BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS, 2

Autor: VEIGA CHACÓN ESTEBAN.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: En esta tesis se presentan una serie de datos que se resumen en las siguientes conclusiones: 1,- El sistema de secreción de las proteínas autotransportadoras (Ats), cuyo arquetipo es la proteasa IgA de Neisseria, permite la presentación ectópica de polipéptidos de muy diversas características sobre la superficie celular de E.coli a base de generar fusiones entre el dominio C-terminal del autotransportador (C-IgAP) con la secuencia polipeptídica de interés. 2,- La capacidad de presentación superficial de polipéptidos heterólogos por los sistemas autotransportadores incluyen no sólo secuencias relativamente cortas sin puentes disulfuro, sino también proteínas globulares con enlaces S-S. 3,- La presentación superficial de secuencias de dimerización Jun y Fos procedentes de activadores transcripcionales eucarióticos mediante fusiones a C-IgAP confirió a las correspondentes células nuevas propiedades de ahesión mutua de forma dependiente de la expresión controlada de las fusiones Jun-C-IgAP o Fos-C-IgAP. 4,- Las fusiones entre el dominio C-IgA de los ATs y módulos scFvs alcanzaron un grado de presentación superficial del anticuerpo correctamente estructurado en torno al 20% de la proteína híbrida total expresada. Tal estructuración, en particular la formación de puentes disulfuro, dependió enteramente de la acción de chaperonas periplásmicas. Esta dependencia se mantuvo en el caso de la presentación de anticuerpos de camello, si bien en este caso la presentación y actividad fue del 100%. 5,- Los autotransportadores tienen la capacidad de exponer distintas actividades biológicas sobre la superficie de bacterias Gram-negativas. Hemos demostrado el uso de estos AT para exponer hacia el medio extracelular distintas proteínas que redirigen de forma específica la adhesión bacteriana. También, experimentos in vivo indican que podemos usar bacterias que expresan un scFv, con actividad neutralizante del virus de TGEV, como agentes de inmunidad pasiva. 6,- El dominio transportador C-IgAP se estructura en la ME formando un oligómero con forma de anillo con un poro hidrofílico común en todas las subunidades de 2 nm de diámetro. 7,- Los dominios pasajeros de las distintas subunidades que forman el complejo oligomérico se secretan a través de este poro hidrofílico. Estos dominios secretados deben plegarse en el periplasma antes de su secreción para ser activos. Si se evita el plegamiento, la secreción no se ve impedida pero los dominios pasajeros no son capaces de plegarse en el medio extracelular.

Autor: SERRANO MELGAR MIGUEL ÁNGEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Durante las etapas iniciales de la infección por Salmonella anterica sv.Typhimurium a células no fagocíticas (HeLa, NRK, etc), se producen alteraciones importantes de la envoltura celular bacteriana, que conllevan la liberación de lipopolisacárido y un cambio estructural que afecta a la composición del peptidoglicano, y que potencialmente conlleva la liberación de péptidos derivados del peptidoglicano. Estos hechos sugieren que elementos derivados de la pared bacteriana puedan modular la proliferación intracelular. Es más, una observación frecuente en cultivos de células HeLa y NRK infectados es la eliminación de la bacteria intracelular en un número considerable de células (mayor en el caso de NRK), que en consecuencia sobreviven a la infección, pero quedan saturadas de restos bacterianos incluyendo restos de la envoltura bacteriana. En consonancia con lo anterior nos pareció posible que la presencia de restos bacterianos, podría afectar a la respuesta celular frente a una segunda infección. En el caso de una respuesta protectiva podría jugar incluso un papel en el carácter autolimitante de muchas salmonelosis, al dificultar la reinfección por bacterias circulantes o liberadas por células próximas. En el presente trabajo hemos investigado ambos aspectos empleando sistemas de infección in vitro con dos tipos celulares, uno permisivo HeLa (alto índice de proliferación tras la infección) y uno no permisivo NRK (bajo índice de proliferación, pero larga persistencia de la infección). Se ha analizado el comportamiento de estirpes bacterianas mutantes en los genes amiA, amiB y amiC, potencialmente implicados en la modificación del peptidoglicano. La mutación en estos genes conlleva un incremento, moderado, de la capacidad de proliferación intracelular de la bacteria, posiblemente como consecuencia de alteraciones en la membrana externa. El efecto es máximo para mutantes en amiA y mínimo par amiAB. La estimulación de la proliferación es efectiva en HeLa y NRK, y parece deberse a una mayor capacidad de supervivencia en el interior celular. Para el estudio de sistemas de "reinfección", en los cuales se analiza el efecto que una primera infección abortiva puede tener sobre una segunda infección de la misma célula por una estirpe virulenta, hemos empleado un mutante auxótrofo para diaminopimelato. Este mutante infecta normalmente pero lisa a las pocas horas de la infección, dando lugar a la liberación de restos celulares en forma similiar a lo observado en células que eliminan al patógeno tras la infección. Mediante este sistema hemos podido ver que la infección abortiva induce una respuesta protectiva importante frente a una segunda infección. La respuesta parece ocurrir a nivel de formación de SIF's (Salmonella induced filaments), y favorece una rápida eliminación de la bacteria virulenta en las células reinfectadas. Finalmente y a raíz de experimentos encaminados a identificar el mecanismo responsable de la eliminación, hemos obtenido datos que indican una caída importante en el potencial de membrana de la bacteria intracelular, y una aislamiento muy eficaz del compartimiento mitocondrial respecto a las vesículas de lipopolisacárido generadas en la infección.

