METABOLISMO BACTERIANO

Autor: ARIAS BARRAU ELSA.
Año: 2004.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTADES DE BIOLOGÍA Y VETERINARIA.

Resumen: En la presente Tesis Doctoral se han identificado y caracterizado los genes que codifican la ruta periférica de degradación de fenilalanina y de tirosina en P. putida U. Éstos se encuentran en tres zonas distintas del DNA. En la primera de ellas existen tres genes: phhA y phhB se transcriben en el mismo sentido y codifican el sistema de hidroxilación de la fenilalanina a tirosina y phhR se transcribe en sentido opuesto y codifica una proteína reguladora de dicha hidroxilasa. En el segundo fragmento aparece el gen aat que codifica una de las posibles aminotransferasas que transforma la tirosina en ácido 4-hidroxifenilpirúvico. En el tercer fragmento se encuentra el gen hpd que codifica la enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, que es la encargada de transformar el ácido 4-hidroxifenilpirúvico en ácido homogentísico. Se han identificado y caracterizado los genes implicados en la ruta central de degradación de fenilalanina y de tirosina en P. putida U. Estos genes forman una agrupación génica en la que tres de ellos (hmgABC) se transcriben en el mismo sentido (operón del homogentísico) y un cuarto gen (hmgR) lo hace de manera divergente. El operón del homogentísico está constituido por el gen hmgA que codifica la enzima homogentisato dioxigenasa, el gen hmgB que codifica la enzima fumarilecetoacetato hidrolasa y el gen hmgC que dcodifica la enzima maleilacetoacetato isomerasa. El gen hmgR codifica una proteína represora que regula el operón del homogentísico. Otros estudios nos permitieron concluir que la degradación del ácido 3- hidroxifenilacético converge con la degradación de fenilalanina y tirosina a nivel del ácido homogentísico, lo que pone de manifiesto que la degradación de este compuesto es una ruta central del catabolismo de diversos compuestos relacionados estructuralmente (L-rirosina, L-fenilalanina y ácido 3-hidroxifenilacético). Se han identificado y caracterizado los genes que participan en la ruta periférica del catabolismo del ácido 3-hidroxifenilacético en P. putida U. Se ha descrito una nueva hidroxilasa de dos componentes, a la que hemos denominado homogentisato sintasa, que es la encargada de convertir el ácido 3-hidroxifenilacético en ácido homogentísico. Esta hidroxilasa está codificada por los genes mhaAB. Al lado de estos dos genes y en el mismo sentido de transcripción se encuentra el gen mhaC que codifica una permeasa implicada en la toma del ácido 3-hidroxifenilacético. Se han identificado y caracterizado en P. putida U otros genes que codifican enzimas necesarias en el catabolismo tanto del ácido 3-hidroxifenilacético como de otros compuestos. Así, se han descrito un sistema requerido para la toma de ácido homogentísico desde el caldo al interior celular, un sistema sentor-regulador y una proteína encargadda del aporte energético. El sistema de transporte para la toma del ácido homogentísico está codificado por los genes hmgDEFGHI. El gen hmgD codifica una proteína periplásmica de unión, los genes hmgEF codifican sendas permeasas, y los genes hmgGH codifican dos ATPasas. Estos cinco genes se transcriben en el mismo sentido mientras que el gen hmgI, que codifica un represor que controla el sistema de transporte, se transcribe de manera divergente. Se ha diseñado un nuevo sitema útil para la identificación de inhibidores de la enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, que pueden ser utilizados como herbicidas y, adecionalmente, como fármacos contra las tirosinemias (herbicidas terapéuticos).

Autor: SANDOVAL ÁLVAREZ ÁNGEL.
Año: 2004.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTADES DE BIOLOGÍA Y VETERINARIA.

Resumen: En el desarrollo de los trabajos para la elaboración de la presente Tesis Doctoral, se completó la secuenciación del locus pha de P. putida U. Este locus tiene una extensión de 7.000 pb y contiene 6 genes (phaC1, phaZ, phaC2, phaD, phaF y phaI). Se identificaron tres regiones de DNA con actividad promotora. Estos promotores gobiernan la expresión de los genes de este locus. La deleción completa del locus pha en P. putida U nos permitió obtener un mutante incapacitado para acumular polímero tanto a partir de precursores alifáticos como aromáticos. En este mutante, la expresión tn trans del gen phaC1 (que codifica la actividad polimerasa) da lugar a la acumulación intracelular de polímero. No obstante, la acumulación tiene lugar siguiendo un patrón (caracterizado por la aparición de un elevado número de gránulos de pequeño tamaño) claramente diferenciado del de la cepa silvestre. Este hecho nos indica que, si bien es posible la acumulación de polímero únicamente con la expresión del gen phaC1, sería necesario el concurso de otros factores para que la acumulación tenga lugar según el modelo propio de la cepa silvestre (pocos gránulos de gran tamaño). Sobre la cepa delecionada en el locus pha en la que se expresa el gen phaC1, se clonaron los genes phaD, phaF, phaI y combinaciones de ellos, utilizando otro plásmido compatible. La expresión de phaF (solo o en combinación con phaD) da lugar a la aparición de unos gránulos similares en número y tamaño a los de la cepa silvestre. Este hecho sugiere que el producto del gen phaF desempeña un papel fundamental en el establecimiento de la arquitectura molecular del gránulo; posiblemente dirigiendo y/o controlando los mecanismos que desencadenan la coalescencia de los gránulos incipientes para generar el gránulo maduro, con la consiguiente disposición y estabilización intracelular del material polimérico. sin embargo, la expresión conjunta de los genes phaI y phaF, de tal modo que PhaI pudiera actuar modulando el efecto de PhF con el fin de controlar el tamaño de los gránulos y la viabilidad de la célula. La deleción de los genes phaD, phaF y phaI en P, putida U y en P, putida UAfadBA, dio lugar a unos mutantes que mostraron un fenotipo caraterizado por acumular una cantidad inferior (del orden del 70% menos respecto a las correspondientes cepas parentales) de polímero de naturaleza alifática, no mostrando acumulación alguna de polímero de naturaleza aromática. Cuando sobre estos mutantes se expresaron los genes phaD, phaF, phaI y combinaciones de ellos, se observó que la expresión de phaF (solo o en combinación con phaD) da lugar a la restauración del fenotipo silvestre. La expresión en trans del gen phaZ ( que codifica la actividad despolimerasa intracelular) en las cepas parentales P. putida U y P. putida UAfadBA, evita la acumulación de material polimérico. Cuando se cultivó la cepa P.Putida UAfadBA que expresa en trans el gen phaZ, en medio mínimo con diferentes ácidos n-fenilalcanoicos, el análisis de los caldos de cultivo revela la presencia de intermediarios del tipo (R/S)-3-OH-n-fenilalcanoatos en una proporción cercana a la de una mezcla racémica. Los compuestos del tipo (R)-3-OH-fenilalcanoatos poseen actividad antibacteriana frente a diferentes cepas del género Listeria. Esta cepa bacteriana, capaz de bioconvertir n- fenilalcanoatos en los correspondientes derivados 3-hidroxilados, puede ser interesante para el desarrollo de diversas aplicaciones biotecnológicas.

