BACTERIOLOGIA, 2

Autor: URQUIJO SARDÁ MARÍA.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: INMUNOLOGIA. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.

Resumen: El objetivo global ha sido la búsqueda de marcadores diferenciales del estado viable no cultivable de C.jejuni, mediante la comparación de los perfiles de proteínas de células viables no cultivables con los de sus homólogas cultivables. Se compararon los perfiles de proteínas inmunorreactivas y glicoproteínas. Se observó un alto grado de mantenimiento de los perfiles en el estado VNC. Entre las variaciones destacadas se observó para bandas concretas en el estado VNC una aumento de reacción frente a inmunosueros y frente a lectina SBA. Todas las bandas inmunorreactivas fueron relacionadas con presencia de glicoproteínas. La desglicosilación química del extracto crudo supuso la pérdida de inmunorreacción de bandas concretas, indicando que los epitopos de esas proteínas residen en la fracción glucídica. El aumento de inmunorreacción en el estado VNC podría ser explicado por un aumento de glicosilación. También destacó entre las variaciones la aparición de dos bandas inmunorreactivas exclusivamente en el estado VNC. Una de ellas se identificó como flagelina. La diferente inmunorreacción de la flagelina en el estado VNC podría tratarse de una glicosilación diferencial de esta proteína. Existen indicios de participación del sistema propio de glicosilación (genes pgl) en la adaptación al estado VNC.

Autor: MADINABEITIA PEIRÓ NURIA.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: HH1036 es una estirpe de Sinorhizobium fredii, bacterias del suelo que establecen simbiosis fijadoras de nitrógeno en la soja y en otras muchas especies de leguminosas, por lo que son consideradas de amplio rango de hospedador. Se disponía de una serie de clones derivados de HH103 obtenidos tras mutagénesis con la funsión Tn5-lacZ, en la que lacZ carece de promotor, que sólo presentaban actividad beta-galactosidasa en presencia de flavonoides, lo que indica que lacZ se encuentra bajo el control de un promotor que se introduce tras la interacción con la plata. Se seleccionaron dos de estos clones, SVQ121 y SV120, para el estudio de sus características, especialmente las relacionadas con el establecimiento de la simbiosis efectiva. Se determinó que el mutante SVQ121 presenta la inserción del transposón en el gen nolO, implicado en la carbamoilación de los carbonos 3 y 4 del extremo no reductor de los factores de nodulación (factores Nod). Tras la secuenciación del gen nolO silvestre se observó que presenta una deleción puntual que provoca un fin de mensaje prematuro, no sólo en HH103 sino también en otras estirpes de S.fredii, lo que explicaría que ninguno de los factores Nod de estas estirpes presenten grupos carbamoilos. Tras el estudio de las propiedades de SVQ121 no se observaron diferencias con respecto a la estirpe silvestre excepto que los factores Nod presentan una disminución en el grado demetilación de las fucosas del extremo reductor y una menor capacidad competitiva para nodular la soja cuando era coinoculada en proporción 1:1 con la estirpe silvestre. Se demostró que la disminución en el grado de metilación era debida a que la inserción del transposón en nolO provoca un efecto polar sobre el gen noel que le sigue. Por otra parte, se construyó un mutante en el gen noeI mediante inserción del interposón omega. Este nuevo mutante comparte todas las características del mutante nolO, excepto que sus factores Nod carecen de grupos metilos. El nivel demetilación de estas moléculas fue restablecido en ambos mutantes cuando se introdujo la copia silvestre de noeI, por lo que se concluyó que el gen noeI es el responsable de la metilación de los factores Nod de HH103 y que los grupos metilos no son necesarios para la nodulación de esta estirpe en ninguna de las leguminosas ensayadas: cajanus cajan, Desmodium canadense, Macroptilium atropurpureum, Macrotyloma axillare, Glycine soja y Vigna radiata. El mutante SVQ120 presenta la inserción del transposón en el gen rhcQ implicado en el sistema de secreción tipo III. El perfil de las proteínas de secreción tras la inducción con flavonoides no sufrió cambios significativos con respecto a la estirpe silvestre. Sin embargo, la mutación en este gen provoca cambios en algunas de las propiedades simbióticas de tal forma que SVQ120 presentó menores valores de actividad reductora de acetileno en los cultivares de soja americanos: Osumi y Williams y mejor capacidad noduladora y fijadora de nitrógeno en la leguminosas: Cajanus cajan, Macroptilium atropurpureum, Erythrina variegata y E.vespertilio. Por otra parte se comparó el perfil de las proteínas de secreción de HH103 frente a ISDA257, otra estirpe deS.freddi, y de sus análisis se concluyó que la capacidad de HH103 para nodular en los cultivares americanos de soja, donde ISDA257 no lo puede hacer, puede ser debida a las diferencias en las proteínas secretadas por una y otra estirpe, puesto que la secuencia de los genes que constituyen el TTSS presenta un identidad del 100%.

Autor: PASCUAL CAMPS MÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSITAT DE GIRONA.

Autor: CASTRO ARANDA ARACELI.
Año: 2002.
Universidad: JAEN.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: AREA MICROBIOLOGÍA.

Resumen: El presente trabajo de investigación consisitió en evaluar la presencia de enterococos en muestras procedentes de alimentos cárnicos, lácteos y vegetales, observándose según los perfiles de RAPD que la especie predominante fue E.faecium frente a E.faecalis. En ninguna de las cepas estudiadas se detectaron caracteres de virulencia ni presencia de genes para la citolisina, la proteína de superficie Esp de los enterecocos, o la adhesina para el colágeno, al igual que fue negativa la inducción de la agregación mediante adición de feromonas sexuales exógenas. En cuanto a los antibióticos, todas las cepas sensibles a los antibióticos ampicilina, penicilina, esteptomicina y gentamicina, mientras que los porcentajes más altos de resistencia fueron detectados frente a la rifampicina, ciprofloxacina, y tetraciclina para E.faecium. Tan solo una cepa mostró resistencoa a la vancomicina. Un porcentaje elevado de cepas mostró propiedades funcionales, tales como la capacidad para hidrolizar la rafinosa, la estaquiosa o las sales biliares. Muchas de las cepas estudiadas eran capaces de producir bacteriocinas, mostrando todas las cepas productoras actividad anti-listerina. El 82.35% de las cepas portaban genes estructurales para las enterocinas A, B o P. Centrando el estudio en tres de las cepas productoras se observó que eran estables al calor, a valores extremos de pH, y a los agentes reductores, al igual que eran capaces de mostrar actividad frente a diferentes cepas de E.faecalis, L.innocua, L.monocytogenes, S.aureus, y B.subtilis.

