LEVADURAS, 2

Autor: CARTAGENA LIROLA HUGO FERNANDO.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA BIOQUÍMICA.

Resumen: La parede celular es una estructura que constituye el exoesqueleto de hongos y levaduras, cuya integridad es esencial para estos organismos. Su estudio tiene interés biotecnológico, morfogenético y en la búsqueda de dianas específicas para el diseño de nuevos antifúngicos. La pared celular de la levadura Saacharomyces cerevisiae se compone de glucano, manano y quitina (este polímro constituye un 3% del peso seco de dicha estructura). El gen CHS5 participa en el proceso de biosíntesis de quitina localizando a la proteína Chs3p, la subunidad catalítica de la actividad Quitín Sintasa III (una de las tres actividades Quitín Sintasa presentes en esta levadura). Además Chs5p participa en el proceso de fusión celular durante la conjugación transportando a la proteína Fusp1p. Ciertas evidencias indican la posibilidad de la existencia de un gen parcialmente redundante con CHS5 en ambos procesos. En esta levadura no hay proteínas homólogas de Chs5p, pero existe una proteína denominada Yft1p y codificada por la fase de lectura abierta YEL043w que es la única, junto con Chs5p, en presentar un dominio Tipo III de Fibronectina (FN3) en su secuencia. Se estudió la relación funcional entre ambos genes y se comprobó que no son redundantes en los procesos de síntesis de quitina y conjugación. En el caso de la levadura Schizosaccharomyces pombe la pared celular está constituida fundamentalmente por glucanos y glactomananos, pero no posee cantidades detectables de quitina. Existe una proteína en esta levadura codificada por Chs5+ que presenta un 31% de identidad con la proteína Chs5p de S.cerevisiae y además es la única en S.pombe que posee un dominio FN3 en su secuencia. El estudio del gen chs5+ demostró que éste no está implicado en la biosíntesis de la pared celular, pero si en el proceso de fusión celular durante la conjugación.

Autor: MONTEROLA QUIARO FREIDA CARMEN.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Resumen: El dimorfismo es la capacidad que presentan algunos hongos para crecer de dos manera diferentes, en forma circular o esférica (levaduras) y en forma filamentosa (hifas y/o pseudohifas). La transición dimórfica depende de dos factores: 1,- De la naturaleza, número e intensidad de las señales ambientales. 2,- De la actividad de vías de señalización que convergen en factores de transcripción diferentes o idénticos que controlan la expresión de genes específicos de morfología. El gen SIN3 de Saccharomyces cerevisiae codifica una proteína que está presente en un gran complejo multiproteíco que incluye a la descacetilasa de histona Rpd3p. La proteína Sin3p funciona como un represor transcripcional de numerosos genes que intervienen en una amplia variedad de procesos biológicos, alterando el estado de acetilación de la cromatina. Nosotros aislamos y delecionamos el gen SIN3 de Candida albicans y Yarrowia lipolytica con el objeto de estudiar si este gen está implicado en el proceso dimórfico. El gen SIN3 en estas dos levaduras, presenta cuatro motivos alfa hélices anfipáticos los cuales están muy conservados en la evolución y se ha sugerido que media la interacción entre proteínas. Nosotros observamos que los mutantes sin3 en estas levaduras presentan un bloqueo en la formación de hifas tanto en medio sólido como en medio líquido, formando pseudohifas. El mutante sin3/sin3 de C.albicans origina una alteración de la expresión de los genes EFG1, CPH1 y TEC1. Estos codifican factores transcripcionales que regulan el proceso dimórfico en este hongo patógeno. Además, estos mutantes presentan defectos en la pared celular y alteración en la expresión de genes de la fosfatasa ácida. Nuestros datos demuestran que la ausencia del gen SIN3 produce un efecto pleiotrópico en la expresión génica, que pudiera ser debido a alteraciones en la conformación de la cromatina.

Autor: ESTEBAN MARTIN VERÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA .
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA-BIOQUÍMICA.

Resumen: Se define el ciclo celular como el conjunto de procesos por el que, a partir de una célula madre, se obtienen dos células con la misma información genética. Se pueden diferenciar 4 fases en el ciclo celular: G1, S, G2 y mitosis. Tanto G1 como G2 son fases de crecimiento celular. En la fase de crecimiento celular. En la fase S se obtiene una copia exacta de cada cromosoma, que posteriormente se repartirán entre las células hijas durante la mitosis. La progresión por las distintas fases del ciclo está controlada por la actividad quinasa de unas proteínas denominadas Cdks, que para ser activas tienen que unirse a otras proteínas llamadas ciclinas. En levaduras existe una única Cdk, denominada Cdc2 en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe y Cdc28 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. La actividad de los complejos Cdk/ciclina oscila durante el ciclo, siendo mínima en G1 y máxima en mitosis, descendiendo bruscamente al final de esta fase. En S.cerevisiae, para que tenga lugar esa reducción de la actividad quinasa se asocia la proteína inhibidora Sic1 a los complejos Cdc28/Clb2 y, además, se induce la degradación de la ciclina Clb2 mediada por el complejo APC unido al activador Hct1. Ambos mecanismos, inhibición y degradación, dependen de la función de la fosfatasa Cdc14. El hecho de que en S.pombe existen homólogos de Sic1 y Hct1, que son las proteínas Rum1 y Ste9, nos llevó a plantearnos como objetivo de este trabajo analizar si la salida de mitosis en S.pombe se regula de forma similar a S.cerevisiae, mediante la identificación de posibles homólogos de Cdc14 en la levadura de fisión. Comparando el gen CDC14 con la secuencia genómica de S.pombe, encontramos un gen muy similar al que denominamos flp1+. Este gen no es esencial y su deleción causa una reducción del tamaño celular, mientras que su sobre expresión induce una parada del ciclo en la fase G. Mediante un análisis bioquímico, comprobamos que las proteínas Ste9 y Rum1 no son sutratos de Flp1. Dado que el fenotipo de la delección y el de la sobre-expresión del gen relación la función de Flp1 con el control de la transición G2/M, analizamos si Flp1 regulaba a las proteínas implicadas en ese control, que son Cdc25, Wee1 y los complejos Cdc2/Cdc13. Así pudimos determinar que Flp1 regula la localización de la proteína Cdc25 y, además, puede desfosforial a Cdc25 in vitro, siendo también capaz de interaccionar con ella in vivo. Al desfosforilar a Cdc25 provoca su inestabilidad y, por tanto, su degradación. Esto implica una reducción de la actividad quinasa de los complejos Cdc2/Cdc13. De esta forma Flp1 participaría en el control de la salida de mitosis.

