BACTERIOLOGIA, 3

Autor: SOTA BUSSELO MERCEDES .
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE EMDICINA.

Resumen: En el campo de la evalución de la actividad microbactericida de los desinfectantes no existe un "gold estándar" aceptado universalmente y los métodos disponibles adolecen algunos defectos que los hace dificilmente estadanrizables. La metodología de este trabajo está basada en el método descrito por Best y Sattar para la evaluación de desinfectantes microbactericidas y presenta algunas modificaciones con respecto a la inóculo y a la sustancia interferente empleados. Se ha realizado en primer lugar un test de suspension cuantitativo con y sin sustancia interferente y posteriormente un test con portagérmenes cuantitativo con y sin sustancia interferente. Se ha estudiado la sensibilidad de glutaraldehído alcalino al 2%, glutaraldehído-fenolato 1/16 (0,17% glutaraldehído + 0,59% fenolato) y N-duoproepnida 1/10 (2,28%) frente a 13 aislados clínicos de M. Tuberculossi, M. Avium-intracellulares y Mycobacterium kansasii y frente a la cepa patrón de M. Smegmatis CIP 7326. Se ha considerado que un desinfectante posee buena actividad microbactericida si consigue una reducción del inóculo inicial en todas las cepas testadas>3 log en los 4 test realizados con tiempos de contacto de 20 minutos y a una temperatura de 20ºC. El glutaraldehído alcalino al 2% ha demostrando una excelente actividad micobactericida superando todos los tests de evaluación. El glutaraldehído-fenolato 1/16 no debería considerarse para realizar una desinfección de alto nivel ya que no ha superado todos los ensayos: ha superado todos los tests realizados con la cepa patrón pero no todos los realizados con los aislados clínicos. N-duopropenida ha demostrado en este estudio poseer una débil actividad micobactericida ya que no ha superado ninguno de los tests de evaluación realizados con los aislados clínicos y ha superado sólo los ensayos sin sustancias interferentes realizados con la cepa patrón.

Autor: ALCANTARA NOALLES M. JOSE.
Año: 2000.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MIGUEL HERNANDEZ.

Resumen: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) es uno de los principales microorganismos causantes de brotes e infeccion intrahospitalarios. La determinacion de los diferentes clones existentes en un hospital resulta de vital importancia para poder determinar los reservorios, mecanismos de transmision y asi, poder actuar sobre ello. Se estudiaron 46 SARM del Hospital de Elche aislados durante 5 años y pertenecientes a dos brotes nosocomiales y a casos esporadicos. Se analizaron mediante tecnicas fenotipicas (antibiograma y fagotipia) y genotipicas: Random Amplified polymorfic DNA(RAPD), electroforesis en campo pulsado (PFGE)y Southern blot, con el fin de determinar la relacion existente entre ellos. El antibiograma diferencio 6 patrones diferentes, de los que los mas frecuentes (PR1 y PR2, con multiresistencias asociadas) englobaron el 85% de los aislados. La fagotipia directa solo tipificó al 76% de los aislados. Un 96% de los SARM mostro una expresion de la resistencia a meticilina alta, clases III o IV. Entre los 46 estafilococos estudiados, ninguno mostró una sensibilidad disminuida a la vancomicina. Mediante la combinacion de 3 cebadores (AP7,AP5 y AP3) con el RAPD diferenciamos 5 genotipos diferentes, de los que el AAA y el CAA englobaron al 91,5% de los estafilococos. La electroforesis en campo pulsado fue la tecnica mas discriminativa y diferencio 7 genotipos, siendo el A el mayoritario (86% de las cepas). Dentro de este genotipo distinguimos 11 subtipos, de los que el A1 y el A2 aparecen el 45% de las cepas cada uno. El Southern blot con posterior hibridacion con la sonda para el gen mecA diferencio tan solo 3 polimorfismos, mientras que con la sonda para el transposon 554 diferencio 5 polimorfismos. Con la combinación de las tecnicas utilizadas, se identificaron 13 clones diferentes entre los Staphylococcus aureus resistentes a meticilina del Hospital del Elche. Teniendo en cuenta sus caracteristicas genotipicas( polimorfismos del gen mecA: genotipos obtenidos mediante la electroforesis en campo pulsado: polimorfismos del transposon 554) y fenotipicas (antibiograma y nivel de resistencia a meticilina) estos 13 clones se pueden agrupar en 3 grupos clonales diferentes:I::A::a, II::B:NH y X::A::a. El clon I::A::a y sus variantes (I::A::a,I::A::b, I::A::M y I::A::N) es el clon endemico en el Hospital de Elche. Aparece en el 76% de los SARM estudiados, y es el dominante en los 5 años estudiados. Presenta las caracteristicas propias del llamado "clon iberico": genotipo I::A::a, un nivel de resistencia a meticilina alto (clases III o IV), un patron de multiresistencias asociadas a la resistencia a meticilina (PR1 y PR2) y una gran capacidad de diseminacion.

Autor: ABITIU NIHAL.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA .

Resumen: En la presente Tesis se aportan estudios sobre la variabilidad en los genes implicados en la biosintesis del nucleo del Lipopolisacarido (LPS) en miembros de la familia Enterobacteriaceae. En primer lugar se finalizan los proyectos de secuenciacion de los genes implicados en este proceso biosintetico, localizados en la agrupacion genica (o cluster) waa, para las especies Serratia marcescens N28b y Klebsiella pneumoniae C3(14 y 13 genes e S. Marcescens y K.pneumoniae C3, respectivamente). En segundo lugar se atribuyen funciones a cada uno de los genes en el proceso de biosintesis del nucleo mediante: (i) experimentos de complementacion con mutantes de E. Coli K-12 y/o de Salmonella enterica serovar Typhimurium, (ii) similitud de secuencia, y (iii) comparacion de las funciones atribuidas con estructuras parciales del nucleo del LPS de estas dos especies bacterianas. En tercer lugar se concluye que dichas agrupaciones waa se encuentran bastante conservadas en diferentes cepas pertenecinetes a diferentes serovares de atigeno O en las dos especies estudiadas. A partir de estos datos y de estudios previos se analizan comparativamente las agrupaciones waa de E. Coli K-12, R-1,R-2,R-3,R-4, S.enterica serovar Typhimurium, Serratia marcescens N28by Klebsiella pneumoniae C3. La ultima parte de la Tesis demuestra la existencia de homologos del gen WaaE en especies que presentan un residuo de Glucosa unido mediante en la B 1 --->4 al residuo de L-glicero-manno-D-Heptosa I (especies K. Pneumoniae, S.marcescens, proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica y Enterobacter aerogenes). Finalmente se establece una misma función para los genes waaE de estas cinco especies bacterianas mediante experimentos de complemenacion de mutantes waaE de S.marcescens y K.pneumoniae con genes waaE aislados por PCR de cada una de estas especies. Se establece la existencia de dos modelos de nucleos de LPS en los miembros de las Enterobacteriaceae en funcion de la presencia o ausencia del gen waaE.

Autor: SANCHEZ ROITZ CESAR O..
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: 1. Identificación de un gen/es de Aeromonas hydrophila y de Plesiomonas shiglloides implicado en la biosíntesis del LPS: Los resultados obtenidos nos ha permitido caracterizar geneticamente un gen de Aeromonas hydrophila que, expresado en Escherichia coli, confiere resistencia a la bacteriocina 28b. En este trabajo hemos descrito la posibilidad de utilizar la bacteriocina 28b para identificar genes implicados en la biosíntesis del LPS, concretamente del lípido A, en Aeromonas hydrophila. El gen caracterizado, denominado waaN, codifica para una aciltransferasa que interviene en el paso de acilación final en la biosintesis del lipido A. Especificamente se trata de una miristoiltransferasa. La mutación del gen waaN de Aeromonas hydrophila, la primera que se realiza en pasos de la biosintesis del lipido A en este genero, provoca una disminución de los niveles de ácido miristico unido al lípido A, sin afectar los niveles de acido láurico. Así mismo hemos observado que el gen waaN no es esencial para el crecimiento. Su mutación provoca cambios en la velocidad de crecimiento, así como cambios morfológicos importantes de las colonias y a nivel celular. Características muy similares a las descritas posee el gen waaN de Pleiomonas shigelloides, cuya similitud nucleotídica con el gen waaN de Aeromonas hydrophila es también muy alta. La mutación del mismo tampoco es esencial para el crecimiento, y confiere a la cepa caracteristicas fenotipicas similares al mutante AH3 waaN. Estos cambios fenótipicos pueden deberse a modificaciones en la fluidez de la membrana, asi como alteraciones en la pared celular. Uno de los aspectos más interesantes de los mutantes está relacionado con la pérdida de virulencia. Los mutantes AH3 waaN y PS302 waaN muestran una disminucion en su capacidad de invasividad y adherencia muy marcada, asi como diferencias en otros aspectos relacionados con la patogenocidad como la sensibilidad al suero y al complemento. Por estos resultados podemos deducir que el gen waaN es necesario para la virulencia de ambas especies. 2. Determinar el efecto de la mutación de gen yibD de Klebsiella pneumoniae sobre la composicióndel polisacárido capsular: El gen yibD esta presente en el cluster waa de klebsiella pneumoiniae C3 pero su participación en la sintesis del nucleo del LPS esta practicamente descartada. Las aproximaciones realizadas, así como las características del producto del gen, nos indican que el mismo no está implicado en la biosíntesis del LPS. Metodos biologicos e inmunologicos indican que la capsula si se ve alterada cuando se realiza la mutación del gen yibD. El mutante NC16 resultó ser resistente al bacteriofago especifico del antigeno k o -2 y el analisis de ELISA (para antigenos K2) indicaba un cambio en la capsula que podía ser disminucion de cantidad o cambio en la composición del polisacarido capsular. Al realizar el análisis de composición no se observaron diferencias importantes entre el mutante NC16 y la cepa parental por lo que inferimos que las diferencias observadas en las pruebas biológicas e inmunológicas se debena una disminución en la cantidad del polisacárido capsular. Posiblemente el producto del gen yibD participe de algún modo en la unión covalente que se establece entre el polisacárido capsular y el nucleo del LPS y al mutar dicho gen se produzca, por esta razon, una disminucion en la cantidad de capsula. Asi mismo el gen yibD de klebsiella pneumoniae está relacionado directamente con la virulencia como lo demuestran los resultados de los estudios de DL50 realizados. Esta perdida de virulencia se puede deber a la disminución de capsula sugerida.

