BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS, 3

Autor: IZETA PERMISAN ANDER DE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA, CSIC.

Resumen: El coronavirus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT) es un virus RNA de cadena sencilla y polaridad positiva, con una RNA genómico de 28.5 kb. El gran tamaño del genoma del VGPT ha dificultado hasta muy recientemente la obtención de un cDNA infectivo de longitud completa que facilite la manipulación génica del virus. Por ello, en el laboratorio nos hemos centrado en el aislamiento y caracterización de RNAs defectivos, minigenomas, de menor longitud que el genoma parental. En esta tesis se han puesto a punto dos sistemas de expresión de minigenomas sintéticos RNA derivados del VGPT bajo los promotores T7 y de citomegalovirus (CMV). Estos minigenomas son replicados y empaquetados (es decir, rescatados) en presencia de virus complementador. Mediante la obtención de mutantes de deleción de los minigenomas y el analisis de la expresión del gen trazador de la B-glucuronidasa, se han determinado las secuencias minimas necesarias para su replicación. Estas secencias se han reducido a 1164 y 278 nucleotidos en los extremos 5´ y 3´ del RNA viral, respectivamente. El minigenoma más pequeño que ha sido rescatado en presencia de virus complementador tiene 3.3 kb (M33), mientras que los minigenomas más pequeños que son replicados pero no encapsidados tienen 2.1-2.2 kb (M21 y M22). La diferencia entre los minigenomas en viriones del VGPT está en estudio. El mapeo de la señal de encapsidación del VGPT será de gran utilidad para diseñar vectores con un solo ciclo replicativo y que no den lugar a la aparición de virus viables por recombinacion (vectores suicidas).

Autor: CABRERIZO SANZ MARIA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CIENCIAS (UAM).

Resumen: Clasicamente, en la infección por virus B de la hepatitis (VBH), la desaparición en suero del antígeno HBs(AgHBs) y del ADN VBH se asociaba a la resolución de la enfermedad. Sin embargo, pequeñas cantidades de VBH puede seguir siendo detectado mediante PCR durante años en pacientes que han resultado una hepatitis aguda o cronica por virus B. En la presente tesis doctoral se ha intentado determinar cuales son los factores viricos y del sistema inmunologico del propio hospedor responsables de la persistencia del VBH en ausencia del AgHBs, estudiando la incidencia, los niveles y el estado molecular del VBH, asi como su capacidad infectiva, en el suero y las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) de 2 poblaciones AgHBs-negativas, una formada por pacientes en hemodialisis cronica con una pobre respuesta inmonológica asociada al fallo renal, y otra compuesta por los miembros de la misma unidad de diálisis que habián pasado una hepatitis aguda por virus B años atrás resuelta clinica y serológicamente y, por tanto, deben ser inmunocompetentes. Los resultados obtenidos indican que existe una alta prevalencia, mayor del 50%, de ADN VBH en la población en hemodialisis AgHBs-negativa, y que tanto en estos pacientes como tras la resolución de una hepatitis aguda, el VBH puede permanecer detectandose a bajos niveles durante años en ausencia del AgHBs. Este VBH es transcripcionalmente activo, al menos en las CMSP, ya que se han podido detectar los intermediarios replicativos. Además, el sistea inmunologico no parece el único responsable de mantener los bajos niveles se VBH en ambas poblaciones. La perdida de detección del AgHBs mediante los metodos convencionales en estos casos es debida la existecia de genomas que contienen una deleción en la region pre-S1 que afecta al promotor del gen S y produce una reducción de la sintesis de las proteinas de la envuelta, de tal manera que el numero de particulas circulantes es bajo. Esta variante tiene que ir siempre acompañada del tipo salvaje para que pueda ser secretada al suero. Por último, este VBH defectivo tiene capacidad para infectar CMSP cultivadas in vitro, replicandose y produciendo particulas víricas que se secretan al medio. La persistencia del VBH durante años y la desregulación de la expresión del AgHBs pueden tener importantes consecuencias clinicas y patológicas no solo en el riesgo de transmisión del virus, sino tambien en el desarrollo con el tiempo de formas mas agresivas de la enfermedad hepatica que pueden terminar en la aparición de carcinoma hepatocelular.

Autor: RIVAS MENA LUIS ALFONSO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: U. AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: En este trabajo se describe el clonaje y caracterización del gen csn y de su expresión en B.subtilis que codifica una proteína con homología de secuencia con enzimas quitosanasas. La proteína ha sido sobreproducida en B.subtilis, purificada y sus características enzimáticas determinadas comprobando que la quitosanasa de B.subtilis es más parecida a las quitosanasas de actinomicetos que a las de su mismo género. La quitosanasa ha sido utilizada como proteína de referencia para analizae la secreción en condiciones de sobreproducción e identificados los pasos limitantes en este proceso. Por último, la quitosana se utilizó como proteína de referencia en el ensayo funcional in vivo de las peptidasas señal de Streptomyces lividans.