Autor: MORIN RODRÍGUEZ MATIAS.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En Yarrowia lipolytica existen dos grandes líneas de investigación: estudio del proceso de secreción y su aplicación en la producción de proteínas heterólogas y estudio del dimorfismo. En función de esto se ha dividido este trabajo en dos partes que comprenden cada uno de estos aspectos. En la primera parte se ha clonado y caracterizado del gen YlSCJ1 de esta levadura. Se ha llevado a cabo la deleción de este gen y analizado el fenotipo de la cepa delecionada. Se ha observado que la cepa delecionada es mas sensible a DTT y tunicamicina que la cepa silvestre. Se ha comprobado también que la deleción del gen provoca un incremento en la actividad lipásica y en la actividad de la fosfatasa ácida, no así en la actividad de la proteasas alcalina. Se ha expresado el alergeno Alt a1p del hongo Alternaria alternata en Y.lipolytica bajo el control del promotor de los genes YlMTPII y YlMTPI. Hemos comprobado que el alergeno producido por la levadura se comporta de modo similar al alergeno natural en pruebas realizadas con pacientes humanos. En la segunda parte se ha realizado el estudio del gen YlHOY1. Se ha realizado la deleción de este gen en dos fondos genéticos con tipos sexuales distintos (MATA y MATB). Las cepas delecinadas son incapaces de formar hifas. Se ha observado que la cepa delecionadas son mas invasivas en agar y que la delección afecta al proceso de conjugación. Se han obtenido diploides comprobándose que las cepas delecionadas homocigotas son incapaces de formar hifas. Además esta cepa es más invasiva de agar que los tipos silvestres. Se ha realizado el análisis de la región 5' del gen YlHOY1 determinándose que la expresión de este gen está regulada por un factor de transcripción de la familia GATA. Se han realizado geles 2D de proteínas de extractos citoplasmáticos de hifas y levadura de la cepa E150 de Y.lipolytica y de levaduras y muestras de células crecidas 24 horas en un medio con N-acetilglucosamina y se ha realizado comparaciones entre las diferentes cepas y morfologías.

Autor: MARTIN SÁNCHEZ M. VICTORIA.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA (UNIVERSIDAD DE SALAMANCA).

Resumen: El objetivo de este trabajo es la caracterización de genes de Schizosaccharomyces pombe relacionados con la biosíntesis del beta- 1,3 glucano, componente estructural mayoritario de las paredes celulares fúngicas. Los genes FKS1 y FKS2 de Saccharomyces cervisiae y cps1*/bgs1 de S.pombe codifican proteínas transmembranales propuestas como subunidades catalíticas de la enzima beta-1,3 glucan sintasa. Mediante una búsqueda en bases de datos de genes homólogos a FKS1 y FKS2 de S.cerevisiae, pudimos encontrar el gen bgs2+, bgs3* se identificó a partir del mutante ehs2-1, hipersensible a Calcoflúor y Equinocandina.bgs3+ también pertenece a la familia de genes FKS de S.pombe. Los resultados de nuestro estudio, pueden resumirse así: A,- La expresión de bgs2+ están restringida al proceso de esporulación. Bgs2p se localiza en la membrana de las proesporas.bgs3+, en cambio, se expresa en todas las condiciones de crecimiento excepto durante la esporulación. Los niveles de Bgs3p no varían cuando las células crecen en diferentes medios o condiciones, y se localiza en las zonas de remodelación de la pared celular. B.- bgs3+ es un gen esencial, requerido para la germinación y el crecimiento vegetativo y bgs2+ es un gen esencial en la formación de las ascosporas. No es posible complementar los defectos de los mutantes nulos bgs2 y bgs3 sobreexpresando las otras proteínas bgs de S.pombe. C,- La eliminación de bgs2+ disminuye la actividad glucán sintasa en esporulación y bloquea la maduración de la pared de las ascosporas. La sobreexpresión o eliminación de bgs3+ es letal y causa defectos en la morfología celular y deposición de materiales de pared. Estas observación relacionan Bgs2p y Bgs3p con la biosíntesis del beta glucano y sugieren que diferentes actividades glucán sintasa desempeñan funciones esenciales y no solapadas en la síntesis o transporte de los polímeros de beta-glucano en la levadura de fisión.

