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BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS



64 tesis en 4 páginas: 1 | 2 | 3 | 4
  • REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN ENTEROBACTERIAS: CARACTERIZACIÓN DE YDGT, UNA NUEVA PROTEÍNA DE LA FAMILIA HHA/YMOA, Y INTERACCIONES CON OTRAS PROTEÍNAS ASOCIADAS AL NUCLEOIDE .
    Autor: PAYTUBI CASABONA SÓNIA.
    Año: 2003.
    Universidad: BARCELONA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA. UNIVERSIDAD DE BARCELONA.
    Resumen: En las bacterias entéricas, las proteínas de la familia Hha/YmoA, juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica en respuesta a factores ambientales. La proteína Hha de Escherichia coli fue identificada como regulador de la expresión de la toxina alfa-hemolisina. Ya se ha descrito con anterioridad, que la proteína Hha interacciona con la proteína H-NS y que el complejo núcleo-proteico formado es responsable de la termo-regulación de la expresión del operón hly de E.coli. También ha sido previamente descrito que E.coli y otras enterobacterias contienen una proteína parálogo a H-NS, la proteína StpA. Esta proteína se expresa muy poco en condiciones normales, pero esta inducida en mutantes hns. La sobreexpresión de StpA suprime parcialmente muchos fenotipos causados por la mutación hns. En esta tesis se ha identificado en el genoma de E.coli el gen ydgT, que codifica para una proteína con elevada homología con proteínas de la familia Hha/YmoA. Esta nueva proteína paráloga a Hha (38% de identidad y 68% de similitud), tiene un comportamiento similar a StpA en el contexto de H-Ns: se sobreexpresa en mutantes hha y puede compensar, al menos parcialmente, el fenotipo hemolítico provocado por la mutación hha. También hemos demostrado que la proteína YdgT, es capaz de interaccionar con H-NS y con StpA, formando con estas complejos hetero-diméricos in vivo. En cambio, la proteína YdgT no interacciona con su proteína paráloga Hha. En esta memoria también se ha establecido una red de regulaciones cruzadas entre las proteínas Hha, YdgT, H-NS y StpA. Las mutaciones hha i/o hha ydgT provocan una disminución de los tránscritos hns i stpA. Se ha analizado el efecto en el patrón de expresión proteica de las mutaciones hha, ydgT i hha ydgT. Los resultados obtenidos muestran el fenotipo pleiotrópico del doble mutante. Hemos sido capaces de detectar varias diferencias y hemos identificado algunas de las proteínas que muestran expresión diferencial entre las distintas cepas estudiadas: OmpA, OmpC, Triptofanasa, dTDP-L-ramnosa sintetasa, proteína precursora de la proteína periplasmática de unión a D-ribosa. Estas proteínas, entre otras funciones, juegan un papel importante en la conjugación, osmoregulación, formaicón de biofilms, formación del LPS y quimiotaxis, respectivamente.
  • AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES IMPLICADOS EN LA BIOSÍNTESIS DEL ANTIBIÓTICO BETA-LACTÁMICO TIENAMICINA EN STREPTOMYCES CATTLEYA .
    Autor: NUÑEZ GONZÁLEZ LUZ ELENA .
    Año: 2003.
    Universidad: OVIEDO.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.
    Resumen: La tienamicina es el primer antibiótico b-lactámico de la clase de las carbapenemas que ha sido aislado. Es uno de los antibióticos más potentes que se conocen y presenta un amplio espectro de actividad. Tiene un importante uso en clínia para el tratamiento de las infecciones bacterianas severas. La tienamicina es activa tanto frente a bacterias Gram-positivas como frente a Gram-negativas, aerobias oanaerobias (incluyendo aislados clínicos resistentes a otros antibióticos) y es resistente a la mayoría de las b-lactámicos convencionales como la cefamina C. La tienamicina es altamente inestable y en clínica se utiliza un derivado de ésta llamado imipenema. Se ha descrito un nuevo mecanismo para la biosíntesis del anillo b lactámico de las clavamas y carbapenemas (conocidos como b-lactámicos no convencionales). Utilizamos la información acerca del nuevo enzima biosintético para diseñar oligonucleótidos con objeto de amplificar el gen que lo codifica a partir del ADN cromosómico de S. Cattleya. El producto de PCR fue utilizado como sonda para hibridar una genoteca del organismo productor e identificamos tres cósmidos solapantes. La implicación de esta región en la biosíntesis de tienamicina fue demostrado mediante inactivación insercional puesto que el mutante obtenido no era capaz de producir tienamicina. Se ha clonado y secuenciado el agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de tienamicina en S. Cattleya y el análisis de la secuencia obtenida reveló la presenta de 28 ORFs completa y dos incompleta, la mayoría de las cuales están probablemente implicadas en la biosíntesis de tienamicina. Asignamos funciones a los genes identificados mediante comparación con las secuencias de proteínas disponibles en las base de datos. Algunos de los genes codificarían enzimas estructurales, y también habría activadores transcripcionales, proteínas implicadas en la resistencia y/o exportación, quorum sensing, etc. Se inactivaron varios genes de la agrupación génica y se confirmó su participación en la biosíntesis de tienamicina ya que los mutantes obtenidos habían perdido la capacidad para sintetizar este antibiótico. Los genes presentes en esta agrupación podrían ser utilizados para incrementar la producción de tienamicina en el organismo productor, así como para obtener nuevos derivados de este antibiótico con propiedades mejoradas mediante manipulación genética.
  • ALGORITHMS AND DATA MANAGEMENT FOR KNOWLEDGE DISCOVERY IN FUNCTIONAL GENOMICS .
    Autor: AGUILAR VILLALBA DANIEL.