Autor: CATANHO PERIRA DE LYRA M. CARMO.
Año: 2001.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En este trabajo, se ha caracterizado fisiológica y genéticamente el mutante SVQ288 de S. Fredii, comprobándose que está mutado en el gen nolT, un gen que forma parte de la máquinaria de secreción de Tipo III. El objetivo inicial del trabajo era obtener mutantes afectados en genes implicados en la nodulación de S. Fredii. Se mutagenizó la estirpe silvestre HH103 con el transposón Tn5-lacZ. Esta estrategia permite encontrar nuevos genes implicados en el proceso de la nodulación, de los que no existe homología previa y que, por tanto, no se podrían encontrar por hibridación. Así, se han obtenido distintos mutantes de HH103 afectados en genes de nodulación. Se asiló también el mutante SVQ288, cuya caracterización ha sido el objeto del trabajo que se presenta. Las conclusiones obtenidas fueran las siguientes: 1,- Se ha secuenciado la región del plásmido simbiótico de la estirpe HH103 de S. Fredii que contiene los genes y4yB, nolX, nolW,nolB, nolU, nolV y hrcN. Tanto la organización de los genes como la secuencia de ADN es prácticamente idéntica ala descrita para la estirpe USDA257 de S. Fredii, excepto en que el gen nolV de HH103 englobaría la ORF4 y al gen nolV de USDA257. 2,- Otras estirpes de S. Fredii, con un origen geográfico distinto, comparten con HH103 la misma secuencia de ADN en nolV, no pareciendo la ORF4 independiente que se ha descrito para USDA257. Por tanto, y a pesar de que los estudios sobre la región nolXWBTUV han sido mayoritariamente realizados en la estirpe USDA257, no se puede considerar que esta región de USDA257 sea representativa de la que está presente en otras estirpes de S. Fredii, sino más bien una excepción. 3,- La mutación en el gen nolT de Sinorhizobium fredii HH103 hace que la bacteria deje de secretar al menos 4 proteínas con pesos moleculares de 64,42,19 y 6 kDa en respuesta a la inducción con flavonoides. 4,- Para la secreción de estas proteínas es fundamental el producto del gen nodD1. 5,- El mutante en el gen nodD1 de HH103 (SVQ319) sigue secretando otras proteínas en respuesta a flavonoides, lo que sugiere la presencia de otro tipo de sistema de secreción independiente de nodD1 e inducible por flavonoides. 6,- La proteína NolT se ha detectado, por imunomarcaje en las fraciones citoplásmicas con un tamaño de 35 kDa y extracelular con un tamaño de 31 kDa. Lo que sugiere que en el citoplasma pudiera estar unida a otra moléculas de naturaleza desconocida. 7,- La mutación en el gen nolT de S.fredii HH103 y nolU de S. Fredii USDA257 hace que se acumule en el periplasma una proteína de 14 kDa. 8,- La proteína NolT es esencial para la biosíntesis de la maquinaria de secreción de Tipo III. 9,- La mutación en el gen nolT de S. Fredii HH103 modifica las características simbiótica de la bacteria expandiendo su rango de nodulación efectiva. EL sentido de estas alteraciones, mejora o reduce la capacidad simbiótica, variando en las diferentes leguminosas estudiadas. 10,- La mutación en el gen nolT reduce drásticamente la capacidad compettitiva de la estirpe HH103 para nodular en el cultivar Williams de soja. Por tanto, este gen, o los genes subsiguientes de la misma unidad transcripcional, son importantes para la capacidad competitiva de la bacteria.

Autor: VEGA HERNÁNDEZ M. CANDELARIA.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DPTO. MICROBIOL Y BIOL. CEL..

Resumen: En esta Tesis Doctoral aborda el estudio del proceso simbiótico entre una leguminosa leñosa endémica de Canarias, Chamaecytisus proliferus var. Proliferus ssp. Palmensis (tagasaste), con las cepas indígenas BTA1 y BGA1 de Bradyrhizobium sp (Chamaecytisus). Se hace además un estudio comparativo del proceso de modulación de estas cepas en una leguminosa herbácea Macroptilium atropurpureum. De los dos mecanismso de infección conocidos, infección a através de pelos radicales e infección a través de heridas o infección por crack, los rizobios infectan el tejido radical de tagasaste por el mecanismo de crack, sin embargo, son capaces de disparar las respuestas iniciales relacionadas con el otro mecanismo de infección: curvatura de pelos radicales inicio de tuboso de infección y formación de focos de células meristemática en el córtez interno de la raíz. Así, el mecanismo de infección por crack en tagasate es único: A,- presenta una combinación de los dos procesos de infección conocidos. B,- los nódulos se desarrollan a lo largo de las raíces laterales en lugar de estar restringidos a las axilas de las mismas. C,- las heridas de la epidermis son provocadas por el crecimiento de un primorido de nódulo que al crecer abre los espacios intercelulares de la epidermis. D,- los tubos de infección no están implicados en ningún estadio de la simbiosis. E,- el proceso culmina con la formación de un nódulo eficaz de tipo indeterminado. Por el contrario, estas mismas cepas infectaron Macroptilium a través del mecanismo más general, por tubos de infección en pelos radicales, formado finalmente un nódulo determinado eficaz. El estudio de las rutas de biosíntesis de ácido índol-3-acético en las cepas de Bradyrhizobium sp. BTA-1 y BGA-1 y en las especies B. Japonicum USDA 110 y B. Elkanii USDA 76, reveló la existencia de dos rutas, la del indopirúvico, ampliamente descrita en todos los rizobios, y la vía del indolacetonitrilo, en la que la acción combinada de una nitrilo hidrata y una amidasa rinde al auxina, siendo esta la primera vez que se describe la existencia de esta vía en el género Bradyrhizobium además se demuestra que la vía de la monooxigenasa o vía de la indoalcetamida propuesta por varios autores para este género, basándose en la detección de indolacetamida (primer intermediario de la ruta) y en la existencia de uan actividad amidasa, no existe.