Autor: BAGINSKY GUERRERO CECILIA.
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: E.T.S.I. AGRONOMOS.
Centro de realización: ETS INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: La producción de H2 por la nitrogenasa tiene lugar concomitantemente con la fijación de nitrógeno. Esta producción de H2 ha sido considerada como una de las principales causas de ineficiencia en la fijación de nitrógeno. Sin embargo, existen algunas especies de bacterias pertenecientes a los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium que inducen en sus nódulos un sistema hidrogenasa (sistema Hup; hydrogen uptake) capaz de reciclar el H2 desprendido por la nitrogenasa. En esta Tesis se abordó la caracterización de la agrupación de genes hup de diferentes cepas de Bradyrhizobium sp. (Lupinus), Bradyrhizobium sp. (Vigna), R. tropici y A. caulinodans. Dentro del grupo de los Bradyrhizobium (Lupinus y Vigna), se observó una alta diversidad intraespecífica en el patrón de bandas de hibridación, en tanto que este patrón fue muy homogéneo en A. caulinodans y especialmente en R. tropici. Este análisis reveló, además, diferencias en los genes reguladores de la hidrogenasa. Los genes de oxidación de hidrógeno de Bradyrhizobium sp. (Vigna) se presentaron alejados filogenéticamente de los genes homólogos de Bradyrhizobium sp. (Lupinus) lo que implica que dichos genes provienen de dos orígenes diferentes. La caracterización molecular del sistema Hup de Bradyrhizobium sp. (Vigna) M5 reveló la existencia de una agrupación génica compuesta por los genes hupSLCDFGHJKhypABFCDE, siendo esta organización génica muy similar a la descrita para la agrupación de los genes hup localizada en la isla simbiótica de B. japoncum USDA110. El análisis molecular del sistema hidrogenasa de A. caulinodans ORS571 permitió identificar una agrupación integrada por los genes hupTUVhypFhupSLCDFGH(IJ)KhypABhoxAhyp CDEhupE. Su organización fue muy similar a la descrita en R. capsulatus, excepto por el gen hupE. La inactivación de los genes hupSL en A. caulinodans ORS571, Bradyrhizobium sp. (Lupinus) Z89 y Bradyrhizobium sp. (Vigna) M5 condujo a una drástica reducción de la capacidad de oxidación de H2 en bacteroides procedentes de S. rostrata, L. albus y V. unguiculata, respectivamente; no obstante, estos valores sólo se correlacionaron con una reducción significativa en la actividad nitrogenasa y en el contenido de nitrógeno en plantas de V. unguiculata en simbiosis con el mutante Bradyrhizobium sp. (Vigna) M5.1.

Autor: TRESIERRA AYALA ALVARO.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Resumen: B.japonicum es una bacteria conocida por su capacidad de denitrificar, asimilar nitrato y fijar N2 en simbiosis con plantas de soja, procesos en los cuales intervienen molibdenzimas como las nitrato reductasas y nitrogenasa. Dada la importancia del transporte de Mo para la síntesis de estas enzimas y la carencia de estudios sobre la caracterización genética de los sistemas de transporte de Mo, se identificó y caracterizó los genes modABC de B.japonicum implicados en el transporte de este elemento. Mediante el empleo de una diversidad de técnicas moleculares, fisiológicas y microbiológicas se ha concluído que: 1,- Bradyrhizobium japonicum contiene los genes modABC, que codifican un sistema de transporte, de alta afinidad, de molibdeno, formado por las proteínas ModA, ModB y ModC. 2,- Los genes mod son esenciales para el crecimiento de Bradyrhizobium japonicum en medios deficientes de molibdeno. 3,- El molibdeno reprime la expresión de los genes modABC de Bradyrhizobium japonicum. 4,- El molibdeno, o un compuesto derivado, regula, a nivel transcripcional, la expresión de los genes napEDABC, que codifican la enzima nitrato reductasa periplásmica, responsable de la reducción anaeróbica del nitrato. 5,- La mutación en los genes mod no afecta la capacidad infectiva de Bradyrhizobium japonicum en plantas de Glycine max, pero disminuye la eficiencia de la fijación simbiótica de N2. 6,- Bradyrhizobium japonicum posee, al menos, tres sistemas de transporte de Mo. Uno de alta afinidad codificado por los genes modABC, el segundo, probablemente, un transportador de sulfato que permite incorporar molibdeno con menor eficiencia, y el tercero que sólo actuaría en condiciones de exceso de sulfato.

Autor: Zafra Amorós Olga.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Centro de Biología Molecular.
Centro de realización: Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa".

Resumen: T. thermophilus HB8 puede crecer anaeróbicamente con nitrato, gracias a la presencia de una nitrato reductasa respiratoria unida a membrana (Nar). En otros microorganismos esta enzima se compone de tres subunidades (NarG, NarH y NarI) codificadas en un operón junto a otro gen para una chaperona específica del sistema (NarJ). En T. thermophilus HB8, un nuevo gen, narC, se encuentra antes de narG. El principal objetivo de este trabajo es estudiar el papel de NarC en la estructura, síntesis y maduración de la nitrato reductasa termófila. En primer lugar se analiza la transcripción del gen narC y se concluye que se contranscribe con las subunidades estructurales de la nitrato reductasa. Además, se identifica el inicio de la transcripción del promotor nar, a unos 91 pb desde el ATG de narC. Después se aislaron mutantes de inserción narC::kat para obtener información sobre su naturaleza y función. Los datos muestran que NarC es un citocromo c anclado a membrana, de unos 27 kDa, cuya presencia es estrictamente necesaria para el crecimiento anaeróbico. Además, se necesita para el anclaje a la membrana de la subunidad catalitica, NarG. En E. Coli, este anclaje depende únicamente de Narl, por lo que se añadieron al estudio mutantes narl::kat de T. Thermophilus, encontrando que el fenotipo era semejante. Por tanto se concluye que ambas proteínas son requeridas para el anclaje a mebrana, lo que sugiere que NarC es una parte estructural de la nitrato reductasa respiratoria temófila. Durante la caracterización de los mutantes en narC y narl se obsevó que la forma soluble de NarG, producida en ambos mutantes, es inactiva con donadores artificiales de electrones, y este hecho se relaciona con una sensibilidad a proteasas, al igual que en mutantes afectados en la chaperona específica (narJ::kat). Por tanto se propone la hipótesis de que es necesaria una unión a la membrana antes de la activación de NarG. Para probarlo se analizó el proceso de maduración de la nitrato reductasa y se confirmó la necesidad de una unión a la membrana. Como resultado, se propone un modelo de biosíntesis de la nitrato reductasa respiratoria de T. thermophilus, consistente con estos resultados y diferente al propuesto para E. coli. Finalmente se busca la presencia del operón nar, y de narC como primer gen, en otras cepas de T. thermophilus que pueden crecer con nitrato en anoxia. Se encuentra que narC está presente siempre que hay un operón nar semejante al conocido para la cepa HB8 y se confirma su importancia aislando mutantes en algunas de estas cepas. Además se muestra que algunas de estas cepas pueden realizar respiración anaeróbica con nitrito, e incluso, que es posible la existencia de otro sistema de respiración de nitrato distinto de Nar.