    Año: 2003.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: Esta tesis doctoral está organizada en cinco capítulos acerca de tres aspectos distintos de la aplicación de técnicas computacionales en la genómica y la proteómica. El capítulo I ofrece una breve introducción a lo que se conoce como biología computacional, su contribución a la investigación experimental y teórica y sus aplicaciones en los campos de la genómica y la proteómica. Este capítulo pretende centrarse en los temas de investigación a los que ha contribuído esta tesis: el análisis de la secuencia de las proteínas, la comparación de genomas completos y la gestión de datos. El capítulo II es un resumen de los tres objetivos de la tesis, correlacionados con los tres capítulos siguientes. El capítulo III presenta tres trabajos sobre el análisis de secuencias de proteínas al nivel de motivos proteicos. Ya que la genómica está produciendo miles de productos génicos sin caracterizar, las herramientas para la identificación de motivos funcionales conservados en secuencias de proteína son útiles para la predicción de la función proteica. La primera parte del capítulo contiene un ejemplo del uso de métodos computacionales para la caracterización de un gen de Bacillus licheniformis secuenciado por un colega del grupo de investigación. El análisis indicó que el gen descubierto codifica una hipotética proteína de unión al DNA. Posteriores análisis experimentales demostraron que la proteína se unía específicamente al DNA de Bacillus licheniformis. El capítulo también contiene una clasificación de motivos proteicos de unión al DNA relacionados con la regulación de la transcripción y un programa de web que fue desarrollado para la detección de motivos conservados en proteínas eucarióticas y procarióticas relacionadas con la regulación de la expresión génica. Finalmente, ese progrma fue utilizado para analizar genomas completos de un grupo de organismos eucariotas con el objetivo de caracterizar proteínas poco o mal anotadas. El capítulo IV describe una aproximación integrada al análisis d elas relaciones entre especies en los tres dominio de la vida, complementaria con anteriores análisis de genomas completos. Las topologías de unos árboles basados en las vías metabólicas principales fueron analizadas par un grupo de organismos representativos, proprocionándose información sobre las características metabólicas y su correspondencia con la evolución de los genomas de los organismos. Las relaciones establecidas de acuerdo con la distribución de las funciones enzimáticasen el metabolismo mostraron cómo el metabolismo refleja las elecciones evolutivas de diferentes filogenias a través de sus especialziaciones para sobrevivir en nichos ecológicos particulares. Finalmente, el capítulo V trata el problema de las nomenclaturas conflictivas de compuestos bioquímicos, problema que, a pesar de los esfuerzos de los comités de nomenclatura, aún está presente en las bases de datos biológicos. Una herramienta web (SNOW, Standard Nomenclature Wizard) fue desarrollada para encontrar la denominación recomendada para nombres de compuestos bioquímicos no oficiales, incorrectos o incompletos.
  • DEFECTOS EN TRADUCCIÓN Y TRANSCRIPCIÓN POR ARN POLIMERASA III EN MUTANTES GCD16 DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
    Autor: HERNANDEZ HIDALGO M. ESTELA.
    Año: 2003.
    Universidad: SALAMANCA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA .
    Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA BIOQUÍMICA.
    Resumen: Estamos interesados en identificar funciones génicas esenciales para el inicio de la traducción en eucariotas. Nuestra aproximación consiste en caracterizar mutantes espontáneos gcd de saccharomyces cerevisiae que tienen alterada la regulación traduccional de GCN4, clonar los genes correspondientes e investigar su función en iniciación y en reiniciación de la traducción. GCN4 codifica un activador transcripcional de 539 genes que se activan en respuesta a la privación de aminoácidos. Su expresión está regulada en función de la disponibilidad de los mismo, por un mecanismo de reiniciación de la traducción que depende de cuatro fases cortas de lectura abierta (uORFs) en el líder ARNm-GCN4 y de múltiples efectores positivos Gcnp y negativos Gcdp. Las primeras proteínas Gcdp identificadas son subunidades de factores de iniciación (eIFs) y las últimas, Gcd10p y Gcd14p, tienen funciones esenciales para el procesamiento del ARNt¡met. Todas ellas están conservadas en eucariotas superiores. El gen GCD16 codifica Rpc34p, una subunidad específica de la ARN Polimerasa III; los mutantes correspondientes tiene desreprimida constitutivamente la traducción de GCN4, muestran crecimiento lento incondicional y son termosensibles. Sus perfiles de polisomas revelan defectos en iniciación de la traducción, concomitantes con un déficit importante de subunidades ribosomales 60S. La mutación gcd16-1 determina la síntesis de una proteína truncada rpc34A21p que es dominante negativa, causando acumulación de precursores del ARNT¡met y disminuciones del 50% en la molécula madura que sugieren un defecto en su procesamiento y en transcripción por ARN Polimerasa III. Estos y otros datos indican que sólo mutaciones que afectan a la ARN Polimerasa III reduciendo diferencialmente la biogénesis del ARNt¡met desreprimen la traducción de GCN4 y que ésta tiene unos requerimientos especiales en relación a otros ARNTs.
  • GENOMICA FUNCIONAL DEL CRECIMIENTO Y LA DIVISIÓN EN ESCHERICHIA COLI .
    Autor: ALVAREZ MARTINEZ CARLOS JAVIER.
    Año: 2003.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.
    Resumen: Hemos empleado la tecnología Gene Arrays para estudiar las variaciones en los niveles de Tránscritos de la bacteria Escherichia coli en función de la velocidad de crecimiento. Los resultados muestran que la mayoría de los genes (98,75%) presentan un patrón metabólico. Treinta y cinco (0,81%) presentan un patrón caja de cambios y el 0,44% restante un patrón estricto. También hemos estudiado diferentes mutantes que presentan alteraciones en la expresión del gen ftsZ. Los distintos estudios realizados muestran que no existen reguladores esenciales (ni no esenciales) específicos de división, y que varios mecanismos y rutas se corregulan con el proceso de división. Finalmente hemos estudiado el gen bolA y su producto de expresión BolA. Los resultados muestran que bolA podría ser un regulador transcripcional, afectando fundamentalmente a genes cuya función se relaciona con morfología y división. La proteína BolA, por su parte, podría actuar como chaperona de distintas proteínas, entre ellas Dps.
  • REGULACIÓN DE LA TRANSFERENCIA CONJUGATIVA DEL PLÁSMIDO DE VIRULENCIA DE SALMONELLA ENTERICA POR LRP Y METILACIÓN DAM .
    Autor: CAMACHO FERNÁNDEZ EVA M..
    Año: 2003.
    Universidad: SEVILLA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
    Resumen: El plásmido de virulencia de Salmonella enterica pertenece al grupo de plásmidos de la familia de F, o plásmidos F-like. La expresión del operón de transferencia de estos plásmidos está activada por la proteína TraJ, codificada porel gen traJ localizado corriente arriba del operón. La expresión de traJ está a su vez regulada por el sistema de inhibición de la fertilidad. Este sistema está formado por los genes finP y finO. El gen finP solapa con el gen traJ y especifica un ARN antisentido que, ayudado por la proteína FinO, bloquea la traducción del ARN mensajero de traJ, impidiendo la síntesis de la proteína TraJ y, como consecuencia, la expresión del operón de transferencia. Nuestros datos indican que la transcripción del genfinP de varios plásmidos de la familia de F, como los plásmidos F, F100 o el plásmido de virulencia de Salmonella enterica, es activada por metilación Dam. Estos resultados sugieren que la regulación de la transferencia conjugativa por metilación Dam es un fenómeno común entre los plásmidos tipo F. El alineamiento de la región promotora de varios plásmidos F-like mostró la existencia de una diana de metilación Dam (secuencia 5'-GATC-3') conservada en todos ellos, y que solapa parcialmente con el módulo -10 del promotor. Sin embargo, la metilación de esta diana GATC no afecta a la expresión de finP. Por tanto, podemos deducir que el efecto de la metilación Dam sobre la transcripción de finP es indirecto, y posiblemente mediado por alguna proteína reguladora no identificada que es a su vez, regulada por metilación Dam. Podría tratarse de un activador presente en fondo Dam+ o un represor presente en fondo Dam. La búsqueda de reguladores de la expresión del operón de transferencia mediante mutagénesis al azar con el transposón defectivo Tn10dCm identificó al gen lrp como un activador del operón. El gen lrp especifica la proteína Lrp (Leucine-responsive regulatory protein) que es un regulador general de la transcripción. Lrp se une a una región de ADN localizada corriente arriba de traJ y activa su transcripción. La proteína TraJ sintetizada activa a su vez la expresión del operón de transferencia. Un análisis más detallado de la regulación de traJ mostró la existencia de al menos dos sitios de uniónde Lrp, un sitio (Lrp-1) y un sitio proximal (Lrp-2). El sitio Lrp-2 incluye una diana de metilación Dam (diana GATC) y la unión de Lrp a este sito es bloqueada por la metilación de esta diana. Dado que para la activación de traJ se requiere la unión de Lrp a los sitios Lrp-1 y Lrp-2, al impedir la unión al sitio dos la metilación Dam reprime la expresión de traJ. Por tanto, la transcripción de traJ está activada por Lrp y reprimida por Dam.