Autor: MORENO MUÑOZ JOSE ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la deficiencia en la síntesis en timidilato sintasa en la virulencia de P. Multocida PM25 y se ha tratado de identificar nuevos factores de virulencia de esta cepa altamente virulenta. Para ello y mediante la complementación de un mutante thyA de c. Coli se ha aislado el gen thy A de P. Multocida. La secuencia de la proteína deducida a partir de la nucleótidos muestra una elevada identidad con su homóloga de H. Influenzae, así como con otras timidilato sintasas de mciroorganismos pertenecientes a las Protebacteris. Solapada a la región 5'thyA de P. Multocida y en el mismo sentido de lectura, se ha localizado la secuencia del gen Igt de P. Multocida, que codifica la fosfatidilglicerol: prolipoproteína-diacilgliceril transferasa. Tal y como sucede en E. Coli, dicha proteína debe de actuar regulando la síntesis de la timidilato sintasa por acoplamiento en la traducción preveniendo la unión a ribosomas. Además, los resultados obtenidos sugieren una ordenación de ambos genes en forma de operón la cual parece exclusiva del grupo gamma de las Proteobacterias. La realización de un dendograma utilizando como base para su elaboración la ezina altamente conservada timidilato sintasa nos ha permitido observar una agrupación muy bien definida de las secuencias de estas enzimas que se corresponde con gran exactitud a la de los diferentes grupos de las Proteobacterias. La obtención de mutantes espontáneos en el gen thyA de P. Multocida por resistencia a trimetoprim ha pemitido demostrar que la reversióin de la deficiencia a la síntesis de timidilato sintasa es extraordinariamente baja, observándose una atenuación muy importante de la virulencia de estos mutante en el modelo animal murino, usando la vía interperitoneal de inoculación. La administración de timina junto al inoculo dentro del modelo experimental animal permite a los mutantes Thy recuperar su virulencia, al igual que la complementación con un plásmido vector portador del gen salvaje. En cambio, la respuesta inmunogéncia que producen estos mutantes Thy no parece ser adecuada en un enfrentamiento homólogo utilizando el mismo modelo animal y vía de inoculación. El conjunto de estos resultados apuntan en que este gen podría ser utilizado para la construcción de vacunas en sustitución de los maracadores de resistencia a antibióticos. Por otra parte y con el objetivo de avanzar en el conocimiento de los factores de virulencia de P. Multocida, se ha logrado identificar, por comparación de perfiles de OMPs (Outer Membrane Proteins) entre cepas virulentas y avirulentas de P. Multocida PM25, el marco abierto de lectura PM1064 como una OMP que presenta una gran similitud con la OMP P4 de H. Influencia, descrita en este patógeno comou n factor de virulencia y como un óptimo inmunógeno candidata ser utilizado en vacunas contra este patógeno. La inactivación de este marco de lectura en P. Multocida por recombinación simple ha permitido obtener mutantes deficientes en la síntesis de la proteína PM1064. La posterior evaluación de la virulencia de estos mutantes nos ha permitido demsotrar que esta OMP no es un factor decisivo en la virulencia de este patógeno, ya que presentan uan DL50 muy similar a la de la cepa parental,.Los datos obtenidos en este trabajo indican que, a diferencia de lo que sucede en H. Ingluenzae donde la OPM P4 interviene en aerobiosis de forma decisiva en la adquisición de la hemina del medio, en P. Multocida probablemente la captura de hemina por parte de su homóloga PM 1064 no es esencial para la virulencia de este patógeno, o bien que dicha proteína tiene una funcionalidad distinta de la descrita para su homóloga de H. influenzae

Autor: ALOU CERVERA LUIS.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La prevalencia de neumococos resistentes acciprofloxacino (CMI,4 mg/L) está mostrando signos de un incremento mundial. En España en dos estudios multicentricos la prevalencia de aislados resistentes a ciprofloxacino fue de 5,3%y 7,1%, en los periodos de 1996-1997 y 1998-1999, respectivamente. Aunque hay muchos estudios dirigidos al conocimiento de los mecanismos de resistencia a la fluorquinolonas en el neumococo, los mecanismos de aparición y diseminación de los aislados resistentes no son todavía bien conocidos. Para ello se estudiaron cepas de Streptococcus penumoniae resistentes a ciprofloxacino donde se estudio su actividad frente nuevas quinolonas como son gemifloxacino y trovafloxacino. Ademas, se realizaron estudios farmacodinámicos con estas quinolonas que incluyeron la actividad bactericida sérica ex vivo, los titulos bactericidas sericos tras la administración de dosis orales de las citadas quinolonas en voluntarios sanos, el efecto postantibiótico in vitro y por último se caracterizó molecularmente mediante electroforesis de campo pulsado aislados de S.pneumoniae resistente a ciprofloxacino así como el mecanismo de expulsión mediante la hibridación con la sonda pmrA(gen responsables de la bomba de expulsión). Una vez evaluados los resultado podemos concluir que: -Gemifloxacino puede ser una alternativa a las terapias clásicas en el tratamiento de cepas multirresistentes de S.pneumoniae, incluso con alta resistencia a ciprofloxacino. -Las diferencias encontradas entre el HPLC y el bioensayo en los niveles alcanzados parecen deberse a variaciones metodológicas. -Tanto gemifloxacino como trovafloxacino mostraron buenos índices de predicción de eficacia clínica en infecciones causas por S.pneumoniae. -El área bajo la curva de los títulos bactericidas(AUBC) parece ser un índice más sensible de los efectos farmacodinamicos que el área bajo la curva (AUC)- -La adición de células polimorfonucleares no incrementó la tasa de muerte de ninguna de las dos quinolonas. -La aparición de neumococos resistentes acciproflocacino parece deberse a mutaciones independientes en la población que han sido seleccionadas por los fármacos, presumiblemente durante el tratamiento con estos antimicrobianos. -La asociación de la resistencia a ciprofloxacino con clones epidémicos internacionales podría garantizar la rápida diseminación geográfica de la resistencia a fluorquinolonas a través de la comunidad. -La ampliación en el número de copias en el cromosoma del gen pmrA no parece contribuir a aumentar la resistencia a ciprofloxacino.