Autor: PALACIN GÓMEZ ARANZAZU.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA (CSIC).

Resumen: En Streptomyces lividans se han clonado y secuenciado los cuatro genes (sipW, SipX, sipY y sipZ), que codifican las peptidasas señal tipo I. Los tres primeros se encuentran formando parte de un mismo operón (sipWXY) y el cuarto (sipZ) es el primer gen de otro operón. Se han construido y analizado fenotípicamente mutantes en cada uno de los genes sip. El mutante en sipY muestra un fenotipo de esporulación retrasada, la secreción de proteínas extracelulares nativas está considerablemente disminuida y presenta un mayor defecto en el procesamiento de proteínas extracelulares modelo sobreproducidas, a lo que sugiere que SipY es la Spasa mayoritaria en S.lividans.

Autor: PORTAL NÚÑEZ SERGIO.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El virus de la hepatitis C es un virus envuelto, RNA, de polaridad positiva de un tamaño de 9,5 Kb aproximadamente. El virus produce una hepatitis crónica que puede llegar a dar lugar un carcinoma hepático. Se estima que actualmente hay unos 250 millones de infectados en todo el mundo. La rivabirinaa y el interferón alfa no son eficaces en todos los casos, esto ha llevado a desarrollar nuevos antivirales capaces de vencer al virus. Este trabajo es una aproximación a este nuevo tipo de antivirales. Se ha desarrollado un ensayo in vitro con el cual poder probar la capacidad inhibitoria de ciertas moléculas a la hora de bloquear la acción de una proteasa viral (la NS3a) cuya función es vital para la correcta replicación del virus. Se ha producido y purificado la región N-terminal de la NS3a (aminoácidos 1-181) procediendo al replegado in vitro de la proteasa una vez extraida de los cuerpos de inclusión. Se ha probado la actividad de esta proteasas replegada frente a un péptido sustrato que mimetiza una de las regiones de corte propias de la poliproteína vírica. Paralelamente se han sintetizado 197 péptidos con distintas modificaciones en su secuencia de los cuales, cinco presentan producir inhibiciones de más de un 50%. Estos péptidos pueden ser candidatos al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el control de la infección causada por el VHC.

Autor: ECHAVE LOZANO PEDRO JUAN.
Año: 2002.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA UDL.

Resumen: La alcohol deshidrogenasa E de Escherichia coli (AdhE) es una alcohol deshidrogenasa hierro-dependiente implicada en el ctabolismo anaerobio de la glucosa. AdhE cataliza la conversión del acetilCoenzima A en un etanol en dos pasos consecutivos. La importancia de esta enzima paral a bacteria estriba en que gracias a estas dos reacciones se regenera el NADH producido durante la glicolisis, de manera que se consigue el balance redox. Debido a la presencia de un ion ferroso, en presencia de oxigeno la enzima se inactiva mediante oxidación catalizada por metal (MCO). Durante el transcurso de mi tesis, en primer lugar se aislaron mutantes de E coli capaces de emplear etanol como fuente de carbono y energia. Posteriormente se determino que en todos los clones que se obtuvieron los cambios a nivel de DNA se localizaban a nivel del gen estructural de adhE, de manera que se habia producido la sustituciónA267T. En otro grupo de mutantes que obtuvimos se encontro que además de la sustitución ya mencionada aparecia otra, E568K. Una vez determinados los cambios geneticos se decidio llevar a cabo una caracterización bioquimica de estos mutantes. Se desarrollo un método que nos permitia purificar el enzima silvestre y los mutantes en cantidades suficientes como para poder llevar a cabo los ensayos posteriores. Así, se encontro que la sustitución A267T hacia que se leiminara el acetaldehido, intermediario toxico de la reacción, con mayor rapidez que en el enzima silvestre. La sustitución E568K tenía, por el contrario un papel estructural. Sin embargo, ninguno de los cambios que encontramos explicaban de que manera las enzimas mutantes eran capaces de funcionar en presencia de oxigeno sin inactivarse mediante MCO. Es mas, los resultados con las enzimas mutantes purificadas indicaban que eran mas sensibleas a la MCO que la silvestre. Esta aparente paradoja se soluciono cuando se encontró que in vivo las enzimas mutantes presentaban una mayor afinidad por la chaperona DnaK que la enzima silvestre. Se demostró que el aumento en la afinidad por la chaperona protegida a AdhE de la MCO. Empleando mutantes defectivos para DnaK se encontro además que el papel protector de la chaperona frente al estrés oxidativo no se limitaba a AdhE, sino que era mucho más general en E.coli. Finalmente, se encontró que mutantes defectivos para adhE eran incapaces de crecer en medio minimo en condiciones aerobicas. Además, AdhE es muy abundante en presencia de oxigeno, representando aproximadamente el 1% del total de las proteinas de la bacteria, pero aproximadamente el 70% de las 10000 moléculas/célula que se estima que existen en estas condiciones se encuentran inactivas por MCO. Se encontró que en ausencia de AdhE la bacteria presentaba un estrés oxidativo endogeno. Por otro lado, in vitro AdhE se inactivaba en presencia de peroxido de hidrógeno con una Ki (5 uM) en el rango de la producción de H2O2 por parte de la cadena respiratoria en condiciones aerobicas. Estos dos hechos nos llevaron a sugerir que in vivo AdhE habia sido seleccionada como un scavenger del peroxido de hidrogeno en condiciones aerobicas.