  • CARACTERIZACIÓN DE LA REGULACIÓN DEL PROMOTOR ALFA4 DE HERPES SIMPLEX TIPO 1 EN VIRUS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA PSEUDORRABIA .
    Autor: GÓMEZ SEBASTIÁN SILVIA.
    Año: 2003.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA U.A.M..
    Resumen: El empleo de PRV como agente oncolítico y como vector presenta ventajas sobre otro virus incluyendo a HSV-1. La capacidad de PRV de infectar tejidos humanos pero sin ser patógeno para los humanos, es la ventaja más remarcable que le confiere ventajas adicionales frente al empleo de HSV-1. De hecho, en la actualidad hay un creciente interés en el estudio y la aplicación de PRV como vector. Se han construido los virus recombinantes de PRV gIs8 (gE defectivo) y N1aHTK por la inserción del gen quimérico alfa4 TK en el genoma de la cepa ATK5 de PRV. Esta quimera consiste en la secuencia codificante del gen de latimidina kinasa de HSV-1 bajo el control transcripcional del promotor alfa4 del gen que codifica para la proteína ICP4 de HSV-1. En la infección con los virus recombinantes gIS8 y N1aHTK se observó que la transcripción de la TK de HSV-1 se producía como la de un gen inmediatamente temprano y que además estaba sometida a una regulación negativa, como ocurre en el caso del promotor alfa4 de HSV-1. La expresión de la actividad kinasa de HSV-1 en estos virus recombinantes les confería una mayor sensibilidad a ganciclovir en comparación con la cepa NiA3 salvaje de PRV. La regulación negativa de la transcripción del gen quimérico se debía a la proteína IE180 de PRV como se demostró por transfección de células humanas con el gen de la proteína IE180 y el quimérico alfa4-TK . En este sistema, la proteína transactivadora VP16 de HSV-1 fue empleada como control y se vio como su expresión aumentaba la transcripción del gen quimérico. Estos datos están en concordancia con la similitud funcional existente entre las proteínas IE180 de PRV e ICP4 de HSV-1. Sin embargo, en experimentos adicionale son se detectó complementación entre otras funciones de estas dos proteínas, lo cual podría estar debido a diferencias en cuanto la interacción de éstas con otras proteínas víricas o factores celulares. Además se ha desarrollado un sistema de diferenciación serológica entre la infección por PRV salvaje (gE positivo) y PRV recombinantes (gE defectivos). Este sistema podría ser muy útil para su empleo en la diferenciación de animales infectados, por virus PRV y gE positivos, de vancunados, por cepas de PRV gE defectivas, debido a su gran sensibilidad y especificidad.
  • HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN DE SISTEMAS BIOSINTÉTICOS PKS-I, PKS-II Y NRPS EN ACTINOMICETOS .
    Autor: AYUSO SACIDO ANGEL.
    Año: 2003.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BÁSICA DE MERCK SHARP & DOHME DE ESPAÑA.
    Resumen: En las últimas décadas los programas de screening de productos naturales han dedicado un enorme esfuerzo en el descubrimiento de nuevos metabolitos secundarios bioactivos de origen microbiano. Las poliquétidos sintasas tipo I y tipo II (Shen, 2003) así como las péptido sintetasas (NRPS) (Schwarer et al., 2003) han sido intensamente descritas como responsables de la síntesis de una amplia diversidad de productos naturales en microorganismos (actinomicetos, myxobacterias, cianobacterias y hongos filamentos). Estos metabolitos incluyen, entre otros: antibióticos, antifúgnicos, antihelmíticos, agentes antitumorales y agentes inmunosupresores (Walsh, 2003). Con objeto de explorar la presencia y distribución de estos sistemas biosintéticos en actinomicetos, se han diseñado parejas de oligonucleótidos específicos de secuencias NRPS, PKS-I y PKS-II que permiten una rápida detección de dichos sistemas biosintéticos en actinomicetos. Estas herramientas han sido validadas en cepas de referencia. Se han encontrado 21 secuencias nuevas de sistemas PKS-I en Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491, 1 nueva secuencia de sistemas PKS-I en Streptomyces sp. MA5969 y 15 nuevas secuencias de sistemas NRPS en Amycolatopsis lactamdurans NRRL 3802. Los oligonucleótidos para PCR han permitido, posteriormente evaluar la distribución de dichos sistemas biosintéticos en una colección de 209 cepas de referencia y 329 aislados salvajes, detectando la presencia de sistemas NRPS, PKS-I y PKS-II en la mayoría de cepas analizadas. Además se ha establecido la relación entre la detección por PCCR de sistemas PKS-I, PKS-II y NRPS y la actividad antimicrobiana en Streptomyces y, finalmente, hemos utilizado estas herramientas para evaluar la diversidad de poblaciones de aislados salvajes pudiendo ser utilizado como un método alternativo para desreplicar aislados salvajes estrechamente relacionados. Estas herramientas podrían permitir dirigir los esfuerzos de los programas de screening hacia aquellas poblaciones de actinomicetos con mayor potencial para producir metabolitos secundarios, aumentando la probabilidad de obtener productos naturales bioactivos.
  • CARACTERIZACIÓN DE UNA NUEVA FASE FENOTÍPICA DE BORDETELLA PERTUSSIS, LA FASE INTERMEDIA (BVG I), Y EVALUACIÓN DE SU POSIBLE PAPEL DURANTE LA INFECCIÓN RESPIRATORIA .
    Autor: VERGARA IRIGARAY NURIA.
    Año: 2003.
    Universidad: NAVARRA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.
