LEVADURAS, 3

Autor: CORDOVILLA GÓNZALEZ ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La fermentación de maltosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae requiere uno de los cinco loci MAL. Cada locus está formado por tres genes, un gen regulador y dos estructurales que codifican la maltosa permeasa, proteína que transporta la maltosa al interior celular y la matasa, enzima que hidroliza la maltosa en dos unidades de glucosa. Estos dos genes, región UAS mal, en presencia de maltosa. En la levadura Kluyveromyces lactis, cepa 2359/I52F, hemos encontrado dos loci MAL, el locus MAL2 localiza en el cromosoma II y el MALS en el IV y/o V, es posible que existan otros loci. El locus MAL2 conviene los genes estructurales KlMAL2I y KlMAL22, el MAL5 los genes KlMAL51 y KlMAL52. KlMAL2I y KlMAL5I codifican maltosas permeasas, los genes KlMAL22 y KlMAK52 maltasas. Los genes estructurales comparten un promotor bidireccional de diferentes tamaño, Io67 pb (locus MAL2) vs I24 pb (MAL5). El análisis de la expresión de estos genes demuestra que es un sistema fuertemente reprimido en presencia de glucosa e inducido con maltosa. El análisis de la secuencia aminoacídica del locus MAL5 avala su no funcionalidad sin embargo hemos detectado transcrito de ambos, posiblemente codifican proteínas trucadas. El gen regulador no está localizado adyacente a los genes KlMAL2I y KlMAL5I como sucede en S.cerevisiae, la organización de los loci MAL en K.lactis es diferente. El promotor bidireccional KlMAL2I-MAL22 es apto para la expresión de proteínas heterologas. Hemos producido dos alérgenos recombinantes Alta IP del hongo Alternaria alternata y Ole eIp del árbol Olea europea, importantes para un futuro desarrollo de vacunas recombinantes. Ensayos con suero de pacientes demuestran que la proteína Alt aIp producida por K.lactis es válida para el diagnóstico de alergia a A.alternata.

Autor: CARNERO GONZÁLEZ ELENA M..
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGÍA BIOQUÍMICA.

Resumen: El mutante ehs-1 fue aislado en una búsqueda de mutantes hipersensibles a Equinocandina y Calcofluor, dos antifúngicos que interfieren en la biosíntesis de la pared celular.ehs1-1 presenta además, un fenotipo de lisis a altas temperaturas que se corrige en presencia de estabilizadores osmóticos.ehs1-1, mayor sensibilidad al tratamiento con enzimas que degradan la pared celular y una pequeña descompensación en los polímeros que componen la pared celular. La proteína Ehs1p muestra un cierto parecido con Mid1p de S.cerevisiae, una proteína asociada a la membrana plasmática y es necesaria para la toma de calcio durante el proceso de conjugación. Basándonos en este parecido hemos visto que ehs1+ está implicado en la acumulación intracelular de calcio. Un incremento de la concentración externa de calcio suprime todos los fenotipos asociados a la falta del gen ehs1+, sugiriendo que los defectos asociados a la integridad celular en el mutante ehs1+ estarían relacionados con defectos en el metabolismo del calcio. En S.cerevisiae se ha propuesto que Mid1p junto con la proteína Cch1p formarían parte de un canal de calcio. Cch1p presenta un gran parecido con las subunidades alfa1 de diferentes canales de calcio dependientes de voltaje identificados en células de mamíferos. Nosotros hemos identificado una proteína similar a Cch1p en S.pombe (Spcch1p). Curiosamente los mutantes ehs1*, spcch1* y ehs1*spcch1* muestran el mismo grado de sensibilidad a Equinocandina lo que sugiere que Ehs1p y Spcch1p podrían formar parte de un canal de calcio que se hallaría conservado a lo largo de la evolución. Hemos observado una interacción génica entre ehs1+ y pck2+ un homólogo a PKC de mamíferos.pck2+ suprime todos los fenotipos asociados al mutante ehs1-1. Nuestros resultados sugieren que Ehs1p formarían parte de un canal de calcio que participaría en el mantenimiento de la integridad celular junto con la proteína quinasa Pck2p.

Autor: GARCÍA RODRÍGUEZ LUIS JAVIER.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA.