Autor: DIEZ HERNANDEZ ELIECER.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDA AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: El factor de transcripción PacC regula la expresión genérica en función del pH ambiental en el hongo Aspergillus nidulans. PacC se activa por procesamiento proteolítico en el entorno del residuo 253 en respuesta al pH ambiental alcalino, para cuya transducción es necesaria la funcionalidad de la ruta de transducción integrada por los genes pal. Los resultados descritos en esta tesis demuestran que el procesamiento de PacC es un proceso que requiere, al menos, dos cortes en otros tantos putos de la proteina. Cada uno de estos dos cortes es debido a una proteasa distinta: la protasa determinativa es responsable de una corte en la región carboxilo terminal de PacC y la proteasa procesativa corta en torno al residuo 253 para generar la forma procesada. Los requerimientos de PacC y la proteasa procesativa corta en torno al residuo 253 para generar la forma procesada. Los requerimientos de PacC necesarios para que las dos proteadas corten son diferentes. Asi, la proteasa determinativa parece reconocer especificamente un punto de corte situado en la region 485-511 y no requiere la presencia de la region 169-234 de PacC. El corte de la proteasa determinativa está regulado positivamente por la señal del pH ambiental. Proponemos que la función de este primer corte seria la de eliminar de forma irreversible las interacciones entre la región carboxilo terminal de PacC y otras regiones interactivas situadas corriente arriba que mantienen la conformacion cerrada de la proteina, en respuesta a la señal pal. El corte de la proteasa procesativa, que esta conservada en S.crevisiae, solo puede suceder si PacC está en la corformación abierta. Sin embargo, la transición de la conformación cerrada de PacC a la conformación abierta no es suficiente para que el procesamiento suceda. El reconocimiento del punto de corte es un proceso multifactorial. Por una parte, es necesario la región comprendida entre los residuos 169 y 234. Esta región forma parte de un determinante de procesamiento mas extenso, que contiene el dominio de union a DNA. El analisis de deleción de pacC ha demostrado que la region 73-234 es suficiente para permitir que la proteasa procesativa corte en PacC. Por otra parte, la eficiencia el procesamiento y la fidelidad del reconocimiento del punto de corte requieren la integridad la region 266-407, como se concluye del analisis de las proteinas truncadas en la region carboxilo terminal, de las protenas mutantes PacA8,9,10 y 11 y del comportamiento de las proteinas de fusion PacC:: GFP. Por último, si bien la proteasa procesatia no reconoce especificamente una secuencia de aminoacidos en torno al punto de corte, la estructrua tridimensional de la region que contiene a este podria jugar un papel en la eficiencia de la reacción procesativa.

Autor: RINCON ORTIZ JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: UNIV. DE LEON.

Resumen: RHODOCOCCUS FASCIANS, es un ac tinomiceto nocardiforme Gran-positvo, con ácidos micólicos en su pared; produce patogenicidad en plantas. Se ha caracterizado una región genómica de la cepa D188 de R. Gasciaus que contien 2 genes que codifica 2 factores simga Rof A y Rof B. Ambos presentan conservadas las regiones características de la familia sigma 70 los dos genes se encuentran en el genoma a una distancia de 8,3 kilobases. Junto al gen raf A se ha caracterizado al gen pgk que codifica una polifosfato glucoquinasa. Se comprobó la actividad quinásica de la proteína de r.fascians, utilizando ATP y polifsfatos como donadores del grupo fosfato. La enzima era activa a termperaturas de entre 25 y 56ª C a altas temperaturas, la enzima de R. Fasciaus utiliza mejor los polifosfatos de cadena larga. Se calcularon las constantes de afinidad (Km) para el ATP y para la glucosa. Se comprobó que la enzima era capaz de fosforilar distintos hexosas y peontosas, además de la glucosa. A 4 Kilobases del gen raf B se localizó el gen dnd R que codifica una proteína reguladora de pendiente de metales. La proteína es inmunorreactiva frente a anticuerpos anti-ATxR de corynebascteruim Dphrherial y se une a las regioens promotoras Tox y Des A a presencia de metales divalentes. Junto al dmdR se localizó un gen galE que codifica una UDP- Galactosa epimerase. Se comprobó la expresión heteróloga del gen y la naturaleza de la enzima codificada.