Autor: BALAS FUERTES DELIA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El gen gyrA que codifica la subunidad A de la DNA girasa de S. Pneumoniae ha sido clonado mediante una estrategia basada en reacciones solapantes de PCR y análisis físico de la región cromosómica, habiéndose determinado la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 2685 pb del cromosoma de la cepa R6 que incluye este gen. Un análisis filogenético ha demostrado identidades del 43 a 60% entre GyrA de S. Pneumoniae y otras proteínas GyrA y del 31 a 39% con otras proteínas ParC. Las secuencias de GyrA y ParC de S.pneumoniae mostraron un 39% de identidad. Las secuencias de GyrA y ParC de bacterias gram-positivas con bajo contenido en G+C, formaron grupos diferenciados. Estos datos apoyan las diferentes características de inhibición por Fluoroquinolonas de bacterías Gram-positivas y Gram-negativas. El promotor de gyrA consta de una región -35, similar a la secuencia consenso en E.coli para la subunidad 70 de la RNAP y de un región -10 extendida. La transcripción del gen se inicia a 6 pb del extremo 3' terminal de la región -10 extendida y a 30 pb del codon de iniciación de traducción. La región que contiene el promotor de gyrA tiene una curvatura intrínseca cuyo centro se localiza en el espaciador entre las regiones -35 y -10 del promotor. La curvatura parece actuar como un represor per se puesto que su presencia disminuye la eficiencia de transcripción. El promotor de gyrB tiene una región -35 homologa a la secuencia consenso, no presenta región -10 y el sitio de inicio de la transcripción se encuentra a 46 pb del codon de iniciación de traducción. La transcripción de gyrA y gyrB se produce a partir de promotores independientes, y es estimulada por la relajación del DNA, lo que se denomina respuesta RST (estimulación de la transcripción mediada por relajación). La respuesta RST del promotor de gyrA en S.pneumoniae depende de la curvatura intrínseca, según se deduce de experimentos de inhibición de la actividad de la girasa con novobiocina y ciprofloxacina y de la determinación de la actividad promotora en fusiones del promotor de gyrA y el gen cat. La respuesta RST del promotor de gyrA en E.coli no depende de la curvatura, sino de las regiones -35 y -10 del promotor, del sitido de inicio de la transcripción y de las primeras bases del transcrito, aunque para la función del promotor, tanto en E.coli como en S.pneumoniae, sólo se requiere la región -10Ext y la secuencia posterior. La diferente respuesta RST del promotor de gyrA de nuemococo en estas bacterias, podría deberse a la ausencia en E.coli de un posible represor característico de neumococo. Este represor, con mayor afinidad por DNA superenrollado que relajado, modificaría la curvatura intrínseca inhibiendo la transcripción. La respuesta RST del promotor de gyrB en S.pneumoniae, según se deduce de experimentos de inhibición con novobiocina y ciprofloxacina y de la determinación de la actividad promotora en fusiones del promotor de gyrB y del gen cat fue de 3 veces superior a la del promotor de gyrA con novobiocina, y de 2 veces superior con ciprofloxacina. La estimulación del promotor de gyrA con ciprofloxacina produjo efectivamente un aumento en el superenrollamiento negativo. Este efecto fue más pronunciado en un mutante para parC, que en la cepa silvestre, debido a la inhibición en la cepa silvestre de la actividad de relajación de la topo IV. La estimulación del promotor de gyrA con novobiocina produjuo asimismo un aumento en el superenrollamiento negativo. Este efecto no se observó en un mutante para gyrB resistente a esta droga.

Autor: ÁLVAREZ DÍAZ DOLORES.
Año: 2001.
Universidad: ISLAS BALEARES.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: LABORATORIO DE MICROBILOGÍA.

Resumen: Las cepas de K.pneumoniae suero-sensibles y suero-resistentes, excepto aquellas cepas con serotipos capsulares particulares, activan el sistema del complemento. Las cepas suero-sensibles activan las dos vías del sistema del complemento mientras que las cepas suero-resistentes activan el sistema del complemento principalmente a través de la VA. Las cepas suero-resistentes reducen la activación de la VC gracias a la presencia de la cadena O del LPS, que inhiben la unión del C1q a las porinas. Se han identificado los componentes de la membrana externa implicados en la unión del C3b, por análisis de Western blotting. El LPS rugoso es capaz de activar el sistema del complemento, al igual que el LPS liso. En K.pneumoniae la región del lípido A de la molécula de LPS activa la VC sin la participación de anticuerpos específicos y la cadena O del LPS activa la VA por un mecanísmo independiente del lípido A e independiente de anticuerpo y es el sitio preferente de deposición del C3b en la membrana externa de las cepas de K.pneumoniae suero-resistentes. Las porinas son el sitio más importante de deposición del C3b y de sus fragmentos de degradación en las membranas externas de las cepas suero-sensibles de K.pneumoniae. En experimentos de ELISA con componentes bacterianos purificados de K.pneumoniae, el C3b se une preferentemente a las pornias, al LPS liso y al LPS rugoso, por este orden. Las cepas suero-sensibles unen mayores cantidades de C3b y de sus fragmentos de degradación que las cepas suero-resistentes. El patrón de degradación del C3b es similar en los dos tipos de cepas, con iC3b como la forma predominate del C3 depositado. En los asilamientos clínicos de K.pneumoniae O-, el polisacárido capsular protegé al microoorganismo de la muerte por el complemento y de la muerte por opsonofagocitosis, independientemente del serotipo capsular. Al menos en cuantro serotipos capsualres estudiados, la expresión capsular fue requerida para resistir la actividad bacteriolítica del complemento. La cantidad de cápsula expresada a nivel se superficie bacterina varía entre cepas incluso dentro de un mismo serotipo. La cantidad de polisacárido capsular presente es capaz de modular el acceso del componente C3 del complemento, y por tanto, modular los niveles de activación del sistema del complemento. La cantidad de polisacárido capsular expresado a nivel de superficie bacteriana está regulado, al menos en parte, transcripcionalmente. Y la actividad de la región promotora del orf3 del cluster de enes de síntesis de cápsula, cps, se correlaciona con la cantidad de cápsula producida y expresada por la bacteria. En fase exponencial del crecimiento y en presencia de orina se produce una mayor actividad de la región promotora del orf3 del cluster cps, y una mayor producción de cápsula. La temperatura no influye en la actividad promotora ni en la expresión de cápsula.