Autor: RODRÍGUEZ MARCO SONIA.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: Los microorganismos del género Streptomyces son bacterias Gram positivas de alto contenido en G+C, que producen gran cantidad de metabolitos secundarios y proteínas extracelulares. Entre estas destacan enzimas hidrolíticas como celulasas, quitinasas, amilasas y xilanasas. Los genes que codifican estas enzimas están generalmente inducidos por los productos de degradación de sus sustratos poliméricos y reprimidos por fuentes de carbono fácilmente asimilables como la glucosa, mediante un proceso denominado Regulación por Fuente de Carbono, Xys1, una xilanasa codificada por el gen xysA de Streptomyces halstedii JM8, ha sido caracterizada en nuestro laboratorio. El objetivo del presente estudio ha sido la determinación de las regiones del promotor implicadas en su represión por glucosa. Se ha utilizado el operon melC de S. Glaucescens como indicador para estudiar en S. Lividans versiones delecionadas y mutadas de dicho promotor. Cinco de estas deleciones y una doble mutación puntual están desreprimidas. Posteriormente ensayos cuantitativos de la actividad xilanásica en sobrenadantes de cultivo mostraron que estas versiones están parcialmente desreprimidas. Así, se han descrito tres regiones del promotor relacionadas con la represión por glucosa, y ensayos de retardo en gel han demostrado que algunas proteínas tanto de S. Lividans como de S. Halstedii se unen específicamente a dichas regiones. Por otra parte, se han intentado aislar activadores transcripcionales del promotor de xysA mediante un escrutinio basado en al expresión del gen de resistencia a neomicina controlado por el promotor de xysA. Este cassette ese integró en el genoma de S. Lividans y esta cepa fue transformada con una genoteca genómica de S. Halstedii contenida en un vector multicopia. Se buscaron colonias con una mayor resistencia a neomicina asumiendo que éstas hubiesen incorporado activadores de xysA. El nuevo método resultó inapropiado debido a que ocurrieron fenómenos de recombinación entre el plásmido integrado y el que contenía la genoteca, que originaban colonias resistentes a neomicina independientemente del promotor de xysA.

Autor: MIÑANA GALBIS DAVID.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este estudio se aislaron un total de 199 cepas mesófilas del género Aeromonas a partir de muestras de moluscos bivalvos y aguas dulces, siendo el medio agar dextrina ampicilina (ADA) el más eficiente de los utilizados. Se elaboró una table identificativa con 16 pruebas clave que permitió la identificación a nivel de especie del 91% de las cepas estudiadas. Se realizó un estudio de taxonomía numérica, con 64 pruebas fenotípicas y 220 cepas, que al 89% de SSM distinguió ocho phena (I-VIII), cada uno de los cuales agrupaba una única especie o varias especies de un mismo complejo fenotípico o fenoespecie, excepto las cepas tipo de A.salmonicida y de A.media que no se agruparon en ningún phenon. Los phena V, VI y VII agruparon cepas aisladas de moluscos vivalvos no identificadas a nivel de especie, sugiriendo la posibilidad de que estas cepas constituyan nuevas especies del género Aeromonas. Por otra parte, la mayoría de las especies mostraron actividad Beta-hemolítica mientras únicamente las especies A.hydrophila, A.bestiarum y S.salmonicida presentaron actividad elastolítica. La presencia de especies patógenas oportunistas de Aeromonas y la detección de factores de virulencia en otras especies hacen recomendable la monitorización de Aeromonas en aguas (potables, recreativas y de piscifactorías) y en alimentos que, como las ostras, se consumen crudos o poco cocidos. Se aplicó la técnica de electroforesis de enzimas multilocus (MLEE) a 122 cepas de las especies A.hydrophila, A.bestiarum, A.salmonicida, A.popoffii y A.trota. Tras el análisis de 15 enzimas, se obtuvieron 79 perfiles alélicos o tipos electroforéticos (ETs). La diversidad genética media (H) de la muestra completa fue de 0,64. Las subpoblaciones A.hydrophila y A.salmonicida presentaron mayor diversidad genética que las subpoblaciones A.popoffii y A.bestiarum. A una distancia genética

Autor: GARCÍA PEÑA M. LUISA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Streptococcus agalactiae (EGB) es causa importante de infección en neonatos y en adultos. La producción de un pigmento rojo-naranja es una característica específica de los EGB beta-hemoliticos que ha sido utilizada para su identificación precoz en determinados medios de cultivo, siendo todos ellos medios de cultivo complejos. La producción de pigmento está condicionada principalmente por los componentes del medio. Los medios de cultivo diseñados para la producción de pigmento de EGB suelen contener una peptona específica (la mas frecuentemente utilizada es la proteosa peptona Nº 3 de Difco), almidón, un inhibidor de la ruta del folato y suero. Nosotros hemos puesto a punto un medio de cultivo quasi-definido compuesto por almidón, metrotrexato, ácido pirúvico, casaminoácidos, hidrolizado pépsico de albúmina bovina, agar, buffer, mezclas definidas e nucleósidos, vitaminas y sales. En este medio crece sin producir pigmento. Sobre este medio hemos ensayado distintas sustancias para identificar factores que activen la producción de pigmentos de EGB. Entre las sustancias ensayadas, la mezcla definida de aminoácidos esenciales para MEM y el extracto de la levadura, fueron las que mostraron mayor capacidad de activar la pigmentación. El componente de la mezcla definida de aminoácidos responsable de activar la producción de pigmento fue la cistina. Otras sustancias investigadas fueron la cisteína (tioglicolato, ditiotreitol, glutatión reducido, 2-mercaptoetanol, metabisulfito y ácido ascórbico) y sustancias con puentes disulfuro (glutation oxidado). Todas mostraron capacidad de activar la pigmentación aunque la intensidad de pigmentación fue variable con la sustancia y con la concentración a la que se incluye en el medio. Con estos resultados se elaboró un medio quasi-definido para el crecimiento pigmentado de EGB, que incluye todos los componentes arriba mencionados para el medio quasi-definido para el crecimiento no pigmentado de EGB, pero sustituyendo los casaminoácidos por la mezcla definida de aminoácidos esenciales del MEM.