Autor: CIFUENTES MARTINEZ ANA.
Año: 2002.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: DPTO. BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR.

Resumen: En esta tesis se presenta un estudio sobre la composición procariótica existente en un ambiente determinado: sedimentos marinos costeros. Para llevar a cabo esta descripción se han empleado tanto las técnicas de cultivom más convencionales, y también se han aplicado técnicas moleculares de reciente desarrollo, especialmente los basados en la amplificación específica clonación y secuenciación de los genes ribosómicos 16 S. Se destaca la gran diversidad hallado, así como los diferentes resultados, obtenidos cuando se emplean diferentes técnicos, indicando la necesidad de estudios de cada vez más amplios.

Autor: CUCARELLA TORMO M. CARME.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA, UNIVERSIDAD CARDENAL Y HERRERA CEU.

Resumen: Los biofilms son comunidades de bacterias englobadas dentro de una matriz polisacárida que crecen adheridas a una superficie. El crecimiento en forma de biofilm protege a las bacterias frente a la fagocitosis y al tratamiento antibiótico, estando asociado a la cronificación de las infecciones. Dentro del género Staphylococcus, la especie en la que se ha estudiado con mayor profundiad es S. Epidermidis, en la que se ha identificado el operón icaADBC como uno de los principales responsables de la formación del biofilm. La evidencia de que existen otros factores y el escaso número de estudios que se han realizado en otras especies de este género justifican la necesidad de la identificación y caracterización de nuevos genes implicados en la formación del biofilm en el género Staphylococcus. El estudio se centra en el microroganismo patógeno S. Aureus por su importancia tanto en clínica humana como en el campo veterinario. Mediante mutagénesis por transposición hemos identificado un gen de 6,8 kb nos descrito hasta el momento al que hemos llamado bap (biofilm-associated protein, AF288402). Este gen codifca una nueva proteína de superficie que posee el motivo LPTXTG de anclaje al peptidoglicano y cuya característica estructural más importante es la presencia de 13 repeticiones de 86 aa casi idénticas entre sí incluso a nivel de DNA. Mediante la comparación con un mutante isogéncio deficiente en Bap, hemos demostrado que la nueva proteína está implicada tanto en la fase de adherencia primaria como en la fase de adherencia intercelular. Bap favorece la acumulación del polisacárido sintetizado por el perónica, pero también es capaz de promover la formación de biofilm incluso en ausencia de este factor, y por lo tanto representa una vía nueva e independiente. Mediante un modelo de infección experimental asocido a cuerpo extraño en ratones, hemos demostrado que Bapfavorece la cronificación del proceso infectivo. Por razones aún no determinadas,la presencia de Bap interfiere en la funcion de las MSCRAMMs, una familia de adhesinas de S. Aureus implicadas en la colonización de tejidos. El gen bap forma parte de una nueva isla de patogenicidad de Staphylococcus aureus a la que hemos llamado SaPIbov2. Esta región de 27,5 kb presenta un núcleo de homología alta con otras islas descritas en este microorganismo, junto con una región específica y puede sufrir deleción en bloque.

Autor: ALONSO UTRILLA SERGIO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: U.C.M..

Resumen: El estireno es uno de los compuestos aromáticos de mayor uso industrial, lo que supone un importante riesgo de contaminación medioambiental. Algunos microorganismos, como Pseudomonas sp.Y2, son capaces de mineralizar este compuesto generando exclusivamente CO2 como producto final. Este trabajo se centra en el aislamiento y caracterización de los genes responsables de la degradación del estireno de Pseudomonas sp.Y2. Para ello se ha realizado una librería genética del cromosoma de esta bacteria en un vector plasmídico, de la que se a obtenido un clon que alberga un plásmido que contiene todos los genes implicados en los primeros pasos de la degradación del estireno. La secuenciación de los 15560 pb de bases que constituyen el inserto de este plásmido, y el análisis de la secuencia obtenida con programas informáticos especializados, ha permitido definir la existencia de cuatro genes catabólicos, styABCD, que codifican tres actividades enzimáticas responsables de la oxidación secuencial del estireno, generando expoxiestireno, fenilacetaldehído y finalmente ácido fenilacético. Los experimentos realizados han confirmado la funcionalidad de estas actividades enzimáticas tanto en Pseudomonas sp.Y2 como en otros microorganismos, a los que dota de la capacidad de eliminar este contaminante. Se ha estudiado en profundidad el sistema que regula la transcripción de los genes styABCD, codificado en dos genes, stySR, que conforman un sistema de dos componentes en el que StyS es el encargado de detectar la presencia de estireno y de transferir la señal, mediante la fosforilación de un residuo específico, a StyR. Esta última proteína es un regulador transcripcional que interacciona directamente con el promotor de los genes estructurales, activando su expresión. El conocimiento obtenido en este trabajo ha permitido la construcción de estirpes modificadas de Pseudomonas sp.Y2 que permiten valorar la presencia de agentes contaminantes en el medio ambiente.