Autor: COMAS RIU JAUME F..
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: BIOLOGIA.

Resumen: Para valorar y aplicar los sistemas de citometria de flujo convencionales al análisis bacteriano se han aplicado técnicas de análisis citométrico a un conjunto de situaciones y tratamientos en cultivos axénicos bacterianos. Las medidas se han hecho sobre la partícula respecto a criterios de tamaño y recuento celular, analizando las señales obtenidas con diferentes marcadores fluorescentes. La aplicabilidad de la técnica ha sido demostrada en la diferenciación de las diferentes fases del ciclo bacteriano analizando parámetros citométricos estructurales y funcionales. A continuación se realiza la comparación citométrica entre diferentes cepas en estado estacionario, y el análisis estadístico de sus distribuciones con la finalidad de encontrar unos rasgos característicos para cada cepa o grupo. La cuantificación y análisis del mecanismo de acción de diferentes agentes letales y tóxicos son estudiados citométricamente en dos organismos (E.coli y S.aureus), de características biológicas y citométricas bien diferenciadas. Se aplican en estas cepas tratamientos de referencia de efectos conocidos (choque térmico, paraformaldehido y gramicidima) y se analiza por citometria su efecto según las variaciones detectadas en los parámetros de refrigencia celular y usando marcadores del contenido aparente de ácidos nucleicos, permeabildiad de membrana y actividad metabólica (fundamentalmente potencial de membrana y actividad esterásica intracelular). Una vez establecidos los efectos citométricos causados por estos tratamientos, se aborda el análisis de tratamientos más complejos que actúan sobre la célula a diferentes niveles, como la aplicación de tensioactivos y el choque osmótico. El análisis citométrico de estas sitauciones permite detectar las células a pesar de la presencia de partículas abióticas en el rango de tamaño celular, y hacer medidas relacionadas con los cambios metabólicos o estructurales causados por el tratamiento. La parte experimental se cierra con un análisis de heterogeneidad efectuado en un sistema de mayor complejidad como es la endoesporulación en un bacilo. El análisis de las diversas poblaciones en función de su marcaje y características ópticas que aparecen y se suceden en el tiempo se complementa con su purificación y análisis por otras técnicas, como microscopía óptica y electrónica, o medidas de viabilidad, lo que permite relacionar las características citométricas de las diferentes subpoblaciones con sus características biológicas. La aplicación de las técnicas de citometria de flujo al análisis de microorganismos supone disponer de una herramienta de estudio pobalcional con las características añadidas de velocidad y capacidad de purificación, que hace posible la medida simultánea de diferentes parámetros estructurales y funcionales celulares.

Autor: CASTILLO FERNANDEZ DEL PINO FRANCISCO JAVIER DEL.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: Las hemolisinas son toxinas que provocan la lisis celular desestabilizando la estructura de la membrana plasmática, siendo uno de los tipos de factores de virulencia más frecuentes en basterias patógenas. La estirpe comensal Escherichia coli K-12 ha sido considerada tradicionalmente como no hemolítica. Sin embargo, la hiperproducción en E. Coli K-12 de varios reguladores transcripcioinales provoca la aparición de un fenotipo hemolítico que no se expresa en las condiciones habituales de cultivo. En este trabajo se ha clonado un nuevo gen cromosómico de E.coli K-12, sheA, cuyo producto presenta actividad hemolítica por sí mismo. El polipeptido SheA carece de péptido señal y de otras señales conocidas para la secreción, a pesar de lo cual es exportado de SheA es independiente de su actividad hemolítica y es acompañada por la liberación transitoria al medio de componenetes periplásmicos, sin que se detecte lisis o perdida de viabilidad de las celulas productoras. La hemolisina SheA no presenta similitudes con otras toxinas citoliticas, siendo el prototipo de una nueva familia de citolisinas. Existen genes homologos de sheA en varias enterobacterias patogenas, de los cuales hemos clonado y caracterizado los correspondientes a E.coli O157:H7 y Shigella flexneri.

Autor: LLULL PEÑALBA DANIEL.
Año: 2000.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CIB (CSIC).

Resumen: El tipo 37 de Streptococcus pneumoniae sintetiza una cápsula formada por un homopolisacárido de glucosa ramificado, siendo la estructura y composición más sencilla de las descritas hasta el momento entre los polisacáridos capsulares de neumococo (se han descrito 90 tipos capsulares diferentes en S.pneumoniae). La cápsula es el principal factor de virulencia de este microorganismo, ya que las estirpes que han perdido la capacidad de sintetizarla son prácticamente avirulentas ya que son fagocitadas rápidamente por el sistema inmunitario del huésped. Dada la importancia de la cápsula, el estudio del tipo 37 parecía ser adecuado para aportar datos acerca de los procesos desconocidos de la síntesis capsular en este microorganismo. No obstante, el estudio del locus cap, responsable de la síntesis en los tipos capsulares estudiados hasta el momento, reveló que este serotipo es un caso especial, ya que la síntesis capsular no está asociada a locus cap37, sino que éste constituye el resto genético del locus capsular de otro serotipo, el 33F. Los neumococos de tipo 37 son binarios genotípicos, puesto que conservan este locus cap37 críptico y, además, poseen un gen, tts, localizado en otra región cromosómica que es el verdadero responsable del síntesis de este homopolisacárido. El gen tts codifica una enzima con actividad beta-glucosiltransferasa dual, para producir los dos tipos de enlace presentes en el polisacárido. La enzima Tts es una proteína asociada a la membrana que conserva su funcionalidad cuando se expresa en otros microorganismos Gram-positivos. Las peculiaridades genéticas encontradas en el estudio del tipo 37 son extrapolables a todos los aislados de este serotipo, ya que todos ellos pertenecen a un único clon que ha permanecido genéticamente estable a lo largo del tiempo.