Resumen: La pared celular de Saccharomyces cerevisiae es un armazón que rodea la membrana plasmática de esta levadura, por lo que condiciona su forma y tamaño. Sin embargo se trata también de una estructura dinámica, capaz de soportar cambios en condiciones fisiológicas normales o en situaciones de estrés que desencadenan un conjunto de respuestas que se conocen con el término genérico de mecanismo compensatorio. Hasta lo que se sabe hoy en día la mediación de estas respuestas para fundamentalmente por la activación de una ruta de comunicación intracelular basada en un módulo de MAP Quinasas: la ruta PKC. Una de estas respuestas consiste en un incremento significativo en la tasa de síntesis de quitina observada por ejemplo en los mutantes fsk1, afectados en la síntesis del beta1,3 glucano, otro componente de la pared celular de S.cerevisiae. En este trabajo se presentan evidencias que relacionan a la cascada de osmorregulación (HOG) con la construcción de la pared. Los mutantes afectados en genes de la ruta HOG son los primeros descritos como resistentes a altas concentraciones de Calcoflúor, un compuesto antifúngico que provoca un aumento en la tasa de síntesis de quitina. Esta cascada sostiene un nivel de funcionamiento en situaciones de no inducción antagónico al que ejerce la ruta PKC para el mantenimiento de la estructura de la pared celular, lo que condiciona el grado de resistencia a Calcoflúor. La ruta PKC es necesaria para alcanzar el máximo de activación en la síntesis de quitina después del tratamiento con Calcoflúor, aunque la activación de esta cascada no es suficiente para conseguir un incremento en la producción de este polímero. Se demuestra además que en el mutante fks1 el aumento en la síntesis de quitina viene mediado por un incremento de la actividad quitín sintasa III que se relaciona con la deslocalización de las proteínas Chs3p, la subunidad catalítica de esta actividad enzimática, y Chs4p, una activador directo de la misma.

Autor: REINOSO MARTÍN CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: EDIFICIO DEPARTAMENTAL.

Resumen: La paracoccidioidomicosis en humanos, es una micosis sistémica causada por el hongo dimórfico Paracoccidioides. Dicha micosis está restringida a Centro y Sudamérica. La infección comienza con la inhalación de los propagulos fungicos, los cuales buscan el epitelio alveolar pulmonar transformándose en levaduras, que es la forma patógena. Hasta ahora, excepto el polimorfismo genético detectado por análisis de RAPD y de RFLP, no existen datos acerca del fenoma de este hongo. En esta tesis se presenta la secuencia de 51019 pb. El contenido total de AT es de 53,64%. Hemos identificado 17 ORFs (8 de ellos parciales) que ocupan el 46,32% de la secuencia completa, un valor menor que el 72% descrito para Saccharomyces cerevisiae. 15 genes tienen genes homólogos en levaduras u hongos, uno muestra homología con una proteína de función desconocida de Bacillus halodurans y otra proteína que muestra homología con una proteína Acil coenzima A deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa. Se han encontrado intrones en 10 genes, las señales de procesamiento de dichos intrones sigen el consenso descrito para levaduras y hongos, desviándose del consenso existente para levaduras. Por otra parte se ha aislado el gen URA3 de Paracoccidionides braisliensis y se ha construido un cassette URA-blaster similar al descrito para el caso de Candida albicans, con el fin de ser utilizado como herramientas para la transformación de dicho hongo. Además se construyó otro plásmido, utilizando el gen de resistencia a la higromician como marcador de selección, con el fin de obtener una cepa Ura- para Paracoccidiondes brasiliensis.

Autor: RODRÍGUEZ-MANZANEQUE MARTÍNEZ M. TERESA.
Año: 2001.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE LLEIDA.

Resumen: Las glutaredoxinas son enzimas que intervienen en reacción redox y cuya función principal consiste en proteger las células oxidativo a través del mantenimiento del estado redox adecuado de los grupos sulfidrilo de las proteínas celulares. Trabajos anteriores han descrito la existencia de dos glutaredoxinas en la levadura Saccharomyces cerevisiae, Grx1 y Grx2, que contienen dos cisteínas en su centro activo las cuales son esenciales para mantener su función. Estas dos glutaredoxinas juegan diferentes papeles en la célula en la protección contra estrés oxidativo. El presente trabajo consiste en el estudio y caracterización de una nueva familia de glutaredoxinas en S.cerevisiae, formada por Grx3, Grx4 y Grx5, que se diferencia de la ya descrita porque las proteínas poseen una única cisteína en su centro activo. Se ha realizado un análisis comparativo de las secuencias de las dos familias de glutaredoxinas de levadura con las existentes en otros organismos, observándose que la estructura básica de las mismas está conservada desde bacterias a humanos. El análisis funcional de los mutantes de esta nueva familia ha revelado que, de las tres glutaredoxinas monotiólicas, Grx5 es la que desarrolla una función más importante en la protección contra estrés oxidativo, claramente diferenciada de Grx3 y Grx4. Grx5 se ha visto localizada en la mitocondria, siendo esta localización indispensable para el normal funcionamiento de la enzima. Grx3 y Grx4, en cambio, se encuentran en el núcleo. En concordancia con la sublocalización celular, se muestran varias evidencias de que Grx5 se halla directamente implicada en la biosíntesis de los centros Fe/S, que en levaduras tienen lugar en la mitocondria. Los mutantes carentes de Grx5 son defectivos en la actividad de enzimas con centros Fe/S y acumulan un exceso de hierro, tanto en el citosol como en la mitocondria. Estudios mediante la técnica del doble-híbrido han demostrado una interacción física entre Grx5 e Osal, otra proteína de la matriz mitocondrial que interviene en la síntesis de centros Fe/S. Los datos existentes apuntan a que la glutaredoxinas monotiólicas pueden desempeñar funciones especializadas cada una de ellas en compartimentos diversos de la levadura, sin excluir la posible redundancia funcional entre Grx3 y Grx4.