Autor: GALÁN SICILIA BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC).

Resumen: El objeto de esta Tesis ha sido el estudio de sistemas de regulación de la expresión génica de rutas del catabolismo de compuestos aromáticos, como un ejemplo del metabolismo secundario. Se han estudiado los promotores Pg y Pr del operón meta de ruta de degradación del ácido 4-hidroxifenilacético (4HPA) en Escherichia coli W. Mediante la utilización de fusiones traduccionales Pg-lacZ se ha demostrado que Pg es un promotor que se induce unicamente en fase estacionaria cuando las células se encuentran creciendo en glucosa como fuente de carbono y energía. Esta represión catabólica está mediada por el complejo cAMP-CRP. El ácido acético presente en el medio en la fase estacionaria como consecuencia del catabolismo de la glucosa, proporciona a la célula la energía suficiente necesaria para activar el promotor Pg. El promotor Pg no depende de la subunidad sigma 38 de la RNA polimerasa y es activado por el regulador global IHF en la fase estacionaria de crecimiento. Mediante ensayos de retardo en gel se ha demostrado que ambos reguladores, CRP e IHF, se unen simultaneamente a Pg y los sitios de unión están centrados en las posiciones -61,5 y -103, respectivamente, respecto al sitio de iniciación de la transcripción del promotor Pg. Además se ha observado un fenómeno denominado silenciamiento exponencial cuando las células se encuentran creciendo en un medio rico en presencia de LB. Por otro lado, se ha estudiado la función del regulador específico HpaR sobre los promotores Pg y Pr (su propio promotor). Se ha demostrado que HpaR reprime la expresión de su propio promotor Pr y del promotor Pg, siendo los compuestos aromáticos 4HPA, 3HPA y 3,4HPA los inductores del sistema. HpaR se une a los promotores Pg y Pr en unas secuencias repetidas e invertidas de 27 pb denominadas OPR1 y OPR2, respectivamente.

Autor: LÓPEZ LÓPEZ ARÁNZAZU .
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPTO. BIOQUÍMICA Y B. MOLECULAR, UMH.