Autor: CASCÓN SORIANO ALBERTO.
Año: 1999.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: DADA LA COMPLEJIDAD TAXONÓMICA DEL GÉNERO AEROMONAS, EL DESARROLLO Y PUESTA A PUNTO DE TÉCNICAS QUE PERMITAN UNA IDENTIFICACIÓN FIABLE DE ESTAS BACTERIAS. EN EL LABORATORIO ES DE VITAL IMPORTANCIA. ASIMISMO EL ESTUDIO DE SUS MECANISMOS DE PATOGENICIDAD PODRÍA UTILIZARSE PARA EL DISEÑO DE VACUNAS ASI COMO PARA IMPLEMENTAR NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO. EN ESTE TRABAJO SE HAN DESARROLLADO 2 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE DIAGNOSTICO. EN ESTE TRABAJO SE HAN DESARROLLADO 2 TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE AEROMONAS MEDIANTE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR, DE LOS GENES LIP Y AROA, CON EL POSTERIOR ANÁLISIS POR RFLP-PCR DEL SEGUNDO DE ESTOS GENES. POR OTRA PARTE SE HAN CLONADO, SECUENCIADO E INACTIVADO POR INSERCIÓN DOS GENES,AHPA Y AHPB, CODIFICANTES DE SENDAS PROTEASAS EXTRACELULARES DE A:HYDROPHILA AG2. EL PRIMERO DE ELLOS NO TENÍA NINGÚN EFECTO EN LA VIRULENCIA DE ESTA CEPA, MIENTRAS QUE EL SEGUNDO CONSTITUYE UN FACTOR DE VIRULENCIA A TENER EN CUENTA EN A. HYDROPHILA AG2.

Autor: BARROSO RODRIGUEZ M. ISABEL.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo hemos estudiado la regulación transcripcional del gen del enzima málico citosólico (ME) por la insulina, en la línea celular de hepatoma de rata H-35. Mediante ensayos de transfección transitoria hemos localizado la región de respuesta a la hormona entre las posiciones 177 y 102 del promotor. Esta zona contiene un posible elemento de respuesta a la insulina (IRE-II). Por ensayos de retardo en gel hemos demostrado que Sp1 y Sp3 se unen a esta secuencia de manera constitutiva. El tratamiento con insulina induce la unión, rápida y transitoria, del factor de respeusta temprano Egr-1 que desplaza a Sp1 de su sitio de unión al ADN. La inducción de Egr-1 depende de la estimualción de la ruta de Ras/MAP quinasa e inhibe el promotor de ME, lo que podría formar parte de una respuesta mitogénica de las células a la insulina. En una fase más tardía la hormona induce la transcripción del gen, mediante la activación de una ruta bioquímica distinta de Ras/MAP quinasa que podría depender fosfatidilinositol 3-quinasa. En esta respuesta tardía podría participar Sp1, cuya funcionalidad en este promotor hemos demostrado en células de "Drosophila" SL-2. Este factor de transcripción activa la transcripción basal de ME y además coopera con miembros de la superfamilia de receptors nucleares que también regulan este promotor.

Autor: FERNANDEZ RODRIGUEZ MARISOL.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Se han estudiado los procesos fisiológicos de Streptomyces antibioticus ETH7451 inhibidos en presencia de 5-Azacitidina(5-Aza), un análogo de citidina que se incorpora al ADN impodiendo los procesos de metilación del mismo. La esporulación y la síntesis de ADN y ARN se inhiben en medio sintético, pero no el crecimiento o la síntesis de proteínas en las condiciones utilizadas. La 5-Aza acentua los procesos líticos que se observan durante el ciclo de desarrollo normal, en los que intervienen nucleasas y proteasas,y permite también la síntesis de antibiótico. El fundamento molecular de la acción del análogo podría estar relacionado con la inhibición de la Mtasa SanI de un sistema de restricción-modificación isoesquizomero de NaeI, detectado en esta bacteria. La 5-Aza constituye un instrumento muy útil para estudiar los fenómenos líticos asociados a una situación de estrés fisiológico, similar a la que induce la diferenciación durante el desarrollo de la bacteria.