Autor: WANG HONGYIN.
Año: 2001.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Autor: MACHIN CONCEPCION FELIX.
Año: 2000.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FISICA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La Tesis presenta los resultados más destacados del estudio del transporte de nitrato y nitrito en la levadura Hansenula polymorpha. En ella se pone de manifiesto que el gen YNT1 aislado en esta levadura es un transportador de nitrato de alta afinidad inducible por su sustrato y nitrito. Además se demuestra que éste también transporta nitrito, por lo que es biespecifico en cuanto a los sustratos que transporta. A parte del transporte de nitrito por Ynt1p, se pone de manifiesto que existe un segundo sistema específico para el transporte de este segundo ión. Por otro lado se presenta un segundo sistema para el transporte de nitrato que es constitutivo y de baja afinidad. El transportador Ynt1p es regulado post-traduccionalmente por la presencia de glutamina o por ausencia de glucosa. Esta regulación supone la inactivación del transporte de nitrato y de nitrito por Ynt1p, así como un aumento en la degradación de la proteína. Los determinantes en la proteína para la regulación post-traduccinal de Ynt1p han sido estudiados mediante mutagénesis dirigida. Se ha encontrado que la región central hidrofilica resulta esencial tanto para la inactivación por glutamina como por ausencia de glucosa. Finalmente se discute que posibles motivos incluidos dentro de esta región pueden ser importantes para este fenotipo.

Autor: CASTILLO BARAHONA LUIS CARLOS.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Diversas técnicas han sido desarrolladas para obtener mutantes relacionados con la biogénesis de la pared celular, pero ninguna ha demostrado ser eficaz en estudios que impliquen genes a gran escala. En este trabajo se utilizó una colección de mutantes de Y. Liplytica obtenidas por transposición. Un total de 3656 cepas mutagenizadas por transposición se analizaron determinando su sensibilidad o resistencia a calcofluor white. En el estudio se aislaron un total de 190 mutantes sensibles y 1125 resistentes. El análisis de las secuencias en las bases de datos reveló que sólo un 10% de los genes presentaban homología significativa con genes conocidos y un 60% de los genes secuenciados no presentaban ningún tipo de homologia. El 22.5% de las secuencias presentaban un dominio con el que presentan varios genes conocidos, pero no se podría relacionar con una función determinada. Por último un 7,5% fueron considerados artefactos de la transposición, es decir, que ésta se había realizado de forma incorrecta por lo que los mutantes correspondientes fueron descartados. El análisis por PCR mostró que una de cada cinco genes presentaron integración homólogo. A partir de los resultados obtenidos se ha podido aislar un gen presuntamente relacionado con la biosíntesis de la pared celular. El gen mutagenizado de la cepa III.18.18 codifica una proteína dedo de zinc de tipo C2-H2 de Y. Lopolytica que se encuentra involucrado en la transición dimórfica. Además hemos aislado dos genes que representan a igual de III.18.18, integración homologa. El mutante I.14.31 presenta alta homología con el gen 2-oxoisovalerato dehigrogenasa y con el gen piruvato deshidrogenasa y el mutante I.12.4 presenta una altahomología con la ribonucleoproteína f. Estudios del mutante de la glutation reductasa de S. Cerevisiate ha mostadro ser hipersensible al calcofluor white, droga que actúa interfiriendo con la formación de microbillas de quitina y B-1,3 glucano y como consecuencia con la organización de la pared celular. En la vista de este resultado se procedió a la caracterización del gen de la glutation reductasa en Y. Lipolytica del mutante I.11.18.La secuencia del gen aislado del mutante presenta homología de un 65.5% con S. Cerevisiae, 50.3% con E. Coli, 48.2% H.sapiens y 46.4% con C.albicans. Posteriormente se procedió a comprobar si la inserción del transposon había sido correcta a través de una técnica de PCR. Los resultados demostraron que la integración había sido heteróloga es decir, incorrecta. A continuación se procedió a la disrupción del gen Y1GRL, utilizándose dos métodos distintos: por integración homologa(gen-ura-gen) y por-in/pop-out. Los resultados obtenidos nos indican que la deleción del gen podría ser letal en este microorganismo, idénticos resultados se ha descrito para Schizosaccharomyces pombe. Finalmente el gen Y1GRL no complementa el mutante de S.cerevisiae de la glutation reductasa, la no complementación del gen Y1GRL en S.cerevisiae posiblemente se explicaría por la divergencia en el procesamiento de la proteína en estas dos especies y como consecuencia en su actividad.

