SINTESIS DE OLIGONUCLEOTIDOS

Autor: MARCOS LUQUE IRENE.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La Retinosis Pigmentaria (RP) es el término empleado para describir un grupo de distrofias retinianas en las que los fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario degeneran. Desde el punto de vista genético la RP presenta una gran heterogeneidad tanto alélica comon o alélica con diferentes modos de herencia: autosómico dominante y recesivo, ligadas al cromosoma X y digénicas. Uno de los locus identificados en familias RPAR, RP25, fue identificado por nuestro grupo en el brazo largo del cromosoma 6 entre los marcadores microsatélites, D6S257 y D6S1644, siguiendo una estrategia de clonaje funcional y mapeo de homozigosis. Nuestro grupo planteó la hipótesis de que alteraciones en la neurotransmisión a nivel de las capas plexiformes de la retina podría estar involucrada en el desarrollo de RP. Para testar esta hipótesis seleccionó los genes que codifican para las subunidades roho1 y rho2 del receptor GABAc, GABRR1 y GABBR2, que parece ser que median la inhibición lateral en la retina. El objetivo planteado en esta Tesis es la identificación del gen/es responsable del locus RP25, por lo que procedimos a evaluar el papel de los genes candidatos GABRR1 y GABRR2 en el desarrollo de la RP en las familias que muestran ligamiento al locus RP25. La ausencia de mutaciones en el análisis molecular directo de los genes GABRR1 y GABRR2 y los resultados obtenidos tras el estudio de segregación de las variantes no patogénicas identificadas en las familias ligadas a RP25, nos permiten excluir ambos genes como responsables del desarrollo de RP en estas familias. Posteriormente, analizamos el gen ELOVL4 responsable de los locus STGD3 y adMD, que colocalizan con RP25 en la región pericentromérica del cromosoma 6. La identificación del gen ELOVL4 en el desarrollo de varios fenotipos de degeneración retiniana, sugiere que el metabolismo de los ácidos grasos polinsaturados de cadena larga, tales como el DHA, ejerce una función importante en la retina. Sin embargo, la ausencia de mutaciones en el análisis molecular directo del gen en los pacientes index de las familias RP25 lo excluye como responsable de dicho fenotipo, indicando que los fenotipos STGD3/adMD y RP25 no son variantes alélicas del gen ELOVL4. Con el objeto de identificar el gen responsable del fenoitpo RP25, procedimos a refinar la región crítica de dicho locus y a la caracterización de genes de expresión en retina ubicados dentro de la región crítica y posterior análisis molecular en los pacientes índex de las familias RP25. El gen SMAP1 (Proteína de membrana asociada al estroma 1), homólogo del gen smpa-1 de ratón, está localizado entre los marcadores microsatélites D6S455 y D6S1673. Este gen, de expresión en retina, está constituido por 11 exones y codifica una glicoproteína tipo II de membrana con una serie de dominos funcionales que parecen implicarla en la organización del citoesqueleto y en el tráfico de vesículas. El gen GlcAT-S (Glucuroniltransferasa-S), homólogo del gen glcAT-S de rata, colocaliza con el gen SMAP1. Este gen, de expresión en retina, está constituido por 4 exones y codifica una enzima glucuroniltransferasa involucrada en la biosíntesis del epítopo carbohidrato HNK-1, el cual está implicado en las interacciones célula-célula y célula-sustrato. El gen HELO1, constituido por 7 exones, codifica una proteína implicada en la elongación de ácidos grasos mono y polinsaturados hasta los 24 carbonos de longitud tanto de la serie omega 3 como omega 6. El análisis de segregación de los cambios identificados en el análisis molecular del gen en los pacientes índex de las familias ligadas al locus RP25 localizan este gen fuera de la región crítica de dicho locus. El gen RAB23, ubicado entre los marcadores microsatélites D6S257 y D6S1695, está constituido por 7 exones y codifica una proteína GTPasa monomérica pequeña, que presenta una alta similitud con su homológa en ratón y que forma parte de la familia Ras de proteína encargadas del tráfico de membrana entre los comportamientos celulares de células eucariotas. Según los datos obtenidos en el análisis molecular de los genes SMPA1, GlcAT-S, TFAP2beta, HELO1 y RAB23 ninguno de ellos es responsable del fenotipo RP25 en las familias ligadas a dicho locus. Por lo tanto concluimos que la región crítica del locus RP25, queda definida entre los marcadores D6S257 y D6S421 en una región cromosómica de 5cM.

Autor: CARIDAD GÜIMIL GARCÍA RAMÓN DE LA.
Año: 2001.
Universidad: NACIONAL DE EDUCACION A DISTANCIA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UNED).