Autor: GARCIA-BERNARDO JUNQUERA JOSE.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la ruta de biosíntesis del antibiótico glicopeptídico vancomicina. La importancia de este antibiótico se centra en su actividad antibiótica frente a bacterias Grampositivas frente a las que otros antibióticos de uso tradicional, como los antibióticos beta-lactámicos, no resultan efectivos. Para llevar a cabo este estudio se procedió a la construcción de una genoteca del ADN cromosómico del microorganismo productor de vancomicina, Amycolatopsis orientalis, utilizando como vector de clonación el cósmido bifuncional para Streptomyces y Escherichia coli pKC505. El tamaño medio de los insertos del ADN cromosómico en dicho cósmido estaba comprendido entre 18 y 30 kb. Se generaron 3300 clones en la genoteca, por lo que teniendo en cuenta que el tamaño del genoma de este microorganismo está proximo a las 10 Mb, la representatividad lograda en la genoteca ronda el 99%. Para la localización de los genes implicados en la ruta de biosíntesis del antibiótico glicopeptídico vancomicina, se procedió al análisis de la genoteca mediante hibridación in situ. Para ello se utilizaron tres tipos de sondas, tanto homólogas como heterólogas. En primer lugar se utilizó una sonda de genes de biosíntesis de deoxiazúcares de antibióticos; en concreto, los genes mtmD y mtmE, implicados en las dos primeras reacciones de la ruta de biosíntesis del antibiótico antitumoral mitramicina. Las reacciones llevadas a cabo por los enzimas codificados por estos dos genes son comunes a la mayoría de las rutas de biosíntesis de deoxiazúcares presentes en antibióticos. La presencia del deoxiazúcar L-vancosamina en la molécula de vancomicina justificaba por tanto la utilización de este tipo de sondas. La segunda sonda utilizada estaba implicada en sistemas de tipo ABC, implicados en exportación y resistencia a antibióticos en los microorganismos productores. Esta sonda se amplificó mediante PCR a partir del ADN cromosómico del microorganismo productor de vancomicina. Finalmente, se utilizó como sonda la glicosiltransferasa implicada en la transferencia del deoxiazúcar 4-oxovancosamina al glicopéptido balhimicina. Usando estos tres tipos de sondas, se localizaron en la genoteca tres cósmidos. Dentro del inserto de uno de los cósmidos así localizados, se clonaron y secuenciaron dos fragmentos Bg/II que se expandían aproximadamente 14 Kb en el inserto del cósmido. La secuencia así obtenida se comparó con las existentes en bases de datos. De este forma, se localizaron once pautas abiertas de lectura. La secuencia de ellas obtenida mostró valores significativos de similitud con distintos genes implicados en las rutas de biosíntesis de distintos antibióticos. En concreto, se obtuvieron valores de similitud con enzimas implicadas en la biosíntesis e incorporación tanto de los deoxiazúcares de la molécula como del heptapéptido que forman la molécula de vancomicina. Se realizaron numerosos intentos de interrupción génica de alguno de los genes secuenciados utilizando las condiciones descritas en la literatura o modificaciones de ellas. No obstante, no se consiguió la transformación efectiva del microorganismo en ninguna de las condiciones usadas.

Autor: ALONSO SANTOS ANA M..
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: Las infecciones por patógenos oportunistas son un problema muy importante en el ambiente hospitalario. A partir de principios de los años 90, la especie bacteriana Gram-negativa Stenotrophomonas maltophilia ha emergido como un patógeno oportunista importante debido principalmente al fenotipo de multirresistencia que presenta. La baja susceptibilidad a agentes antimicrobianos en S. Maltophilia supone un riesgo importante, ya que una vez que se ha asentado la población resistente su erradiación mediante tratamiento antibiótico es extremadamente dificil. En la ultima decada la identificación y caracterización de sistemas de bombeo a llevado a considerar a estos como el mecanismos más importante de multirrersistencia en microorganismos Gram-negativos. Estos sistemas estan localizados en la envoltura celular y son los responsables del transporte de distintos compuestos, incluyendo antibióticos, desde el citoplasma hacia el medio externo. Esto implica que la actividad de los sistemas de bombeo produce niveles de resistencia elevados para diversos antibióticos. Estos son los resultados de la memoria de tesis: Se ha clonado y caracterizado el primer sistema de bombeo de drogas de S. Maltophilia, smeDEF(Stenotrophomonas multiple efflux). El funcionamiento de SmeDEF es dependiente de la fuerza motriz de protones y este presente en todos los aislados de S.maltophilia analizados. La expresión del sistema SmeDEF disminuye la sensibilidad a eritromicina, cloranfenical, quinolonas y tetraciclina, tanto en S. Maltophilia, como cuando se expresa en un huesped heterólogo como Escherichia coli. Se han identificado dos mecanismos de regulación de la expresión de smeDEF:1) represión de la transcripción por un posible regulador especifico y 2) regulación dependiente de la fase de crecimiento. Se ha identificado el posible represor transcripcional (smeT) del sistema smeDEF. SmeT muestra homología con proteinas represoras de transcripcion de la subfamilia TetR. La comparación de las secuencias smeT de S. Maltophilia D457 y su derivado multirresistente D457R ha permitido la identificación de una mutación puntual en el gen smeT del mutante multirresistente. Esta mutación es posiblemente la responsable de la desrepresión de smeDEF en el mutante multirresistente. La sobreexpresión de SmeDEF en aislados clínicos de S. Maltophilia que muestran los valores de CMIs más elevados, indica que este sistema es un mecanismo importante en la adquisición del fenotipo de multirresistencia en esta especie bacteriana.

Autor: FERRERO GOMEZ LARA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CIB Y CNB.