Autor: RODRIGUEZ NAVARRO SUSANA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: En los últimos cinco años hemos asistido a un cambio en la metodología de estudio de determinados problemas en biología. La secuenciación completa de genomas de distintos organismos, tanto procariotas como eucariotas, ha abierto un nuevo campo de investigación: la genómica. En 1996 se publicó la secuenciación total del genoma de Saccharomyces y se determinó el número de genes aproximado que componian dicho organismo. Uno de los mayores retos que surgió a partir de esta información fue el descubrimiento de nuevas ORFs de función desconocida y su posible caracterización. Posteriormente se desarrollaron técnicas de estudio global de expresión de estos nuevos genes mediante la tecnología de Chips de DNA. Toda esta información junto con la posibilidad del estudio in silico de muchas cuestiones, ha revolucionado el panorama actual en el estudio de la biología molecular de levadura. Este trabajo pretende ser una muestra y aportación de este cambio nacido de la secuenciación del genoma. El estudio funcional del genoma de levadura pretende dilucidar la función de estas nuevas ORFs descritas in silico, pero nunca antes estudiadas. Este es el objetivo principal de todo el trabajo realizado. En el Capítulo I se describe el estudio, sistemático y árduo, de doce ORFs huérfanas (función desconocida) en el momento de inicio del trabajo. En el Capitulo II, se estudia la utilidad de un nuevo sistema para el análisis funcional de genes esenciales, analizándose cinco de estos genes. Tres familias génicas son estudiadas en el Capítulo III asignándose función a algunos de los genes estudiados. Y por último en el Capítulo IV se describe la identificación y caracterización de un nuevo gen de S. Cerivisae SRC1. Las herramientas metodológica que ha generado la realización del proyecto EUROFAN y en general, los análisis globales tanto de expresión como de interacciones a nivel de proteínas (doble híbrido global),junto con la disponibilidad en las bases de datos de nuevas técnicas informáticas para distintos análisis in silico,ponen en nuestras manos elementos de estudio y conocimiento utilizables para llegar a la función desconocida de uan ORF, aunque como será discutido posteriormente, no siempre con éxito.

Autor: LEON SANTANA MAELA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSITAT DE VALÉNCIA.

Resumen: El B-1,3 glucano es un polímero muy importante dentro de los componentes de la pared cecular en muchos hongos. Las enzimas que lo sintetizan tienen grandes niveles de homología entre ellas, en diferentes hongos. Utilizando este hecho como base, se siguió como estrategia el diseño deoligonucleótidos degenerados para obtener sondas específicas de Y. Lipolytica. La utilización de estas sondas permitió clonar los gnes Ylgs1 y Ylrh01, homólogos a aquellos que codifican las subunidades catalíticas y reguladora del complejo B-1,3 glucan sintasa en otros hongos. La caracterización de estos genes evidenció la esencialidad del gen Ylgs1 para la viabilidad celular. El gen Ylrh01 no es esencialy su deleción provoca alteraciones en el crecimiento en presencia de rojo congo y calco fluor white.

Autor: ARRATUA BARBADO LORENA.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: QUIMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS.