Autor: ABALOS RODRIGUEZ ARELIS .
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAT FARMACIA.

Resumen: El trabajo aborda el diseño del medio de cultivo para la producción de ramnolípidos por Pseudomonas aeruginosa ATIO, aplicando la técnica de optimizacion Metodología de Superficies de Respuesta. El análisis químico de los ramnolípidos demostró que Pseudomonas aeruginosa ATIO produce 8 moléculas homólogas que constituyen una mezcla nueva. Los ramnolipidos disminuyen la tensión superficial del sistema hasta 26,8 nN/m con una concentración micelar crítica de 150nN/m; poseen además marcada actividad antimicrobiana frente a hongos y bacterias Gram positivas. Los ramnolipidos producidos por Pseudomonas aeruginosa ATIO incrementan la actividad biodegradativa del consorcio microbiano AM en 34% para la fracción alifática y en un 62,28% para la fracción aromática.

Autor: GARCÍA GARCIA AMPARO.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA .

Resumen: Clostridium difficile es el principal agente etiológico de la diarrea intrahospitalaria, así como del 1-2% de las diarreas de la comunidad. La infección por este microorganismo se relaciona en casi todos los casos con el uso previo de antibióticos y abarca un amplio espectro de enfermedades intestinales como es el estado de portador asintomático, diarrea leve, colitis no complicada y colitis pseudomembranosa. En la Ciutat Sanitaria i Universitaria de Bellvitge (CSUB), la incidencia de la enfermedad asociada a c.difficile (EACD) en los pacientes con diarrea intrahospitalaria es del 10% aproximadamente. Los episodios acontecidos corresponden a casos esporádicos sin que se observe una transmisión intrahospitalaria ni ningún factor de riesgo precipitante. Los pacientes infectados por el VIH, al contrario de los que ocurre en los pacientes con enfermedad hematológica, no son en nuestra institución una población de riesgo para la infección o colonización por C.difficile. En cuanto al diagnóstico de la EACD, la prueba de laboratorio más eficaz es la detección de la toxina B directa de las heces por cultivo celular. No obstante, para una total sensibilidad, es conveniente asociarla a otra técnica, principalmente el cultivo anaerobio. Éste ofrece una sensibilidad variable. Ante una población con baja incidencia de la infección por C.difficile, la prueba más eficaz es el cultivo, simpre y cuando se utilicen técnicas de recuperación de esporas y no se trate de pacientes sintomáticos. Tras el aislamiento del clostridio en el medio de cultivo siempre debe investigarse la capacidad toxigénica de éste. La técnica de cultivo celular realizada directamente a partir de las colonias crecidas en el medio sólido selectivo es un método rápido y sencillo que mejora de una forma global y desde el punto de vista clínico la eficiencia del cultivo anaerobio. Las técnicas de investigación genómica realizadas directamente a partir de las muestras de heces, son pocos útiles para el diagnóstico habitual de la EACD por su gran laboriosidad y sensibilidad insuficiente que en ningún momento supera a la de la prueba de citotoxicidad. En la CSUB, el metronidazol o la vancomicina siguen siendo el tratamiento de elección para la EACD, no habiéndose aislado ninguna cepa con sensibilidad disminuida a ninguno de los dos fármacos.

Autor: MORA GUTIERREZ AZUCENA.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTADE DE FARMACIA.

Resumen: Los E.coli verotoxigénicos (ECVT), y muy especialmente el enterohemorrágico altamente virulenta del serotipo O157:H7 (ECVT O157), son importantes patógenos emergentes que causan patologías muy severas en seres humanos: colitis hemorrágica (CH) y el síndrome urémico hemolítico (SUH). El ganado vacuno y ovino constituyen el principal reservorio de este tipo de microorganismos, siendo la carne picada y las hamburguesas los principales vehiculos de transmisión. Más de la mitad de los terneros y corderos llevan en su flora intestinal ECVT, muchos de los cuales pertenecen a los mismos serotipos O:H que las cepas que causan infecciones en seres humanos. El ECVT O157 ha provocado en los últimos años un gran número de brotes de CH, la mayoría de los cuales han tenido lugar en los países anglosajones y en Japón. En España, las infecciones por ECVT son relativamente frecuentes y se han producido varios brotes, causados principalmente por el ECVT O157 del fagotipo 2. Nos planteamos los siguientes objetivos: -Desarrollar tecnicas capaces de detectar ECVT O157 y no O157 en muestras clinicas, animales asintomáticos portadores y alimentos. -Investigar la frecuencia de las infecciones causadas por los ECVT en pacientes con diarria y otras alteraciones gastrointestinales. -Evaluar el ganado bovino y ovino como reservorio de los ECVT potencialmente patogenos para seres humanos. -Examinar la presencia de los ECVT en carne de vacuno destinada al consumo humano. -Determinar los serotipos O:H y los genes de virulencia de los ECVT aislados. -Establecer los fagotipos y los perfiles de macrorrestricción por PFGE delos cepas del ECVT O157. -Estudiar los genes de virulencia de la isla de patogenicidad LEE y desarrollar PCRs que detecten los diferentes tipos de intiminas y genes tir, espA, espB, y espD. -Evaluar el nivel y los patroens de resistencia multiple a los antibioticos en los ECVT de origen humano y animal.