Resumen: Para profundizar en la regulación transcripcional del gen ftsZ se han realizado dos tipos de abordaje experimental. Uno de ellos consistió en la búsqueda de nuevos reguladores en trans de ftsZ mediante la obtención de mutantes, por inserción en el cromosoma de un cassette de kanamicina mini-Tn10, que presentaban alteraciones de su expresión. Se obtuvieron trece mutantes de los que se incluye que existe una regulación de la expresión ftsZ dependiente de cAMP, una posible conexión entre división y el estado de aerobiosis de la bacteria y se apunta a la existencia de controles, para la expresión de ftsZ, provenientes del catabolismo de hidratos de carbono. Existen posibles proteínas de función desconocida implicadas en la regulación de ftsZ. El otro abordaje experimental realizado consistió en el estudio del posible papel del morfogen bolA como regulador transcripcional de ftsZ. Para ello se realizó un análisis del transcriptoma de Escherichia coli, mediante la tecnica de las matrices genicas (gene arrays), cuando se sobeexpresa bolA. De los resultado obtenidos se puede concluir que un aumento de la expresión de bolA, en fase exponencial, causa un cambio en el transcriptoma de E. Coli, donde bolA esta ejerciendo una regulación sobre 490 genes. Cuando se sobreexpresa bolA, en fase exponencial, se producen cambios en la expresión de genes implicados en la división (fsI) y en la sintesis del peptidoglicano(dacA y murI), pero no se observa una alteración significativa de la expresión de ftsZ.

Autor: SERAL GARCÍA CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA. ZARAGOZA.

Resumen: El aislamiento clínico del género Streptococcus hemos comprobado el incremento de la resistencia adquirida a macrólidos, de alto y bajo nivel, con fenotipo MLSb constitutivo en neumococos y estreptococos de los grupos C y G, y fenotipo M en S.pyogenes. En las cepas de S. Pneumoniae y S.pyogenes con fenotipo cMLSb, el gen erm(B) es el que codifica para la metiltransferasa, en tanto que en los aislamientos de estreptococos grupos C y G, el más frecuente es el gen erm(A). El gen mef(A), determinante de resistencia por eflujo, es el responsable fundamental del fenotipo M en el género Streptococcus. El gen mef(A), además de estar presente en S.pneumoniae y S.pyogenes, lo hemos encontrado en estreptococos del grupo viridans (S.mitis), estreptococos Beta-hemolíticos del grupo B (S.agalactiae) y enterococos (E.faecalis) lo que indica una distribución de este gen mucho más amplia de los que se había imaginado inicialmente. Hemos demostrado la coexistencia de varios genes de resistencia a macrólicos en cepas de neumococos y estreptococos grupos C y G son fenotipos cMLSb. En S.pneumoniae encontramos 10 asociaciones diferentes de determinantes de resistencia, predominando: erm(B), tet(M), catpc194 y erm(B), tet(M). Era muy frecuente la asociación de los genes erm(B) y tet(M) entre las cepas de los SG/STs 15 y 6A. En contraste, la mayoría de las cepas de S.pyogenes poseían el gen de resistencia mef(A) y no llevaban ningún determinante de resistencia asociado. En las cepas que poseen el gen erm(B) suele estar presente el gen intTn, confirmando que el vector es el transposón conjugativo Tn1545. Las cepas que contenían el gen mef(A), no tenían plásmidos ni transposones conjugativos de la familia Tn1545-Tn916. Este gen se asocia con elementos conjugativos localizados en el cromosoma. El gen erm(A), encontrado en estreptococos beta-hemolíticos de los grupos A. C y G se encontraba en la mayoría de las cepas sin ningún otro determinante de resistencia asociado y no reside en un transposón conjugativo de la familia Tn1545-Tn916, lo que parece confirmar su probable origen estafilocócico. La coexistencia de diferentes genes de resistencia en el mismo transposón conjugativo como sucede en S.pneumoniae es de gran importancia desde el punto de vista de la salud pública, puesto que el tratamiento antibiótico, con culquiera de los antibióticos a los que confiere resistencia el transposón, podría seleccionar cepas multirresistentes.

