INGENIERIA GENETICA

Autor: SÁNCHEZ GARCÍA JULIO CÉSAR.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FAC. CIENCIAS.

Resumen: En el presente trabajo se obtuvieron los Interferones (IFNs) alfa 2b Humano y el alfa 8b Humano por vía recombinante usando Escherichia coli como hospedador bacteriano. Se demostró la alta calidad y homogeneidad molecular de ambas preparaciones proteicas. El primero de los subtipos de interferones ya se usa en la actualidad para tratar diversas enfermedades en humanos. Por último, se demostró la superioridad como agente antiviral en un sistema "in vitro" del IFN alfa 8 Hu-rec al compararlo con el IFN alfa 2b Humano-rec.

Autor: SALINAS BERNÁ PALOMA.
Año: 2003.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALICANTE.

Resumen: El sistema de dos componentes NtrB-NtrC, implicado en la regulación del metabolismo del nitrógeno en enterobacterias, se ha utilizado ampliamente como modelo en el estudio de la transducción de señales en bacterias. En la presente Tesis Doctoral se aportan nuevos datos sobre su funcionamiento, a través del análisis de las interacciones proteicas que tienen lugar entre dominios de las proteínas NtrB y NtrC, y entre NtrB y otras proteínas de la ruta de transducción de señales de nitrógeno. Los resultados obtenidos, que suponen la primera aplicación del sistema del doble híbrido de levaduras en la caracterización de interacciones físicas entre proteínas implicadas en transducción de señales bacterianas, confirman la utilidad de esta herramienta genética en el estudio de reguladores procarióticos y de las interacciones intra e intermoleculares en las que participan. El potencial demostrado por el sistema del doble híbrido fue aprovechado para la identificación de nuevas proteínas implicadas en transducción de señales de nitrógeno mediante la construcción y escrutinio de genotecas genómicas, obtenidas por restricción parcial con Sau3AI de genoma de Escherichia coli. Como cebo se utilizaron las proteínas NtrB y GlnB. La disponibilidad de la secuencia genómica completa de este organismo modelo y la gran cantidad de información obtenida sobre el comportamiento en el doble híbrido de las proteínas utilizadas como cebo, permitió predecir algunos resultados. Los clones identificados en los escrutinios confirmaron interacciones funcionales conocidas e identificaron nuevas interacciones no descritas con anterioridad, contribuyendo a la construcción de un "interactoma del nitrógeno" en enterobacterias. Estos resultados se discuten en relación a la calidad y representatividad de las genotecas obtenidas, y a la utilidad de la herramienta genética utilizada en este estudio.

Autor: CARACUEL RÍOS ZAIRA.
Año: 2003.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.

Resumen: Fusarium oxysporum es un hongo patógeno que origina marchitez vascular en gran variedad de especies cultivadas, causa importantes pérdidas en la economía mundial y está presente en la mayoría de suelos cultivados. La especie infecta a sus huéspedes penetrando a através de sus raíces y extendiéndose hacia arriba por el sistema vascular. A pesar de los numerosos estudios ultraestructurales, bioquímicos y genéticos se desconoce en gran medida del mecanismo de patogénesis y de inducción de los sintomas producidos por el hongo. Hay muchos microorganismos que viven en ambientes con pHs variables, para evitar derroches energéticos, estos organismos disponen de un sistema que les permite sintetizar determinadas moléculas (enzimas, metabolitos primarios y secundarios, etc.) únicamente cuando el rango de pH externo es adecuado para su funcionamiento. En los hongos la expresión génica por el pH ambiental se encuentra regulada por una cascada de señalización altamente conservada cuyo componente final es el factor de transcripción PacC. Hemos identificado el ortólogo de PacC de F.oxysporum que se une a la secuencia consenso 5'-GCCAAG-3' y se procesa proteolíticamente de manera similar a PacC de Aspergiulls nidulans. En F.oxyporum los niveles de transcripción de PacC son elevados en condiciones alcalinas y casi imperceptibles en condiciones ácidas. Un mutante nulo de pérdida de función PacC+/- muestra un fenotipo de mímesis de acidez, con una baja tasa de crecimiento a pH alcalino, mayor secreción de proteasas ácidas, mayor sensibilidad al H2O2 y a la neomicina y sobreexpresión de genes responsables de endo-poligalacturonasas. La complementación del mutante nulo con una copia del alelo silvestre restaura el fenotipo del silvestre. Un mutante dominante activo muestra un fenotipo de mímesis de alcalinidad, menor secreción de proteasas alcalinas y fosfatasas alcalinas, así como mayor resistencia al H2O2 y a la neomicinal. El mutante nulo PAcC+/- muestra un leve incremento en la virulencia, mientras que plantas infectadas con el mutante dominante activo PacCc muestran un retraso significativo en los síntomas típicos de la infección. Por tanto, PacC funciona como un regulador negativo de la virulencia en F.oxysporum, probablemente prviniendo la expresión de genes ácidos importantes para la infección. Asimismo, hemos caracterizado otros genes regulados por PacC y por el pH ambiental, e implicados en la adaptabilidad de Fusarium al medio. Entre los genes regulados por PacC se encuentra ena1 responsable de una ATPasa de Na+ implicada en la expulsión de iones y el establecimiento del equilibrio homeostático. PacC juega un papel esencial en la tolerancia iónica de F.oxysporum, ya que el mutante nulo PacC+/- resulta ser altamente sensible al Na+ y al Li+, por el contrario, el mutante dominante activo PacCc muestra mayor resistencia a elevadas concentraciones de dichos iones. También se ha aislado el gen gas1, implicado en la biogénesis de la pared celular, una barrera esencial en la interfase hongo-planta. Gas1 juega un papel importante en la patogénesis, ya que en el mutante nulo se produce una reorganización de la pared celular que afecta a la capacidad de infectat a la planta.