Autor: ROBLEDO ZUBIRIA BEATRIZ.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las infecciones por C.albicans se han incrementado dramáticamente durante las dos últimas décadas debido a una serie de factores predisponentes como la adicción a drogas por vía parenteral, la neutropenia, la antibioticoterapia prolongada y la inmunosupresión. Al aumentar la incidencia de las candidiasis, ha aumentado también la frecuencia de casos resistentes a los tratamientos hasta ahora seguros, como el fluconazol en las candidiasis superficiales. Las dificultades en el tratamiento han estimulado el interés en otras estrategias terapéuticas como el desarrollo de vacunas preventivas, la terapia pasiva con anticuerpos o la terapia con citocinas y receptores de citocinas. El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de la eficacia de algunos anticuerpos monoclonales anti-C.albicans en la protección frente a la candidiasis experimental invasiva, y el estudio de los mecanismos por los que se lleva a cabo la supuesta protección. Este trabajo se centra en particular en la activación de los macrófagos, dando su papel como célula efectora, para tratar de explicar la relación entre la inmunidad celular y la humoral en las infecciones fúngicas. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la protección observada in vivo como consecuencia de la administración del monoclonal C7, se establece en parte por la acción candidacida directa del anticuerpo y en parte por la activación de los macrófagos mediada por el completo.

Autor: JAAFAR LAHCEN.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS-UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: Yarriwua lipolytica es un hongo dimórfico que está catalogado dentro de lo que se ha venido a denominar grupo de las "levaduras no convencionales". Al igual que Saccharomyces cerevisiae, la levadura del pan, el vino y la cerveza, Y.lipolytica está considerado como organismo segura (GRAS, "Generally Regarded As Safe") en procesos alimentarios, lo que permite también su utilización en distintos procesos industriales, tales como la obtención de ácido cítrico. A diferencia de S.cerevisiae, Y. Lipolytica es dimórfico y secreta de forma natural una gran cantidad de enzimas, por lo que constituye un buen modelo para el estudio del dimorfismo y es también un hospedador idóneo para la expresión de proteínas recombinantes. La pared celular juega un papel importatne tanto en la transición dimórfica, por ser en último extremo la estructura responsable de la forma de la células, como en la secreción de proteínas, por ser una barrera que limita este proceso. Sin embargo no existen tan apenas estudios sobre estructura en Y.lipolytica, y es por ello que el objetivo de la tesis que se presenta era precisamente contribuir a rellenar este hueco. Los resultados obtenidos consisten en la caracterización de dos proteínas que forman parte de la pared celular, el aislamiento de los genes que las codifican y la caracterización del fenotipo resultante de la disrupción de los mismos. Las dos proteínas caracterizadas son homólogas a dos proteínas de pared celular de S.cerevisiae, pertenecientes respectivamente a las dos familias de proteínas de pared celular (CWPs) mayoritarias en este organismo, la de las PIR-CWPs y las de las GPI-CWPs. Este resultado parece indicar que existe una similitud en la estructura de la pared celular en S.cerevisiae y Y.Lipolytica y abre la posibilidad de caracterizar nuevos homólogos y de plantear un modelo de estructura basado en la de la pared celular de S.cerevisiae. Finalmente, se ha aislado un gen implicado en la glicosilación de las proteínas de secreción en Y.lipolytica y se ha caracterizado una cepa disrupcionada en este gen, que se caracteriza, entre otras cosas, por tener una pared celular alterada en su estructura. Esta cepa podrá utilizarse en futuros estudios de estructura y composición de la pared celular, aparte de tener una aplicación potencial como hospedador en la expresión de proteínas recombinantes.

Autor: BAQUERO HERRERA CLAUDIA JANNETH .
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: A partir de la secuencia nucleotídica del intrón del gen CaRPS0 de Candida albicans se ha diseñado una pareja de oligonucleótidos cebadores que se ha empleado en un análisis de PCR sobre DNA genómico y células enteras de especies del género Candida y otros microorganismos. En todos los aislados clínicos de C. Albicans se generó el amplicón de 310 pb esperado; en otroas especies de Candida, así como en otras cepas de laboratorio pertenecientes a otros hongos, no se generó ningún amplicón excepto en los casos de C.pseudotropicalis (amplicón de 1200 pb), Kluyveromices marxianus (amplicón de 1250 pb) y Cryptococcus neoformans (varios amplicons mayores de 1250 pb). En aislados poco comunes de C.albicans procedentes de Africa también se generó el albicón de 310 pb esperado. Estos resultados indican que los genes que presentan intrones pueden ser de utilidad en el diseño de oligonucleótidos cebadores, específicos de especie, para la identificación mediante PCR de cepas fúngicas. La sensibilidad del método se evaluó empleando diferentes cantidades (de 224 ng a 2.7 pg) e DNA de C.albicans así como de distintas cantidades de células (de 10(7) a 5). Los resultados obtenidos pueden ser útiles en una detección temprana de candidiasis. Los genes RPS0 A y B de Saccharomyces cerevisiae codifican proteínas esenciales para la maduración de la subunidad ribosomal 40S. Hemos aislado el gen homólogo a RPS0 en C.tropicalis y lo hemos denominado CtRPS0. El gen CtRPS0 codifica para una proteína de 261 resíduos aminoacídicos con un tamaño molecular teórico de 28.65 kDa y un punto isoeléctrico de 4.79. La proteína CtRsp0 presenta una elevada homología con C.albicans, S.cerevisiae, Neurospora crassa, Schizosaccharaomyces pombe, Pneumocystis carinni y otros organismos como humanos, ratón y rata. CtRPS0, en un vector de elevado número de copias, es capaz de complementar el fenotipo letal unido a la disrupción de los dos genes RPS0 en S.cerevisiae. El análisis mediante Southern Blot sugiere que C.tropicalis contiene una única copia del gen RPS0 en su genoma, al igual que sucede en C.albicans, y no dos como es el caso de S.cerevisiae. La secuencia nucleotídica del gen CtRPS0 ha sido depositada en la base de datos EMBL con el número de AJ278686.