Autor: MARCO NOALES M. ESTER.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS - UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Vibrio vulnificus serovar E es una bacteria patógena de anguila y del ser humano. Hasta el momento se ha aislado principalmente de anguilas enfermas, pero hay también algunos aislamientos clínicos y ambientales. La hipótesis de partida de esta Tesis es que el reservorio de esta bacteria debe ser el ecosistema acuático, encontrándose no sólo en las anguilas sino también en el agua, el sedimento y los moluscos filtradores. Así pues, el objetivo principal fue analizar las estrategias de supervivencia de V. Vulnificus serovar E. Dentro y fuera de su hospedador natural, la anguila. De resultados obtenidos se derivan varias conclusiones. Esta bacteria sobrevive dentro de la anguila porque resiste la acción bactericida del complemento del suero, siendo responsable de dicha resistencia la cadena lateral O del lipopolisacárido característico del serovar. Fuera de la anguila, el patógeno adopta estrategias de supervivencia características de las bacterias acuáticas. Asi, es capaz de sobrevivir durante largos períodos sin nutrientes, y mantiene esas condiciones su potencial virulento tanto para la anguila como para el ser humano. El rango de salinidades y temperaturas a las que puede sobrevivir es amplio, abarcando desde salinidades del 0,3% hasta las típicas del agua de mar, 3,8% y temperaturas de entre 12 y 30ºC, es decir, que puede sobrevivir en aguas estuarinas y marinas en las diferentes épocas del año. A temperaturas bajas (5ºC) o en ausencia de sales adopta el llamado estado viable no cultivable, perdiendo la cultivabilidad en medio sólido pero reteniendo la actividad metabólica, cuando la temperatura asciende la bacteria revierte al estado cultivable, a través de lo que puede ser un proceso de "resucitación" o a través del recrecimiento de unas pocas células cultivables no detectadas previamente. Sin embargo, cuando la no cultivabilidad es inducida por la carencia de sales las células no recuperan el estado original. Como paso previo a algunos de los experimentos realizados se puso a punto una técnica de inmunofluorescencia sensible, específica, rápida y útil para la detección y enumeración de la bacteria. Mediante esa técnica se comprobó que este patógeno puede coexistir con varias especies bacterianas en agua de mar artificial sin nutrientes, si bien algunas de estas especies, como Aeromonas hydrophila, ejercen un efecto perjudicial; por otro lado, cuando los nutrientes están presentes, éstos parecen ser utilizados más eficientemente por algunos competidores. Todo esto podría explicar la dificultad para el aislamiento de V. Vulnificus serovar E a partir de muestras acuáticas en los medios de cultivo habitualmente empleados para ello. Se observó también que la bacteria sufre una intensa predación en aguas naturales por parte de los protistas, no constituyendo una causa de disminución de su supervivencia en esta agua otros factores como la presencia de bacterias competidoras y de virus bacteriófagos. La caracterización de cepas ambientales de la especie en este trabajo ha puesto de manifiesto la existencia de un subserovar no patógeno para anguila dentro del serovar E. De V. Vulnificus. Por último, se comprobó que el agua es la vía primaria de transmisión de esta bacteria, la cual puede entrar en la anguila por varios orificios naturales pero preferentemente a través de la piel, sobre la que forma un biofilm cuando el número de individuos bacterianos todavía no es suficiente para desarrollar una infección. En definitiva, V. Vulnificus serovar E no es un patógeno obligado de anguila sino un patógeno oportunista (primario para anguila y secundario para el ser humano) capaz de sobrevivir en el ambiente acuático fuera de su hospedador natural, aunque debe estar presente en baja proporción.

Autor: LLAMAS COMPANY INMACULADA.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Halomonas eurialina es una bacteria halófila moderada frecuente en los hábitats hipersalinos, especialmente en los suelos salinos. Este microorganismo es un bacilo Gram negativo aerobio que se caracteriza por la producciónd e expolisacárido (EPS). Se encuadra dentro de la familia Halomonadaceae. Para la realización de la presente Tesis Doctoral se eligió la cepa F2-7 de Halomonas eurihalina. Dicha bacteria simetiza el EPS V2-7, polímero de interés industrial con el que se pueden preparar suspensiones acusosas de viscoidad intermideia y comportamiento pseudoplástico, que gelifican al descender el pH. El trabajo realizado ha incluido la puesta a punto de las técnicas de biología molecualr salvando siempre dos obstáculos la presencia del material extracelular viscoso y los altos requerimientos salimos del microorganismo objeto de estudio. Por otra parte, a lo largo del estudio, hemos obtenido mutantes con marcadores genéticos, que eránd e gran utilidad para llevar a cabo estudios posteriores. Hemos hecho el análisis de la organización genómica de la cepa F2-7, determinando el tamaño del cormosoma (2,500 kb) y comprobando las presencia de dos plásmidos, pVE1 y pVE2, cuyos tamaños, mapas genéticos, funcióny homología conotros plásmidos de bacterias halófilas moderadas han sido estudiadas. Por último, hemos iniciado el rastreo del genoma consondas específicas, estudios de complmentación con mutantes deficientes en exopolisacárido y análisis de las secuencias génicas mutadas por transposición. Mediante mutagénesis con el transposónmini-Tn5 se ha seleccionado el mutante S36K, de fenotipo colonial liso, afecto en el gen carB que se corresponde con la subunidad mayor del enzima carbamilfosfato sintestasa. En Halomonas eurihalina cepa F2-7 dicho enzima está codificado por dos genes carA y carB que se encuentran dispuestos de forma contigua separados por una regiónd e 57pb. Su secuencia presenta un porcentaje de homología con el gen de la misma enzima en Pseudomonas aeruginosa.