Autor: CEJAS GUERRERO PALOMA .
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS (ALBERTO SOLS) CSIC-UAM.

Resumen: El Análisis Seriado de la Expresión Génica (SAGE) es una técnica que permite la identificación de genes expresados diferencialmente sin restricciones de ningún tipo. La aplicación de esta técnica para estudiar el efecto del TNFalfa en células N2A ha permitido encontrar que el gen que codifica la Glutatión peroxidasa de fosfolípidos (PH-GPx) se activa tras el tratamiento. Esta es la única enzima capaz de reducir directamente los hidroperóxidos de los lipidos de membrana. En esta tesis se ha clonado una región de este gen con actividad promotora, pero no se ha conseguido demostrar que se active diferencialmente tras el tratamiento con TNFalfa, aunque sí se activa por presencia de suero, lo que sugiere una regulación post-transcripcional del mRNA Ensayos de Run On han descartado una activación transcripcional por el tratamiento con TNFalfa, confirmando, por tanto, la hipótesis de regulación post-transcripcional. Debido a la gran importancia que tiene los hidroperóxidos de lípidos en el control de la producción de mutaciones y en el control de la apoptosis, se decidió estudiar el efecto de este gen en una serie de tumores humanos de mama, encontrándose que la expresión de este gen se reprime en los tumores frente a los tejidos no tumorales y que la represión se correlaciona negativamente con el grado de diferenciación tumoral.

Autor: INIESTA MARTÍNEZ ANTONIO ÁNGEL.
Año: 2002.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En este trabajo, se demuestra (mediante su expresión en E.coli) que los productos de los genes orf1 y orf3 del operón carB de M.xanthus son una enzima sintetasa de geranilgeranil pirofosfato y una enzima sintetasa del fitoeno, respectivamente. Por su función demostrada y por su secuencia similar a proteínas de otras bacterias, el gen orf1 y su producto Orf1 pasan a denominarse crtE y CrtE, respectivamente, y el gen orf3 y su producto crtB y CrtB, respectivamente. Por otro lado, datos previos habían demostrado que, en M.xanthus, la deshidrogeneración del fitoeno hasta licopeno, vía fitoflueno, dseta-caroteno y neurosporeno, era llevada a cabo conjuntamente por dos deshidrogenasas que están determinadas por el gen orf2, del operón carB, y por el gen crtI. En este trabajo se ha avanzado en el estudio de las acciones concretas de dichas enzimas en el proceso de deshidrogenación, principalmente por expresión heteróloga de los genes orf2 y crtI en estirpes de E.coli productoras de carotenos parcialmente deshidrogenados. Se concluye, con dichos experimentos, que la proteína Irf2 realiza la isomerización del cis-fitoeno a trans-fitoeno y las dos primeras deshidrogenaciones que transforman el trans-fitoeno en dseta-caroteno. La proteína CrtI es capaz de deshidrogenar el dseta-caroteno hata licopeno. También se concluye que el reconocimiento de Orf2 y CrtI por su sustrato depende más de la conformación estereoespecífica del mismo que de su grado de deshidrogenación. Se propone el nombre de CrtIa para la deshidrogenasa Orf2 y CrtIb para la anterior deshidrogenasa "CrtI". Por otro lado, datos previos indicaban que la enzima de M.xanthus capaz de ciclar sólo uno de los extremos del licopeno, produciendo gamma-caroteno, estaba formada por un heterodímero constituido por una molécula de Orf7 y otra de Orf8, productos de los genes orf7 y orf8, respectivamente, del operón carA. Sin embargo, todas las enzimas ciclasas de licopeno conocidas de otros organismos ciclan ambos extremos del licopeno convirtiéndolo en beta-caroteno. En este trabajo, se han fusionado traduccionalmente los genes orf7 y orf8, pero intercalando entre ellos una secuencia de DNA que determina una hélice transmembranal. La expresión de dicha fusión en E.coli productora de licopeno demuestra que esta modificación convierte a la enzima monociclasa original en una enzima biciclasa productora de beta-caroteno. También se asigna los nombres de crtYc y crtYd a los genes orf7 y orf8, respectivamente. Por último, se han obtenido cepas de E.coli productoras de carotenos, como licopeno, gamma-caroteno, que pueden responder a cambios en las condiciones de cultivo aumentando su producción. Dichas cepas son candidatas a incorporarse en el creciente mercado de la biotecnología en la producción de carotenos, y poder dar solución a la demanda del uso de carotenos en alimentación animal, complementos nutricionales, con fines farmacéuticos debido a sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas y un largo etcétera.