Autor: ARGANDOÑA BERTRÁN MONTSERRAT.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Halomonas maura es una bacteria halofila moderada aislada de suelos salinos del Norte de Marruecos, que se caracteriza porque sus cepas producen EPS con propiedades interesantes, tales como elevada viscosidad en solución, poder emulgente o captación de metales pesados. Al igual que la mayoría de las especies de su género, Halomonas maura posee un metabolismo respiratorio quimioorganotrofo, con la particularidad de que es capaz de crecer en anerobiosis utilizando el nitrato como último aceptor de electrones, propiedad poco frecuente entre los miembros de este grupo. El presente trabajo no sólo se ha centrado en el estudio genético del metabolismo respiratorio de la cepa tipo de Halomonas maura, (S-31T), sino que, como paso previo, se han abordado aspectos relacionados con su genoma. Así, hemos podido comprobar que H.maura posee uno de los genomas de mayor tamaño entre las bacterias halófilas moderadas (aproximadamente 4100 kb), y que además, contiene dos elementos extracromosómicos, un plásmido de 70 kb y un megaplásmido de más de 500 kb. El método de detección de plásmidos de gran tamaño puesto a punto en este trabajo ha servido para demostrar que estos elementos están presentes en numerosas especies halófilas moderadas del género Halomonas y otros géneros relacionados. El rastreo de una minigenoteca de Halomonas maura S-31T obtenida mediante mutagénesis insercional con el transposón mini-Tn5, nos permitió localizar dos regiones génicas directamente implicadas en el metabolismo respiratorio. El cluster narGHJI que codifica para una enzima de tipo NAR, una nitrato reductasa anerobia ligada a membrana y responsable de la respiración anaerobia sobre nitrato; y la religión ccoNOQP, que codifica para una citrocromo c oxidasa de tipo cbb3, responsables de la actividad citocromo c oxidasa y relacionada con la respiración en microaerobiosis. Estos estudios han puesto de manifiesto la versatilidad del metabolismo respiratorio de Halomonas maura, que con una cadena de transporte de electrones ramificada, puede inducir diferentes oxidorreductasas teminales en función de las demandas medioambientales. Por último, la existencia de esta citocromo c oxidasa cbb3, presente en muchas bacterias capaces de fijar nitrógeno atmosférico en microaerobiosis y, en ocasiones, responsable de dicho proceso, nos llevó a descubrir esta capacidad en Halomonas maura S-31 T.

Autor: GONZÁLEZ BENÍTEZ NATALIA.
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Resumen: Esta tesis doctoral se basa en el estudio, del balance metabólico de los sistemas oligotróficos aucáticos,prestando una atención especial a su variabilidad temporal y variabilidad espacial asociada a las estructuras de mesoescala, así como el papel que jeugan las bacterias heterotróficas en la circulación biogeoquímica del carbono y del oxígeno antes y después de un pulso de alforamiento costero. El balance entre la fijación fotosintética de carbono inorgánico y el consumo de carbono orgánico determina el balance metabólico de la comunidad.Cuando la producción excede a la respiración se produce una síntesis neta de carbono orgánico disponible para ser exportada acumulada dentro del sistema. Cuando la respiración supera la producción se produce una demanda neta de carbono y el sistema se encuentra en desequilibrio metabólico. Con esta investigación se pretende resolver la enorme controversia sobre el papel que juegan los océanos oligotróficos en el flujo de CO2 entre el océano y la atmósfera.A pesar de su poca productividad,la gran extensión de estas regiones hace que representen un 80% de la producción global oceánica.

Autor: BADOSA ROMAÑO ESTHER.
Año: 2001.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: ESCUELA POLITECNICA SUPERIOR.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GIRONA.

Resumen: Muchas bacterias del grupo fluorescente del genero Pseudomonas son capaces de controlar enfermedades de las plantas causadas psor hongos y bacterias fitopatogenos (ACBs) o muestran actividad como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (BPCPs). Se han descrito divervos metabolitos que intervienen en su actividad como ACBs y BPCPs. Dada la importancia en el biocontrol de la produccion de los metabolitos como Phl, PCA y Prn, el objetivo preliminar consistio en la busqueda y aislamiento de cepas productoras de estos metabolitos, utilizando una aproximacion molecular basada en la deteccion de los genes biosinteticos implicados en su produccion. En total se ha aislado a partir de diversos ambientes 4 cepas portadoras de los genes de la sintesis de PCA, 15 de Phl y 1 de Prn. Se ha constituido una colección de 72 cepas de Pseudomonas del grupo fluorescente que incluye 18 aislados propios de los genes biosinteticos necesarios para la produccion de Phl, PCS y Prn, 6 cepas de referencia procedentes de colecciones de cultivos tipo, 14 cepas productoras se los diferentes antibioticos cedidas por otros investigadores y una eleccion de 34 cepas procedentes de un trabajo previo realizado en nuestro grupo de investigacion. En la colección se encuentran cepas candidatas a ACBs y BPCP de diversas enfermedades y plantas. Las 72 cepas se han caracterizado fenotipica y genotipicamente. La caracterizacion fenotipica se ha llevado a cabo mediante la identificacion a nivel de espacie con las galerias API 20NE y pruebas bioquimicas especificas, la produccion de metabolitos como PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, sideforos y quitinasas mediante el uso de diferentes tecnicas, antagonismo in vitro en diversos medios frente a dos hongos fitopatogenos y tres bacterias fitopatogenas, la eficacia de la inhibicion de la infeccion en bioensayos in vivo sobre material vegetal y finalmente, en ensayos de promocion de crecimiento en dos portainjertos comerciales. La caracterización genotipica se ha realizado mediante el analisis de los polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccion de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) y el analisis de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de macrorestriccion genomica de DNA cromosomico separados en electroforesis de campo pulsante (MRFLP-PFGE). Con los datos obtenidos en la caracterizacion fenotipica y genotipica se ha realizado un analisis multivariante (correspondencias, correlaciones de Spearman y de frecuencias con variables categoricas). Se ha demostrado la importancia de disponer de una tecnica de caracterizacion genotipica que permite depurar una colección de cepas descartando aquellas que sean geneticamente identicas ya que influyen en los resultados de los analisis. Para los tres patogenos ensayados como indicadores (Stemphylium vesicarium, Penicillium expansum y Erwinia amylovora) y los dos portainjertos utilizados (Marianna 2624 y GF677) no se ha observado ninguna correlación entre la inhibición de la infeccion o la promocion del crecimiento con las caracteristicas fenotipicas y genotipicas de las cepas que fuese significativo y consistente en las tres tipos de analisis estadistico realizados.