Autor: CIMA CABAL Mª DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Streptococcus pneumoniae es un patógeno muy importante para el hombre ya que causa grandes tasas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Desde el punto de vista patogenético se le puede considerar como un mosaico de factores de virulencia que interactuan cooprativamente, produciendo como consecuencia enfermedades graves entre las de destacan, neumonía y meningitis, acompañadas o no de sepsis, así como otitis media aguda y sinusitis. Del referido conjunto de factores de virulencia, neumolisina, la toxina tiol-activada producida por este microorganismo, se ha demostrado recientemente implicada como un importante factor de patogenicidad. Esta proteína está altamente conservada en todos los serotipos de neumococo, encontrándose en la práctica totalidad de los mismos. En base al referido interés de la infección neumocócica y de la neumolisina, y contando con un panel de anticuerpos monoclonales murinos altamente específicos frente a la misma, se planteó la posibilidad de realizar un proyecto de Tesis Doctoral para estudiar las "Aplicaciones Biomédicas de Anticuerpos Antineumolisina". Los objetivos que nos habíamos marcado al inicio de este estudio habian sido,por una parte estudiar la utilidad diagnóstica de neumolisina como marcador antigénico y/o diagnóstico del neumococo; desarrollar un test ELISA basado en la neumolisina para el diagnóstico de las infecciones neumocócicas; proceder a una estimación directa de la cantidad de neumolisina producida por las diferentes cepas neumocócidas; análisis del reconocimiento de epítopos en toxinas tiol-activadas por nuestros anticuerpos; y analizar el potencial terapéutico experimental de anticuerpos antineumolisina. Las conclusiones a todos estos estudios en base a los resultados obtenidos han sido: Se ha puesto de manifiesto que la neumolisina es un marcador antigénico que permite la identificación rápida y fiable del neumococo; se ha puesto a punto un test ELISA de captura de neumolisina, que poseyendo alta sensibilidad, ha permitido la detección de esta toxina en algunas muestras biológicas ensayadas; mediante el test ELISA mencionado, se ha llevado acabo, por primera vez, una estimación directa de la cantidad de neumolisina producida por diferentes cepas de neumococos. En concordancia con las observaciones de actividad de neumolisina; por medio del anticuerpo monoclonal murino PLY-5, se ha puesto en evidencia,también por primera vez, que las toxinas tiol-activadas comparten un epítopo común, localizado en el undecapéptido conservado rico en triptófanos, que está implicado en al interacción de dichas toxinas con las membranas eucariotas; anticuerpos antineumolisina proporcionan una protección total frente al efecto tóxico de la neumolisina purificada, y parcial en un modelo murino de neumonía neumocócica experimental.

Autor: HERNAEZ SILVA M. JOSE.
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La tetralina es un compuesto recalcitrante formado por un anillo aromático y otro alicíclico, los cuales comparten dos átomos de carbono. Este contaminante es tóxico e inhibe el crecimiento microbiano. La estirpe TFA fue aislada de los fangos del Rin y seleccionada por su capacidad de crecer en tretalina como única fuente de carbono y energía. Esta fue la estirpe que se utilizo en esta tesis para caracterizar la ruta de degradación de la tetralina. En esta tesis, se ha determinado el grupo taxonómico al que pertenece TFA. También se ha caracterizado las fuentes de carbono y de nitrógeno que utiliza. En cultivos liquidos con tetralina se determinó la temperatura óptima de crecimiento y el intervalo de pH al que podía crecer. Por otra parte se observó la gran capacidad de TFA de introducir ADN foráneo tanto por conjugación como por electroporación. Utilizando mutantes polares y no polares se determinó que los genes implicados en la ruta de degradación de la tetralina se encontraban dispuestos en dos operones divergentes. Cuando se secuenció un fragmento de unas 15 kb se encontró 12 pautas abiertas de lectura completas, las cuales se parecían a genes implicados en rutas de degradación de compuestos aromáticos. Se caracterizó cada uno de los intermediarios que se producían en la ruta de degradación de la tetralina. El resultado mostró que con tan sólo los productos de estos genes se realiza la degradación del anillo aromático y del anillo alicíclico de la tetralina. Esto es produce mediante dos pasos enzimáticos consecutivos, la dioxigenasa extradiólica abre el anillo aromático y en el paso siguiente la hidrolasa abre el anillo alicíclico. Es la primera vez que se describe que una hidrolasa C-C abra un anillo alicíclico.