Resumen: Para el estudio de la diversidad procariótica en los ambientes estudiados en esta tesis (medio marino y salinas solares) se han utilizado tanto las técnicas clásicas de aislamiento en cultivo puro como las técnicas moleculares de identificación de microorganismos, intentando en lo posible evitar el sesgo que produce la utilización de un solo tipo de técnica. En la mayor parte de los trabajos presentados se ha realizado en primer lugar una evaluación global de la biodiversidad procariótica existente en el ambiente o "fingerprinting", aplicando una metodología molecular sencilla que se conoce como RISA (Ribosomal Internal Analysis), de gran utilidad para comparar múltiples muestras de forma simultánea y observar posibles variaciones bajo diferentes condiciones ambientales. Posteriormente, de las muestras más interesantes obtenidas con esta primera aproximación, se ha determinado mediante clonaje y secuenciación de los genes rRNA 16S cuáles son los grupos filogenéticos presentes en la muestra natural y en los cultivos llevados a cabo. Por último, se han estudiado con más detalles aquellos grupos de secuencias o aislados que, por su baja similaridad con filotipos o microorganismos ya descritos, parecían ser interesantes desde el punto de vista de la biodiversidad. Ambientes marinos El primero de los trabajos realizados, llevado a cabo con muestras procedentes del Océano Antártico obtenidas durante la Campaña DHARMA, ha contribuido de forma significativa al conocimiento de las comunidades procarióticas del océano profundo. En este estudio, mediante la clonación y secuenciación de los rRNA 16S, investigamos la diversidad procariótica en muestras obtenidas a 3000 metros de profundidad en el Frente Polar Antártico. Durante el análisis de las secuencias obtenidas a partir de esta muestra, se detectó la existencia de un nuevo filotipo formado por un grupo de secuencias relacionado con las Euryarchaeotas, cuya posición en el árbol filogenético parecía indicar que estaban relacionadas con las haloarqueas. La ubicación filogenética exacta de este grupo así como su distribución geográfica vertical, fue determinada en un estudio posterior que reveló este nuevo linaje, al que se denominó Grupo Marino IV, se situaba en la base del grupo de las arqueas halófilas, independientemente del método filogenético utilizado. A partir de las secuencias obtenidas se diseñaron cebadores específicos para la detección por PCR de este grupo en otros ambientes marinos. Para ello se utilizaron muestras recolectadas a distintas profundidades en distintas regiones oceánicas. En todas ellas el Grupo IV fue detectado en muestras de profundidad y nunca en superficie, lo que mostró su ubicuidad en las aguas profundas. El último de los trabajos presentados en esta tesis relacionado con ambientes marinos consiste en la descripción de un nuevo género marino perteneciente a la subclase alfa-Proteobacteria. Uno de los objetivos principales marcados al inicio de esta tesis fue el aislamiento y la caracterización de microorganismos que, siendo representativos del ambiente, no habían sido obtenidos en cultivo puro. Para ello, realizamos una serie de cultivos con muestras procedentes de distintas zonas marinas (Mar Mediterráneo y Océano Antártico) en los que se pretendía mimetizar en lo posible las condiciones existentes en el medio natural. De las colonias obtenidas se seleccionaron algunas de ellas en base a criterios morfológicos, para un estudio más detallado mediante la aplicación de las técnicas de secuenciación del rRNA 16S. Mientras que en los cultivos realizados con muestras del Océano Antártico no se obtuvieron microorganismos interesantes desde el punto de vista de la biodiversidad, en los experimentos realizados con aguas del Mar Mediterráneo pudimos detectar la presencia de una bacteria no descrita, a la que denominamos QMT2, que parecía ser abundante en la muestra natural. El análisis filogenético reveló que la cepa QMT2 pertenecía a la familia Rhodospirillaceae y que, dada su baja similitud de secuencia rRNA 16S con el resto de los miembros de la familia, podría tratarse de un microorganismo no descrito. Posteriores análisis tanto genotípicos como fenotípicos llevaron al establecimiento de este nuevo género y a la descripción de Thalassospira lucentensis, gen.nov, sp.nov. Ambientes hipersalinos. En el primero de los trabajos presentado en esta memoria al objetivo principal era estudiar e intentar mejorar la recuperación por cultivo de las arqueas halófilas presentes en el estanque de mayor salinidad (CR30) de las salinas de Santa Pola, ya que las especies que se habían recuperado por cultivo no se correspondían con las detectadas mediante técnicas moleculares. Para ello se utilizaron distintas condiciones de cultivo, variando tanto la naturaleza física del medio como los parámetros que pueden influir en el crecimiento de estas arqueas (temperatura de incubación, naturaleza y concentración de la fuente de carbono, intensidad lumínica y disponibilidad de oxígeno). La utilización de las técnicas de ARDRA y RISA nos permitió conocer la temperatura y la concentración de la fuente de carbono a las cuales la diversidad de arqueas recuperadas en cultivo era mayor. Con estas condiciones óptimas, y variando otros parámetros que influyen en el crecimiento microbiano, se realizaron cultivos que fueron monitorizados mediante la técnica de RISA. Además, los productos de amplificación obtenidos mediante esta técnica fueron clonados y secuenciados para la identificación de los microorganismos presentes tanto en los cultivos como en la muestra natural. Se obtuvieron secuencias de los microorganismos presentes tanto en los cultivos como en la muestra natural. Se obtuvieron secuencias de los microorganismos capaces de crecer bajo distintas condiciones de incubación y los presentes en la muestra natural y, aunque la diversidad obtenida fue muy baja, su comparación nos permitió conocer cuáles son las condiciones óptimas para el crecimiento de estas arqueas halófilas. En el segundo trabajo realizado en este ambiente nos centramos en el estudio de la variación de las comunidades procarióticas a lo largo del gradiente de salinidad. Nuestro trabajo se centró en conocer la diversidad de secuencias procarióticas a lo largo del gradiente de salinidad utilizando distintas técnicas moleculares. Además se realizó la comparación de la diversidad obtenida por técnicas moleculares con la obtenida por cultivo en tres de los estanques de estas salinas, que seleccionamos como representativos de bajas, medias y altas salinidades. Este estudio nos permitió la obtención de secuencias, tanto de clones como de aislados, con las que se realizó el análisis de la diversidad procariótica presente en el ambiente y la comparación de los datos obtenidos por cultivo con los obtenidos mediante técnicas moleculares.

Autor: MARAVER MOLINA ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA (CSIC).

Resumen: La investigación se ha centrado en el estudio de la relación existente entre las diferentes proteínas estructurales del virus de la bursitis infecciosa, demostrando que una correcta interacción entre las proteínas VP1 y VP3 es fundamental tanto en la morfogénesis del virus como en la replicación del genoma viral.