Autor: ANDRES BORDERIA ISABEL .
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Saccharomyces cerevisiae es la levadura del pan, de la cerveza y del vino y en tal papel se ha venido utilizando desde las primeras sociedades agrícolas. En los últimos años, y gracias al desarrollo de la ingeniería genética, S.crevisiae ha añadido a sus usos tradicionales el de servir de hospedador para la producción de proteínas heterólogas. Las células de S.cerevisiae estan rodeadas por la pared celular, en cuya composición destacan las manoproteínas, las cuales deben necesariamente ser secretadas para llegar a su destino final, por lo que contienen tanto secuencias que determinan su secreción, así como secuencias que determinan su retención en la pared celular, y que vienen determinadas por el extremo carboxi-terminal de dichas proteínas. Estas secuencias pueden ser utilizadas para dirigir la localización de proteínas heterólogas a la pared celular, premisa en la que se basa este trabajo, el cual consistió en utilizar las señales de secreción y de retención a la pared celular de dos proteínas caracterizadas anteriormente por nuestro grupo, Pir4, una proteína extraíble por agentes reductores, e Icwp, una proteína GPI, para determinar la secreción, o en su caso la localización en la pared celular de distintas proteínas recombinantes con aplicación en biotecnología, tal como un ligando específico que permitiese la inmovilización de las células en una matriz sólida, una enzima activa o un antígeno de un microorganismo patógeno, aproximaciones que han dado lugar a los tres capítulos de que consta esta tesis: 1,- Inmovilización de células de Saccharomyces cerevisiae en una matriz de proteína G.Sefarosa mediante Ingeniería Genética de la pared celular. 2,- Expresión de la xilanasa a de Bacillus sp. BP-7 en Saccharomyces cerevisiae en forma de proteína de fusión con la proteína de la pared celular Pir4. 3,- Expresión de un antígeno viral de la cápsida del rotavirus SA11 en Saccharomyces cerevisiae, en forma de proteína de fusión con dos proteínas de la pared celular.

Autor: TORRES ROSELL JORDI.
Año: 2002.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA, UNIVERSITAT DE LLEIDA.

Autor: LIU YUHUI.
Año: 2002.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La diferenciación celular implica al menos dos principales y distintas etapas: el compromiso a abandonar el ciclo celular irreversiblemente y la inducción de genes específicos de tejido que determinarán la identidad tisular. En este trabajo se ha utilizado como modelo la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano, para estudiar los mecanismos moleculares que controlan la coordinación entre la detección del ciclo celular y la diferenciación neuronal. La exposición secuencial a ácido retinoico (RA), un potente agente de diferenciación en muchos tipos celulares, y al factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), esencial para la supervivencia y la diferenciación de varios tipos neuronales, causa la detención de las células SH-SY5Y en la fase G1. Esta parada en G1 va acompañada del incremento en los niveles de los inhibidores de Cdk, p21CIP1 y p27KlP1, así como de la acumulación del aforma hipofosforilada de pRB. En la fase inicial de diferenciación, el tratamiento con RA resulta en un inmediato incremento de p21ClP1 y, simultáneamente, en una disminución de Id2, un regulador negativo de la diferenciación. Este hecho permite establecer un nexo temporal entre ciclo celular y diferenciación. La regulación de p21Clp1 inducida por RA se da de forma gradual por dos mecanismos diferentes. La inducción temprana parece estar mediada directamente por el receptor de RA (RAR) a través de elementos de respuesta a RA. La proteína de bHLH E47 se une al promotor de p21 ClP1 in vivo y contribuye a la segunda inducción a través de elementos E box. E47 también se unea la promotor de TrkB, un gen esencial como marcador específico de neuronas, y activa su transcripción durante el tratamiento con RA. Id2, el regulador negativo dominante de proteínas bHLH, es capaz de inhibir la actividad transcripcional de p21Clp1 y TrkB en presencia de RA. En consecuencia, los reguladores transcripcionales bHLH juegan un papel importante en la coordinación de la detención del ciclo celular y la diferenciación neuronal, de forma cooperativa, regulando la expresión de inhibidores de ciclo y del receptor específico de neuronas, a través de mecanismos transcripcionales comunes. La forma hipofosforilada de pRB activa la transcripción de p21Clp1 en ausencia de señales inducidas por RA. Por lo tanto, la relación negativa entre Id2 y pRB podrían contribuir al incremento de la actividad transcripcional de las proteínas bHLH. El tratamiento secuencial con BDNF mantiene la detención en la fase G1 del ciclo celular y promueve la diferenciación en células SH-SY5T, previamente tratadas con Ra. BDNF provoca una expresión sostenida de p21ClP1 a nivel transcripcional, en células previamente tratadas con RA. La activación de la vía de la quinasa PI3 es necesaria para el mantenimiento de los niveles de p21ClP1 mediados por BDNF. Nuestros resultados revelan una nueva función de la proteínas bHLH, favoreciendo la inducción de la diferenciación neuronal, y aportan evidencias de que factores de diferenciación y reguladores de ciclo cooperan para hacer incompatible la proliferación y la diferenciación celular.