    Resumen: Bordetella pertussis es un cocobacilo gram-negativo responsable de la tos ferina, una enfermedad respiratoria aguda exclusiva del ser humano que afecta cada año a más de 250.000 personas en todo el mundo, principalmente niños. Hasta el momento se conocía bien la capacidad de B.pertussis para alternar entre dos fases fenotípicas o antigénicas distintas denominadas fase positiva (Bvg +) y negativa (Bvg -), en respuesta a estímulos ambientales químicos o físicos (agentes moduladores) captados y procesados por el sistema de dos componentes BvgAS. En este trabajo hemos identificado una tercera fase fenotípica (fase intermedia (Bvg i)) y hemos demostrado que las fases Bvg i de B.pertussis y B.bronchiseptica (una especie estrechamente relacionada con B.pertussis que no infecta al ser humano) son muy similares. Así, la transición de B.pertussis a la base Bvg i se puede inducir mediante mutagénesis dirigida (presencia del alelo bvgS-I1 de B.bronchiseptica) o cultivando el microorganismo en condiciones de semimodulación, esto es, en presencia de concentraciones intermedias de moduladores o bien por incubación a 30ºC. Como B.bronchiseptica, B.pertussis genera en su fase Bvg i colonias de tamaño, grado de aplanamiento y actividad hemolítica intermedias entre las características de las fases Bvg+ y Bvg- y expresa un polipétido de alto peso molecular específico de la fase Bvg i denominado BipA. La expresión de BipA es máxima en la fase Bvg i y está regulada por BvgAS a nivel de la transcripción. Sin embargo, las fases Bvg i de B.pertussis y B.bronchiseptica difieren en el rango de sustancia moduladora que necesitan para inducir la modulación a la fase Bvg i, en el hecho de que B.bronchiseptica expresa BipA también en la fase Bvg+ y en el menor peso molecular de BipA de B.pertussis. El hecho de que un mutante de B.pertussis bloqueado en la fase Bvg i fuera incapaz de colonizar la tránquea y el pulmón del ratón demuestra que la fase Bvg+ de B.pertussis es necesaria para establecer una infección del tracto respiratorio. Aunque la inactivación de BipA no redujo la virulencia de B.pertussis en el ratón, la expresión de BipA cuando B.pertussis se encuentra en la fase Bvg i en el tracto respiratorio del ratón, le proporciona una mayor capacidad colonizadora de las fosas nasales. Este hecho sugiere que la fase Bvg i podría estar implicada en la colonización del tracto respiratorio superior y quizás en la transmisión del microorganismo entre individuos. Finalmente, no se encontraron anticuerpos frente a BipA en el suero de un amplio grupo de pacientes convalecientes de tos ferina, lo que no permite concluir que la expresión de la fase Bvg i ocurra dentro del húesped natural de B.pertussis.
  • CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS SISTEMAS REGULADORES DE DOS COMPONENTES PHOR2-PHOP2 Y PHOR3-PHOP3 DE MYXOCOCCUS XANTHUS .
    Autor: MORALEDA MUÑOZ AURELIO.
    Año: 2002.
    Universidad: GRANADA.
    Centro de lectura: CIENCIAS .
    Resumen: Myxococcus xanthus es una bacteria Gram negativa que vive en el suelo donde puede degradar una gran variedad de complejas macromoléculas utilizando para ello una maquinaria hidrolítica extracelular. Estas bacterias se desplazan deslizándose como un enjambre en una superficie semisólida. Esta comunidad multicelular se nutre de otros microorganismos y macromoléculas utilizando enzimas extracelulares. Cuando las mixobacterias se encuentran en un medio con nutrientes siguen un ciclo de vida vegetativo durante el cual cada célula individual se elonga y, finalmente, se divide mediante fisión binaria originando dos células hijas. Sin embargo cuando los nutrientes del medio se agotan las células inician un ciclo de desarrollo, muy particular entre los procariotas, aunque muestra varias similitudes con el ciclo de desarrollo de ciertos eucariotas. Aunque el agotamiento de los nutrientes desencadena el ciclo de desarrollo, deben darse varias circunstancias adicionales para que el ciclo se complete, tales como una alta densidad celular (que permite la transmisión de diversas señales entre las células) y una superficie sólida (que posibilita el movimiento por deslizamiento). Cuando la densidad celular es suficiente, las células son móviles y los nutrientes del medio se han agotado, las células dentro de un enjambre comienzan a moverse hacia ciertos puntos donde se agregan y originan estructuras multicelulares y macroscópicas denominadas cuerpos fructificantes. En el interior de los cuerpos fructificantes las células bacilares vegetativas se diferencian en células metabólicamente quiescentes y resistentes a la desecación, la radiación UV y la sonicación denominadas mixósporas. La formación del cuerpo fructificante es un proceso dinámico en el cual se pueden diferenciar diversas etapas: A,- Un gran número (10 5-10 7) de células del enjambre pierde su individualidad física durante el proceso de morfogénesis. B,- El crecimiento vegetativo de los bacilos cesa. C,- Las células se ordenan y mueven inicialmente como ondas mediante oscilaciones rítmicas. A continuación. D,- Las células se agregan en determinados puntos, aunque en las primeras etapas de este proceso los centros de agregación aparecen y desaparecen constantemente. En una etapa posterior. E,- En algunos centros de agregación se apilan unas 100.000 células unas sobre otras originando un cuerpo fructificante naciente. Finalmente. F,- Las células que se han agregado se diferencian en mixósporas inmóviles y originan un cuerpo fructificante maduro que es una estructura estática. Las mixósporas son capaces de germinare iniciar un nuevo ciclo vegetativo cuando las condiciones nutriconales vuelven a ser favorables. La germinación es el evento que cierra el ciclo de desarrollo de las mixobacterias. Se han encontrado muchos genes que están regulados espacial (células bacilares vegetativas o mixósporas latentes) y temporalmente durante el ciclo de desarrollo de M.xanthus. Por otra parte, las mixobacterias deben de disponer de sistemas de comunicación intercelular que posibilite llevar a cabo este ciclo de desarrollo cooperativo que culmina con la formación de estructuras macroscópicas multicelulares. Además, las mixobacterias deben de disponer de mecanismos sensores que detecten las condiciones medioambientales y el desencadenamiento de respuestas frente a cambios en esas condiciones. En este sentido, M.xanthus, prototipo de las mixobacterias, posee numerosas proteínas quinasa de tipo eucariótico capaz de fosforilar en residuos de serina, treonina y tirosina. Algunas de estas proteínas quinasa, tales como Pkn1, Pkn2, Pkn5 y Pkn6, y Pkn9, han sido caracterizadas y estos hallazgos indican que la fosforilación de determinadas proteínas debe de desempeñar un importante papel en la regulación del ciclo de desarrollo y que, ademas, deben de existir proteínas con actividad fosfatasa que desfosforilen los sustratos fosforilados por las quinasas, permitiendo, de este modo, que el sistema retorne a su estado inicial. Mediante la construcción y el análisis de una genoteca de ADN cromosómico de M.xanthus se han aislado genes que inducen en E.coli la capacidad para degradar el BCIP, un sustrado de las fosfatasas. El análisis de estos genes ha indicado que codifican proteínas que