Autor: MARISCAL SANCHO LUISA FERNANDA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS BIOLÓGICAS, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El virus TT (TTV) fue identificado en 1997 a partir del suero de un paciente con una hepatitis aguda postransfuncional. Se trata de un virus cuyo genoma es ADN monocatenario, circular y de polaridad negativa con una longitud aproximada de 3,8 kb. Por sus características genómicas se propuso que el TTV replica siguiendo el mecanismo del "círculo rodante". En la presente tesis doctoral se ha determinado la presencia del TTV en suero, hígado y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con hepatitis crónica, demostrándose la infección por dicho virus en hígado y CMSP mediante PCR e hibridación in situ y por tanto que se trata de un virus hepatotropo y linfotropo. Por otra parte, se ha establecido un sistema de cultivo e infección in vitro por TTV de las CMSP mediante el cual se ha demostrado que las células son infectadas por el virus de forma similiar a como ocurre in vivo. Sin embargo, para que se lleve a cabo la replicación del virus es necesario que las CMSP estén estimuladas. En estas células se ha demostrado la presencia de intermediarios replicativos de ADN de cadena doble, por lo que se puede afirmar que el TTV replica siguiendo el mecanismo del "círculo rodante" y mediante el modelo simétrico. Además, también se ha detectado la presencia de ARN mensajero del TTV y se ha demostrado que las partículas virales recuperadas de cultivos infectados in vitro son capaces de infectar nuevas células.

Autor: TORRES BELINCHON BEGOÑA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS.

Resumen: En esta tesis se han estudiado los elementos reguladores de la transcripción del "cluster" mhp de Escherichia coli para la degradación del ácido 3-hidroxifenilpropiónico. Se han descrito los dos promotores divergentes de esta ruta, Pa y Pr. El activador específico de esta ruta, MhpR, es una proteína capaz de unirse in vitro al promotor Pa. Los compuestos aromáticos capaces de inducir la ruta mhp son 3-hidroxifenilpropiónico (3 HPP), 3-hidroxicinámico (3HCI) y 3-dihidroxifenilpropiónico (DHPP). La activación del promotor Pa esta sometida a represión catabólica por glucosa mediada por el complejo CRP-AMPc. El producto del gen mhpT, la proteína MhpT, es un transportador de 3HPP en Escherichia coli. Se ha demostrado en esta tesis que el sistema de metilación-restricción EcoRI es un sistema idóneo para diseñar circuitos de contención genética en Proteobacterias y mediante la combinación de este sistema con los elementos reguladores MhpR/Pa de la ruta de degradación del 3HPP, se ha desarrollado el primer circuito de contención biológica basado en un sistema de toxina/antídoto que responde a la presencia/ausencia de 3HPP. Además, se ha diseñado por primera vez un circuito dual basado en la combinación de funciones letales distintas (endonucleasa EcoRI y colicina E3), con dianas celulares diferentes (ADN y ARNr) y bajo controles independientes y se ha demostrado que este circuito reduce significativamente la frecuencia de transferencia de un gen marcador flanqueado por las dos funciones letales.

Autor: PALOMARES QUESADA CONCEPCIÓN.
Año: 2001.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: MICROBIOLOGÍA.

Resumen: Los alimentos utilizados o preparados en la Industria proceden de materias primas que están contaminadas por una microflora bacteriana. En muchas ocasiones esta microflora puede dar lugar al deterioro del producto y/o un riesgo potencial para el consumidor. Esta tesis desarrolla un método de amplificación y delección de ácidos nucleicos (PCR en tiempo real) de Salmonella enterica, Shigella spp; Staphy/lococcus aureus, Lactobacillus plantarom y Baccillus . Estas técnicas suponen un drástico incremento en la sensibilidad y especificidad, así como una reducción del tiempo necesario para la identificación. Las técnicas desarrolladas pueden aplicarse a nivel industrial, ya que los microorganismos detectados van a ser los responsables de la contaminación y deterioro de la mayoría de los productos alimenticios. Este método supone un significativo incremento de la competitividad al reducir los costes de producción e incrementar la seguridad en la elaboración y consumo de los alimentos.

Autor: SEGURADO CARRASCAL MÓNICA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: La recombinación genética juega un importante papel en el reparación de daños en el DNA incudios durante la replicación. Se conocen diversas mutaciones que afectan a proteínas que intervienen en la replicación como DNA polimerasas, helicasas o ligasas que provocan un aumento de la recombinación mitótica. En sistemas procariotas se ha demostrado que la recombinación asegura que la replicación sea completa reparando horquillas colapsadas o incluso es necesaria para iniciar la replicación. En eucariotas estos procesos son menos conocidos, pero se piensa que la recombinación entre cromátidas hermanas es responsable de la reparación de lesiones producidas durante la replicación. Por medio de electroforesis bidimensional hemos estudiado la recombinación mitótica en Schizosaccharomyces pombe durante la fase de síntesis del DNA. Nuestros resultados indican que los intermediarios de recombinación aparecen únicamente en regiones que contienen origenes de replicación. Análisis de cultivos sincrónicos de varias regiones del genoma que funcionan como orígenes de replicación, revelan que la aparición de intermediarios de Holliday sigue la misma cinética que la activación del orígen. Hemos determinado la frecuencia de integración en diferentes puntos del genoma, de un plásmido linearizado que contiene el gen marcador ura+ y hemos encontrado que la frecuencia de recombinación homóloga está aumetnada de 15 a 20 veces en regiones próximas a orígenes de replicación, por lo que sugerimos que los orígenes de replicación en S.pombe podrían actuar como hotsports de recombinación. Además mutantes afectados en genes de reparación como rad22+, rhp54+, rhp51+ han mostrado un severo defecto tanto en replicación como en recombinación. Planteamos la posibilidad de que ambos procesos estén relacionados funcionalmente en S.pombe, pudiendo la recombinación ser necesaria en zonas de inicio de la replicación para reparar daños o solucionar estructuras derivadas de la activación de la replicación

