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MICOLOGIA, 2



89 tesis en 5 páginas: 1 | 2 | 3 | 4 | 5
  • APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR: IDENTIFICACIÓN DEL BASIDIOMICETO TRANETES SP. I-62 Y EXPRESIÓN HETERÓLOGA DEL GEN CGLCC1 EN KLUYVEROMYCES LACTIS Y YARROWIA LIPOLYTICA .
    Autor: ARANA CUENCA AINHOA.
    Año: 2001.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS.
    Resumen: Se realizan estudios bioquímicos y moleculares para identificar la especie del basidiomiceto Trametes sp. I-62 ya que no fue posible su caracterización por métodos clásicos. Los resultados del presente trabajo indican que no fue posible identificar la especie en estudio ya que no correspondía con ninguna de las especies tipo elegidas aunque se corrobora el género. Por otra parte se realiza la expresión del gen la casa del basidiomiceto Coriolopis gallica en las levaduras Kluyveromyces lactis y Yarrowia lipolytica y se estudia el comportamiento de la proteína heteróloga sobre efluentes industriales y pasta de celulosa procedente de Pinus radiata. Se obtienen cepas de expresan eficientemente la enzima y se demuestra su potencial aplicación el tratamiento de pastas en la industria de la pasta y el papel.
  • PURIFICACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y CLONACIÓN DE UNA BETA-1,6-GLUCANASA DE TRICHODERMA HARZIANUM .
    Autor: MONTERO MACARRO MANUEL.
    Año: 2001.
    Universidad: SALAMANCA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.
    Resumen: Dentro del género Trichoderma se han encontrado numerosos agentes de control biológico frente a diversas enfermedades fúngicas de interés en agricultura. Entre los mecánimos por los que algunas cepas de Trichoderma antagonizan a otros hongos filamentosos destaca el proceso del micoparasitismo, en el que juegan un importante papel las enzimas hidrolíticas que Trichoderma produce, entre las que se encuentran las beta-1,6-glucanasas. Hasta la fecha se han descrito dos isoenzimas con esta actividad en T.harizanum. En este trabajo hemos purificado y caracterizado una tercera isoenzima, a la que llamamos BGN16.3, que se ha purificado de cultivos de T.harizanum CECT 2413 con paredes celulares de Botrytis cinerea como única fuente de carbono. La enzima fue purificada a homogeneidad electroforética en tres pasos: afinidad, cromatoenfoque y filtración en gel. BGN16.3 presentó una masa molecular de 48 KDa y un punto isoeléctrico de 4.1 en cromatoenfoque y 4.5 en isoelectroenfoque. Además se ha comprobado que posee efecto antilúngico frente a Penicillium digitatum tanto por sí sola como en combinación con otras enzimas hidrolíticas de Trichoderma. A partir de secuencias proteicas parciales de BGN16.3, utilizando la técnica de PCR con oligonucleótidos degenerados, se consiguió clonar un fragmento del gen que la codifica. Utilizando este fragmento como sonda se realizó un escrutinio de una genoteca de cDNA, consiguiendo un clon con el cDNA completo de bgn16.3, que fue caracterizado por medios bioinformáticos. Posteriormente también se clono el DNA genómico de BGN16.3, incluyendo 1.6 Kb de la región promotora del gen. Se llevaron a cabo estudios de regulación de la expresión del gen mediante Northern-blot observando como carácterísticas más interesantes la ausencia de expresión de la enzima en inducciones con quitina, sustrato habitualmente empleado para la obtención de enzimas hidrolíticas de Trichoderma. Mediante RT-PCR se ha demostrado la implicación de la BGN16.3 en el proceso de micoparasitismo.
  • CARACTERIZACIÓN Y DETECCIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE COLLETOTRICHUM CAUSANTES DE ANTRACNOSIS EN FRESA. BÚSQUEDA DE PROTEASAS DE TRICHODERMA IMPLICADAS EN SU BIOCONTROL .
    Autor: SUÁREZ FERNÁNDEZ M. BELEN.
    Año: 2001.
    Universidad: SALAMANCA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.
    Resumen: Las especies del hongo Colletotrichum son las responsables de la antracnosis de la fresa y causan importantes pérdidas económicas en el sector. En la Unión Europea, C.acutatum es considerado un patógeno de cuarentena. En EE.UU., la enfermedad también es producida por C.fragariae, que se considera una variedad virulenta de C.gloeosporioides (estado asexual de Glomerella cingulata), del que es indistinguible en términos morfológicos. En este trabajo se lleva a cabo la caracterización, a nivel bioquímico y fisiológico, de 73 cepas de estas especies con el fin de poder diferenciarlas e identificarlas correctamente. Los resultados obtenidos permitieron la división de las cepas en dos grandes grupos, centrados en C.acutatum y C.fragariae/gloeosporioides. A partir de estudios moleculares y de datos de secuencia de las regiones ITS del ADNr se desarrollaron métodos de diagnóstico de C.acutatum y C.fragariae mediante PCR. Esta técnica resultó eficaz en la detección e identificación rápida y fiable de estos patógenos en plantas de fresa todavía asintomáticas. Trichoderma harzianum, es un hongo micoparásito utilizado como agente de control biológico de hongos fitopatógenos. Un mecanismo fundamental del efecto antagonista de Trichoderma es el micoparasitismo, que se basa en la producción de enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular fúngica. En este trabajo se lleva a cabo el aislamiento y caracterización del gen pra1, que codifica una proteasa acídica de 28 kDa en T.harzianum CECT 2413. Previamente la proteína se purificó y caracterizó como una enzima tipo tripsina con afinidad por paredes celulares de C.acutatum. Las comparaciones de dos péptidos secuenciados con las bases de datos confirmaron la pertenencia de PRA1 a la familia quimotripsina de las serin-peptidasas, hasta ahora no descrita en Trichoderma. Los ensayos de actividad enzimática y análisis tipo Northern mostraron que pra1 se reprime por glucosa y nitrógeno inorgánico y que se induce tanto por paredes celulares fúngicas como por quitina. También el pH del medio juega un papel importante en la regulación ya que la expresión se anula completamente a pH ácido.