Autor: ROSA REYES JOSÉ MANUEL DE LA.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DPTO. MICROBIOLOGÍA Y BIOLOGÍA CELULAR.

Resumen: Con objeto de contribuir al mejor conocimiento de los mecanismos de secreción de proteínas, en este trabajo nos propusimos iniciar el estudio de algunos de los componentes implicados n la translocación de polipéptidos a través de la membrana del retículo endoplásmico RE en la levadura Candida albicans, teniendo en cuenta, además, la importancia de este organismo desde el punto de vista clínico. Mediante la transformación de mutantes de Saccharonyces cerevisiae, afectados en el gen SEC61, con una genoteca de DNA genómico de c. Albicans construida en un vector autorreplicativo se aislaron tres clones diferentes, denominados pCA18, pCA47 y pCA51, capaces de complementar el fenotipo termosensible de los mutantes.Dichos clones fueron capaces, además, de desbloquear, al menos paracialmente, la secreción de invertasa y de carboxipeptidasa y cuando la cepa mutante se incubó a la temperatura restrictiva. De éstos, tan sólo el denominado pCA47 contiene un gen cuyo producto puede estar directamente relacionado con el mecanismo de translocación de proteínas en la membrana del RE: el gen SPC3, el cual codifica uno de los componentes del complejo de la peptidasa señal. El gen SPC3Ca fue capaz de complementar el fenotipo termosensible de mutantes spc3 y sec61 de S. Cerevisiae. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre con el gen homólogo de esta especie, el gen SPC23 de C. Albicans no complementó la termosensibilidad de un mutante sec 11 de S. Cerevisiae.Dicha complementación habla a favor de la estrecha relación funcional que debe existir entre los complejos proteicos que constituyen el translocón y la pepetidasa señal.Los dos clones restantes aislados por complementación (pCA18 y pCA51) no parecen contener elementos, al menos conocidos, que se relacionen con el fenómeno de la translocación. Por otra parte, medianye hibridación con una sonda homóloga, se consiguió aislar el gen SEC 61 de C. Albicans a partir de una genoteca genómica construida en el fago GEM12. El análisis de la secuencia de dicho gen permitió determinar que el mismo podría codificar una proteína de características similares al componente Sec61 del transolocón de S. Cerevisiae. Aunque el gen SEC61Ca no complementa el fenotipo termosensible del mutante sec61 de S. Cerevisiae, en los transformante tiene lugar la expresión de dicho gen, obteniéndose una cantidad de producto transcrito proprocional al número de copias del mismo.Mediante transformación del mutante sec 61 con una fusión del gen SEC61Ca con el fen de la GFP de Aeoquorea victoria se comprobó que, en los transformante, además de la transcipción del gen, tiene lugar la traducción del mRNA transcirto.La proteína quimérica sintetizada ocupa en las células una posición que parece indicar su correcta localización en la membrana delRE. De modo análogo a lo que ocurre en otros organismos, la interrupción de uno de los alelos del gen SEC61Ca y la expresión condicionada del otro alelo, bajo el control del promotor MET3, permitió comprobar el carácter esencial de dicho gen, lo que apoya que el mismo sea el gen estructural de proteína Sec61 en C. Albicans. Adyacente al gen SEC61Ca, en el mismo fragmenteo del cromosoma 3, se encontró el gen FBP1Ca que codifica la enzima gluconeogéncia fructosa bifosfatasa. La clonación y secuenciación de dicho gen reveló que el mismo codifica una proteían de caracterísitcas muy similares a las de la fructosa-1,6-bifosfatasa de otros organismos encarióticos.La transcripción del gen FBP1Ca en C,. Albicans y en un mutante fbp1 de S. Cerevisiae parece estar regulada por el tipo de fuente de carbono en el medio de cultivo. Aunque dicho gen no fue capaz de complementar la incapacidad de un mutante fbp1 de S. Cerevisiae para crecer a expensas de una fuente de carbono gluconeogéncia, sí fue capaza de complementar las deficiencias en el crecimiento de dos mutantes fbp de Escherichia coli, lo que indica que FBP1Ca es el gen estructural de la fructosa-1,6-bifosfatasa de C. Albicans.

Autor: AMOROS ALONSO MARA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: La levadura S.cerevisiae constituye un modelo adecuado para el estudio de los mecanismos de respuesta a estrés en la celula eucariota. La regulacion de la respuesta a condiciones adversas se produce fundamentalmente a nivel transcripcional: una vez detectada la presencia de estrés se activan rutas de señalización que conducen a la induccion transcripcional de genes con funciones protectoras. Estos genes en sus promotores elementos reguladores que son reconocidos por factores transcripcionales activados por estrés. En S.cervisiae existen rutas especificas del tipo de estrés y una ruta general que se activa ante cualquier condicion desfavorable. Los factores transcripcionales de la ruta general se respuesta a estrés son las proteinas con dedos de zinc Msn2p y Msn4p, que reconocen y se unen especificamente al elemento regulador en cis STRE, que se encuentra en los promotores de los genes diana. En este trabajo se han abordado diferentes objetivos relacionados con la función Msn2p y Msn4p en la activacion de los genes regulados por la ruta general de respuesta al estrés. Utilizando cepas mutantes en los genes MSN2 y MSN4 y en los que codifican otros factores transcripcionales de respuesta a estrés, hemos estudiado la contribución de los mismos en la expresión de distintos genes por diferentes tipos de estrés. Los resultantes muestran que la contribucion relativa de cada uno de los factores implicados en la induccion transcripcional es diferente según el gen y el tipo de estrés. Tambien se ha investigado la funcion de Msn2p y Msn4p como facilitadores de la unión de otros factores transcripcionales al promotor a traves del reclutamiento de complejos remodeladores de cromatina.