Resumen: A raíz de la elucidación estructural del ADN en el año 1953, la síntesis de los ácidos nucleicos, como portadores de la información genética, se ha convertido en un objetivo importante para los químicos orgánicos. Centrada en este campo, en la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la introducción de dos tipos diferentes de análogos de las bases naturales en oligonucleótidos sintéticos. Así mismo se ha realizado el estudio que dicha modificación provoca en las propiedades de hibridación de los correspondientes oligonucleótidos modificados. El trabajo de investigación realizado se puede dividir en dos partes fundamentales: 1,- Obtención del monómero protegido y funcionalizado para la incorporación de 5-azacitosina a oligodesoxirribonucleótidos. 2,- Preparación e incorporación de 8-aminopurinas a oligodesoxirribonucleótidos. En cuanto a la primera parte, la 5-azacitosina, perteneciente a un grupo de bases modificadas, es el agente más potente para inhibir la acción de la metiltransferasas en las citidinas del ADN (estos compuestos se han empleado en el tratamiento de lecucemias). Para conseguir este primer objetivo de la Tesis, se han desarrollado las estrategias sintéticas oportunas, que incluyen el empleo de grupos protectores desarrollados por el Dr. Pfleiderer para la protección de las bases duratne la síntesis de oligonucleótidos. En el desarrollo de la segunda parte del trabajo, se han realizado análisis teóricos de simulación molecular de triples hélices de ADN, que sugirieron que la introducción de un grupo aminio en la posición C-8 de las hélices tipo d(A.T.T.), facilitaría la formación de un enlace por puente de hidrógeno adicional que traería consigo un incremento de la estabiliad de la triple hélice. Así pues, se han analizado la síntesis y propiedades estabilizadoras de triples hélices de oligodesoxirribonucleótidos que contienen tres análogos no naturales de las purinas con un grupo aminino en posición 8.

Autor: FRIEDEN BRUGERA MIRIAM.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: DPTO. DE QUÍMICA ORGÁNICA.

Resumen: El uso de oligonucleótidos como fármacos contra el cáncer y contra determinadas infecciones víricas constituye una alternativa atractiva al tratamiento de estas enfermedades a nivel genético. Los oligonucleótidos cíclicos presentan una determinada estabilidad frente a la acción de las exonucleasas por su carencia de extremos terminales. Esta característica los convierte en candidatos ideales en diferentes estrtegias de control de la expresión génica. Otra aplicación interesante de los oligonucleótidos cíclicos es su uso como modelos estructurales en el estudio de formas no canónicas del DNA. En la presente tesis doctoral nos hemos propuesto la optimización de un método de síntesis química de oligonucleótidos cíclicos (denominado método del o-clorofenilo) para la preparación de moléculas de gran tamaño. El segundo objetivo ha consistido en evaluar la capacidad de reconocimiento molecular de ciertas polimerasas con respecto a moldes de DNA cíclico de pequeño tamaño. En tercer lugar, se ha trabajado en el desarrollo de un método de síntesis de RNA cíclico en fase sólida. Por último se ha hecho una aportación al estudio estructural del motivo "bi-loop2. Se ha resuelto con buenos resultados la preparación de DNA cíclico de tamaños comprendidos entre un 13 y un 28 mer, moléculas no abordables por otras metodologías descritas en la literatura. Se rata de objetivos sintéticos difíciles, no solo por su gran tamaño, sino también por su elevado contenido en bases púricas (80%). El éxito en esta síntesis ha implicado la previa optimización de las etapas de análisis, pruficación y caracterización. Estos moldes circulares se han empleado como substratos en la Replicación y Transcipción por círculo rodante de diferentes plimerasas con resultados remarcables. Incluso el 13mer da lugar a copias multiméricas fruto de un proceso de amplificación enzimática. El método de o-clorofenilo resulta útil en la preparación de RNA cíclico simpre y cuando el precursor anclado a resina contenga un 2'-desoxinucleósido o un 2'-O-metil ribonucleósido en el extremo 3'-terminal. Se ha desarrollado un nuevo método de síntesis de oligonucleótidos cíclicos que emplea el nitrofeniletilo con espaciador bifuncional, punto de unión entre el oligonucleótido y la resina, y que posibilitan la preparación de RNA cíclico sin modificación alguna de su esqueleto. Por último se ha abordado el estudio por dicroísmo circular por ultravioleta y por RMN de los oligonucleótidos cd (CGCTCCGT), cd(CGCTCTAT), c(UGUUGCT) y d(GCTCATT) con el fin de acotar todavía más los requerimientos secuenciales en la adopción de un "bi-loop".

