 exones. El gen de la Act 403 tiene un tamaño intermedio, 13.1 Kb y contiene 7 exones. Todos los genes presentan un exón en posición 5' no codificante de muy pequeño tamaño (55 pb en la Act 211,35 pb en la Act 302 y 31 pb en la Act 403). Existen 5 posiciones diferentes de inserción de intrones a lo largo de las secuencias codificantes. Una de ellas común a las tres isoformas, la situada entre los aminoácidos 41 y 42; las otras 4, situadas en los aminoácidos 121-122, 168, 246-247 y 301 son comunes en 2 de ellas. Mientras que los intrones situados en los codones 41-42 y 121-122 existen en otros muchos genes de actina, el intrón que interrumpe el codon 168 únicamente se ha descrito en Artemia y el nematodo Ochocerca volvulus, el intrón situado entre los codones 246-247 solo se había encontrado en el alga verde Volvox carterii y el intrón situado en el codon 301 no se ha hallado en ningún otro organismo. El análisis de las regiones que preceden el primer exón de cada gen ha permitido identificar los sitios de inicio de la transcripción y efectuar un análisis estructural de las posibles regiones reguladoras situadas en estos promotores. En un análisis evolutivo, se han comparado las tres isoformas de actina de Artemia con otras descritas tanto en invertegrados como en vertebrados. El árbol filogenético elaborado a partir de estos datos, muestra que la trayectoria evolutiva de los genes de las isoformas musculares y citoplásmicas ha sido totalmente diferentes en los Curstácelos e Insectos dentro del filum de los Artrópodos.