Autor: JIMENEZ MARTINEZ ESPERANZA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS.

Resumen: Los organismos estan sometidos a cambios en las condiciones ambientales y fisiologicas. Las celulas han desarrollado mecanismos para enfrentarse a las condiciones desfavorables para el crecimiento, mecanismos que se conocen con el nombre de Respuesta al estrés. En la levadura Saccharomyces cerevisiae existe una ruta general de Respuesta al estrés que se induce por diferentes condiciones desfavorables. Los factores transcripcionales implicados en la induccion de la expresion genica en esta ruta sono Msn2p y Msn4p. Estos factores se unen al elemento regulador STRE en el promotor de genes de respuesta general al estrés y activan su transcripcion. En este trabajo se han identificado diferentes genes inducidos por esta ruta y que, ademas, estan implicados en su regulacion. Uno de ellos, SDH junto con su homologo MSG5 que codifican proteina fosfatasa duales, estan implicados en la regulacion de la induccion de genes regulados por la Ruta General de Respuesta al estrés en condiciones de estrés osmotico y oxidativo y son necesarios para el crecimiento en estas condiciones. Estas fosfatasas junto con la quinasa Kns1p, participan en la regulacion de la actividad de los factores Msn2p y Msn4p, probablemente a traves del control de su localizacion nuclear. Por su parte el gen USV1 y su homologo RGM1 que codifican proteinas con dedos de Zn que podrian actuar como factores transcripcionales, estarian implicadas junto con Msn2p y Msn4p en la activacion transcripcional de genes de respuesta al estrés.

Autor: ÚBEDA RUIZ PEDRO JOSÉ.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: Los principales objetivos de la determinación de la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos son intentar predecir la respuesta terapéutica y valorar el desarrollo de resitencias, con idea de guiar a clínicos y epidemiólogos en el tratamiento y control de las infecciones fúngicas por levaduras. En 1997 el National Commitee for clinical Laboratoy Standard de Estados Unidos publicó el Documento M27-A, que supone un avance considerable al establecer los métodos de macrodilución y microdilución en el medio de cultivo RPMI-1640 como los de referencia para determinar la sensibidad de Candida spp.y Cryptococcus neoformans a anfotericina B (AMB), fluconazol (FLC), ketoconazol, itraconazol (ITC) y flucitosina (5FC). El método alternativo que utiliza RPMI-1640 con glucosa al 2% (RPMI-2%) mejora el crecimiento de ls levaduras, facilita la determinación del punto final de inhibición y acorta el tiempo de lectura. Por otro lado, la difusión en aar se utiliza en los laboratorios debido a su bajo coste y a la facilidad de realización. Al igual que con las técncias de microdilución, los resultados dependen de factores como el tamaño del inóculo, medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación. De los aspectos microbiológicos y epidemiológicos estudiados de las 217 levaduras aisladas en sangre de 212 pacientes ingresados en el Hospital La Fe durante los años 1995-1998, resaltamos que son una causa frecuente de spsis nosocomial, con un crecimiento rápido en los medios de sistemas de monitorización continua de hemocultivos, que la especie aislada con más frecuencia es C. Albicans segudia de C. Parapsilosis, y que los pacientes son parincipalmente varones adultos ingresados en áreas críticas del hospital. C.krusei se aísla mayoritariamente en pacientes onco-hematológicos y C. Neoformans en pacientes infectados por el VIH. Determinamos la sensibilidad a los antifúngicos AMB, FLC, ITC y 5FC de 201 de los 217 aislados anteriormente citados por los métodos de microdilución en RPMI-1640 y en RPMI-2% y difusión agar de Shadomy modificado. Observamos que las CMI en general son más elevadas en el medio RPMI que en RPMI-2%. La resistencia in vitro a los azoles es baja y el número de cepas que se inhiben con concentraciones elevadas de AMB y 5FC es muy bajo. C. Parapsilosis requiere concentraciones más latas de antifúngicos para inhibirse que C. Albicans, y las especies con mayor número de aislados resitentes con C. Krusei y C. Glabrata. El método de difusión en agar puede servir para separa las cepas sensibles a los azoles y 5FC; en cambio, las cepas resistentes por este método deben de confirmarse por el método de referencia. La concordancia, validez y correlación del método de mcirodilución en RPMI-2% con el método de referencia son elevadas par 5FC e ITC y más bajas para FLC y AMB. Por el contrario, para el método de difusión en agar son muy bajas para los cuatro antifúngicos. En consecuencia, desde un punto de vista práctico, la aplicabilidad el método de microdilución estudiado en el presente trabajo dependería de la especie implicada y el antifúngico ensayado.