Autor: ARÍS GIRALT ANNA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Los últimos avances en biología molecular y celular no tan solo han contribuido al conocimiento de la base molecular de muchas enfermedades, sino que también han proprocionado una tecnología con el potencial para manipular genes in vivo. Así pues, la Terapia Génica surge como una estrategia terapéutica basada en la transferencia de material genético para el tratamiento de enfermedades de origen genético o infeccioso, substituyendo, reparando o potenciando la función biológica de los tejidos o sistemas lesionados. Los principales estudios en esta línea de investigación van dirigidos al desarrollo de vectores eficientes en la transferencia génica. En los últimos años, el uso de vectores no víricos en terapia génica ha ido tomando importancia, ya que aunque se ha demostrado que los vectores víricos son herramientas muy eficaces en la transferencia de DNA, presentan limitaciones asociadas tales como la difícil obtención de títulos elevados de partículas víricas, la inducción de respuestas inmunológicas y riesgos de seguridad biológica como la mutagénesis insercional y la posible reversión a vectores recombinantes competentes en replicación. Es muy importante mantener en el uso de sistemas no víricos procedimientos de transferencia génica mediada por receptor para dirigir el proceso de internalización celular eficientemente y asegurar la especificidad para un tipo celular diana. Las proteínas quiméricas recombinantes son candidatos muy interesantes en la transferencia génica no vírica. La generación de estos vehículos ha sido poco explorada dentro de la terapia génica y se basa en la combinación de diversas proteínas o dominios proteicos bioactivos en una sola cadena polipeptídica. Estas regiones heterólogas combinadas, aportan la capacidad de unir moléculas de DNA; el reconocimiento y la internalización celular y posibles funciones potenciadoras de la transferencia celular tales como la lisi de endosomas y el transporte nuclear. Los sencillos procesos de producción y purificación a gran escala junto con su naturaleza modular, hacen que sean vehículos que pueden ser fácilmente optimizados y adecuados a nuevas aplicaciones de terapia génica y con un elevado potencial como vectores alterantivos a los sistemas víricos. En esta Tesis Doctoral se han desarrollado una serie de proteínas quiméricas prototipo, basadas en el enzima beta-galactosidasa de Escherichia coli, que presentan en su superficie una cola de lisinas como dominio de unión a DNA y la región de reconocimiento celular del virus de la fiebre aftosa basada en motivos RGD. Además, el enzima beta-galactosidasa actúa como dominio de purificación de la construcción resultante y permite su detección y cuantificación mediante ensayos colorimétricos sencillos. La presencia de forma natural en este enzima de una señal de localización nuclear críptica permite a estas proteínas dirigir eficientemente la transferencia de DNA a células de mamífero. La primera construcción obtenida fue la proteína 249AL y se demostró que era capaz de unir y condensar DNA y que dirigía específicamente, mediante el reconocimiento de la integrina celular alfavbeta3, su transferencia en cultivos celulares. Tras la optimización del proceso de transferencia in vitro, se realizaron aproximaciones in vivo inyectando complejos ADN proteína intracerebralmente en ratas postnatales P9. Los resultados mostraban que la proteína 249AL es un prototipo de vector alternativo al uso de vectore víricos en el SNC, especialmente en aplicaciones terapéuticas a zonas lesionadas en las que existe un incremento en la expresión de los genes de las integrinas alfavbeta3. Derivados de la proteína 249AL como la proteína NLSCt demuestran que mediante la incorporación de nuevos dominios tales como otras SLN, como la del Antígeno-T de SV40, se pueden obtener niveles de expresión génica más elevados. Estos resultados invitan a profundizar en la aproximación modular al diseño de vectores recombinantes para terapia génica.

Autor: BRUNA CABOT ALEJANDRA.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: IRBB/PCB.

Resumen: Los resultados realizados en este trabajo sugieren la implicación de las proteínas inhibidoras del ciclo celular (921 waf1 y p27 kip1) en el mecanismo de inhibición de la JNK por desametasona a tiempos largos de tratamiento con la hormona. En experimentos de ensayo de actividad JNK in vitro se ha comprobado que tanto la proteína recombinante GST-p21 waf1 como GST-p27 kip1, inhiben, de manera dosis dependiente, la activación de la JNK. También se demuestra que la concentración de dex necesaria para transreprimir y para inhibir a la JNK es la misma y de un orden de magnitud inferior a la necesidad para activar la expresión de sus genes diana. Para estudiar en mayor profundidad el mecanismo molecular por el que un tratamiento corto con GCs inhibe la activación de la JNK, analizan el efecto de dex en la integridad de los complejos MKK7 y JNK. De acuerdo con resultados previos, la JNK se encuentra en complejos jutnoa la MKK7 y un tratamiento corto con dex claramente reduce la cantidad de MKK7 unida a JNK. En una aproximación experimental similar, la disociación entre JNK y MKK7 inducida por dex se correlaciona con la inhibición de la JNK mediada por sobrexpresión de MKK7. Posteriormente, utilizando un mutante del GR (GR NL1-) que es incapaz de acumularse en el núcleo en respuesta a hormona, demuestran que la inhibición de la JNK por GCs tiene lugar en el comportamiento citoplasmático y sugieren que la disociación entre MKK7 y JNK inducida por dex es suficiente para la inhibición de la ruta de la JNK, mientras que la acumulación nuclear de JNK puede ser dispensable para esta determinada acción. Asimismo, demuestran que existe una interacción entre la JNK y GR inducida por hormona. Haciendo uso de otros mutantes como el GR dim y una construcción que contiene 25 amino ácidos de la región visagra y todo el dominio de unión a ligando (GR-LBD), y de análogos de glucocorticoides (ZK07, ZK57, RU486), demuestran que la capacidad de inhbición de la JNK por GCs está mediada por la interacción JNK/GR y que dicha interacción es necesaria para la translocación de la JNK inactiva al núcleo inducida por GCs.