muestran una elevada identidad con histidina quinasas y reguladores de respuesta, las cuales constituyen un sistema regulador de dos componentes que ha sido denominado PhoR2-PhoP2. Dichos genes se asemejan a los que regulan las expresión de las fosfatasas en otras bacterias. La utilizanción del gen phoP2 como sonda permitió la identificación de un sistema regulador de dos componentes homólogo constituido igualmente por una histidina quinasa, PhoR3, y un regulador de respuesta, PhoP3, también similares a los sistemas implicados en la expresión de las fosfatasas en otras bacterias. El análisis de las dos histidina quinasas ha revelado que poseen una región transmembrana que las divide en dos dominios, uno sensor localizado en el espacio periplásmico y otro catalítico, situado en el citoplasma. La identidad entre los dos dominios sensores es del 46% y entre los dominios, uno regulador y otro efector. El dominio efector posee una estructura hélice-giro-hélice típica de las proteínas que se unen al ADN, lo que indica que debe funcionar como un activador transcripcional. La identidad entre los dominios reguladores es del 57%, y entre los dominios efectores del 70%. A nivel de la hélice de unión al ADN la identidad es del 100%. El estudio de los niveles y tiempo de expresión de estos sistemas mediante el análisis de bacterias portadoras de fusiones con el gen LacZ, Western blot y retro PCR ha puesto de manifiesto que el sistema 2 es expresado a niveles muy bajos, indetectables en las condiciones estudiadas, tanto durante el crecimiento vegetativo como durante el ciclo de desarrollo. El mismo tipo de análisis llevado a cabo con el sistema 3 ha revelado que su expresión tiene lugar durante el crecimiento vegetativo, y que aumenta sus niveles transcurrida una hora del agotamiento de nutrientes, para pasara a niveles indetectables a las 2 horas y tiempos posteriores. Por otra parte, el análisis fenotípico de mutantes que portan una deleción en el sistema 2 y en el sistema 3 durante el crecimiento vegetativo ha revelado que no existe diferencia alguna ni en el tiempo de generación, ni en la densidad celular máxima alcanzada por los cultivos, ni en la fase de lisis entre las cepas mutantes y silvestre cuando son cultivadas en medios con gran abundancia de nutrientes. Sin embargo, el mutante en el siste 2 origina cuerpos fructificantes y mixósporas en medios que contienen 1/5 y 1/10 de los nutrientes presentes en los medios usuales, mientras que el mutante del sistema 3, por su parte, se comporta en todos estos medios como el silvestre. No obstante, durante el ciclo de desarrollo ambos mutantes muestra defectos tanto en la agregación como en la esporulación en medios que carecen de fosfato, donde originan cuerpos fructificantes desorganizados y menos elevados que los producidos por la cepa silvestre. Algunas esporas no llegan a adquirir su típica forma cocoidea y permanecen como bacilos cortos. Por otro lado, los dos mutantes poseen niveles de las dos fosfatasas alcalinas descritas en M.xanthus muy similares a los de las bacteria silvestre. Sin embargo, ambos mutantes poseen niveles reducidos de las fosfatasas neutra y ácida que aparecen durante el ciclo de desarrollo. Finalmente, se ha comprobado que el gen pphl, que codifica la única proteína fosfatasa de M.xanthus descrita hasta el momento, no se encuentra bajo el control del sistema PhoR3-PhoP3.
  • IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA S-ADENOSILMETIONINA SINTETASA DE LEISHMANIA DONOVANI .
    Autor: PÉREZ PERTEJO YOLANDA.
    Año: 2002.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: La metionina adenosiltransferasa (MAT), anteriormente conocida como S-adenosilmetionina sintetasa, cataliza la síntesis de S-adenosilmetionina (AdoMet), utilizando ATP y L-metionina como sustratos. La AdoMet es una molécular clave en el metabolismo celular, pues actúa como donante de grupos metilo en el 90% de las reacciones de transmetilación de la célula y una vez descarboxilada cede su grupo amino propilo para la síntesis de poliaminas. En este trabajo hemos identificado y caracterizado la MAT de Leishmania donovani. El gen que codifica para dicha enzima está constituido por una secuencia de nucleótidos de 1179 pb y genera una polipéptido de 392 aminoácidos con un peso molecular teórico de 43 kDa. Tras la purificación de esta proteína, procedimos a su caracterización enzimática y al estudio mutacional de los aminoácidos implicados tanto en la catálisis como en el mantenimiento de la estructura. Finalmente, realizamos la expresión homóloga de la MAT en promastigotes de L.donovani y observamos, entre otras cosas, que los promastigotes son capaces de expulsar, por un mecanismo desconocido, el exceso de AdoMet que les resulta perjudicial.
  • CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LA ATPASA F0F1 DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE. BLANCO DE ACCIÓN DE ANTIMICROBIANOS .
    Autor: MARTÍN GALIANO ANTONIO JAVIER.
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.
    Resumen: Streptococcus pneumoniae es una de las bacterias patógenas con mayor índice de mortalidad a escala mundial. Es uno de los principales agentes etiológicos de la neumonía, otitis media, bacteiremia y meningitis. El control de las patologías que produce está dificultado por el gran porcentaje de aislados clínicos resistentes a compuestos antimicrobianos y a que la efectividad de la vacunación no es completa en los grupos de riesgo. Se observó un incremento en la actividad de la ATPasa F0F1 de S.pneumoniae en respuesta a la acidificación del medio extracelular. La función de esta enzima es la de expulsar protones cuando disminuye el pH del medio y forma parte de la respuesta de tolerancia al ácido de esta bacteria. Se observaron incrementos paralelos en la cantidad de esta enzima, su ARNm y la actividad del promotor del operón que la codifica, por lo que la regulación de esta enzima se ejerce a nivel de iniciación de transcripción. Una mutación en la caja -10 del promotor impedía la regulación por pH por lo que podría existir una secuencia de reconocimiento por parte de algún factor regulador. Se demostró que esta enzima es el blanco primario de la mefloquina y una serie de compuestos relacionados ya que existe una relación directa entre su capacidad antimicrobiana y su capacidad de inhibición de la enzima in vitro, según se observó utilizando una serie de mutantes con distinto grado de resistencia a la mefloquina. La mayor parte de estos mutantes se obtuvieron después de transformar una cepa sensible con los genes que codifican la diana de la droga amplificados a partir de la misma cepa, demostrándose que los cambios eran consecuencia de la tasa de error de la ADN polimerasa. Este método fue también de utilidad para obtener mutantes de resistencia a ciprofloxacina, rifampicina y estreptomicina, algunos de ellos no previamente descritos en S.pneumoniae. Se caracterizó genéticamente un aislado clínico del grupo viridans que era sensible al compuesto optoquina, una cracterística utilizada en la identificación de S.pneumoniae, debido a que había sufrido un evento de recombinación in vivo para los genes responsables del fenotipo de sensibilidad a optoquina, atpCA, a partir de una cepa de S.pneumoniae.
  • EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA COINFECCIÓN POR LEISHMANIA/VIH .
    Autor: MORALES HERNÁNDEZ MIGUEL ANGEL.
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.
    Resumen: Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades causadas por un protozoo del género Leishmania, que afectan a más de 14 millones de personas, con 400.000 casos nuevos cada año, actualmente con tendencia a un fuerte incremento por su asociación al SIDA. La leishmaniasis visceral (LV) es una forma extendida por muchas zonas, entre ellas la cuenca mediterránea dónde se debe a L.infantum y puede ser mortal sin tratamiento. Desarrollamos un método nuevo y original para caracterizar y detectar infecciones por Leishmania en pacientes con SIDA. La técnica está basada en la amplificación mediante PCR de regiones polimórficas del ADN extracromosómico del parásito. Esta potente herramienta nos permitió evaluar la incidencia de la coinfección Leishmania/VIH, así como detectar brotes de leishmaniasis entre ADVPs. Utilizando esta PCR-RFLP en pacientes coinfectados procedentes de la isla de Mallorca, revelamos una propagación clonal de estos parásitos, que indicaban una transmisión antroponótica de la enfermedad en esta zona endémica. Más adelante desarrollamos y aplicamos una PCR seminested más sensible y reproducible que nos permitió detectar por primera vez la importancia de las jeringuillas en la transmisión de la leishmaniasis. Es más, nos permitió distinguir las reinfecciones de las recaídas en lops enfermos coinfectados por Leishmanial/VIH, una información importantísima para los clínicos para elegir el tratamiento adecuado de la enfermedad.
  • CARACTERIZACIÓN DEL GEN S1 DEL REOVIRUS AVIAR S1133 .
    Autor: BODELÓN GONZÁLEZ GUSTAVO.
    Año: 2002.
    Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA-UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
    Resumen: En este trabajo hemos puesto de manifiesto que el gen S1 de los reovirus aviares es funcionalmente tricistrónico, ya que en células infectadas dirige la síntesis, además de la proteína de unión a los receptores celulares sigmaC, de los polipéptidos que denominamos p10 y p17. Mientras que la proteína sigmaC es una proteína estructural que forma parte de las partículas virales, p10 y p17 son proteínas no estructurales. Por otra parte hemos demostrado que la actividad fusogénica asociada con el gen S1, reside exclusivamente en la proteína p10, y no en las proteínas sigmaC o p17. También hemos estudiado la modificación de la permeabilidad de membrana inducida por la infección de células en cultivo por el reovirus aviar, y hemos demostrado que la infección induce la alteración de la permeabilidad a tiempos tardíos de infección, y no a tiempos tempranos, y que este efecto es dependiente de la síntesis de determinadas proteínas virales denominadas viroporinas y de su transporte a la membrana plasmática a través de la ruta exocítica. Comprobamos que la proteína p10 altera la permeabilidad de membrana de bacterias y de células eucariotas, por lo que p10 posee actividad viroporina. Por último, demostramos que el dominio fusogénico de p10 no es responsable de la capacidad desestabilizadora de la membrana, por lo que las actividades fusogénica y viroporina radican en diferentes dominios de la proteína p10.
  • DIFERENCIAS EN LA PROTECCIÓN FRENTE A LA LEISHMANIASIS CANINA MEDIANTE LA INMUNIZACIÓN HOMÓLOGA/HETERÓLOGA CON VEHÍCULOS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN EL ANTÍGENO LACK .
    Autor: RAMIRO IBÁÑEZ M. JESÚS.
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLÓGICAS.
    Resumen: En distintos modelos animales se ha demostrado que vacunas recominantes donde se emplean DNA plasmídico y virus vaccinia como vectores, provocan una elevada respuesta inmune celular e induce protección frente a diversos patógenos intracelulares. En este trabajo estudiamos la eficacia de dos protocolos de vacunación, homólogo y heterólogo, con dos vehículos recombinantes que expresan el antígeno LACK (DNA-LACK y VV-LACK), en perros Beagle infectados experimentalmente con promastigotes de L.infantum. Nosotros detectamos un 60% de protección frente a la infección cuando se aplicó un régimen heterólogo de vacunación, mientras que un régimen homólogo no impidió que los perros desarrollaran la enfermedad, si bien provocó una reducción de la carga parasitaria en todos ellos. El estudio de diversos parámetros inmunológicos, como la expresión de IL-4, INF-gamma e IL-12p40 en distintas muestras de tejidos, ensayos de linfoproliferación frente a LACK y concanavalina A y la valoración de anticuerpos específicos frente a LACK, isotipos IgG1 e IgG2, sugiere la existencia de una respuesta inmune celular, con predominio de IFN-gamma en los animales protegidos. Este tipo de vacunación utilizando vehículos recombinantes en régimen heterólogo puede ser efectivo para combatir la leishmaniasis visceral canina provocada por L.infantum.
  • CLONACIÓN Y ANÁLISIS MOLECULAR DEL GEN CODIFICANTE DE LA TOPOISOMERASA II DEL PROTOZOO PARÁSITO L. INFANTUM.
    Autor: HANKE SCHAEFER TOBIAS.
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLÓGICAS.
    Resumen: Los tripanosomátidos contienen una única mitocondria con un singular tipo de DNA llamado DNA del kinetoplasto, formado por dos tipos de DNA circular: los minicírculos y los maxicírculos. Al contrario de lo que ocurre en los eucariotas superiores, la replicación del DNA mitocondrial y nuclear es simultánea. Mientras los maxicírculos permanecen unidos a la red del kDNA durante la replicación, los minicírculos son liberdos de la red, replicados y posteriormente unidos una vez que ha finalizado la fase S. Para la liberación y unión de los minicírculos de la red de kDNA, muy compleja topológicamente, es necesaria la presencia de una DNA topoisomerasa. En este trabajo se ha clonado el gen que codifica la proteína DNA topoisomerasa II asociada al kinetoplasto de Leishmania infantum; se ha realizado un estudio del producto de transcripción del gen a lo largo del ciclo vital y celular del parásito; se ha expresado la proteína recombinante en E.coli; se han realizado el análisis de localización subcelular de la proteína y se ha demostrado la actividad del producto del gen clonado por complementación y ensayos de actividad en levadura.
  • CARACTERIZACIÓN DE LOS MECANISMOS DE CAPTACIÓN DE HIERRO DE PASTEURELLA MULTOCIDA .
    Autor: BOSCH GALLEGO MONTSERRAT.