Autor: PEREZ ARELLANO M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: GENETICA.

Resumen: En esta tesis se han desarrollado dos subfamilias de vectores de clonación para L. Casei (una con origen PAMB1 y la otra con origen PWV01) Además se ha construído un vector de expresión con el promotor de la lactosa y se ha expresado la proteina verde fluorescente, la betaglucuronidasa. Se han hecho estudios con este promotor sobre su estabilidad y sus caracteristicas estructurales. Se ha secretado la a amilasa de bolicheniformis con el promotor de la lactosa y se ha comparado con otros vectores con el mismo gen reporte. Se han visto diferentes tasas de expresión y secreción en distintos azucares, explicados parcialmente por un efecto de regresión por catabolito. Se ha secretado la VP8* en L. Lactis en cantidades de O.S. Pg/ml y se ha visto que retiene su capacidad hemoaglutinante. Se ha secretado la VP8* en L.Casei y se ha hecho un estudio sobre las condiciones optimas de secreción. Se ha bisto que el procesado de la VP8* en esta construcción depende de la temperatura, y no se realiza a 30ºC.

Autor: VIANA BALLESTER ROSA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: IATA-CSIC.

Resumen: Tras la caracterización de los elementos generales del sistema fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato de Lactobacillus casei, HPr y enzima I, la inactivación de la enzima I y la construcción de mutantes puntuales en el centro activo de fosforilación a la Ser-46 de HPr, pudimos estudiar la implicación de estos elementos en el transporte de azúcares, específicamente en el proceso de exclusión del inductor, y la relación que tienen estos elementos con la represión catabólica. Los resultados se adecuaron al modelo de transducción de señal PTS/CcpA propuesto para B.subtilis y otras bacterias Gram-positivas. Para determinar si los elementos de transducción de señal PTS/CcpA estaban implicados en la regulación general de los flujos de carbono, en especial en la glucólisis, decidimos clonar los genes pfk y pyk, que codifican las enzimas clave que regulan esta ruta en muchos microorganismos: la PFK y la PYK. La clonación y secuenciación de los mismos confirmó que, como en otros muchos microorganismos, estos genes se encuentran en el mismo operón. Los estudios de la expresión de este operón en varios mutantes de L.casei han demostraron que estos genes podrían estar regulados por un doble mecanismo. Por un lado existe unamoderada represión mediada por CcpA y por otro lado existe una inducción mediada por elementos del PTS. El elemento del PTS que podría estar implicado ene sta inducción podría ser la P-ser-HPr ya que la expresión de este operón en las cepas, o en los azúcares, que poseen afectada o disminuida esta forma fosforilada de HPr, es muy baja. La actuación de CcpA sobre la regulación de la expresión génica de este operón no está clara porque no se ha encontrado en la zona promotora ninguna secuencia cre. Parece que la represión producida por CcpA en L.casei no esta mediad por la formación del complejo CcpA/P-Ser-HPr como ocurre en todos los procesos de represión o activación catabólica en los que interviene CcpA. Otra de las enzimas que nos pareció importante estudiar para conocer como discurren los flujos de carbono fue la L-lactato deshidrogenasa. Decidimos inactivarla y ver cuales eran los cambios que se producían en el metabolismo de una bacteria que casi exclusivamente produce L-láctico, el producto de esta enzima, como metabolito final. Así, la inactivación de este gen tuvo como consecuencia una desviación del metabolismo del piruvato hacia rutas que forman metabolitos secundarios como el etano, acetato, acetaldehído, CO2 o diacetilo. Las enzimas que metabolizan piruvato y que se activan en estas condiciones podríans er la piruvato formato liasa (PFL) y la alfa-acetolactao sintasa (ALS). La PFL se activa cuando la relación NADH/NAD+ es alta, lo que es muy probable que pase en el mutante idhL. Los productos de la PFL y la ALS, el acetilCoA y el alfa-acetolactato serán convertidos posteriormetne en acetato o etanol y en diacetilo, acetoína o butanodiol, respectivamente. El CO2 se puede desprender de cualquiera de las dos rutas activadas. El estudio de la regulación de la expresión de idhL reveló que la proteína CcpA puede activar ligeramente la transcripción del gen que a su vez está inducida por la presencia de azúcares PTS. Tampoco la búsqueda de unas ecuencia cre en la zona promotora de este gen fue fructífera pues no se encontró nada parecido al consenso cre en el fragmento del promotor de la secuencia depositada en la base de datos. Durante esta última parte del estudio detectamos una inesperada conexión entre la mutación idhL y la falta de represión catabólica. Así, se ha propuesto varias hipótesis para explicar este extraño fenómeno siendo la más sólida aquella que concede un papel importante a los cofactores redox NADH/NAD+. No sabemos como pueden actuar estos cofactores sobre el mecanismo de represión catabólica, pero es posible que, como en B.subtilis, medien en la inhibición que produce CcpA sobre la transcripción de los genes que regula.

Autor: CORBELLA M. EUGENIA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR IV.