Autor: PARRA BOLA M. ISABEL.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: El sistema de activaicón del plasminógeno es el proceso mediante el cual el zimógeno inactivo plasminógeno es convertivo en su forma activa plasmina por acción de dos proteasas extracelulares que actúan como activadores específicos, el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa o uPA y el de tipo tisular o tPA. La generación de plasmina está regulada negativamente a nivel de los activadores por acción de inhibidores específicos de los activadores del plasminógeno, o PAIs, y a nivel de la propia plasmina por la alfa2-antiplasmina. Está descrito que la proteolisis pericelular mediada por plasmina juega un papel importante de la invasión tumoral y la metástasis. De hecho, se ha observado una expresión elevada de algunos de los componentes del sistema, como uPA y PAI-1, en células tumorales y/o en el estroma que las rodea, siendo considerados factores de mal prognóstico. Este hecho nos ha llevado a plantear si en el contexto de una célula normal, no tumoral, su expresión pudiera estar modulada por el tratamiento con agentes genotóxicos ambientales, conocidos inductores de carcinogénesis. En esta tesis demostramos, en primer lugar, que la radiación UV y el agente alquilante MNNG inducen la expresión del gen uPA a través de un mecanismo transcripcional, siendo un elemento enhancer de tipo AP1 localizado a -2.4 kb del sitio de inicio de la transcripción del promotor de uPA, el responsable de dicha inducción. Además, hemos determinado que la vía de señalización de JNK (y no ERK o p38) es la responsable de la activación transcripcional de uPA en respuesta a ambos agentes. En segundo lugar, hemos demostrado que, al igual que uPA, su inhibidor fisiológico PAI-1 también es inducido en respuesta a MNNG. La inducción de la expresión de PAI-1 por MNNG se produce también a través de un mecanismos transcripcional, requiriéndose la presencia de un elemento de respuesta a p53 localizado a -136 pb del sitio de inicio de la transcripción del promotor del gen PAI-1. Además, hemos demostrado que MNNG induce la fosforilación de p53, así como en la activación transcripcional de PAI-1 y que las quinasas ATM y ATR median de manera secuencial la fosforilación de la serina 15 de 953 y, consecuentemente, la inducción del gen endógeno PAI-1 por MNNG. Finalmente, hemos demostrado que MNNG es también capaz de inducir la fosforilación de p53 en las serinas 33 y 46, cooperando ambas modificaciones en la activación transcripcional de PAI-1 en respuesta al alquilante.

Autor: OYA APONTE RICARDO.
Año: 2002.
Universidad: JAEN.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS EXPERIMENTALES.

Resumen: La infección por VIH-1 (vivos causante del SIDA), actualmente puede ser tratada mediante fármacos anti-retrovirales. Sin embargo un pequeño número de vivos permanece esondido dentro de células, en un estado de latencia que pueden originar rebrotes de la infección. Para intentar eliminar estos provinus, hemos diseñado un vector retroviral basado en el VIH-1 que, en cottivo, ha demostrado su capacidad para detectar y eliminar células infectadas con esto sprovirus latentes, dejando intactas a las células sanas.

Autor: ZARATIEGUI BIURRUN MIGUEL ANGEL.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: La transferencia genica al músculo es una de las estrategias de terapia genica de mayor aplicabilidad hoy en día. El vector más prometedor para esta aplicación son los virus recombinantes adeno-asociados. Sin embargo su uso no esta exento de dificultades: la producción es difícil y el producto final está frecuentemente contaminado con adenovirus. Hemos desarrollado un sistema de complementación que hace uso del sistema cre-loxp para volver al adenovirus inempaquetable reduciendo asi su titulo en la preparación de rAAV. Hemos comparado la eficiencia y la duración de la expresión de los RAAV producidos con este protocolo con las de otros dos vectores de transferencia genica al músculo: el DNA-PVP y los híbridos HVJ-liposomas. Los resultados demuestran que la eficiencia de los RAAV aumenta con el tiempo llegando al máximo entre 8 y 16 semanas tras la inyección en músculos, tibialis anterior del ratón, mientras que el DNA-PVP tiene un máximo de expresión la primera semana tras la inyección. Los HVJ-liposomas mostraron eficiencias inferiores durante todo el estudio. Para comprobar la eficacia terapeutica de estos vectores in vivo utilizamos el modelo de cirrosis por inhalación de CCL4 e inyección de un AAV que codifica la IGF1 de rata. La inyección intramuscular de AAVIGF1 no produjo efecto terapéutico en las ratas cirroticas? Quedando su efecto recluido en el tejido inyectado y provocando hipertrofia muscular.

Autor: GIMÉNEZ CAMINERO ESTELA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: El objetivo principal de esta tesis es el estudio del papel de la tirosinasa en el desarrollo de la retina de ratón. Para cumplir este objetivo se ha generado un sistema de expresión génica inducible por doxiciclina en ratones transgénicos con el que regular, temporal y espacialmente, la expresión del gen de la tirosinasa de forma reversible. Estudios posteriores con este sistema permitirán evaluar si la activación del gen de la tirosinasa en ratones albinos supone variaciones fenotípicas en la retina de los ratones. Por otro lado, se analizó el papel de la región controladora de locus (LCR) del gen de la tirosinasa en el desarrollo de la retina de ratón utilizando como herramienta ratones transgénicos que carecen de dicha LCR. Estos estudios demostraron que dicha LCR es necesaria para el adecuado establecimiento y manteniemiento del dominio de expresión del gen de la tirosinasa a lo largo del desarrollo embrionario. Su ausencia provoca un retraso temporal en la iniciación y acumulación de pigmento en el epitelio pigmentado de la retina (RPE) durante el desarrollo. Análisis morfológicos de estos mismos ratones que carecen de la LCR del gen de la tirosinasa, en cuyas retinas conviven pigmentadas y células albinas, indicaron que las interacciones puntuales que se producen entre las células del RPE y la neuroretina de ratón en desarrollo, que son críticas para el desarrollo de la retina, son de tipo local y no de tipo global. Por último, se dilucidó el patrón de expresión del gen de la tirosinasa en etapas embrionarias mediante métodos directos de detección de expresión génica (Hibridaciones in situ), demostrando que el patrón de expresión del gen de la tirosinasa en ratón se restringe al epitelio pigmentado de la retina en estadios tempranos del desarrollo embrionario.