Autor: ALDONZA GARCÍA LUIS ALBERTO.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: El objeto del presente trabajo es profundizar en el conocimiento de la actividad inmunomuduladora de ciprofloxacina, ofloxacina y pefloxacina. Para ello hemos estudiado la modificación de la capacidad de ingestión y de producción de citoquinas del macrófago peritoneal, inducida por el tratamiento con las citadas quinolonas, dado que ambas son dos de las respuestas más precoces del organismo frente a al invasión por un agente patógeno. Las citoquinas estudiadas son IL-1alfa y TNF-alfa. También hemos estudiado la modificación de la producción de PGE2 inducida por el tratamiento con las citadas quinolonas, en el mismo tipo celular, dado de este prostanoide junto con las citoquinas mencionadas son tres mediadores clave de la respuesta inflamatoria. Para llevar a cabo el desarrollo de nuestro trabajo, hemos sometido a tratamiento con los citados antibióticos, a ratones Swiss OF1 para las experiencias de fagocitosis, ya ratones C5BL/6J para las experiencias destinadas a la producción de las citoquinas objeto de estudio. De cada antibiótico han sido estudiadas las concentraciones máxima y mínima de uso clínico. Los resultados obtenidos muestran que ambas dosis de las tres quinolonas inducen una modificación de la capacidad de ingestión y de la síntesis de las citadas citoquinas y PGE2 por macrófagos peritoneales de ratón.

Autor: MENDOZA DEL CUETO M. TERESA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: DsbA es una proteína que pertenece a la familia enzimática Trx de tiol-disulfuro óxido-reductasas, localizada en el periplasma bacteriano, y catalizadora de puentes disulfuro. La formación de estos puentes disulfuro es importante para la adquisición de una conformación estable y activa de un número de proteínas extracitosólicas, entre las que se incluyen factores relacionados con la virulencia de bacterias como Escherichia coli, Shigella flexneri o Vibrio cholerae. Previamente, en nuestro laboratorio se habían descrito tres genes de Salmonella (dlp, en el plásmido de virulencia de S.enteritidis, dlt y del en el cromosoma de S.typhi y de S.enteritidis, respectivamente) cuyos productos tienen la secuencia Cys-Xaa-Xaa-Cys característica de las proteínas de la familia Trx, pero que daba su baja homología (33%) con dsbA suponíamos que no correspondían con el alelo de dicho gen. Posteriormente, hemos conseguido clonar los genes dsbA de S.typhi y de S.enteritidis, los cuales presentan una homología del 83% con dsbA de E.coli. Así mismo hemos comprobado que estos genes de Salmonella son capaces de complementar las deficientes fenotípicas descritas en el mutante dsbA::kan (SS140) de E.coli, en cuanto a la disminución de la actividad fosfatasa alcalina y glucosa-1-fosfatasa, crecimiento en presencia de sales de cadmio y zinc, formación de biofilm y, parcialmente, la sensibilidad a DTT 10 mM. Por otra parte, hemos interrumpido del gen dsbA de las cepas 5866 de S.typhi y 366 de S.enteritidis (que carece de plásmido de virulencia), observando que estos mutantes presentan una disminución en la capacidad invasiva y adhesiva en células epiteliales (Henle-407) y en la supervivencia en macrófagos (U-937). La disminución en la invasión y adhesión en Henle-407 es complementada totalmente por los genes dsbA y delp en bajo número de copias; sin embargo la menor supervivencia en U-937 sólo es complementada parcialmente por estos genes. Otras alteraciones fenotípicas presentes en estos mutantes son la pérdida de movilidad, enlentecimiento del crecimiento, sensibilidad al crecimiento en presencia de DTT, de sales de cadmio y zinc, así como deficiencia en la actividad de la glucosa-1-fosfatasa. Además las últimas 200 pb de la secuencia 3' del gen dsbA son específicas de género y se pueden emplear como método rápido para diferenciar Salmonella del resto de las enterobacterias.

Autor: MONTES CAMPOS M. MERCEDES.
Año: 2001.
Universidad: VIGO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS.