Resumen: Dos cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de forma independiente, 142 y JB2, y dos de Pseudomonas putida, P111 y CLB250, presentan patrones de degradación diferentes para mono- y diclorobenzoatos, intermediarios de la degradación aerobia de bifenilos policlorados. Hemos evaluado la capacidad de degradación de clorobenzoatos cuando se utilizan como única fuente de carbono y energía, y cuando se cometabolizan en cultivos que utilizan como única fuente de carbono principal. En todos los casos se observa que, si bien los cultivos crecidos en presencia de glucosa son capaces de deshalogenar de los substratos eficientemente, la tasa de deshalogenación por unidad de masa del cultivo es mucho menor que en células creciendo a expensas del cloroaromático. Esto sugiere que las rutas están sometidas a represión catabólica. En un intento de identificar las causas genéticas de las diferencias de sustrato utilizados por las distintas cepas, y la existencia de sistemas de represión catabólica, hemos analizado la expresión de tres operones implicados en la degradación de clorobenzoatos y (cloro) catecoles. Las dos cepas de P.aeruginosa contienen copias prácticamente idénticas de dos operones que codifican elementos de dioxigenasas de anillo aromático: i.ohbAB, que codifica la subunidades alfa y beta del componente dioxigenasa de una dioxigenasa de tres componentes implicada en el metabolismo de 2-clorobenzoato, y ii.ohbABCDEFGH, que incluye genes correspondientes a una segunda dioxigenasa de 3 componentes, proteínas de transporte y reguladores transcripcionales. Además se ha obtenido evidencia de la presencia del operón clcABDE, que codifica la ruta orto modificada de metabolismo de clorocatecoles. La secuencia de los operones clcABDE en P.aeruginosa 142 y JB2 resultó ser casi idéntica a la del plásmido de Pseudomonas pAC27. A pesar del grado de similitud, el análisis de las diferencias de secuencia de nucleóticos sugiere que esta agrupación génica se ha transmitido entre diferentes especies y cepas de Pseudomonas hace alrededor de 1 millón de años. Por otra parte, en las dos cepas de P.putida sólo se pudo identificar el operón clcABDE. El análisis de la inducción de las actividades enzimática halobenzoato y catecol dioxigenasa I y II, y la medida de la expresión de los operones ohbAB, hybABCDEFGH y clcABDE durante el crecimiento con diferentes sustratos, indican que ohbAB, en P.aeruginosa, se induce por 2CBA y 2,4DCBA y está, además, sometido a represión por catabolito en presencia de glucosa. El operáon hybABCDE muestra una inducción significativa en presencia de glucosa en las dos cepas de P.aeruginosa analizadas, y se induce por 2CBA, 2,3- y 2,5-diclorobenzoato y benzoato en JB2; sin embargo, en P.aeruginosa 142 sólo se induce por 2,4 DCBA. Estos resultados pueden explicar las diferencias observadas en la capacidad de degradación de las dos cepas, y sugieren que en P.aeruginosa 142 el regulador transcripcional de ohbAB podría reconocer 2,4DCBA como mejor inductor que 2,3- y 2,5DCBA mientras que en JB2 sucedería lo contrario. La obtención de mutantes deficientes en la utilización de 2CBA en P.aeruginosa 142 y su complementación con plásmidos que contienen genes homólogos a los del operón nitrilasa de Sinechocystis sp., sugiere, además, la existencia de otros loci implicados en el metabolismo de, al menos, 2CBA. Respecto a la degradación de los (cloro)catecoles que se producen como intermediarios de la ruta, los datos recogidos apuntan a la presencia de un sistema alternativo al codificado por clcABDE, con capacidad de producir la ruptura en orto tanto de catecoles como de clorocatecoles y que, a diferencia del operón clc, no está sometido a represión catabólica. Finalmente, se ha obtenido evidencia de que ninguno de los operones analizados responde a sistemas de regulación por quorum sensing., sin embargo hybABCDE muestra diferencias de inducción entre la fase exponencial y fase estacionaria de crecimiento del cultivo, lo que apuntan a la participación de un circuito de regulación dependiente de la fase de crecimiento del cultivo.

Autor: MARÍN AYLLÓN MERCEDES M..
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Los alcanos son hidrocarburos lineales presentes de manera abundante el petróleo y constituyen fuentes de crecimiento para muchos microorganismos. Por tanto, los microorganismos degradores de alcanos resultan útiles en procesos de biorremediación de sitios contaminados por petróleo y biotransformación de sus derivados. En la mayoría de ellos, el primer caso consiste en una oxidación terminal de la molécula catalizada por una alcano hidroxilasa. En este trabajo se ha estudiado la expresión de genes que codifican alcano hidroxilasas en las cepas aisladas de lugares contaminados por petróleo: Burkholderia cepacia RR10, Pseudomonas aeruginosa RR1 y Alcanivorax borkumensis AP1. Y se han obtenido las siguientes conclusiones generales: 1,- La expresión de los genes que codifican alcano hidroxilasas B.cepacia RR10, P.aeruginosa RR1 y A.borkumensisi AP1 depende de: A,- La presencia de alcanos en el medio. Las alcano hidroxilasas sólo se expresan si existen alcanos en el medio susceptibles de ser metabolizados. B,- La fase de crecimiento de las bacterias. La expresión de las alcano hidroxilasas no es constante a lo largo del tiempo, sino que cada una de ellas se expresa en un momento concreto del crecimiento. C,- La existencia de otras fuentes de carbono en el medio además del alcano, es decir, la expresión de las alcano hidroxilasas está sujeta a represión catabólica. 2,- La expresión de la alcano hidroxilasa de B.cepacia RR10 se induce con alcanos de entre 12 y 30 átomos de carbono. En el caso de las dos alcano hidroxilasas de P.aeruginosa RR1, su expresión se induce con alcanos de entre 12 y, al menos, 20 átomos de carbono. 3,- El hecho de que la expresión de las alcano hidroxilasas de B.cepacia RR10, P.aeruginosa RR1 y A.borkumensis AP1 esté sujeta a represión catabólica sugiere que los alcanos no son sustratos de crecimiento preferentes para las bacterias, por lo cual, no se expresarán si existen otras fuentes de carbono más favorables en el medio. Estos resultados son importantes para el diseño de estrategias de biorremediación en los que se requiera estimular artificialmente el crecimiento de las bacterias biodegradadoras, y de sistemas de biotransformación basados en estos enzimas.

Autor: HERNANDO RICO VICTOR.
Año: 1999.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La sintesis de Lisina en Actinomicetos es un aspecto de suma importancia debido a que este aminoacido es el precursor directo del ácidol-aminoadipico, compuesto utilizado en la sintesis de antibiotico b-lactamicos. Se han clonado los genes ask y asd de N.Lactamburus que codifican las enzimas de los dos primeros pasos comunes en la sintesis de aminoacidos de la familia del aspartico. Estos genes se transcriben en un único transcrito, dando lugar su sobreexpresión a un incrmento en la producción de cefamicina C. El último paso de la sintesis de lisina se ecuentra codificado por el gen Lus A, que en N.Lactandurus se encuentra formado un operon conel gen args y los genes biosinteticos de treonina hours y thr C. La síntesis de ácido diaminopimelico, precursor directo de la lisina, tiene lugar en N. Lactanduros mediante la ruta de la sucinilasa, careciendo de actividad Ac.Dap desacetilisa y dap-deshidrogenasa. La presencia de esta única ruta de sintesis de dap tambie´n se confirmo para Streptoruces clariligerus y Streptomyces lividans.