Autor: CAÑESTRO GARCÍA CRISTIAN.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE GENÉTICA.

Resumen: Este Tesis trata sobre las implicaciones funcionales y evolutivas de la expansión de la familia de las alcohol deshidrogenasas durante la evolución de los cordados. Hemos caracterizado el gen alcohol deshidrogenasa clase 3 (Adh3) en dos especies de cefalocordados (Branchiostoma floridae y Branchiostoma lanceolatum) y una especie de Urocordados (Ciona intestinalis) como el único miembro de esta familia génica en organismos procordados. Nuestros resultados sobre la caracterización de las constantes cinéticas, estructuras génicas, posición cromosómica, análisis evolutivos moleculares, actividades bioquímicas y patrones de expresión de los miembros de esta familia a lo largo de la historia animal, apoyan firmemente que la expansión de esta familia se produjo hace 500 millones de años dentro del linaje de los vertebrados, probablemente después de la separación de lo agnatos, por un fenómeno de duplicaciones génicas en tándem. Además, fruto de este estudio se ha podido estimar por primera vez el tiempo de especiación de dos cefalocordados en 190 millones de años durante el Jurásico superior. Por otro lado, nuestros resultados de análisis Southern sobre la Adh3 en cefalocordados y por SP-PCR, ha revelado la existencia de un elevado polimorfismo, el cual por vez primera se ha relacionado con la existencia de una gran cantidad de DNA repetido -VNTRs y elementos móviles-. Entre el DNA repetido en tándem hemos descrito un nuevo tipo de minisatélites, (Miratges) que se caracterizan por tener una unidad de repetición que se expande sobre la frontera exón-intrón. Además, la descripción de la inestabilidad de tamaño en los VNTRs intrónicos y la demostración de que existen alelos recombinantes de forma somática, hace que los cefalocordados se muestren en este sentido como animales mosaicos. Asimismo, la descripción del amphiEXE, el primer putativo elemento no autónomo descrito en estos organismos, permite asociar los este tipo de elementos repetidos disperso por el genoma, como una fuente adicional de variabilidad genética. Finalmente, y dento del proyecto de caracterización de las regiones reguladoras de los genes Adhn esta familia, ha revelado la existencia de actividad beta-galactosidasa endógena en cefalordados, la cual a su vez se ha mostrado como un potente marcador histoquímico del sistema digestivo de estos organismos.

Autor: NEGREDO ANTÓN ANA ISABEL.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El aumento de la incidencia de las infecciones causadas por C. Albicans así como la gravedad de estas en pacientes inmunocomprometidos ha hecho necesario abordar el carácter patógeno de esta levadura dimórfica desde nuevos planteamientos, como son los que aporta la Biología Molecular y la Genética. Para ello se requiere desarrollar herramientas que permitan manipular genéticamente este microorganismo, trabajo que comenzó a dar sus frutos en la década de los años 80, sin embargo, hoy se siguen desarrollando y mejorando dichas herramientas por presentar C. Albicvans determinadas características genéticas y que dificultan su manipulación a este nivel. Para la caracterización de los distintos procesos celulares es preciso, entre otras herramientas, construir cepas con marcadores genéticos obtenidas mediante interrupción génica así como mejorar los vectores génicos. Se clonaron los genes nutricionales HIS4 y ARG5,6 mediante complementación, heteróloga y homóloga respectivamente, de mutanes con deficiencias en estas rutas de biosíntesis como posibles marcadores genéticos, y se utilizó el gen HISI con esta misma finalidad. Mediante la interrupción de los genes HISI y ARG5,6 empleando el sistema de interrupción que permite recuperar el marcador de selección(Casete URA3) en la cepa CAI4(ura3 )se obtubieron cepas con dos y tres marcadores genéticos, RM1000 (ura3 ,his1 ) y CNC43(ura3 ,his1 ,arg5,6 ). Estas dos cepas presentan una gran versatilidad, así, la cepa RM100 posibilitó desarrollar un nuevo método de interrupción génica que consiste en interrumpir los dos alelos de un gen en un único paso de transformación empleando distintos marcadores para cada alelo. Por otra parte, la disponibilidad de la cepa CNC43 permitió desarrollar un sistema para demostrar la esencialidad de un gen en un microorganismo diploide como es C. Albicans. El gen ARG5,6 clonado se empleó para la construcción dke una genoteca genómica de C. Albicans necesaria para el análisis genético de mutantes alterados en su morfología celular, carácter que a priori es considerado como un posible determinante del mecanismo de virulencia de esta levadura, sin embargo, no posibilitó el estudio genético del dimorfismo, lo que demostraba la dificultad de clonar genes por complementación directa en C. Albicans empleando la complementación funcional de una disfunción que posiblemente se deba a la alteración de al menos dos genes hecho que puede haber ocurrido a consecuencia de un drástico tratamiento mutagénico. Se intentó abordar el estudio del proceso dimórfico obteniendo, con dosis mutagénicas menores, un nuevo tipo de mutante morfológico incapaz de invadir el medio de cultivo Spider, no obstante, el tipo de mutante que se obtuvo presentaba una alta capacidad de reversión a su fenotipo morfológico silvestre, por lo que corroboró la dificultad de manipular genéticamente a este microorganismo.