Autor: ACEDO FELIX EVELIA.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Se realizó un análisis taxonómico siguiendo un criterio polifásico de Lactobacillus casei. Se utilizaron técnicas fenotípicas como fermentación de carbohidratos, temperatura de crecimiento a 15 y 45º C y producción de exopolisacáridos. Las técnicas genotípicas incluyeron RAPD, ribotipado análisis de macrorestricción, Análisis de restricción del DNAr 16S implicado por PCR,caracterización electroforética de los espaciadores intergénicos y la secuenciación del domini I de los DNAr 16S y 23S. Se caracterizó un total de 30 cepas de Lactobacillus, de las cuáles 17 corresponden a Lactobacillus casei y 13 caracterizadas como especies distintas. A nivel fenotípico y genotípico las cepas de lactobacillus casei y L. Poracasei se agrupan dentro un mismo taxón, excepto la cepa tipo L. Casei ATCC 393 que se agrupa junta a L.zeae ATCC165820. El análisis filogenéticdo determinado con el dominio I de los DNAr16S y 23S, es útil para agrupar y caracterizar cepas dentro de grupos definidos.

Autor: BOTELLA GRAU M. SALUT.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAT DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: La importancia de las campilobacterias como causantes de gastroenteritis en el hombre ha aumentado la necesidad de disponer de métodos rápidos de detección de estos microorganismos por lo que se plantearon diferentes objetivos entre los que destacan la cuantificación de la presencia de campilobacterias en aguas y alimentos, la puesta a punto de una metodología analítica adecuada, la caracterización fenotípica y genotípica de las ceptas obtenidas y el desarrollo de una técnica de detección por PCR. Para el desarrollo de estos objetivos se procedió a la realización de este trabajo experimental concluyendo con el aislamiento de un gran porcentaje de estos microorganismos e identificándolos fenotípica y genotípicamente utilizando la técnica de la PCR, que también resulta adecuada para la detección directa de la presencia de estos microorganismos, reduciendo considerablemente el tiempo necesario hasta la obtención de resultados, frente a las técnicas tradicionales de cultivo en placa.

Autor: LOPEZ-MOLINA CANTERA NURIA.
Año: 1999.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Hoy en dia, Salmonella es la causa registrada más común de toxiinfeción alimentaria en la mayoria de los paises. En la Comunidad Autonoma Vasca, entre 1990 y 1992, se comprobó que Salmonella es el responsable de más de la mitad de los brotes de origen alimentario declarados. En dicho periodo, en el 91% de los hospitalizados afectados por brotes de toxiinfecciones, el agente causal fue Salmonella, lo que indica la importancia del control y prevención de toxiinfeciones producidas por este agente. A raíz de lo descrito anteriormente, el objetivo general de este trabajo fue el desarrollar diversas tecnicas moleculares y en concreto geneticas, como marcadores epidemiológicos de Salmonella spp. Se desarrollaron y evaluaron las siguientes tecnicas:análisis de proteinas totales, ERIC-PCR,RAPD-PCR, uso del iniciador M13 y la novedosa tecnica de IRS-PCR. Los resultados fueron comparados con los datos de fagotipificación. Además, en la PCR se hizo un estudio de optimización y reproducibilidad entre 2 laboratorios con 2 termocicladores distintos. Los resultados de este trabajo llevan a las conclusiones de que el analisis de perfiles de proteinas totales no se recomienda como marcador epidemiológico. Las tecnicas de PCR discriminan entre los distintos serotipos de Salmonella spp. Analizados. En general, la discriminación en Salmonella enteriditis con las tecnicas moleculares es moderada, apoyando la hipótesis de clonalidad de este serotipo, y además una estabilidad del genotipo de S. Enteritidis a lo largo de los 15 ultimos años.,

Autor: SOLÉ CORNELLÁ ANTONIO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los tapetes microbianos del delta del Ebro son ambientes extremos sujetos a periodos de inundación y de desecación, y a temperaturas y salinidades elevadas. Los microorganismos que viven en estos ecositemas deben adaptarse a condiciones que son extremas para la vida. Hasta el momento, se conoce parte de la biodiversidad de estos tapetes, su dinámica y el estado nutricional de las poblaciones más importantes de estas comunidades. El objetivo del presente trabajo es incrementar el conocimiento que actualmente se tiene sobre la biodiversidad de cianobacterias, mediante estudios "in situ", y determinar las variaciones de biomasa de los diferentes morfotipos de este grupo de microorganismos, mediante microscopía scanning láser confocal CLSM. Las fluctuaciones de biomasa total (Abril de 1997 a Mayo de 1998), mostraban un valor máximo en el mes de Julio de 1997 de 8,86 mgC/cm2 y un valor mínimo de 2,05 mgC/cm2 en el mes de Febrero de 1998. Por útlimo los valores de biomasa más altos corresponden al morfotipo 2 (Microcoleus Chthonoplastes). Este microorganismo se distribuye por todo la zona pigmentada y aunque mayoritariamente se encuentra en la zona oxigénica 36,59 mgC/cm3 también puede encontrase en la anoxigéncia. El CLSM es un método idóneo para analizar las poblaciones microbianas de ecosistemas bentónicos estratificados. Dicho microscopio permite estudiar los tapetes microbianos sin la necesidad de seccionar las muestras, evitando el uso de largos y exhaustivos protocolos y da imágenes sin ruido de fondo, además mediante su uso se ha podido reconsturir bi- y tridimensionalmente la estructura del tapete.