Resumen: Este trabajo se engloba dentro del marco de la acuicultura marina, concretamente dentro del cultivo de rodaballo. Este sector, de gran importancia en España y en Galicia, constituye una alternativa a la pesca dada la crisis por la que atraviesa dicho sector. A pesar de la importancia económica del sector acuícola, éste se ha tenido que enfrentar con una serie de problemas administrativos, zoosanitarios y medioambientales para intentar resolverlos. Nuestro interés radica en aquellos problemas relacionados con la Microbiología del medio ambiente, como el control de brotes epizoóticos, el control de la calidad de las aguas de los sistemas de cultivo o la evaluación del impacto ambiental que el vertido de las aguas de los cultivos supone en el medio natural. Todos estos aspectos implican la necesidad de un estudio exhaustivo de la microbiota autóctona ligada a los cultivos marinos. Por ello, se ha realizado un estudio de la microbiota bacteriana asociada al cultivo de rodaballo (Scophthalmus maximus). Las 496 cepas bacterianas obtenidas de epidermis de rodaballo y de su agua de cultivo, se caracterizaron fenotípicamente y se sometieron a un estudio de taxonomía numérica. Además se realizó una caracterización molecular de las principales cepas de Vibrio utilizando las técnicas del ribotipado y la secuenciación de los genes que codifican para el ARNr 16S, para confirmar las identificaciones fenotípicas y asignar aquellas pocas precisas. Los aislados obtenidos fueron bacterias heterótrofas, Gram-negativas que se dividieron en dos grandes grupos: bacterias anaerobias facultativas o fermentadoras y bacterias no fermentadoras o con metabolismo aerobio. La mayoría de las cepas fermentadoras pertenecieron al género Vibrio, y las especies mayoritarias descritas en el estudio fenotípico fueron: V.splendidus I, V.aestuarianus, V.fischeri, V.ordalii y V.scophthalmi. Para las bacterias no fermentadoras se difinieron 4 grandes grupos: Shewanella, Pseudomonas, Pseudoalteromonas y Flavabacteriu. El análisis molecular señaló la presencia de cepas de V.scophthalmi, V.splendidus I, V.lentus y V.fischeri, observándose tanto la variabilidad inter como intraespecífica y definiéndose diferentes ribotipos para las especies mencionadas. Se ha observado que los métodos moleculares son necesarios en las identificaciones al nivel de especie dada la gran variabilidad fenotípica existente entre las cepas ambientales. Sin embargo se han podido describir caracteres diferenciales interespecíficos para las principales especies descritas en este estudio. Por otro lado, este trabajo supone la primera descripción de V.scophthalmi aislado de agua de mar y de la epidermis de los rodaballos, características que la señalan como una bacteria específicamente ligada al cultivo de rodaballo. También, la presencia de cepas de V.lentus supone la primera descripción de esta especie asociada a este cultivo. Por último cabe señalar la presencia, como microbiota normal, de cepas de V.splendidus y V.fischeri, especies que pueden provocar epizootías en determinadas condiciones. Palabras clave: cultivo de rodaballo, taxonomía numérica, ribotipado, secuenciación, Vibrio, V.splendidus, V.lentus, V.scophthalmi, V.

Autor: CANDUELA PÉREZ MIREN JOSUNE.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: Aislamientos de Acinetobacter baumannii, juegan un papel fundamental en brotes de neumonía nosocomial. Estas infecciones son muy difíciles de tratar debido a la habilidad de estos microorganismos a convertirse rápidamente en resistentes a múltiples grupos de antibióticos. Los objetivos de este trabajo fueron: investigar y comparar la evolución de la resistencia antibiótica y de la estructura clonal de la población de aislamientos de A.baumannii recogidos en el hospital de Santa Marina mediante la aplicación de técnicas de identificación genética y detectar y caracterizar nuevos mecanismos de resistencia como los integrones de clase 1, analizar su distribución en la población y determinar su implicación en la resistencia. Se analizaron 102 cepas en el año 1999 y 82 en el año 2002. Los antibióticos más eficaces fueron amikacina, meropenem e imipenem un porcentaje importante de los aislamientos eran multirresistentes a todos los antibióticos y la mayoría presentaban resistencias múltiples a una media de 7 antibióticos. Mediante RAPD y ERIC-PCR observamos 3 genotipos predominantes en el año 1999, denominados I, II, III, siendo el II el mayoritario. Se han encontrado integrones de clase 1 en un 91% de la población. La presencia de integrones en las cepas estudiadas parece estar relacionada con el desarrollo de resistencias puesto que los aislamientos con integrones mostraron un nivel de resistencia mayor especialmente a aminoglicósidos y b-lactámicos, hecho que queda demostrado por la secuenciación de dos de los integrones en los que se obtuvieron genes ANT (2'), AAC (6')-Ib y OXA7. En el año 2002 hemos observado un aumento de la resistencia sobre todo a amikacina y meropenem al igual que un aumento en cepas resistentes a todos los antibióticos. Estos aislamientos pertenecían mayoritariamente el clon I que ha desplazado al clon II como clon predominante. Los integrones detectados son de los mismos tamaños que los del año 1999 pero uno de ellos se ha diseminado ampliamente entre los aislamientos resistentes aún perteneciendo a clones diferentes. Es importante destacar la presencia de varios integrones a la vez en cada aislamiento. Aunque otros mecanismos como la impermeabilidad de la membrana o presencia de bombas de reflujo podrían estar implicados, este estudio demuestra la relación de la resistencia mostrada en los aislamientos de A.baumannii estudiados con la diseminación de un clon mayoritario que ha adquirido varios integrones de clase 1 a lo largo del periodo de estudio.

Autor: PUJANA URIARTE IDOIA.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: Las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en enfermos bronquiectásicos crónicos están asociadas con un aumento de su tasa de mortalidad y una disminución de su calidad de vida. Nuestro trabajo se basa en el estudio epidemiológico (previa estandarización de técnicas de tipado basadas en la PCR) de estos aislamientos con objeto de establecer si persiste la misma bacteria a lo largo del todo el periodo de infección, si las variaciones de la respuesta a antibióticos y la aparición de mucosidad esta relacionada con cambios genéticos, y establecer el grado de homología entre los aislamientos detectando si un mismo clon infecta varios pacientes. Así mismo se estudiaron los niveles de resistencia a los antibióticos y se detectaron nuevos mecanismos de resistencia como son los integrones de tipo 1. Nuestros resultados mostraron que la técnica de "PCR-fingerprinting", con los iniciadores RD1 y ERIC2, ha demostrado ser una herramienta muy útil para el tipado de aislamientos clínicos de P.aeruginosa permitiendo la determinación genética específica y rápida de todos los aislamientos estudiados. Nuestros resultados demuestran que siempre que se lleve a cabo una estandarización meticulosa de los parámetros de la reacción, la técnica resulta ser rápida, reproducible e interpretable. El análisis de los perfiles de bandas de ADN obtenidos y de sus coeficientes de similitud, permitió identificar 66 genotipos distintos en los 196 aislamientos estudiados que procedían de 61 pacientes bronquiectásicos crónicos tratados en el Hospital de Santa Marina de Bilbao entre 1993 y 1999. Nuestros resultados constataron que mayoritariamente los pacientes bronquiectásicos mantienen de forma crónica un único clon propio de P.aerugonosa independientemente de las variaciones fenotípicas (mucosidad y variación de la respuesta a los antibióticos) que se observan en cada aislamiento. Sólo en un número pequeño de casos se identificó la presencia de distintos clones en el mismo paciente, o del mismo clon en diferentes pacientes. El nivel de resistencia a los antibióticos fue elevado, siendo el último de los aislamientos de cada clon el más resistente. En general el antibiótico más eficaz era amikacina, seguido de amikacina, segudio de ceftazidima; y los menos activos cefotaxima y ciprofloxacino. Además, un porcentaje importante de los aislamientos eran multiresistentes a una media de cuatro antibióticos. La diseminación de integrones de clase 1 entre los aislamientos de P.aeruginosa del Hospital de Santa Marina es un aspecto a tener en cuenta ya que desde que se detectó la primera de estas estructuras en un aislamiento del año 1996, se ha constatado un aumento de su presencia. Se detectaron cuatro estructuras distintas con tamaños de 1700, 1400, 800 y 700 pb respectivamente, que aparecen en el 24% de los aislamientos estudiados. La presencia de integroens en las cepas estudiadas parece estar relacionada con el desarrollo de resistencias, puesto que los aislamientos con integrones muestran un nivel de resistencia mayor a los antibióticos, especialmente a aminoglicósidos y betalactámicos.