Autor: GONZALEZ LOPEZ CLAUDIA.
Año: 2000.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Los reovirus aviares son los agentes responsables de numerosas patologías en aves de granja, las cuales originan importantes pérdidas económicas a la industria avícola. A pesar de su gran importancia cómo patóngenos, se conoce muy poco sobre los aspectos básicos de la biología de los reovirus aviares. Desde hace varios años, en nuestro laboratorio se está llevando a cabo una caracterización bioquímica profunda de estos agentes, lo que creemos que permitirá sentar las bases para diseñar sistemas de diagnóstico, serotipaje y producción de vacunas, con el fin último de prevenir y/o combatir las enfermedades inducidas por estos agentes. Con la realización de esta tesis nos propusimos estudiar la sensibilidad del reovirus aviar S1133 frente a la acción antiviral del interferón y determinar los mecanismos que utiliza el virus para contrarrestar la acción antiviral del inteferón. En primer lugar, demostramos que el reovirus aviar S1133, pero no el virus vaccinia o el virus de la estomatitis vesicular, es resistente a la acción antiviral de un inteferóna viar recombinante enfibroblastos ambrionarios de pollo. A continuación, observamos que los extractos de células infectas con reovirus aviar, pero no los de células sin infectar, bloquean la activación de las enzimas dependientes de dsRNA en extractos de reticulocito de conejo, y que esa actividad bloqueante radicaba en la proteína viral oA, una proteína del core viral con una gran afinidad de unión a RNA de doble cadena. El gen que codifica oA se clonó en un vector de expresión procariota, y también se generó un virus vaccinia recombinante que expresa dicha proteína. La expresión de oA, a partir del virus vaccinia recombiannte WRS2, protege el virus vaccinia de la actividad antiviral del intreferón e inhibe la activación de la proteína quinasa dependiente de RNA de doble cadena, probablemente secuestrando el dsRNA activador. En conjunto, todos estos resultados sugieren que la proteína viral oA desempeña un papel importante en la resistencia del reovirus a viar hacia la acción antiviral del interferón.

Autor: MENDOZA BAISAS IMELDA.
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: IRNA-CSIC.

Resumen: Se ha utilizado la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para identificar genes y proteinas esenciales en la tolerancia a la salinidad. Se estudian dos genes aislados por complementacion de mutantes de levadura sensibles a NaCI. Uno de ellos codifica la subunidad reguladora de la proteina fosfatasa calcineurina y el otro al factor de transcripcion Yap4. Se desmuestra que calcineurina es necesaria para la tolerancia a sodio debido a su actividad en la regulacion de la Na+-ATPasa Ena1 y en el sistema de transporte de potasio Trk. La activacion consitutiva de calcineurina, mediante coexpresion de la subunidad reguladora y una subunidad catalitica truncada, produce celulas mas tolerantes a sodio. Yap4 es un factor de transcripcion tipo bZIP que media la expresion de los genes ENA1 y PMR1, regulados a su vez por calcineneurina.

Autor: SOLORZANO QUIJANO ALICIA.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: IMB (USAL/CSIC).

Resumen: La levadura Saccharomyces cerevisiae tiene dos tipos de virus RNA denominados 20S y 23S RNA que pertenecen a la familia Narnaviridae, cuya principal caracteristica es la de no estar encapsidados. Los genomas de estos virus con un tamaño entre 2 y 3 kb codifican para RNA polimerasas dependientes de RNA, llamadas p91 y p104, respectivamente. P91 y p104 se pueden asociar con sus RNAs respectivos para formar complejos ribonucleoproteicos. En este trabajo hemos demostrado que ambos RNAs y sus proteinas se localizan en el citoplasma celular. Hemos expresado las polimerasas solas y fusionadas a la GFP y hemos comprobado que la conformacion de ambas depende de la presencia del RNA respectivo. Estos RNAs son escasos en crecimiento logaritmico pero abundantes en condiciones de estrés nutricional. Las proteinas estan agregadas en las primeras condiciones mientras que son solubles en las segundas y eso depende de su unión al RNA. Las proteínas de fusión también son capaces de asociarse al RNA. Además hemos determinado que sólo seune una protiena por cada RNA, es decir, la relación estequiométrica RNA/proteína es de 1:1. Todas las moléculas de 20S y 23S RNA por su parte, existen formando complejos rinoculeoproteicos con sus RNA polimerasas respectivas y éste es su modo de vida en el interior de la levadura. Estos RNAs, que además no tienen colas de polia y probablemente no tengan Cap, son RNAs mensajeros pero sobreviven a los mecanismos de degradación de mRNAs que la celula posee, posiblemente formando estas ribonucleoproteínas. Con el sistema de replicación "in vitro" para 20S RNA, hemos estudiado el final de la elongación de las cadenas (+) de este virus. W, una forma bicatenaria que 20S RNA lleva asociada, no forma parte del ciclo sino que es un producto secundario del mismo. Por tanto son virus RNA de cadena (+).