Autor: ESTEVE ZARZOSO BRAULIO.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS -UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Se ha desarrollado un nuevo metodo de identificacion de levaduras por datos de biologia molecular, principalmente para levaduras de interes biotecnologia. De esta manera se ha caracterizado perfectamente el genero Hanseniaspora y las especies Zygosaccharomyces lentus, Z.cidri y Z.fermenti. Al aplicar tecnicas en el proceso de elaboracion de los vinos de la D.O. Jerez, se han identificando las cepas de levaduras flor, se ha demostrado que la levadura comercial usada en la bodega no es la responsable de la fermentación, siendo las autoctonas las que actuan, y se han caracterizado las cepas implicadas en el envejecimiento de los vinos. Por ultimo, se ha demostrado que las variedades de uva, la localizacion geografica de los viñedos y la metodlogia de la vinificacion, influyen en la poblacion levaduriforme encontrada.

Autor: FLORES YÁÑEZ M. CONSUELO.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: En el presente trabajo se ha procedido a realizar un estudio comparativo de determinadas características estructurales y bioquímicas (hidrofobicidad de la superficie celular, adherencia a componentes de la matriz extracelular de mamíferos- laminina, fibronectina, colágeno- y del plasma -fibrinógeno), así como la producción de una proteasa ácida y fosfolipasa que parecen jugar un papel importante como determinantes (factores) de virulencia en el hongo dimórfico, patógeno oportunista, Candida albicans, en cepas mutantes de dicho microorganismo que tienen disrupciones en hetrocigosis (ACCI2) o en homocigosis (ACCI4) del gen CYC3, que codifica la síntesis tanto de una enzima citocromo c-hemolilasa presente en las mitocondrias, como de una proteína integral de la pared celular de ambas formas (levadura y micelio) del hongo. Además se obtuvieron curvas de supervivencia en ratones inmunocompetentes y neutropénicos, inoculados por la vena lateral de la cola con cada una de las cepas en estudio. Paralelamente a estos estudios de virulencia se sacrificaron dos individuos de cada grupo a las 24,48 y 72 horas, separando los riñones y el hígado para su análisis histopatológico y para determinar el número de microorganismos (unidades formadoras de colonias-UFC-). En general, los resultados obtenidos indican que las cepas con disrupciones en una o en las dos copias del gen CYC3 tienen una menor capacidad para adherirse a los componentes del suero y la matriz extracelular, una menor hidrofobicidad superficial y unos niveles más bajos de actividad hidrolítica, en comparación con la cepa parental (CAI4) a partir de la cual se obtuvieron. Las cepas en estudio no causaron la muerte en ningún grupo al cabo de los 28 días en ratones inmunocompetentes y 10 días en ratones neutropénicos, no observándose colonización de tejidos, así como recuperación de UFC al cabo de 48hrs. La postinoculación intravenosa de una dosis letal de la cepa C.albicans ATCC 26555 en ratones preinoculados con estas cepas revelaron una protección del 40% en el caso de ratones inoculados con las cepas ACCI2 y CAI4 y del 60% en ACCI4.

Autor: POZA DOMÍNGUEZ MARGARITA.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FAC. FARMACIA, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO.

Resumen: Myxcoccus xanthus es capaz de secretar gran cantidad de moléculas de interés industrial tales como antibióticos, carotenoides y enzimas hidrolíticos. Anteriores estudios indican que podrían existir de proteasas producidas por M.xanthus de distinta naturaleza bioquímica. Basándonos en trabajos que exponen la idea de que la mixobacteria podría ser una excelente fuente de proteasas de interés biotecnológico, en concreto, en la industria quesera, capaces de coagular la leche, se planteó, en primer lugar la caracterización de las proteasas producidas por 4 cepas diferentes de M.xanthus así como su posterior producción semi-industrial empleando una planta piloto de fermentación. Así, se describió que los sobrenadantes de los cultivos de las cepas de M.xanthus 422, DK1622, DX10407 y DZF1, muestran actividad coagulante sobre leche entera y desnatada, siendo la cepa de M.xanthus 422 la que mostró los valores de actividad más altos. La actividad máxima se observa en todas las cepas al final de la fase exponencial. Las condiciones óptimas para el crecimiento de las cuatro cepas y la producción de la proteasa coagulante fueron de 33ºC y 200 rpm, en el medio CTT. Además de la actividad coagulante, las cepas de M.xanthus 422, DK1622, DZF1 y DK10407 producen otras proteasas degradativas capaces de originar halos en placas de agarosa con caseína y de deshacer el coágulo lácteo. Esta actividad se detecta directamente en el sobrenadante de la cepa DZF1 o en los concentrados de los sobrenadantes del resto de las cepas. El factor de concentración máximo para la obtención de los concentrados de cuajo fue de 20 veces. Por encima de este valor, la actividad no aumenta y se favorece la acción de las proteasas degradativas que deshacen la cuajada. La cepa de M.xanthus 422 produce una proteasa coagulante de aproximadamente 40 kDa, con un pH óptimo de 6, una temperatura óptima de actuación de 37ºC y un punto isoeléctrico de 5.06. El enzima se encuentra probablemente acomplejado originando formas que eluyen de diferente manera a través de columnas de cromatografía de intercambio aniónico. Los resultados del cultivo de la cepa de M.xanthus 422 en un fermentador BIOSTAT C, demostraron que es factible su empleo en la industria para obtener de forma eficaz y rentable cuajo natural para la fabricación de masas queseras. En una segunda parte del trabajo, se llevó a cabo el aislamiento, la colonación y la caracterización de los genes implicados en el fenotipo coagulante de M.xanthus 422, para ser posteriormente clonados en diferentes sistemas de expresión; E.coli y en levaduras. La finalidad última era obtener una cepa de levaduras hiperproductora capaz de originar masas queseras para ser posteriormente empleada en la industria quesera. Para ello, en primer lugar se construyó una genoteca de M.xanthus con 20.000 colonias recombinantes portadoras de secuencias de ADN de un tamaño medio de 4Kb, que, con una probabilidad del 99,99%, contiene cualquier gen de M.xanthus. Se aislaron 3 genes de M.xanthus, cltA-cltB y cltC, capaces de originar actividad coagulante sobre leche cuando se expresan en C.coli. La cuajada originada por los genes cltA-cltB clonados conjuntamente resultó ser más compacta y muy similar a la originada por la cepa 422 de M.xanthus. A continuación, los genes cltA-cltB y cltC se expresaron en las cepas de Saccabaromyces cerevisiae DBY746 y DBY747 utilizando el vector pYES2 y bajo el control del promotor GAL1. Los niveles de expresión fueron inferiores a los encontrados en E.coli y en la cepa silvestre de M.xanthus 422. Por último, los genes cltA-cltB se expresaron en la cepa GS115 de Pichia pastoris utilizando el vector pGAPZalfaA y bajo el control del promotor GAP. Los niveles de expresión fueron inferiores a los obtenidos en C.coli y en S.cerevisiae. Finalmente, se obtuvieron cepas de levadura capaces de coagular la leche pero solamente a nivel extracelular.