Autor: PALLOTTI CLAUDIA GABRIELA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La pared celular de Candida albicans esta formada basicamente por glucanos, manopreoteinas y quitina que se disponen formando una estructura tridimensional y dinamica. La quitina y B-glucanos forman el esqueleto rigido de la pared por lo que la quitina aunque es uno de los componentes minoritarios es fundamental para la insolubilización del resto de los componentes y por lo tanto la actividad quitinásica es basica para el crecimiento fungico. Durante el analisis de los productos obtenidos para la degradación controlada, con tripsina, de paredes celulares purificadas de C. Albicans previamente solubilizadas con SDS se aisló una proteína de 50 kDa que fue purificada y secuenciada. La secuencia amino terminal de la proteina de 50 kDa presentó un 100% de homología con la quitinasa 2 y un 92% con la quitinasa 3 de C.albicans. Para conocer la función biologica de estas quitinasas en C.albicans se realizó la delección de los genes CaCHT2 y CaCHT3 y debido a la elevada homologia que existe entre las quitinasas de C. Albicans con la quitinasa de S.cerevisiae se obtuvo también la cepa interrumpida en el gen ScCTS1 de S.cerevisiae. Así como las cepas sobreexpresantes del gen CaCHT2 tanto en C.albicans como en S. Cerevisae. Se estudio la expresión de los mensajeros de los genes CaCHT2 y ScCTS1 y se realizaron analisis fenotipicos de las cepas deleccionadas y sobreexpresantes de C.albicans y de S.cerevisiae así como analisis electroforeticos del material solubilizado por la tripsina de paredes celulares tanto de C.albicans como de S.cerevisiae asi como del material de diferentes fracciones subcelulares y de sobrenadante de medio de dichas cepas. Los resultados obrenidos sugieren que las enzimas que degraban los polimeros de la pared celular la quitinasa 2 y 3, están involucradas en los procesos morfogeneticos, además de la existencia de mecanismos compensatorios para un funcionamiento sincronizado de las enzimas invulucradas en la sintesis y/o remodelacion de la pared durante el crecimiento, para mantener la integridad celular.

Autor: TAPIAS RIBOT ANGELS.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DEL DOCTORADO Y DE FORMACION CONTINUADA.

Resumen: La construcción de fusiones transcripcionales con el gen recA y su analisis en los distintos miembros de la familia Rhizobiaceae ha permitido establecer la existencia de una regulación interespecífica, lo que a nivel funcional significa la presencia en dicha familia de una vía reguladora común para este gen. Tras determinar este punto, se abordó la caracterización molecular del motivo regulador del gen rec A de Rhizobium etli, que hemos demostrado que corresponde a la secuencia GAAC-N7-GTAC. Sin embargo, y para poder afirmar que tal secuencia era la caja SOS, era necesario disponer de otros genes pertenecientes al sistema SOS de estos microorganismos. Para ello, y mediante experimentos de complementación con cepas mutantes se aisló el gen uvrA de Sinorhizobium meliloti. Adyacente a este gen, pero con el sentido de transcripción opuesto, se detectó la presencia del gen ssb. El análisis de la región promotora de los dos genes nos permitió determinar que ambos eran inducibles por lesiones en el DNA y que dicha inducibilidad dependía del motivo GTTC-T7-GTTC que es la secuencia reversa y complementaria de la que, como ya seha comentado, controla el gen recA(GAAC-N7-GTAC). El analisis comparativo de los promotores SOS de diferentes miembros de la clase Alfa de las proteobacterias, grupo taxonómico al que pertenece la familia Rhizobiaceae, ha revelado que su caja SOS es la repetición directa GTTC-YYKTTTT-GTTC, siendo este el primer caso conocido en que el motivo regulador SOS no es de naturaleza palindrómica. Así mismo, se ha clonado el gen lexA de R.sphaeroides para proceder a su análisis. La construcción de una cepa mutante deficiente en este gen, ha demostrado inequívocamente que su producto, la proteína LexA, es el represor del sistema SOS y que la organización de este presenta características diferentes importantes en comparación con el de otros microorganismos caracterizados previamente. Finalmente, se ha purificado la proteina LexA de R.sphaeroides y se han analizado sus características de unión a DNA. Los resultados obtenidos demuestran que la proteína LexA de R.sphaeroides presenta afinidades similares para los diversos operadores SOS de este microorganismo y forma un complejo ternario con la RNA polimerasa, lo que sugiere que su mecanismo de acción se basa en el bloqueo de un paso posterior a la unión RNA polimerasa-promotor. Esta sería el primer caso en que se demuestra este tipo de mecanismo regulador para una proteína LexA.