Resumen: En este trabajo se ha reproducido la ultima etapa de la ruta de secrecion de la levadura Saccharomyces cerevisiae mediante un ensayo in vitro. Para ello se han purificado tanto vesiculas de secrecion como vesiculas de membrana plasmatica invertidas a partir del mutante de secrecion sec 6-4. Purificadas ambas fracciones se comprobo que las principales proteinas implicadas en los procesos de fusion intracelular se encuentran presentes en las mismas con un perfil de distribucion definido. El proceso de fusion entre vesiculas de secrecion y vesiculas de membrana plasmatica invertidas se midio a traves de las propiedades autoatenuables de la sonda lipidica octadecilrodamina, R18. Dicho proceso es dependiente de la temperatura y de la presencia de ciertos cationes en el medio, mostrando ademas, un perfil de saturacion con el tiempo y con cantidades crecientes de membrana diana. Asimismo, por medio de fragmentos Fab contra las proteinas Sso 1p (t-SNARE) y Snc1p(v-SNARE) se ha demostrado que ambas proteinas estan directamente implicadas en el proceso de fusion. Por otra parte,tanto la adicion exogena de ATP como la adicion de GTP son capaces de estimular el proceso, lo que indica que ambos nucleotidos participan en el mismo. Por ultimo, el proceso de fusion se visualizó mediante microscopia electronica.

Autor: CALCEDO DEL HOYO ROBERTO .
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DEL PAIS.

Resumen: En los ultimos años ha tenido lugar un marcado aumento, de la micosis, especialmente las invasivas y mucocutaneas producidas por Candida albicans, siendo esta ultima el objetivo de nuestro estudio. En el 40-60% de las personas C.albicans sobrevive en las mucosas como comensalinocuo donde la SIgA, es el principal mecanismo de defensa y control. En determinadas ocasiones origina infecciones orales agudas o cronicas. El cambio brusco de temperatura, otro tipo de estrés, necesario para la formacion del tubo germinal en el proceso infectivo, origina proteinas de estrés termico que han demostrado ser objetivo de la respuesta humoral del hospedador y la causante de alteraciones en el sistema inmune que conducen a la aparicion de enfermedades autoinmunes y cronicas. En este estudio hemos identificado la variacion causada por la temperatura en la expresion de 6 antigenos manoproteicos con Pm: 36,42,80,90,205,223 kDa, todos ellos reconocidos por la IgA humana. La expresion de estos antigenos fue estudiada en las diferentes fases de crecimiento del hongo, medios de cultivo con limitaciones nutricionales, y cepas, varias de ellas procedentes de infeccion reciente. Ademas en todas las condiciones se estudio la relacion hidratos de carbono/proteina como indicativo de glicosilacion. Posteriormente se procedio a la caracterizacion bioquimica de cada uno de ellos y a la secuenciacion del extremo N-terminal para su identificacion en bases de datos.

Autor: CALVO PEREZ ESTHER.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las infecciones por Candida albicans se han incrementado dramaticamente durante las dos ultimas decadas. Desde un punto de vista diagnostico, la candidiasis invasiva es la que presenta más dificultades debido a la ausencia deuna sintomatologia clínica especifica, a la imposibilidad de obtener en muchos casos muestras histológicas para la demostración de la presencia del hongo en el tejido infectado y a la ocurrencia de falsos negativos en los hemocultivos. Por todo ello, el diagnostico serológico, basado bien en el estudio de la respuesta de anticuerpos del paciente, bien en la deteccion de antigenos circulantes y metabolitos fungicos, se ha visto impulsado en los ultimos años en un intento de identificar marcadores serologicos de la candidiasis invasiva. Sin embargo, esta identificacion resulta complicada debido a la complejidad y variabilidad de la composición antigenica de Candida albicans. Asi, la electroforesis bidimensional (2-DE) basada en el fraccionamiento acoplado a la carga y el peso molecular de los proteinas ha demostrado ser una herramienta muy util en el analisis de mezclas complejas de proteinas de Candida. La combinación de esta tecnica de separacion electroforetica con la inmunodetección mediante Western blot y revelado con quimioluminiscencia frente a distintos antisueros animales, humanos, anticuerpos monoclonales y lectinas, ha permitido llevar a cabo el objetivo principal del presente trabajo, la identificacion y caracterizacion de proteinas de Candida albicans mediante 2-DE en busca de posibles marcadores antigenicos de la candidiasis invasiva. De esta manera, de los aproximadamente 700 péptidos resueltos en los mapas proteicos en dos dimensiones, se han considerado antigenos de interes diagnostico por presentar una marcada respuesta de anticuerpos en los pacientes con candidiasis invasiva pero ninguna o muy poca en las personas sanas, catorce antigenos de naturaleza manoproteica y cuyos epitopos de reconocimiento son precisamente la fraccion manosil de los antigenos.