    Año: 2002.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: Los objetivos de la presente tesis doctoral han sido la caracterización de los mecanismos de captación de hierro de Pasteurella multocida, con el fin de contribuir al diseño de una vacuna contra este patógeno basada en la sobreexpresión de proteínas de membrana externa, receptoras de hemoglbina y/o hemina, o en la expresión constitutiva de las proteínas de membrana reguladas por hierro (IROMPs). Se ha identificado el gen fur de P.multocida y se ha estudiado el perfil electroforético de las proteínas de membrana externa de dicho patógeno, descubriéndose un control de la expresión de una proteína mayoritariamente de membrana (OmpH) por parte de la proteína Fur. Se ha contribuido un mutante fur y se ha demostrado que la mutación de este gen no presenta ningún efecto sobre la virulencia de la cepa. Así mismo, se ha caracterizado la región cromosómica de P.multocida que contiene los genes exbB, exbD y tonB, detectándose la existencia de promotores internos en dicha región y por lo tanto la expresión independencia de cada uno de los tres genes del sistema. Se ha estudiado la regulación de la expresión de todos ellos, demostrándose que pertenecen al regulón Fu, y se han construido mutantes en los genes exbB, exbD y tonB. Se ha calculado la dosis letal 50 (DL50) de cada una de las cepas construidas, determinándose que cada uno de estos genes es imprescindible para el desarrollo normal de una infección por P.multocida, ya que en todos los casos se obtuvo un incremento de la DL50 superior a los tres órdenes de magnitud con respecto la cepa salvaje. Por otro lado, se ha analizado el genoma de P.multocida Pm70 se han estudiado 9 proteínas que, por similitud con los receptores descritos en el banco de datos, podrían actuar como receptores de hemoglobina y/o hemina. Así se ha podido determinar que algunas de ellas son capaces de unir hemoglobina y hemina (PM0040, PM0236, PM 0300, PM071, PM1081 y PM1428), mientras que otras tan sólo interaccionan con la hemoglobina (PM0576) o la emina (PM1282), y que otra (PM1078) no reconoce ninguna de estas fuentes de hierro. De entre todas estas proteínas se ha elegido la PM0300, que se ha denominado HgbA, para realizar un estudio más detallado de este tipo de receptores de membrana. Así, se ha demostrado que el gen hgbA forma una unidad transcripcional con los genes PM0298 y PM0299. Estos genes presentan similitud con hugX y hugZ de Plesiomonas shigelloides respectivamente, y están implicados en procesos de detoxificación de hierro. Se ha demostrado que, en P.multocida, las proteínas PM0298 y PM0299 son esenciales para la viabilidad de la cepa. Por otro lado, se ha determinado que el gen hgbA se expresa en las primeras dos horas de la infección y que, in vitro, su expresión se induce en ausencia de hierro. Además, se ha construido un mutante deficiente para esta proteína y se ha comprobado que no presenta disminuida ni su capacidad de unir hemoglobina in vitro ni su virulencia. Por otro lado, se ha comprobado la distribución prácticamente universal de este gen en cepas de P.multocida de distintos serotipos y orígenes animales, hecho que propone a esta proteína como candidata para el desarrollo de un método de identificación rápido y específico de este microorganismo. Por último, se ha analizado la capacidad inmunogénica y protectora de los receptores de hemina y/o hemoglobina. Así, se ha demostrado que por lo menos tres de estas proteínas (PM0236, PM0741 y HgbA) son inmunogénicas. Sin embargo, la inoculación en ratones de las proteínas HgbA y PM0741, ya sea de forma individual o conjunta, no induce protección ante un enfrentamiento homólogo.
  • IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA CAJA SOS DE RALSTONIA METALLIDURANS Y DEINOCOCCUS RADIODURANS .
    Autor: CASARES PROAÑO LORENA CECILIA.
    Año: 2002.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: El sistema SOS de Escherichia coli ha sido durante mucho tiempo el modelo de referencia para su estudio en otras especies. Este sistema se encuentra en otros microorganismos incluyendo bacterias gramnegativas, grampositivas y otras. Recientemente se ha encontrado diferencias entre las cajas SOS y los genes que integran el regulón SOS en E.coli respecto a otras especies bacterianas. El propósito de este trabajo ha sido determinar y caracterizar las cajas SOS de dos especies bacterianas, Ralstonia metallidurans y Deinococcus radiodurans, pertenecientes a los grupos beta-Progeobacterias y Deinococcus-Thermus, respectivamente. En primer lugar se realizó la clonación y secuenciación de los genes recA y lexA de R.metallidurans, el primero mediante hibridación con una sonda del gen recA de Agrobacterium tumefaciens y el segundo utlizando programas informáticos en los que se usó la secuencia del gen lexA de E.coli para identificar dicho gen en la secuencia parcial del genoma de R.metallidurans. Tras un análisis de sus regiones promotoras, se determinó que ambas contenían un motivo regulador, CTGT-N8-ACAG, idéntico al de E.coli. Se comprobó que esta caja reguladora era funcional tanto en R.metallidurans como E.coli, evaluando su capacidad de inducir el gen recA frente a lesiones en el DNA. Adicionalmente se determinó que la caja SOS de este microorganismo se encontraba en varios genes que, en E.coli forman parte del regulón SOS, como recA, lexA y un hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. En cambio, no se identificó dicha caja en los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG, los cuales, en E.coli, también integran el regulón SOS. Mediante el análisis por RT-PCR on-line de los tránscritos se demostró que la expresión de todos estos genes era inducible al lesionar el DNA. Asimismo, mediante ensayos de movilidad electroforética, utilizando extractos proteicos de LexA de E.coli purificada y extractos crudos de R.metallidurans y R.metallidurans LexA(Def), se determinó que la proteína LexA era la responsable de la regulación de los genes recA, lexA y el hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. Por el contrario, los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG no están bajo el control de la proteína LexA. Por lo tanto, si bien R.metallidurans posee una caja SOS idéntica a la de E.coli, solo algunos de los genes integrados en el regulón SOS de E.coli forman parte de este regulón en R.metallidurans. Además, el hecho de que los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG sean inducibles por lesiones en el DNA indica que deben estar sometidos a algún control independiente de LexA. Para determinar la caja SOS de D.radiodurans, se procedió a clonar el gen lexA obteniéndose su secuencia mediante programas informáticcos que permiten localizar secuencias de un genoma con un determinado grado de similitud a otras secuencias conocidas. Una vez clonado dicho gen, se sobreexpresó la proteína LexA de este microorganismo y el extracto proteico obtenido se utilizó para realizar ensayos de movilidad electroforética frente al promotor del gen lexA de D.radiodurans, demostrándose que el gen lexA se autorregula. Seguidamente y mediante ensayos de movilidad electroforética se acotó al máximo la región promotora del gen lexA hasta identificar un posible motivo regulador. Mediante mutagénesis dirigida de las diferentes bases de dicho motivo se determinó que la proteína LexA de D.radiodurans reconoce específicamente el palíndromo CTTG-N8-CAAG como motivo de unión, siendo las bases señaladas en negrita las más importantes para la unión proteína-DNA. Finalmente se demostró que otros genes como recA o el hipotético lexA2 no tienen la misma caja SOS ni son regulados por LexA. Se concluye que la proteína LexA de D-radiodurans tiene un motivo regulador diferente a los anteriormente descritos para otros grupos de microorganismos y que debe haber un tipo de regulación diferente a los anteriormente descritos para los genes involucrados en procesos reparativos.