Autor: QUINTERO CARRASCO M. JOSE.
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y BIOLOGIA M..

Resumen: Las cianobacterias son organismos procarióticos capaces de llevar a cabo una fotosíntesis oxigénica similar a la que realizan las plantas superiores. Son variadas las fuentes de nitrógeno que estos organismos pueden utilizar para su crecimiento: nitrato,nitrito,amonio e incluso, en algunas estirpes, dinitrógeno urea o aminoácidos. Haciendo uso de la secuencia del cromosoma completo de la cianobacteria unicelular Synechocystis sp. PCC 6803, nos dispusimos a buscar ORFs presentes en la misma cuyos productos hipotéticos mostraran homología con proteínas de otros organismos implicadas en el transporte a través de membrana. Se generaron y analizaron los fenotipos mostrados por mutantes insercionales en las ORFs seleccionadas. De este análisis se concluyo que el sistema Nat responsable de la entrada al interior celular de los aminoácidos neutros en Synechocystis sp. Esta constituido por cinco componentes diferentes, esta cianobacteria posee además un sistema Bgt implicados en el transporte de glutamato dependiente de sodio. Una vez en el interior celular, los aminoácidos pueden ser sustrato de las enzimas responsables de su metabolización. Para discernir ente los distintos destinos que puede tomar la arginina en Synechocystis sp. Se analizaron los productos que aparecían después de incurbar las células con distintos aminoácidos marcados con 14 C. Con el fin de determinar las actividades metabólicas responsables de la aparición de estos productos, se generaron mutantes insercionales en ORFs que pudieran determinar enzimas implicadas en estos procesos. Mediante ensayos de actividad y estudios de producción de metabolitos marcados in vivo a partir de [14C]arginina y [14C]prolina se ha confirmando la identificación de algunas de estas ORFs con sus correspondientes genes, como en los casos de argF,putA y proC, y su participación en el catabolismo de la arginina. Se ha determinado también que la prolina oxidasa es la enzima responsable del catabolismo de la prolina en Synechocystis sp. PCC 6803.

Autor: MAICAS PRIETO SERGI.
Año: 1997.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: DEPARTAMENT DE MICROBIOLOGIA I ECOLOGIA (UNIVERSITAT VALENCI PROGRAMA DE DOCTORADO: MICROBIOLOGIA (275-A).

Resumen: El análisis de diferentes sistemas alternativos a la fermentación realizada de manera tradicional nos ha permitido determinar su aplicación tecnológica. La obtención de resultados favorables en la rápida degradación del ácido málico utilizando células no proliferantes dependía de la combinación de diferentes factores como son el pH, la cepa utilizada y la concentración inicial de inóculo. El establecimiento de un sistema de fermentación en continuo permitía disminuir el tiempo necesario para realizar la fermentación maloláctica (FML) operando los biorreactores de manera satisfactoria durante 2-3 semanas. La inmovilización de O. oeni sobre esponjas de celulosa con cadenas laterales de carga positiva (DEAE y DE) ofreció resultados notablemente superiores a los detectados con otras sin carga lateral. Se observaron mejores tasas de absorción a valores de pH bajos atribuibles a una mayor interacción química entre los grupos funcionales básicos y la suspensión celular acídica. La utilización de estos sistemas, de forma individual o combinando varios de ellos, permitiría la realización de la FML de una manera más rápida y controlada que la conseguida con una fermentación tradicional. Además en este trabajo se ha estudiado la metabolización de hexosas por O. oeni bajo diferents condiciones ambientales con el objetivo de optimizar las condiciones de producción de cultivos iniciadores.

Autor: BAÑERAS VIVES LLUIS.
Año: 1996.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: INSTITUTO DE ECOLOGIA ACUATICA PROGRAMA DE DOCTORADO: LIMNOLOGIA GENERAL Y APLICADA.

Resumen: LA PARTICIPACION DE LAS BACTERIAS FOTOTROFICAS DEL AZUFRE EN EL CICLO DE NUTRIENTES DE LOS ECOSISTEMAS ACUATICOS SE HA ESTUDIADO EN LA CUBETA C-IV DEL LAGO DE BANYOLES, LA LAGUNA DEL VILAR Y LA LAGUNA SISO. EN TODOS LOS CASOS SE HA OBSERVADO UNA RELACION DIRECTA ENTRE LA ACUMULACION DE FOSFORO PARTICULADO EN LA COLUMNA DE AGUA Y LA PRESENCIA DE BACTERIAS FOTOSINTETICAS DEL AZUFRE. LA ACUMULACION SE DABA PREFERENTEMENTE EN LA INTERFASE O2/H2S, CON CONCENTRACIONES SUPERIORES A 15 GAMMAMOL1-1, Y SE HALLABA RELACIONADA, ENTRE UN 40 Y UN 70%, CON LA VARIACION DE LA CONCENTRACION DE PIGMENTOS FOTOSINTETICOS BACTERIANOS. LA ACUMULACION EN ESTAS ZONAS PRODUCIA UNA DISMINUCION DE LA DIFUSION DEL FOSFATO, EVITANDO LA FERTILIZACION DE LAS ZONAS SUPERFICIALES Y CAUSANDO UN CAMBIO CUALITATIVO Y CUANTITATIVO EN LA POBLACION ALGAL. EN ESTA SITUACION SE PUEDE CONSIDERAR A LAS POBLACIONES DE BACTERIAS FOTOSINTETICAS COMO UN FILTRO BIOLOGICO, CAPAZ DE REDUCIR LA FERTILIZACION DEBIDA AL PROCESO DE CARGA INTERNA. LAS CINETICAS DE ASIMILACION DE FOSFATO EN BACTERIAS FOTOTROFICAS DEL AZUFRE SE HAN ESTUDIADO EN CULTIVOS AXENICOS. CON ESTA FINALIDAD, SE DESARROLLO UN SISTEMA ANAEROBICO DE CULTIVO CONTINUO APTO PARA EL CRECIMIENTO DE ESTOS MICROORGANISMOS. PARA LOS TRES MICROORGANISMOS UTILIZADOS, CHLOROBIUM LIMICOLA, CHLOROBIUM PHAEOBACTEROIDES Y CHROMATIUM MINUS, SE AJUSTARON LAS CINETICAS DE SATURACION AL MODELO DE MONOD, CON VALORES DE LA CONSTANTE DE SEMISATURACION PARA EL TRANSPORTE DE FOSFATO (KS) DE 1,7 I 1,6 GAMMAMO11-1 PARA CHLOROBIUM PHAEOBACTEROIDES Y C. LIMICOLA RESPECTIVAMENTE Y DE 3,7 GAMMAMO11-1 PARA CHROMATIUM MINUS. PARALELAMENTE SE HA DETERMINADO LA INFLUENCIA DE OTROS FACTORES COMO LA INTENSIDAD DE LUZ O LA CONCENTRACION ESPECIFICA DE FOSFORO EN LA VELOCIDAD DE ASIMILACION. LOS RESULTADOS DEMUESTRAN QUE SE DA UNA INHIBICION DE LOS SISTEMAS DE TRANSPORTE EN SITUACIONES EN LAS QUE EL POOL INTERNO DE FOSFATO SE ENCUENTRA PROXIMO A LA SATURACION. SE HA ANALIZADO ASIMISMO LA CAPACIDAD DE LAS ESPECIES DE BACTERIAS FOTOTROFICAS DE ACUMULAR POLIFOSFATOS EN CONDICIONES DE LABORATORIO, DANDO RESULTADOS POSITIVOS EN LAS ESPECIES DE CHLOROBIUM. LA CONCENTRACION DE POLIFOSFATOS PODIA REPRESENTAR HASTA EL 60% DEL FOSFORO PARTICULADO. EN NINGUNO DE LOS CULTIVOS DE CHROMATIUM MINUS SE DETECTO LA PRESENCIA DE ESTAS MOLECULAS. EN NINGUNA DE LAS MUESTRAS DE CAMPO ANALIZADAS SE DETECTARON POLIFOSFATOS. PARECE SER QUE LAS CONDICIONES DE LA COLUMNA DE AGUA NO PERMITEN LA ACUMULACION DE ESTE TIPO DE MOLECULAS, DADO QUE LA CONCENTRACION DE FOSFATO SOLUBLE ES RELATIVAMENTE BAJA. POR OTRA PARTE, LAS CELULAS SE ENCUENTRAN EN UN ESTADO DE CRECIMIENTO CONSTANTE, MIENTRAS QUE LA SINTESIS DE POLIFOSFATO SE DA EN LA FASE ESTACIONARIA DEL CRECIMIENTO.