Autor: UFANO ORTIZ SANDRA.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La estructura más externa que presentan las celulas de hongos y levaduras es la pared celular, siendo sus funciones principales actuar como barrera protectora contra el medio circundante y conferir a las celulas su forma caracteristica. El proceso de esporulacion en la levadura Saccharomyces cerevisiae implica un programa regulado de desarrollo celular que conduce a la encapsulacion de nucleos haploides en el interior de ascosporas con paredes celulares de multiples capas que confieren una mayor protección frente a condiciones de estrés, comparado con la pared celular vegetativa. SWM1 se expresa debilmente durante el crecimiento vegetativo pero se induce fuertemente en condiciones de esporulación, con una cinética similar a la de los genes medios especificos de esporulación. Diploides homozigóticos swml realizan normalmente las dos divisiones meióticas pero no son capaces de formar ascas maduras. La deleción de SEM1 afecta especificamente a la expresión de genes tardios y muy tardios de esporulación, como SSG1, DIT1 o SPS100 por lo que estos mutantes poseen defectos en la sintesis y ensamplaje de la pare celular de la espora. La proteina nuclear Swm1p participa, junto con la ruta de MAPKs especifica de esporulacion en la correcta inducción y regulacion temporal de los genes tardios y muy tardios de esporulacion, desempeñando un papel independiente de dicha ruta. Las células carentes del gen SWM1 se lisan cuando crecen a elevadas temperaturas (37ºC), defecto que se recupera en presencia de sorbitol. Las celulas mutantes presentan defectos en citoquinesis y poseen un exceso de quitina en los tabiques, estando extremadamente engrosados en algunos casos, y en las paredes celulares, donde se observan acumulos deslocalizados. Mediante analisis de transcripción utilizando membranas "microarrays" se ha comprobado que la deleción de SWM1 afecta a la expresión de numerosos genes relacionados con la pared celular, algunos de los cuales codifican para proteínas que se anclan en la pared celular mediante enlaces de tipo GP1 y otros para diferentes proteinas de la pared celular.

Autor: SANCHEZ MARTINEZ ELISA ISABEL.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INST. MICROBIOLOGIA BIOQUIMICA/DPTO. MICROBIOLOGIA Y GENET.

Resumen: La proteína Cdc6 de Saccharomyces cerevisiae es necesaria para la formación de los complejos pre-replicativos, que son requeridos para el disparo de los origenes de replicaciion durante la fase S del ciclo celular. La expresión desregulada de CDC6 provoca un retraso en la entrada de mitosis en S.cerevisiae. La deleción del gen hace que las células se dividan sin que previamente hayan realizado una fase S, resultando en un fenotipo letal conocido como catastrofe mitotica Por esas razones hemo analizado si CDC6 forma parte de un mecanismo de comprobaciónd e inicio de fase S, construyendo dos tipos de muantes. Tras este analisis, no podemos afirmar que exista un control de comprobación de inicio de fase s, aunque nuestros datos indican que la función de inhibición de la mitosis estaria ejercida por los primeros 47 aminoácidos de la proteína. La replicación del DNA se inicia en orígenes de replicación que se activan por un patrón predecible: algunos se activan pronto en el ciclo (origenes tempranos) y otros más tarde (orígenes tardíos). La hidroxiurea bloquea la progresión de la horquilla de replicación de los orígenes tempranos, inhibiendo la activación de los origenes tardios mediante un mecanismos de comprobación, intrinceso a fase S, mediando por las quinasas Mec1 y Rad 53. Nosotros mostramos que, probablemente, Cdc6 no este implicado en este mecanismo de comprobación. Finalmente, la salida de mitosis requiere la inactivación de la quinasa Cdc28/Clb a traves de un mecanismo regulado incialmente por Cdc20 y posteriormente por Cdc14, que desfosforila a Sic1 y Htc1. Nuestros datos sugieren que Cdc6, además de ser un componente clave y conservado a lo largo de la evolución necesario para la formación de los complejos pre-replicativos, coopera con las proteínas requeridas para la inactivación de Cdc28/Clb que conducen a la salida de mitosis.

Autor: GARCIA SANCHEZ RAUL.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA, USAL.