Autor: RUBIO HERRERO LUIS MANUEL.
Año: 1998.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En este trabajo se han estudiado diversos aspectos de la proteinanitrato reductasa asimilatoria y de la genética de la reducción del nitrato a nitrito en Synechooocus sp.PCC 7942, OBTENIENDOSE LAS las siguientes conclusiones. 1. Se han identificado todos los genes necesarios para la biosíntesis de Mo-molibdopterina (moaA, moaB, moaC, moaD, moaE, moeA y moeB y el gen mobA requerido para la biosíntesis del dinucleótido de molibdopterina y guanina (MGD). Los genes moaA, moaB, moaC, moaD Y moaE constituyen un operón. El gen moeA se encuentra agrupado junto al operón moa y se transcribe en sentido divergente a él. 2. El gen narB representa el gen estructural de la nitrato reductasa. Esta es la primera identificación inequivoca de un gen que determine una nitrato reductasa asimilatoria en bacterias. La secuencia de aminoácidos de la nitrato reductasa comienza en el residuo de metionina que ocupa la posición 15 del gen narB previamente descrito. 3. La nitrato reductasa contiene una agrupación sulfoférica que sugerimos que sea del tipo (3Fe-4S) con S= 5/2. El residuo de cisteína 56 parece estar implicado en la unión de este agrupamiento sulfofenico a la apoproteína. El resto de residuos necesarios para la coordinación de esta agrupación podría corresponder a las cisteínas que ocupan las posiciones 9, 12 y 16. 4. La nitrato reductasa contiene un cofactor de molibdeno del tipo MGD. Sugerimos que éste se encuentre en una forma bis-MGD donde el átomo de molibdeno estaría coordinado por seis átomos de azufre, cuatro procedentes de dos moléculas de MGD, uno podría pertenecer a un residuo de cisteína y el otro a un residuo de metionina (que podrían ser Cys-148 y Met- 149).

Autor: VALVERDE ALBACETE FEDERICO.
Año: 1998.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: Se ha estudiado el sistema formado por las enzimas gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas (GAPDH) en cianobacterias y microalgas como modelo en la bioenergética de la fotosíntesis. En cianobacterias se expresa mayoritariamente una enzima GAPDH2 anfibólica, tanto por su dependencia del cofactor nucleotídico (NAD ó NADP) como por su participación en rutas anabólicas y catabólicas, por lo que ha sido considerada como una nueva enzima por la IUBMB con el número de identificación EC 1.2.1.59. El gen gap2 que codifica esta enzima en la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC 6803 ha sido clonado por complementación funcional de un mutante gap-de E. coli, siendo la primera vez que esta estrategia se emplea con un gen implicado en la asimilación fotosintética del carbono. Su expresión es máxima en autotrofía y mínima en heterotrofía. En la microalga Chlorella fusca se encuentran tres enzimas GAPDH diferentes, dos fosforilantes (una en el cloroplasto y la otra en el citosol) y una no fosforiante citosólica. La utilización de los genes clonados y de anticuerpos monoespecificos en experimentos de "Northern" y "Western blot" ha mostrado que la enzima fosforilante cloroplástica desaparece virtualmente en presencia de glucosa en luz pero no en oscuridad, mientras que las otras dos enzimas se expresan en grado máximo en condiciones mixo-y heterotróficas. El gen que codifica la enzima GAPDH no fosforilante de guisante se ha clonado y la proteína se ha expresado en la enterobacteria E. coli, demostrándose así la funcionalidad de una posible ruta glicolítica no fosforilante sin rendimiento energético neto, que podría ser operativa en eucariotas fotosintéticos (microalgas y plantas).

Autor: CUTRIN LOBATO JUAN MANUEL.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La existencia de reservorios de diverso tipo en las proximidades de las piscifactorías en las que se ha detectado el virus IPN nos ha hecho pensar en la posible implicación de dichos reservorios. Por ello, se ha llevado a cabo un estudio en el que se han comparado más de 300 cepas de virus IPN, incluyendo cepas de referencia y aislados gallegos obtenidos a partir de reservorios y de piscifactorías. Este estudio comparativo se ha realizado a distintos niveles, comenzando con el estudio de los patrones electroforéticos del genoma de estas cepas, para el establecimiento de grupos de similitud; a partir de los 10 electroferotipos (en 6 electroferogrupos) establecidos se seleccionó una serie de cepas de diversos orígenes, cepas que se utilizarían en los siguientes niveles de comparación. Los estudios de infectividad in vitro e in vivo permitieron, por un lado comprobar la eficacia de la línea celular CHSE-214 para la detección de cualquiera de las cepas de IPNV, y por otro determinar la posible patogenicidad de algunas cepas de reservorios sobre especies de peces en cultivo; sin embargo, la comparación a este nivel no permitió determinar la existencia de una relación clara entre cepas de ambos orígenes. Mediante la utilización de antisueros específicos comprobamos que si bien algunas de las cepas ensayadas podían ser serotipadas como tipo Sp y una de tipo WB, la mayor parte de las cepas ensayadas dieron relaciones serológicas cruzadas con más de uno de los antisueros, no pudiendo llegar a una conclusión clara sobre la relación serológica entre cepas. Mediante el análisis de mapas de restricción, sin embargo, sí se han podido establecer grupos de similitud entre las cepas ensayadas, encontrando, en varios casos, una alta homología entre cepas aisladas de reservorios y de alguna piscifactorías del mismo área. Estas mismas similitudes se han observado mediante la comparación de las secuencias genómicas de ambos segmentos. De este modo, mediante ambas técnicas hemos demostrado que los reservorios de diverso tipo pueden ser causantes, por dispersión del virus, de las epizootias detectadas periodicamente en algunas piscifactorías de áreas relacionadas.