Autor: SAN ROMAN SARMIENTO KATHIE JESSICA.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un paramixovirus que afecta al sistema respiratorio y/o nervioso de aves de corral. Este virus tiene una membrana lipoproteica que contiene dos glicoproteinas transmembranales, la hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F). La HN es la responsable de la unión del virus a los receptores celulares. La proteína F contiene el péptido de fusión responsable directo de la fusión de la membrana vírica y celular, y tres regiones llamadas "heptad repeats" que se supone participan también en el proceso de fusión de membranas. Para profundizar en el estudio de la fusión de membranas inducida por el NDV hemos estudiado la actividad biológica y algunas propiedades funcionales de dos péptidos sintéticos, N24 y C24, derivados de las regiones HR1 y HR2 de la proteína F. Ambos péptidos han resultado ser inhibidores de la fusión, mostrando diferente potencia inhibitoria sobre la infección del NDV en cultivos celulares. Así, el péptido N24 resultó ser 150 veces más potente que el péptido C24. Ambos péptidos interactúan entre sí, y cuando se mezclan en concentraciones equimolares se anula su efecto inhibidor de la fusión. Además, los péptidos inducen la agregación de vesículas fosfolipídcas neutras y aniónicas, aunque carecen de propiedades fusogénicas. Por ello, proponemos que su efecto inhibidor de la fusión se deba a qué interaccionan con regiones funcionales de la proteína de fusión, probablemente con las regiones HR complementaria, impidiendo que la proteína F adquiera su conformación fusogénica.

Autor: ALCALA GALICIA BELEN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIV. AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: Neisseria meningitidis, tradicionalmente conocida como meningococo, es una bacteria patogena, exclusivamente humana, responsable de la denominada enfermedad meningocócica. Durante mucho tiempo, en España, el serogrupo B ha sido el mayoritario, fundamentalmente en la década de los 70 y de los 80. Sin embargo, a comienzos de 1990 empezó a registrarse un tendencia ascendente de serogrupo C, originando durante el periodo 95-97 la aparición de una nueva onda epidémica. La expresión antigénica asociada correspondía a la combinación fenotípica C:2b:P1.2,5, habiendo reemplazado a la antigua cepa epidémica de serogrupo C, C:2b:NST. Su aparición nos llevó a realizar un estudio del conjunto de cepas C:2b:P1.2,5 aplicando diferentes marcadores de naturaleza molecular tales como la electroforesis en cambo pulsado o PFGE, que nos permitia analizar la totalidad del ADN cromosómico mediante aplicación de enzimas de restricción de baja frecuencia de corte y Multi locus sequence Typing o MLST basado en la amplificación y posterior secuenciación de 7 genes housekeeping de meningococo. El análisis refleja la existencia de una estructura poblacional muy homogenea y su pertenencia al clustr poblacional A4. Hasta este momento, se describía que la antigua cepa epidemica circulante de serogrupo C, la cepa C:2b:NST, pertencia al cluster poblacionasl ET-37, sin embargo, un analisis más detallado, por PFGE y MLST, del conjunto de cepas pertenecientes al periodo 92-99, expresando dicha combinación antigénica, apunta un hecho de vital importancia para el conocimiento de la epidemiologia de meningococo entre la población española y que explicaria la aparición de la onda epidémica iniciada en el año 95. Este hecho supone que el antiguo cluster poblacional ET. 37 constituido por cepas de expresión antigénica C:2b:NST, se ha visto reemplazado por cepas pertenecientes al cluster poblacional A4, fundamentalmente asociadas a la expresión fenotipica C:2b:P1.2,5. La falta de una exposición previa de la poblacion a la expresión fenotipica C:2b:P1.2,5 y por tanto, la falta de inmunidad, junto a una especial virulencia de la misma la apuntan como principal responsable de dicha onda epidémica. Por otro lado, el analisis complementario de otras expresiones antigénicas, revela además la existencia de dos grandes lineas evolutivas españolas: la línea evolutiva ET-37 existentes hasta el año 94 que incluyese expresiones antigénicas del tipo C:2b:NST y C:2b:P1.2 Por último, el análisis de variantes más heterodoxas del tipo B:2b:P1.2,5 revela su origen en cepas de expresión antigenica C:2b:P1.2,5 que hubiesen modificado la expresión de su capsula con la consiguiente importancia que este hecho conlleva, teniendo en cuenta que la presión inmune ejercida por la aplicacióno vacunal puede llevar a seleccionar dichas variantes, no existiendo en la actualidad vacuna frente a dicho serogrupo B.