Autor: DOMÍNGUEZ BENÍTEZ JOSÉ ANTONIO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARI GERMANS TRIAS I PUJOL.

Resumen: El diagnóstico de las neumonías plantea más dificultades que el de cualquier otro síndrome infeccioso. El objetivo principal del presente trabajo fue desarrollar, estandarizar y evaluar nuevas técnicas inmunológicas y técnicas de amplificación genética para un diagnóstico rápido, sensible y específico que posibilitara una orientación terapeútica adecuada y precoz de las infecciones respiratorias. Hemos estadarizado un EIA para la detección de PCA en suero y orina. La técnica mostró en suero una sensibilidad en las neumonías neurmocócicas bacteriémicas del 60% y del 39,1% en las no bacteriémicas, mostrándose muy poco útil en la detección de PCA en orina. También hemos evaluado la utilidad de una inmunocromatografía ICT para la detección de PnC de S. Pneumoniae en orina. La ICT permitió detectar todos los serotipos en orina con sensibilidad de 80,4%. Hemos abordado también la estadarización de una nested-PCR para la amplificación de un fragmento del gen de la neumolisina en suero, comparándola con una single-PCR. Los resultados demostraron que la utilización de una nested-PCR sobre una singel-PCR es obligada para la detección de DNA neumocócico y también la conveniencia de incorporar controles internos de amplifiacación. Evaluamos la aplicabilidad de técnicas de detección de antígeno enorina en el diagnósitco de la legionelosis. Evaluamos un ROA para la detección de Legionella pneumophila s. 1, incidiendo en la mejora de la sensibilidad y de la especificidad de la técnica mediante desproteinización de la orina y concentración del antígeno. El ROA es una prueba rápida, muy sensible y específica. La concentración del antígeno por utlrafiltración selectiva incrementa la sensibilidad sin detrimento de la especificidad. También se estudió la aplicabilidad de un EOA para la detección de L.pneumophila s. 1 comparándolo con el RIA. Finalmente, evaluamos la utilidad de unEIA para la detección de antígeno de L. Pneumophola (s. 1 al 14). Su utilización no supone un descenso de la sensibilidad en la detección de L. Pneumophila s. 1. Estudios con antígeos procedentes de extractos de cultivos de L. Pneumophila de los s. 1 al 14 indican que ambos EIA son capaces de detectar antígeno de todos los serogrupos. También se estudió una ICT para la detección de L. Pneumophila s. 1 Esta técnica reduce el tiempo necesario para la detección del antígeno con una sensibilidad y especificidad similar al EIA. Finalmente, hemos evaluado una técnica de detección de IgM anti-Mycoplasma pneumoniae en población pediátrica, comparando los reusltados con la fijación de complemento y la aglutinación de partícuals de gelatina sensibilizadas. Las técnicas mostró una concordancia del 100% con las técnicas de referencia, aportando un mayor número de diagnósticos en la fase aguda.

Autor: OTEIZA UBANELL AMAYA CONCEPCION.
Año: 1999.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: En la actualidad los estafilococos coagulasa negativos(ECN) son un grupo bacteriano muy importante en las infecciones nosocomiales, fundamentalmente en las asociadas a dispositivos protésicos. Los ECN infectan los dispositivos por que producen una sustancia de naturaleza polisacarídica en la que quedan incluidos y adheridos a la superficie del dispositivo formando una estructura conocida como biofilm. Este trabajo se ha realizado con 96 ECN aislados de muestras de pacientes con este tipo de infecciones. En él se ha demostrado la equivalencia de 3 metodos utilizados para cuantificar la formación de biofilm por los ECN, el método espectrofotométrico de Christensen, el del fenol sulfúrico y el del ATP-bioluminiscencia. Tambien se ha demostrado al estudiar la sensibilidad de los aislamientos a los agentes antimicrobianos, en presencia de biofilm por el método del ATP-bioluminiscencia, la buena actividad de antibióticos como la fosfomicina, eritromicina, rifampicina y tetraciclina, en contraste con una menor actividad de los glicopéptidos vancomicina y teicoplanina. Por otro lado, se ha podido observar la relación entre una morfologia rugosa en agar rojo Congo, una elevada capacidad de formación de biofilm y una mayor resistencia a los antibióticos. Finalmente el tipado de los ECN mediante las tecnicas de biotipado(API STAPH), tipado mediante el estudio de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos, ribotipado y electroforesis en campo pulsado (PFGE) ha permitido demostrar la utilidad de la tecnica de ribotipado para la identificación de los ECN a nivel de especie y la capacidad de la tecnica de PFGE y del estudio de sensibilidad a los agentes antimicrobianos para diferenciar cepas dentro de la especie S.epidermidis. La tecnica de PFGE ha resultado muy util para determinar si dos estafilococos aislados en diferentes muestras procedían de un mismo clon y con ella se ha podido observar la diversidad genética existente entre los aislamientos clinicos de S. Epidermidis. Además se ha podido detectar la relación entre un fenotipo más resistente alos antibióticos y una mayor capacidad de formación de biofilm, en concreto se ha demostrado una relación clara entre la pertenencia a un determinado grupo de genotipos determinados por PFGE y una mayor producción de biofilm.