Autor: LABRADA MOREDA LUCIA.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Los reovirus aviares son los agentes responsables de diversas patologías en aves de granja, fundamentalmente la artritis aviar o tenosinovitis infecciosa, enfermedad que causa importantes pérdidas económicas en las granjas avícolas. A diferencia de sus homólogos de mamífero, cuya bioquímica y biología molecular se han estudiado en profundidad, se desconocen muchos aspectos básicos de la biología de los reovirus de ave. En nuestro laboratorio se está llevando a cabo una caracterización bioquímica profunda de los reovirus aviares con el propósito de prevenir y combatir en el futuro las enfermedades provocadas por estos virus. Diversas investigaciones indican que los reovirus de mamífero provocan la muerte por apoptosis de las células infectadas. En este trabajo se demuestra que, al igual que sus homólogos de mamífero, los reovirus de ave activan la maquinaria apoptótica de los fibroblastos embironarios de pollo. Nuestros resultados demuestran que la inducción de apoptosis muestra una estrecha dependencia tanto del tiempo como de la multiplicidad de infección e indican, asimismo, que la activación de la maquinaria apoptótica se produce antes de que comience la expresión de los genes virales. Por otra parte, nuestros resultados muestran que las proteínas no estructurales del virus no se encuentran implicadas en la activación del proceso de muerte celular programada. Una de las características que distinguen a los reovirus de ave de los de mamífero es que los primeros inducen la formación de sincitios en las células infectadas. La inducción de fusión celular es un fenómeno inusual entre los virus carentes de envoltura lipídica y por el momento se encuentra muy poco caracterizado. En la segunda parte de este trabajo pretendíamos aportar nuevos datos acerca de los mecanismos que gobiernan la formación de sincitios inducida por la infección con el reovirus aviar S1133. Nuestros resultados demuestran que la expresión intracelular en diversas líneas eucariotas del polipéptido p10, codificado por la primera pauta abierta de lectura del segmento genómico S1, induce fusión celular. Pese a que, por el momento, no hemos podido determinar si este polipéptido se expresa en el interior de los fibroblastos embrionarios de pollo infectados con el reovirus aviar S1133, nuestros datos sugieren que p10 juega un papel muy importante en la formación de sincitios inducida por la infección viral.

Autor: GRANDE PEREZ ANA .
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: Los reovirus aviares son los agentes responsables de numerosas patologías en aves entre las que destaca la artritis aviar o tenosinovitis infecciosa, enfermedad que provoca grandes pérdidas económicas en la industria avícola. A pesar de su gran interés como patógenos poco se conoce sobre los aspectos básicos de su biología. En nuestro laboratorio se está llevando a cabo una caracterización bioquímica profunda de los reovirus aviares con el propósito de que en un futuro podamos prevenir y combatir las enfermedades que estos virus provocan. En este trabajo de Tesis Doctoral se han optimizado las condiciones de manipulación de los reovirus aviares en el laboratorio. Para ello, hemos estudiado los distintos parámetros que afectan tanto al crecimiento como a la purificación de los reovirus aviares. Nuestros resultados muestran que las condiciones óptimas para el crecimiento del reovirus aviar S1133 en monocapas de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF) implican el infectar con una moi de 0,1 ufp/cél, realizar la adsorción a 37grados. C durante 90 min, incubar con medio 199 suplementado con 2,5% de suero fetal de ternera (FCS) y recoger las células a las 28 hpi. A continuación hemos analizado la estabilidad de la partícula viral encontrando que estos virus son inestables por encima de los 30 grados C y que las sales ayudan a preservar la integridad y la infectividad del reovirus aviar. En cuanto al almacenamiento del reovirus aviar hemos demostrado que la congelación y descongelación, el pH ligeramente ácido y el glicerol provocan la pérdida de infectividad del virus. En la segunda parte de este trabajo hemos estudiado la interacción del reovirus aviar S1133 con CEF. Nuestros estudios demostraron que la proteína C, constituyente de la cubierta externa viral, es la proteína viral responsable de la interacción inicial del virus con los receptores de fibroblastos embrionarios de pollo. También hemos demostrado que la proteína C presente tanto en el virus como en el citoplasma de células infectadas es un oligómero y su estructura oligomérica es imprescindible para su función de unión a los receptores celulares. Nuestros resultados sugieren que cada oligómero se compone de tres unidades monoméricas. Además hemos visto que la unión del reovirus aviar o de la proteína C a fibroblastos embrionarios de pollo es específica y saturable. Los oligómeros de la proteína C se encuentran estabilizados por interacciones hidrofóbicas y son altamente resistentes a la temperatura y a la degradación proteolítica. La oligomerización de la proteína C a partir de las subunidades monoméricas se produce sin la participación de otras proteínas virales. Este proceso sucede post-traduccionalmente y comienza a través del extremo amino terminal de C que es fundamental para la oligomerización de la proteína. La deleción de 5 aminoácidos del extremo carboxilo terminal del polipéptido C no impide su oligomerización pero desestabiliza la estructura oligomérica. Por último hemos estudiado la interacción del reovirus aviar con CEF desde el punto de vista celular encontrando que en fibroblastos embrionarios de pollo existen aproximadamente 1,8 x 10 elevado a 4 lugares receptores por célula para el reovirus aviar S1133 y 2,2 x 10 elevado a 5 unidades receptoras por célula para la proteína C y que el receptor celular del reovirus aviar en CEF es de naturaleza proteica; los azúcares y fosfolípidos no parecen estar implicados en el reconocimiento del virus por el receptor.