Resumen: La esporulación en Saccharomyces cervisiae es un modelo perfecto para el estudio de la esporulacion el cual es un proceso en el que la expresion secuencial y especifica de una serie de genes conduce a la formación de una estructura especializada denominada ascospora, resistente a las condiciones ambientales adversas. El gen SSG1 codifica para una exo-1,3-B-glucanasa, inducida en los ultimos estadios de este proceso. En este trabajo, hemos estudiado el promotor SSG1 para identificar las secuencias de DNA que son importantes para mantener su represión durante el crecimiento vegetativo y aquellas que son necesarias para inducir la transcripción durante la esporulación. Para ello, se construyeron un conjunto de deleciones sucesivas de la region 5 no codificante de SSG1 para analizar la actividad B-glucanasica producida por cada una de las construcciones. De esta manera se identificaron tres regiones independientes que actuan como secuencias represoras en el contexto del promotor nativo asi como un gen heterólogo, el gen lacZ de Escherichia coli, durante el crecimiento vegetativo. Ademas se hizo otras colección de deleciones que fueron analizadas durante la esporulación, lo que permitió identificar uan región distinta que se encarga de inducir la expresion de la glucanasa durante este proceso de diferenciación. En una aproximación alternativa, se ha llevado a cabo la búsqueda de genes regulatorios responsables de la expresión diferencial de SSG1. Para ello, cepas haploides portando cada una de las regiones represoras colocadas en la region 5´de dos genes marcadores, URA3 y KanMX4, fueron sometidas a mutagenesis por integracion del transposón Tn3. El analisis de las estirpes prototrofas para uracilo y resistentes a kanamicicna, ha permitido, identificar cuatro genes implicados en la represion de SSG1: Dos de la ruta RAS/cAMP (CDC25 y CYR1) y dos del complejo mediador de la RNA polimerasa II (SIN4 y MED1).

Autor: BLANCO RODRIGUEZ MIGUEL ANGEL.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y GENETICA/IMB.

Resumen: La proteina ste9 de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe pertenece a la familia de proteinas con dominios WD(triptófano-aspártico) y presenta un alto grado de similitud con la proteina de mamiferos Hct1 y cob la proteina Fzr de Frosophila. Todas estas proteinas son activadores/reguladores del complejo APC/C (complejo promotor de la anafase/ciclosoma). En este trabajo, demostramos que APCste9 induce especificamente la degradación de las ciclinas mitóticas cdc13 y cig1 pero no de la ciclina de fase S cig2. La función de APCste9 no es necesaria para la degradación de cdc13 y cig1 en la transición metafase-anafase pero si para la proteólisis de estas dos ciclinas durante la fase G1 de ciclo celular. Por tanto, proponemos que la principal funcion de ste9 es inducir la degradación de las ciclinas mitolicas cuando es necesario provocar un retraso o un bloqueo de la fase G1 del ciclo celular. También se demuestra que ste9 está regulado negativamente mediante un proceso de fosforilación dependiente de la quinasa cdc2. En la fase G1, cuando los niveles de actividad de los complejos cdc2/ciclina son reducidos, ste9 se desfosforila, interacciona con el complejo APC y lo activa. Durante el resto del ciclo celular, la fosforilación de ste9 induce su degradación y, al mismo tiempo, provoca su disociación del complejo APC. Este mecanismo de regulación permite la inactivación de cdc2 en la fase G1 y la impide durante el resto del ciclo celular. En la segunda parte de este trabajo hemos identificado y caracterizado un nuevo regulador del complejo APC especifico de la meiosis. Mediante la meosis los organismos diploides con reproducción sexual generan los gametos haploides. En las levaduras, despues de la meiosis se produce la esporogénesis mediante la cual cada nucleo haploide se encapsula en una forma de resistencia denominada espora. Estos dos procesos, eiois y esporogénesis, estan coordinados de tal modo que la formación de las esporas no se inicia hasta que no se hayan completado totalmente las dos divisiones meióticas. En este trabajo describimos una proteina especifica de meiosis, mfr1, que esta implicada en la coordinacion entre la meiosis y la esporogénesis. Mfr1 es un activador del complejo APC necesario para la degradación correcta de las ciclinas cdc13 y rem1 al final de la meiosis II, antes de que se forman las esporas. Las células que carecen de mfrl completan a meiosis II, pero los niveles de actividad de los complejos cdc2/ciclina se mantienen anormalmente elevados lo que provoca un grave defecto en la formación de las esporas. Por comparación con el ciclo mitótico, donde la degradación de las ciclinas mitóticas y la inactivación de cdc2 es necesaria para inducir la salida de mitosis y el inicio de la citoqinesis, proponemos que la degradación correcta de las ciclinas al final de la meiosis es esencial para inducir la esperogénesis.