Autor: BLANCA POSTIGO JOSE MIGUEL.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Se ha caracterizado molecularmente, en Drosophila, una region de unas 40 kb. Correspondiente a lo que hemos designado locus cromosomico dfh, por contener el gen homologo del causante de la patologia humana ataxia de Friedreich. Este locus se localiza en la region 8C/D del cromosoma X y presenta almenos 6 genes, que son :1d14360, tej.2.1, 1d03794, dfh, his3.3B y Ost50. Los tres primeros han sido descritos por primera vez en este trabajo y los tres restantes lo fueron por otros autores (Cañizares et.al. 2000;Stagljar et al. 1995 Akhmanova et al.1995. Hemos caracterizado molecularmente los genes 1d14360.tej.2.1 y 1d03794, asi como determinado su patron de expresion incluido el del gen dfh. El gen 1d03794 codifica para la proteina BAP111 que fue descrita por Papoulas y colaboradores (1998), y su expresion se extiende a lo largo de todos los estadios de desarrollo. En la fase embrionaria muestra mayor intensidad en el sistema nervioso central. El gen dfh codifica para una proteina de la familia frataxina, comparte con estas las señales necesarias para la localizacion mitocondrial del producto maduro, asi como los residuos de la superficie aniónica acida y de la hidrofilica, ademas del patron general de hidrofobicidad, lo cual indica que probablemente tenga la misma estructura terciaria, cuaternaria y funcion. Su expresion es generaliada entre los estadios embrionarios 6 y 16. El gen tejas 2.1 codifica para una proteina de 1231 aminoacidos, de funcion desconocida, y con una expresion limitada al estadio embrionario. El gen 1d14360 codifica una proteina de 321 residuos que probablemente sea de membrana. Se expresa desde el estadio embrionario adulto, circunscribiendose al sistema nervioso central, cierre dorsal y epidermis en el embrion. Asimismo se ha estudiado la expresion del gen B-galactosidada presente en un elemento P artificial que se inserta en el promotor del gen 1d14360 en la cepa P1468. Los dos patrones resultaron ser muy similares. Se ha obtenido tambien un mutante para este gen con una estructura genica y un patron de expresion severamente afectado, que sin embargo no presenta un fenotipo claro.

Autor: RODRIGUEZ RUIZ JUAN.
Año: 2000.
Universidad: ALMERIA.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES .
Centro de realización: FACULTAD DE CC. EXPERIMENTALES.

Resumen: Los acidos grados poliinsaturados de cadena larga (LCPUPFAs) tienen un gran interes en salud humana. Las microalgas se han propuestocomo fuente potencial para la obtencion de estas biomoleculas. Sin embargo, se requiere incrementar la productividad de los cultivos microalgales para hacerlos competitivos frente a la fuentes tradicionales de LCPUFAs (aceites de pescado). Se puso en marcha un programa de mutacion/selección con dos microalgas (Porphyridum cruentum y Phaeodacty luas tricornilium) con el objetivo de incrementar su contenido en LCPUFAs o bien obtener militantes alterados en la biosintesis de estos compuestos que pudieran aportar un mejor conocimiento de las rutas biosinteticas de estos microorganismos, poco conocidas aun. Para elloo se emplearon tres agentes mutagenicos: ultravioleta, etil-melanosulfonato y nitrosoguanidina. El desarrollo de este objetivo requeria realizar miles de analisis de acidos grados, por lo que se desarrollo previamente su metodo rapido de trans-esterificacion directa de la biomasa para la preparacion de los acidos grados para su analisis mediante cromatografia gaseosa(GLC). El desarrollo del programa de mutacion/selección con Porhyridum crientum no dio lugar a mutantes estables alterados en la biosintesis de sus acidos grasos, aunque los mutagenos si actuaban sobre esta especie, como demuestra la obtencion de doce mutantes pigmentarios obtenidos a partir de esta alga roja. En cuanto a Phaeodacty lum tricoructum la aplicación del programa de mutacion/selección si dio lugar a varos mutantes afectados en las rutas de sintesis de acidos grasos. Se realizo una caracterizacion lipidica detallada de los cinco mutantes obtenidos y de la cepa salvaje (UTEX 640) a dos temperaturas distintas (6 y 26ºC). La caracterizacion lipidica de la cepa salvaje a 6ºC destaco sobre todo por un enorme incremento en la sintesis de triacilgliceroles. Los mutantes acabaron mostrando cierta inestabilidad.

Autor: PEREZ ESPINOSA ALONSO .
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD HISPALENSE.