Autor: OBRA SANZ PILAR DE LA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Helicobacter pylori es un bacilo Gram negativo, infecta aproximadamente a la mitad de la población mundial, causando gastritis, úlcera gástrica y también se asocia con adenocarcinoma gástrico y linfoma tipo MALT. El tratamiento de la infección requiere varios fármacos, entre ellos antimicrobianos como el metronidazol. La prevalencia de la resistencia a metronidazol varia entre el 11 y el 70% dependiendo de la población estudiada y la aparición de ella conlleva una pérdida significativa de la eficacia del tratamiento erradicador. El objetivo de esta tesis fue estudiar la prevalencia de la resistencia a metronidazol, nitrofurantoína y furazolidona durante un periodo de cuatro años y determinar las características de la población que puden ser factores de riesgo para la resistencia antibiótica. Así como, el estudio de distintos aspectos de la resistencia a metronizadol (tasa de mutación espontánea, implicaciones del gen rdxA y frxA, prevalencia de infecciones mixtas con cepas sensibles y resistencia a los 5-nitrofuranos, la utilidad clínica de la proteína RdxA en la detección de resistencia a metronidazol) en aislamientos clínicos de H. Pylori obtenidos en nuestro ámbito. Para ello se utilizaron las técnicas microbiológicas clásicas de cultivo y determinación de la sensibilidad, además de técnicas de inmunotransferencia y de biología molecular basadas en la PCR. Encontramos que en nuestro ámbito la resistencia a metronidazol fue de 23,77% de 0,6% para nitrofurantoína y del 1,8% para furazolidona. El aislamiento simultáneo de cepas sensibles y resistentes en el mismo paciente se debió a la misma cepa con heterorresistencia a metronidazol. Encontramos una clara implicación de gen rdxA en la resistencia al metronidazol. La nitrofurantoína y furazolidona tuvieron tasas de mutación espontáneas muy inferiores al metronidazol. Existe una alta correlación entre la producción de la proteína RdxA, detectada por inmunotransferencia, y la sensibilidad a metronidazol de los aislamientos clínicos de H.pylori, este hallazgo podría tener utilidad en la detección clínica de la resistencia a este antimicrobiano.

Autor: GARCÍA IBÁÑEZ BLANCA M..
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Resumen: Hemos obtenido mutantes de Schizosaccharomyces pombe hipersensibles a los antifúngicos Equinocandina B (LY280949) y Calcoflúor. El análisis genético de las mutaciones indicó que son mutaciones nucleares, monogénicas, recesivas y que pertenecen a 11 grupos de complementación. Se ha caracterizado el mutante ehs2-1. La mutación ehs2-1 se ha localizado cerca del marcador ade6, en el cromosoma III. Hemos clonado 2 genes, ypt2+ y bgs3+ por complementación del fenotipo de hipersensibilidad a los antifúngicos del mutante ehs2-1. Ambos genes son supresores de la mutación ehs2-1., ypt2+ está implicado en el último paso de la ruta de secreción. La presencia de una proteína Ypt2 defectuosa produce una serie de fenotipos relacionados con una construcción defectuosa de la pared celular, lo que implica un nueva función de ypt2 en la biosíntesis de la pared celular. También, se ha clonado el gen bgs3+ como otro supresor de la mutación ehs2-1.bgs3+ es un gen nuevo que presenta gran homología con los genes de la familia de beta(1-3)glucán sintasa (tanto de Saccharomyces cerevisiae como de S.pombe).bgs3+ codifica una presunta proteína integral de membrana y demostramos que es esencial para la viabilidad celular. La localización subcelular de la proteína Bgs3 está restringida a las zonas de crecimiento activo de la célula (polos y septo de división). Bgs3 podría estar implicada en la biosíntesis de la pared celular durante la elongación.