Autor: PRADA GATO JOSÉ M. DE.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Resumen: El ciclo celular de S.pombe consta de 4 fases: G1, S, G2 y M. Las ciclinas cdc13, cig1, cig2 y puc1 controlarían el paso por estas fases. 1,- cdc13 es la única ciclina esencial, ya que promueve la mitosis. Su actividad oscila en el ciclo celular, sindo mínima en G1 y máxima en mitosis. Esto depende directamente de la proteolisis de cdc13, pues ciertas mutaciones es la secuencia del gen producen una proteina resistente a degradación. Este mutante, cdc13-des2, es letal para la célula en sobreexpresión, pues no permite la salida de mitosis. En cambio, en condiciones silvestres, la célula puede vivir, aunque presenta defectos en los procesos de mitosis y desarrollo sexual. 2,- La función de cig1 parece ser redundante con otras proteínas. Participa en la inducción de la entrada en fase S y sus niveles proteicos oscilan de forma similar a los de cdc13: son mínimos en G1 y máximos en mitosis. 3,- cig2 es la principal ciclina que activa la fase S en S.pombte. A pesar del alto grado de homología con cdc13, cig2 no puede sustituirla.Por otra parte, la expresión de un mutante indestructible de cig2, cig2DB*, ocasiona un retraso en la fase G1, y ello depende del medio de crecimiento. También se ven afectados cl tamaño celular, la capacidad de bloquearse en G1 por privación de nitrógeno y la fertilidad. 4,- puc1 regularía la entrada en el proceso de desarrollo sexual. Sus niveles proteicos son constantes durante el ciclo celular, y no aumentar en condiciones de privación de nitrógeno. Puc1 contribuye también al paso por G1, y su falta, junto con cug1 y cig2, provoca hiperfertilidad. Este fenotipo se suprime eliminando a cum1. Así mismo, puc1 puede fosfoli-- a rum1 para su degradación, y es un sensible a la inhibición por parte de aquél.

Autor: SÁNCHEZ GARCÍA M. MAR.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Este trabajo estudia la homología funcional de los genes CDC6 de la levadura de gemación Saccharomyces cervisiae y cdc18+ de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, genes esenciales para el inicio de la replicación del DNA en estos organismos. Dicha homología se demuestra mediante la complementación, en condiciones específicas, de defectos asociados a determinadas mutaciones de cdc 18 o a la ausencia de este gen. También aborda el análisis de las interacciones moleculares entre la proteína heteróloga y los complejos de la principal quinasa de S.pombe, Cdc2, con el fin de establecer semejanzas y diferencias en los mecanismos de control del inicio de la replicación en estas levaduras. Se muestra, a este respecto, la fosforilación in vitro de proteína recombinante Cdc6Ha por complejos Cdc2/Cdc13 y Cdc2/Cig1. Finalmente, a favor de la homología funcional postulada, se reproducen los fenotipos asociados a la sobreproducción de Cdc18, sobre-expresando el gen CDC6, lo que interrumpe el control sobre la re-replicación en esta levadura, dando lugar a rondas sucesivas de síntesis continua de DNA sin mitosis intermedias.

Autor: PARADA VALDECANTOS PILAR ANGÉLICA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: Se realizó un estudio del tallo ribosómico de levadura, que contempló una caracterización bioquímica, obteniéndose proteínas ácidas mutagenizadas que se analizaron mediante entrecruzamiento químico de los ribosomas portadores de estas proteínas mutagenizadas. Se encontró formación de dímeros y unión a ribosoma de estos dímeros en todos los casos ensayados con las proteínas del tipo P2, pero en el caso de las proteínas del tipo P1, éstas se unen a ribosomas sólo cuando existen dos sitios de unión para estas proteínas libres en el ribosoma. Un estudio biofísico posterior, consistió en la expresión y purificación de distintas proteínas P del tallo ribosómico y la posterior medición de las constantes de asociación entre ellas, usando la técnica de resonancia de plasmones de superficie. Se regristró un valor de Kd= 2,2 x 10-7, entre la proteína recombiante P2beta y un fragmento correspondiente a los últimos 98 aminoácidos de la proteína P0. El estudio celular se realizó mediante una técnica muy novedosa de microscopía de dos fotones asociada a espectroscopía correlacional de fluorescencia. Se obtuvieron proteínas P de fusión a GFP y se expresaron en distintas cepas de levadura. La cepa W303 presentó una autofluorescencia muy alta que impedía la medición de intensidad de fluorescencia debida a la presencia de la proteína de fusión a GFP. Se cambió de fondo genético de estudio a una cepa Dpep4, deficiente en proteasas vacuolares. En este fondo genético se comprobó que cuando se expresan dos proteínas de fusión a GFP,la intensidad de fluorescencia es el doble que cuando se expresa sólo una. Topdos estos experimentos en conjunto apoyarían la teoría de una composición homogéna de tallos ribosómicos, donde existirían una proteína ácida de cada tipo unida al ribosoma.