Autor: JUNQUERA LOPEZ SONIA M..
Año: 1998.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: A partir del genoma de Lactobacillus plantarum ATCC 10241 se han clonado dos genes codificadores de actividad nucleasa en Escherichia coli (lpnC y lpnP). El análisis de dichos genes permitió comprobar que, mientras lpnC es de origen cromosómico, lpnP es un gen plasmídico. Ambos genes se han secuenciado, realizándose posteriormente estudios estructurales, incluyendo mapeo del sitio de inicio de la transcripción y ensayo de su producción in vivo. También se han realizado estudios funcionales tanto en E. coli como en la cepa productora. Se obtuvo mediante curación una cepa derivada de L. plantarum ATCC10241 carente del plásmido codificador de lpnP. A partir de ella se realizaron estudios para comparar la actividad nucleásica relativa de ambas cepas.

Autor: YIM LEONE LUCIA.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: En este trabajo se ha profundizado en el estudio de la relación entre estructura y función de la proteína FtsA, integrante del septosoma en E. coli. Mediante el sistema del doble híbrido de levaduras, se ha determinado una auto-interacción de esta proteína in vivo, la cual requiere de la integridad del extremo C-terminal de la molécula. Formas derivadas de FtsA, en las cuales se han deleccionado algunos residuos del C-terminal son incapaces de interaccionar eficientemente con la forma intacta, y a la vez tienen afectada su funcionalidad eficientemente con la forma intacta, y a la vez tienen afectada su funcionalidad biológica y su actividad ATPasa in vitro. Las formas truncadas de FtsA si bien son capaces de interaccionar con la proteína FtsZ, otro integrante esencial del septosoma de E.coli, no se localizan en el anillo septal, lo cual indica que deben existir señales adicionales para la localización de FtsA en el septo. Se postula que la oligomerización sería un mecanismo de regulación negativa de la actividad de la proteína, de manera que las formas oligoméricas serían inactivas para la septación.

Autor: MACHADO RODRIGUEZ GLORIA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este estudio se logró la infección por b.infantum en Hamster (mesocrisetus auratus) y ratón Balb/c. Secaracterizó la respuesta humoral frente a las proteínas KMP11, PSA, gp63, Hsp70, Hsp83, LiP2a, LiP2b, H2A, Proteína Toatal (PT) y proteína Quimera (Q). Se determinó la víade inoculación y el número mínimo de parásitos para lograr infección estable en raton Balb/c (10 elevado a 5 promastigotes/animal) y muerte del huésped en hamster (10 elevado a 3 prom/animal). Se ensayaron las proteínas de fusion Hsp70-KMP11, Hsp70-PSA y Hsp70-gp63; la mezcla de las proteínas Hsp70,gp63,KMP11 y PSA y la proteína Q como vacuna multicmponente y se encontró que en todos los casos hubo reducción significativa de la parasitación tanto en hígado como en bazo (hamster) y también en médula ósea (ratón). Además en hamster se observ una reducción en el daño de los tejidos de los órganos como bazo, hígado y riñon por análisis de anatomía patológica. De los estudios de marcaje metabólico se encontraron diferencias de expresión entre los promastigotes de las cepas LEM75 (no infectiva) y BCN150 (infectiva). También se vieron diferencias en la inmunolocalización de las proteínas Hsp83, KMP11 y PSA en las formas amastigote y promastigote de los parásitos, con la proteína Hsp70 no se observaron diferencias. Además se postula la proteína Q como marcador de enfermedad y la proteína KMP11 como marcador de infección o presencia de parásito.