Autor: ESCAJA SÁNCHEZ NÚRIA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA, UB.

Resumen: La presente Tesis Doctoral consta de dos objetivos principales: la optimización de un método de síntesis en fase sólida para la obtención de oligonucleótidos cíclicos y el estudio estructural de diferentes secuencias cíclicas. En el Capítulo 1 se describe la optimización del método de síntesis así como su aplicación a la obtención de oligonucleótidos cíclicos a gran escala. En los Capítulos 2,3 y 4 se detalla el estudio estructural mediante difracción de RX, RMN y DC de seis secuencias de octámeros cíclicos: d(pCATTCATT), d(pTGCTCGCT), d(pCGCTCATT), d(pCCGTCCGT), d(pTGCATGCA), d(pAGCTAGCT). Este estudio ha permitido demostrar la existencia de un nuevo motivo estructural del DNA, tipo cuádruplex, formado por dos moléculas de octámero cíclico en disposición antiparalela y estabilizado por la formación de puentes intermoleculares tipo Watson-Crick. Dicho motivo, denominado bi-loop, se ha observado en las seis secuencias estudiadas y tanto en estado sólido como en disolución. Por último, en el Capítulo 5, se describe el estudio termodinámico realizado a partir de los datos de RMN y curvas de fusión por DC que ha permitido estimar la estabilidad del motivo bi-loop en función de la secuencia oligonucleotídica.

Autor: BELTRAN PINA M. TERESA.
Año: 1998.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: El principal objetivo ha consistido en estudiar la introducción de los residuos básicos lisina e histidina en la secuencia peptídica de nucleopéptidos. El principal problema a resolver ha sido encontrar un grupo protector adecuado para las cadenas laterales compatible con el esquema sintético y la unión péptido-oligonucleótido. Para el residuo de lisina, los grupos trifluoroacetilo (Tfa) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) cumplen los requisitos, y de ellos Tfa sería el que ha presentado menos inconvenientes. Para el residuo de histidina, se ha encontrado que si se encuentra en posición C-terminal se debe emplear el grupo 2,4-dinitrofenilo, pero si se encuentra en posición intermedia la mejor alternativa es el grupo tosilo. También se ha estudiado la introducción del residuo homoserinaen síntesis de nucleopéptidos. El segundo objetivo ha consistido en el estudio de la reacción de un nucleopéptido que contiene His-dG frente el antitumoral cisplatino. En ésta, se han obtenido dos nuevos compuestos derivados del antitumoral, identificados como moléculas isoméricas de tipo constitucional.

Autor: ALAZZOUZI ELMOSTAFA.
Año: 1995.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: QUIMICA ORGANICA PROGRAMA DE DOCTORADO: QUIMICA FUNDAMENTAL: QUIMICA ORGANICA.

Resumen: SE HA DISEÑADO Y PUESTO A PUNTO UN NUEVO METODO DE SINTESIS EN FASE SOLIDA DE OLIGONUCLEOTIDOS CICLICOS. EL ESQUEMA SINTETICO SE INICIA CON EL ANCLAJE A LA MATRIZ POLIMERICA DEL NUCLEOTIDO 3'-TERMINAL A TRAVES DEL ACIDO 3- CLORO-4-HIDROXIFENILACETICO, CUYO HIDROXILO FENOLICO ESTERIFICA Y PROTEGE EL FOSFATO MIENTRAS QUE EL ACIDO CARBOXILICO ESTABLECE UN ENLACE AMIDA CON EL SOPORTE SOLIDO. EL GRUPO FOSFATO SE ENCUENTRA PROTEGIDO ADEMAS CON EL GRUPO 2-CIANOETILO. PARTIENDO DE ESTA NUCLEOTIDIL-RESINA, EL ENSAMBLAJE DE LA CADENA OLIGONUCLEOTIDICA SE REALIZA POR EL METODO DEL FOSFITO TRIESTER UTILIZANDO METILFOSFORAMIDITOS Y LOS GRUPOS PROTECTORES DEL HIDROXILO 5' Y DE LAS BASES HETEROCICLICAS QUE SON HABITUALES EN SINTESIS DE OLIGONUCLEOTIDOS. LA CICLACION ENTRE EL HIDROXILO 5' Y EL FOSFATO 3'-TERMINAL DE LA CADENA LINEAL (PREVIA ELIMINACION DEL GRUPO CIANOETILO) TIENE LUGAR SOBRE EL SOPORTE POLIMERICO POR EL METODO DEL FOSFATO TRIESTER. TRAS LAS ETAPAS DE DESPROTECCION Y DESANCLAJE SE OBTIENE EL OLIGONUCLEOTIDO CICLICO.