Resumen: Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici es un hongo fitopatógeno de relevante importancia agronómica que patogeniza a la planta de tomate. Dicha especie vegetal produce un alcaloide glicosilado denominado tomatina que tiene actividad fungitóxica. En esta tesis se han aislado y caracterizado varios genes que se inducen en el hongo en presencia de dicho glicoalcaloide. En primer lugar se ha clonado el gen que codifica la tomatinasa, enzima que degrada la tomatina. La secuencia de este gen no presenta homologia con la del gen de la tomatinasa de S.lycopersici, otro patógeno del tomate. La existencia de enzimas diferentes que son capaces de anular el efecto tóxico de la tomatina constituye un ejemplo de convergencia evolutiva. Hemos observado que la tomatinasa de F.oxysporum tiene homologia con xilanasas pertenecientes a la familia 10 de glicosil hidrolasas y como la expresión de dicho gen está sujeto a represión por catabolito, rasgo que presentan algunas xilanasas, dicha enzima podria haber evolucionado a partir de la duplicacion de un gen que codificara una proteina con actividad xilanasa. Oros dos genes inducidos por tomatina son el que codifica pantotenato sintetasa y el de una proteína homología con IFR-H de plantas. En la secuencia promotora de estos dos genes se ha observado el motivo STRE, que se encuentra en genes inducidos en respuesta a situaciones de estrés. Es posible que la tomatina origine una respuesta general como consecuencia del estrés provocado a nivel de membrana. El gen de pantotenato sintetasa de F.oxysporum complementa a un mutante de E.coli deficiente en actividad pantoteato sintetasa, auxótrofo para ácido pantoténico. El gen con homología a IFR-H tiene relevancia pues tales enzimas se han descrito sólo en plantas. Este gen se expresa en los primeros estudios de la infección, aunque no es esencial para la patogénesis ya que mutantes con el gen interrumpido fueron igualmente infectivos que la estirpe silvestre en plantas de tomate. Finalmente se ha aislado un nuevo transposón en F.oxyporum denominado Bacalao que podria incluirse en la superfamilia hAT, debido a la conservación de los dominios de la transposasa y a la presencia de duplicaciones directas de 8 pb en los extremos del mismo. El elemento es activo al menos desde el punto de vista transcripcional.

Autor: GOMEZ GOMEZ ESPERANZA ROCIO.
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Fusarium oxysporum es una de las especies de hongos mas abundantes, tanto en suelos cultivados como naturales. Dentro de esta especie se incluyen patógenos que producen marchitez vascular en un gran numero de cultivos de importancia económica, provocando en las plantas que infectan la enfermedad conocida como fusariosis. Para penetrar y colonizar el sistema vascular de la planta a la que atacan, estos patógenos producen distintas enzimas extracelulares que degradan la pared vegetal. El xilano es el principal componente hemicelulósico de las paredes vegetales, por lo que las enzimas que degradan este complejo polisacárido son importantes para que el hongo supere con éxito las barreras estructurales del hospedador y avance en su invasión. El sistema xilanolítico lo integran distintas enzimas, siendo las principales las endo-b-1,4-xilanasas, llamadas comunmente xilanasas, que rompen enlaces internos del esqueleto de xilano. El sistema xilanolítico de F.oxyporum está integrado por varias xilanasas: se ha purificado y caracterizado la enzima XYL1, y se han clonado y caracterizado los genes xy12 y xy13, perteneciendo estas tres xilanasas a la familia 10. En este trabajo se han aislado y caracterizado dos nuevos genes xilanasa, xy14 y xy15, pertenecientes a la familia 11. Ambos genes se expresan en cultivo axénico, siendo el xilano el principal sustrato inductor, si bien xy15 tambien se expresa en presencia de carboximetilcelulosa y de tejido vascular de tomate. La expresión de xy14 esta regulada por la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y el pH ambiental. Los genes xy14 y xy15 se expresan en plantas de tomate infectadas por F.oxysporum f.sp. Lycpersici, lo que indica su posible participación en la patogenesis, aunque sus patrones de expresión son distintos. Nuestro estudio se ha dirigido tambien a determinar si las xilanasas de F.oxysporum son esenciales en patogenesis,y para ello se han inactivado los genes xy13,xy14 y xy15, y se ha estudiado el comportamiento patotípico de los mutantes xy1-. Los mutantes xy13-, xy14- y xy15- crecen sobre xilano y en general, su actividad xilanasa no se ve afectada, probablemente como consecuencia de la redundancia funcional de los genes xilanasa. Uno de los mutantes xy13- muestra un incremento de esta actividad, posiblemente por la sobreexpresión de otros genes xilanasa. Todos los mutantes analizados son patogenos, lo que indica que los genes estudiados no son esenciales para la patogenicidad del hongo, aunque su expresion in planta sugiera su intervencion en las interacciones planta-patogeno.

Autor: JIMENEZ GARCIA ALBERTO.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y GENETICA. FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La riboflavina o vitamina B2 es un factor de crecimiento esencial para el hombre y los animales superiores cuya producción industrial asciende a mas de 3000 t/año. El empleo de microorganismos superproductores como Ashbya gossypii ha mejorado notablemente el rendimiento del proceso de produccion industrial. La disponibilidad del precursor inmediato de la ruta de biosínteis de purinas es una etapa limitante de la producción de la vitamina. En este trabajo se ha abordado la caracterización y modificación de los dos primeros pasos de la ruta de sintesis de purinas, con el fin de aumentar el flujo de metabolitos hacia la formación de GTP y mejorar, por tanto, la producción de riboflavina en A.gossypii. La construcción de cepas portadoras de formas mutantes sobreexpresadas de PRPP sintetasas ha permitido elevar la producción de riboflavina en un 100%, aunque los datos obtenidos sugieren que la sintesis de PRPP no es un paso limitante de la producción de vitamina B2. Por el contrario, mediante la sobreexpresión de formas mutantes de PRPP amidotransferasas ha sido posible obtener cepas de A.gossypii que alcanzan unos niveles de produccion 10 veces superiores a los de la cepa silvestre. Estos resultados indican que la anulación de los mecanismos de regulación a los que esta sometida la sintesis de fosforribosilamina, es suficiente para aumentar la producción de riboflavina. Considerando los trabajos realizados en organismos procarióticos respecto a la función reguladora de FMN y FAD sobrela sintesis de riboflavina, se ha identificado y caracterizado el gen FMN1 en Saccharomyces cerevisiae y la localizacion subcelular de su producto, la enzima flavokinasa. Los estudios realizados ponen de manifiesto que en eucariotas ni FMN, ni FAD ejercen un papel regulador de la biosintesis de riboflavina.