  • NUEVAS APORTACIONES AL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DE LA PESTE PORCINA AFRICANA .
    Autor: GALLARDO FRONTAURA M. CARMEN.
    Año: 2002.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UAM).
    Resumen: La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad infecciosa del cerdo doméstico causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA). Debido a que en la actualidad no existe una vacuna eficaz contra la PPA, los programas de erradicación y control de la misma pasan por la puesta en marcha de estrictas medidas sanitarias, por un diagnóstico de laboratorio eficaz, así como por estudios de epidemiología molecular que nos permitan identificar el origen de posibles brotes de la enfermedad. El incremento de cepas de baja virulencia capaces de inducir anticuerpos específicos en sangre durante largos períodos de tiempo, incluso años, y la ausencia de anticuerpos vacunales, son las dos razones fundamentales por los que el diagnóstico de la PPA se basa en la detección de anticuerpos específicos del VPPA. La técnica recomendada es el ELISA, seguida de la confirmación mediante el IB. Estas técnicas de diagnóstico cuentan con diversos inconvenientes cómo son el uso de virus vivo en la producción del antígeno por lo que su manipulación está restringida a laboratorios que reúnan las adecuadas condiciones de bioseguridad. Con el objetivo de mejorar los test de diagnósticos serológicos de la PPA, durante esta Tesis se han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico para la detección de Ac frente al VPPA basados en el uso de las proteínas recombinantes p32, p54 y pp62 del VPPA cómo antígeno. Los resultados obtenidos muestran que el uso de estas proteínas en el diagnóstico serológico de la PPA mejora la sensibilidad y especificidad del diagnóstico convencional. De las tres proteínas recombinantes utilizadas, los mejores resultados se obtienen con la poliproteína pp62 indicando por un lado las propiedades antigénicas de esta poliproteína, y por otro lado una mayor estabilidad de los epítopos conformacionales presentes en la poliproteína pp62. Estas características hacen que la poliproteína pp62 del VPPA sea una de las proteínas más interesantes para ser usadas en el diagnóstico serológico de la PPA. Los estudios de caracterización molecular de aislados virales permiten conocer mejor los aspectos epidemiológicos de la enfermedad que producen, los mecanismos de evolución viral y establecer relaciones de filogenia entre diferentes aislados. En el VPPA estos estudios se han vito dificultados por el tamaño del genoma del VPPA (170-190 kb) y por su baja variación a nivel nucleótidico al ser una molécula de AND lo que ha limitado la secuenciación exhaustiva del genoma completo. Un tipo de variabilidad genética en el VPPA da lugar a pequeñas variaciones en la longitud del genoma inferiores a 1kb, detectables mediante secuenciación y se deben a variaciones en el número y en la secuencia de las unidades repetidas en tándem (SRT). Por tanto, el otro objetivo planteado en esta Tesis consistió en el análisis y caracterización de SRT de 35 aislados del VPPA originarios de diferentes zonas de Europa, África y América, mediante PCR, análisis de restricción y secuenciación. Los resultados obtenidos sugieren que todos los aislados europeos y americanos están estrechamente relacionados entre sí y con los aislados del oeste de África sin que se hayan podido encontrar variaciones significativas en las regiones analizadas. Por el contrario, en los países procedentes de Africa del sur y oriental, se observa mayor variabilidad en el análisis de las secuencias, posiblemente debido que en estos países la enfermedad se ha mantenido de forma endémica gracias a un ciclo de transmisión entre las garrapatas, los facoqueros y los cerdos domésticos. Las principales variaciones encontradas se deben a la inserción o selección de las SRT.
  • CARACTERIZARON FENOTÍPICA Y ANÁLISIS DE COMPONENTES MACROMOLECULARES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA PROCEDENTE DE AISLADOS CLÍNICOS CUBANOS .
    Autor: COBAS PUPO GUILLERMO.
    Año: 2002.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA. CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".
    Resumen: Se aislaron, y caracterizaron 115 cepas de Pseudomonas aeruginosa de origen clínico a través de pruebas bioquímicas, marcadores inmunoepidemiológicos y microbiológicos, confirmando que todas las cepas que incluimos en el estudio, corresponden al género Psudomonas, especie aeruginosa. Se corroboró que los serotipos de mayor circulación en los hospitales de la ciudad de Santiago de Cuba son el O11, con un 32,5% de los aislados seguido del O15 y el O4 con un 11,5% en ambos. La mayoría de las cepas mostraron además una elevada resistencia a los agentes antimicrobianos, presentando la mayor resistencia a Imipenen y piperacilina con un 99,1%. Estos resultados nos permitieron hacer una selección de 19 cepas para profundizar en otros aspectos de interés, comparando y analizando el grado de proximidad existente entre las mismas. Se estudió la regularización de los sistemas de bombeo múltiples de drogas MexAB-Opr; MexCD-OprJ, analizando el efecto que tienen las mutaciones sobre aspectos importantes para su trasnmisibilidad y virulencia. Estos sistemas parecieron no influir en la viabilidad y propagación en el medio ambiente, sin cambios significativos en ciertos aspectos tales como supervivencia en agua, superficie secas así como la producción de biofilm. La virulencia en C.elegans tuvo un comportamiento inespecífico, además de no afectar a ciertos factores de virulencia como los sideróforos y proteasas. Se expresaron además los genes mexC, mexA, mexE y mexX en todas las cepas analizadas. Se purificaron y caracterizaron algunos componentes mayoritarios de la pared celular de las cepas de Pseudomonas aeruginosa seleccionadas, como fueron proteínas de secreción, de membranas, LPS y peptidoglicano, concluyendo que las proteínas de membranas presentaron mayor homogeneidad en sus perfiles electroforéticos que las de secreción, en ambas la reactividad de anticuerpos policlonaes se comportaron de forma muy similar. Por otra parte se logró purificar el LPS donde pudimos comprobar que la reactividad de los sueros de pacientes fue elevada, lo que indica la presencia de anticuerpos anti-LPS. Por último el peptidoglicano de las baceterias analizadas no presentó una variabilidad significativa en sus parámetros estructurales, encontrándose el muropeptido específico identificado para Pseudomonas aeruginosa.
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