Autor: COLOMBO RODRIGUEZ M. VICTORIA.
Año: 1996.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOTECNOLOGIA AGRARIA Y FORESTAL.

Resumen: LA REGULACION DE LA BIOSINTESIS DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN STREPTOMYCES ESTA DETERMINADA POR UNA CASCADA DE SEÑALES QUE TIENE SUS ULTIMOS PASOS EN GENES ESPECIFICOS DE LA RUTA BIOSINTETICA. DICHOS GENES ESTAN FISICAMENTE LOCALIZADOS JUNTO A LOS DEMAS GENES DE LA MISMA. EN NUESTRO LABORATORIO SE HABIAN CLONADO Y SECUENCIADO UN GRUPO DE GENES IMPLICADOS EN LA BIOSINTESIS DE UN COMPUESTO POLIQUETIDO PROCEDENTE DE STREPTOMYCES ANTIBIOTICUS ATCC 11891. ENTRE LOS GENES LOCALIZADOS APARECIA UNA FASE DE LECTURA ABIERTA (ORF0) ALTAMENTE HOMOLOGA A REGULADORES DE TRANSCRIPCION DE LA FAMILIA LYSR. (FERNANDEZ HEREDIA, 1992). EN ESTE TRABAJO SE ESTUDIAN LAS CARACTERISTICAS DE LA REGULACION DE DICHA RUTA DE BIOSINTESIS. CUMPLIENDO LAS CARACTERISTICAS PROPIAS DE LA FAMILIA LYSR, EL PRODUCTO GENICO DE ORF0 SE UNE A SU PROPIO PROMOTOR, COMO SE HA DEMOSTRADO MEDIANTE ENSAYOS DE RETARDO EN GEL Y "FOOTPRINTING" CON DNASA I, UTILIZANDO PROTEINA SOBREEXPRESADA EN ESCHERICHIA COLI, Y PURIFICADA Y RENATURALIZADA A PARTIR DE CUERPOS DE INCLUSION. EL PAPEL DE ORF0 EN LA REGULACION DE LA TRANSCRIPCION DE LOS GENES DE LA POLIQUETIDO SINTETASA (PKS) A LOS QUE ACOMPAÑA, SE HA DETERMINADO EN CONDICIONES HETEROLOGAS, UTILIZANDO PARA ELLO STREPTOMYCES COELICOLOR, PRODUCTOR DEL POLIQUETIDO PIGMENTADO ACTINORRODINA. MEDIANTE ESTUDIOS DE COMPLEMENTACION ENTRE AMBAS RUTAS Y PROTECCION A RIBONUCLEASA S1 SE HA DETERMINADO QUE ORF0 ES NECESARIA PERO NO SUFICIENTE PARA LA EXPRESION DE LA PKS PROCEDENTE DE S. ANTIBIOTICUS, EN CONDICIONES HETEROLOGAS. ESTA EXPRESION ES DEPENDIENTE A SU VEZ DEL REGULADOR DE LA BIOSINTESIS DE ACTINORRODINA, ACTII-ORF4. POR ESTE MOTIVO SE PROCEDIO A LA LOCALIZACION DE GENES REGULADORES PROCEDENTES DE S. ANTIBIOTICUS CAPACES DE ACTIVAR LA PRODUCCION DE ACTINORRODINA EN STREPTOMYCES LIVIDANS Y EN MUTANTES ACTII-ORF4 DE S. COELICOLOR. DE ESTE MODO, SE HAN CLONADO Y SECUENCIADO TRES NUEVOS GENES FISICAMENTE LIGADOS AL "CLUSTER", UNO DE ELLOS ALTAMENTE HOMOLOGO A ACTII-ORF4 Y LOS OTROS DOS HOMOLOGOS A SISTEMAS DE REGULACION DE DOS COMPONENTES (SENSOR Y REGULADOR). ESTA AGRUPACION DE GENES DE BIOSINTESIS CONTIENE POR TANTO TRES TIPOS DE REGULADORES DE TRANSCRIPCION, DOS DE ELLOS PERTENECIENTES A DOS DE LAS FAMILIAS DE REGULADORES MAS EXTENDIDAS EN PROCARIOTAS (FAMILIA LYSR Y FAMILIA DE SISTEMAS DE REGULADORES DE DOS COMPONENTES) Y UN TERCERO HOMOLOGO A ACTII-ORF4, QUE ENCABEZA UNA FAMILIA DE REGULADORES DE TRANSCRIPCION DE PKS EN STREPTOMYCES.