Autor: FARTO SEGUIN ROSA M..
Año: 1999.
Universidad: VIGO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE VIGO.

Resumen: Esta memoria se ha centrado en el estudio de la posición taxonómica y de las características de virulencia de tres cepas bacterianas del génro Vibrio (7P, 16N y 43N), que fueron aisladas a partir de tres epizootías que afectaron a rodaballos cultivados en la Ría de Vigo. En dicho estudio se han empleado a su vez numerosas cepas de referencia con fines comparativos. Los estudios de la posición taxonómica (caracterización fenotípica y ribotípica), han permitido asignar a los aislados 16N y 43N a V. Splendidus pero ha generado un dilema taxonómico con el aislado 7P que hace necesario el empleo de otras técnicas moleculares para confirmar la especie. Por otro lado, los análisis de los perfiles de proteínas de membrana, perfiles de lipololisacáridos y el serotipado no han contribuido a clarificar las relaciones interespecíficas e intraespecíficas de ninguno de los tres aislados. Mediante el estudio de los factores de virulencia asociados a la superficie celular, se ha observado que los tres aislados han sido altamente hidrofóbicos, autoagregantes y no aglutinantes de eritrocitos de trucha y células de levadura.Dichas propiedades, que se expresaban independientemente, podrían favorecer la capacidad de adhesión a las células del hospedador y por tanto la virulencia de las cepas, pero ninguna de ellas es determinantes exclusiva de la virulencia de estos aislados. El estudio de los factores de virulencia extracelulares, ha mostrado que las exotosinas excretadas por lso tres aislados estudiados, provocaron daños macroscópicos similares en rodaballo, pero participan de forma diferente en la virulencia de las cepas. Entre los productos extracelulares ECP que excreta el aislado 7P, se encuentra una proteasa que es la responsable principal de la toxicidad (daños corporales y letalidad en el hospedador) del ECP, que podría contribuir de forma primordial en la virulencia de dicha cepa en rodaballo. La caracterización estructural y funcional de la misma, ha revelado que se trata de un monómero de 39kDa de tipo metaloproteasa con dos centros activos que actúan independientemente, manifestando respectivamente las actividades endo y exoporteásica. Su caracterización molecular indica que su secuencia N-terminal mostró una gran homología con metaloproteasas excretadas por otras cepas del génro Vibrio y que el gen que la codifica se encuentra en el cromosoma bacteriano. Por otro lado, las exotoxinas excretadas por los aislados 16N y 43N, entre las que se destaca la presencia de hemolisinas, estarían implicadas de forma secundaria en la virulencia de ambas cepas sobre rodaballos, puesto que presentaron un grado de letalidad muy bajo para dicho hospedador.

Autor: NAVARRETE AGUILERA ANTONI.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA. UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Un tapete microbiano es una comunidad formada principalmente por diferentes poblaciones de bacterias formando finas laminas horizontales. Estas laminas crecen activamente, y su grosor oscila entre varios milimetros y unos pocos centimetros. Ademas, estas capas son el resultado de microgradientes que se establecen en interfases fluidas (normalmente agua, pero en ocasiones tambien vapor) sobre el substrato solido. Se establece asi en la interfase un gradiente redox. En consecuencia, el agotamiento de oxigeno bajo la superficie del tapete coincide con el incremento de sulfhidrico (y en ocasiones de metano) en profundidad. Se han aislado, y posteriormente identificado una serie de cianobacterias autoctonas de los tapetes microbianos del Delta del Ebro. Ademas, se ha encontrado Spirosymplokos deltaeiberi, la espiroqueta más grande de vida libre, que en un principio se creia exclusiva de los tapetes microbianos del delta del Ebro, en tapetes de America del norte. Aparte, se realizó el analisis quimico de los sedimentos, a diferencia del estudio morfologico, ya que estos pueden ser indicativos de diferentes variables como biomasa, funcion o actividad metabolica de los procariotas entre otras. De las diferentes actividades posibles, se ha caracterizado la fotosintetica y la respiratoria de los tapetes microbianos en conjunto y de algunas de las cianobacterias aisladas de estos. Aparte, se ha observado que la presencia de sulfhidrico afecta la actividad fotosintetica que pueden presentar estas comunidades. La presencia de un 0,4 mM de sulfhidrico, aproximadamente, inhibe casi por completo (un 95%) de la produccion de la actividad fotosintetica. La determinación de la biomasa, a lo largo de un ciclo diario, se ha cuantificado mediante pigmentos, carbono organico (junto con nitrogeno y azufre) y acidos grasos del tipo fosfolipidos (phospholipids fatty acids, PLFA). Los valores de la estimacion de celulas viables, se determinaron a partir del numero de celulas estimado mediante los datos de PLFA, detectando diferencias significativas en el intervalo de la sexta hora de muestreo coincidiendo con el maximo valor de produccion de los poli B-hidroxialcanoatos. A lo largo del ciclo diario, se observó que las células de las bacterias rojas del azufre acumula granulos de azufre en su interior durante las horas diurnas. El sulfhidrico, producido en el tapete microbiano por las bacterias sulfatorreductoras, pasar a ser azufre elemental mediante reacciones oxidativas y este acaba oxidandose a sulfato de una forma mas lenta pasando por una serie de intermediarios.

Autor: CLIMENT VIDAL NURIA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.