Autor: MIRO CASTILLO FRANCESC XAVIER.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: INSTITUTO BIOLOGIA MOLECULAR BARCELONA (CSIC).

Resumen: LAS FOSFODIESTERASAS (PDE) SON LOS ENZIMAS RESPONSABLES DE LA HIDRÓLISIS DEL AMP CICLICO. SE HA PROPUESTO QUE INHIBIR SU ACCIÓN PODRÍA SER BENEFICIOSO PARA UN GRAN NUMERO DE PATOLOGIAS. NOSOTROS NOS HEMOS CENTRADO EN LAS FAMILIAS 4 I 7, HABIÉNDOSE CLONADO EL CDNA DE PDE4C, PDE4D Y PDE7A HUMANAS. SE HAN ENCONTRADO LOS PRIMEROS INHIBIDORES DE PDE7A QUE SE DESCRIBEN, QUE SE CONSIDERAN DE UN GRAN INTERES COMO BLOQUEADORES DE LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS T. SE HA VISUALIZADO MEDIANTE HIBRIDACIÓN "IN SITU" LA DISTRIBUCIÓN DE LAS FAMILIAS 4 Y 7 EN LOS CEREBROS DE RATON, MACACO Y HUMANO, INCLUYENDO LAS VARIANTES DE "SPLICING" DE PDE4D Y PDE7A, QUE RELACIONA UNA FUNCIÓN EN EL CEREBRO EN PROCESOS DE APRENDIZAJE Y MEMORIA, DONDE HAN MOSTRADO TODAS ELLAS UN PATRÓN DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL, Y QUE MUESTRAN ESTAR DIFERENTEMENTE REGULADAS EN LOS TRATAMIENTOS AGUDO Y CRONICO CON EL ANTIDEPRESIVO FLUOXETINA EN EL CEREBRO DE RATA. TAMBIEN SE HA VISUALIZADO COMO VIENEN REGULADAS PDE4D Y PDE7A EN LAS PRIMERAS ETAPAS DE LA RESPUESTA INFLAMATORIA EN UN MODELO DE INFLAMACION "IN VITRO". TAMBIEN SE HA VISUALIZADO LA DISTRIBUCIÓN DE PDE7A EN ORGANOS PERIFERICOS DE RATA.

Autor: LORENZO GILSANZ M. MAR.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INIA.

Resumen: El virus vaccinia tiene dos formas infecciosas distintas, una forma intracelular que sólo sale al exterior por rotura mecánica de la célula (IMV), y una forma extracelular (EEV), con una envuelta adicional derivada del TGN. El transporte intracelular de los virus a la membrana plasmática, bien sea por colas de actina o por otro mecanismo, depende de la adquisición de la envuelta. Se han descrito hasta el momento seis proteínas asociadas a al última envuelta del EEV. Los estudios recientes sobre estas proteínas se han centrado en su análisis bioquímico y en el estudio de los mutantes de deleción. En esta tesis se pretende dar un nuevo enfoque al estudio de la envuelta del EEV, realizando la caracterización funcional de las proteínas implicadas, tanto en la infección como expresadas individualmente en ausencia de infección. Las proteínas a incorporar en la envuelta han de estar presentes en el TGN en el momento en el que el virus adquiere la envuelta. Así, pues, durante la infección, una o varias de estas proteínas han de quedar, de alguna manera retenidas en ese compartimento y determinar así el sitio de envolvimiento del virus. En primer lugar se estudió la localización celular de las proteínas de la última envuelta del EEV en una infección comprobando que en células infectadas por vaccinia, las proteínas B5R, F13L y A56R mostraron patrón de envuelta. Por el contrario, A56R se localizó en membrana plasmática, pero no produjo un patrón atribuible a virus, A34R se localizó en un área yuxtanuclear de mayor extensión que el Complejo de Golgi y membrana plasmática. En segundo lugar se estudió la presencia de señales de localización de las proteínas de la última envuelta del EEv mediante su expresión en ausencia de infección utilizando el sistema de expresión basado en el Semliki Forest Virus, comprobando que A34R y B5R contenían señales de localización intracelulares. B5R fue la única proteína que quedaba restringida al Golgi. Cuando se caracterizó la proteína que quedaba retenida en el golgi se comprobó que los 42 aminoácidos C-terminales, que incluyen los dominios transmembrana y citosólico de B5R, son suficientes para retener una proteína de fusión con la GFP en el Golgi. Posteriormente se abordó el estudio de la localización celular de las proteínas en mutantes de deleción y su papel en la inducción de colas de actina, así como la determinación de las interacciones proteína-proteína que definen localización intracelular de las proteínas de la envuelta del EEV y su incorporación en los virus envueltos. De los resultados se dedujo un modelo de interacción en anillo de las proteínas de la envuelta. Este modelo implica interacción F13L-B5R-A34R-A33R-F13L. La proteína A36R se encontraría interaccionando con el complejo de las otras cuatro proteínas en la envuelta externa del IEV, pero sería desplazada de la envuelta del EEV. El fenotipo causado por las distintas delecciones permiten deducir que A36R es la proteína más directamente implicada en la formación de tallos de actina. Estudios con diversos mutantes sugieren que, además de la incorporación de A36R en el IEV, es necesaria una interacción estrecha, probablemente mediada por B5R y A34R, entre las dos envueltas externas del IEV para la inducción de colas de actina.