  • ANALISIS DE LA REGULACION DE LA EXPRESION DEL GEN PCBAB DE PENICILLIUM CHRYSOGENUM, EL PRIMER GEN DE LA VIA BIOSINTETICA DE LA PENICILINA .
    Autor: KOSALKOVA KATARINA.
    Año: 2000.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: BIOLOGIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES.
    Resumen: La Tesis Doctoral se ha orientado al estudio de la expresión del gen pcbAB de Penicillum chrysogenum, el primer gen de la via biosintetica de la penicilina. Este gen codifica la enzima a-aminoadipil-cisteinil-valina sintetasa(ACV sintetasa). La expresión de gen pcbAB se considera el paso limitante de la biosintesis de penicilina. Se cree que en el control de la regulación tanto de pcbAB como de pcbC interviene la zona intergénica situada entre ellos, que sirve como promotor bidireccional para ambos genes. Para determinar las regiones esenciales en la regulación del gen pcbAB se obtuvieron delecciones 5´consecutivas del promotor pcbAB, las cuales se fusionan con el gen testigo lacZ y se introdujeron en forma de una copia en el locus pyrG en P.chrysogenum npe10 pyrG(mutante no productor de penicilina). El estudio de la expresión del gen pcbAB, usando el gen la lacZ como el gen testigo revelo la existencia de represión por glucosa en todos los transformantes que expresan el gen pcbAB. Asimismo se han seleccionado tres regiones del promotor pcbAB, denominadas cajas A,B y C, cuya delección conduce a una significativa disminución de la expresión del gen pcbAB. Se ha observado la formación de complejos de unión al ADN con las cajas A y B, usando los extractos preparados a partir de los micelios crecidos con glucosa y lactosa. En concreto el complejo AG1, usando la sonda A y los complejos BG1,BG2 y BL1, usando la sonda B. La secuencia de unión involucrada en la formación del complejo AG1 es el heptanucleotido palindrómico TTAGTAA,situado en las posiciones -679 a -673 respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen pcbAB. La sustitución de una timina en la posición 1 ó 5 en el heptanucleotido TTAGTAA es suficiente para impedir la formación del complejo AG1 según se observa en ensayos de alteración de la movilidad electroforética (EMSA). El estudio de la expresión in vivo revela que la secuencia TTAGTAA es imprescindible para la expresión del gen pcbAB. La deleción de la secuencia consenso CreA1 situada dentro de la caja B, conduce a una desrepresión de la expresión del gen pcbAB en presencia de glucosa, registrándose un incremento del 370% en la actividad presente en cultivos control con glucosa como única fuente de carbono.
  • CARACTERIZACIÓN AEROPALINOLOGICA DEL BIOAEROSOL ATMOSFÉRICO DE CARTAGENA .
    Autor: ELVIRA RENDUELES M. LUISA BELEN.
    Año: 2000.
    Universidad: POLITECNICA DE CARTAGENA.
    Centro de lectura: INGERNIEROS INDUSTRIALES .
    Centro de realización: E.T.S.I.I. Y E.T.S.I.A..
    Resumen: En el trabajo se presenta el resultado del estudio cualitativo y cuantitativo de pólenes y esporas fúngicas aerovagantes de la ciudad de Cartagena así como su comportamiento en relación con la meteorología. Se han identificado un total de 44 tipos polínicos pertenecientes a 36 familias de las que el 48,9% son pólenes de plantas herbáceas, el 45,6% árboles o arbustos y un 4,6% son gramíneas. Se ha realizado el Calendario Polínico, siendo los taxones predominantes Irticaceae, Cupressaceae, Chenopodiaceae-Amaranthaceae, Pinaceae, Oleaceae, Poaceae, Quercus, Plantago, Plantanus, Populus, Artemisia, Eucalyptus, Arecaceae y Zygophyllum. La primavera es la estación en la que se encuentran las mayores concentraciones de pólenes totales y la mayor variedad de tipos polínicos alergénicos, dominada por la familia Urticaceae (27,3% de los pólenes totales). Cupressaceae, Pinaceae y Platanus adelantan sus floraciones con niveles máximos en la estación preprimaveral. Olea con una floración corta e intensa es uno de los pólenes más alergénicos presentes en nuestra primavera. Chenopodiaceae-Amaranthaceae presenta dos floraciones primaveral y otoñal siendo el otoño donde alcanza sus máximas concentraciones representando el 64% de los pólenes totales. Hemos sido el primer grupo de aerobiólogos en identificar el polen de Zygophyllum en la atmósfera, consecuencia de ello ha sido su comprobación como alergerno (Belchí Hernández et al, 1997 y su carácter anfifilo (Castells, 2000). En la estación invernal es de destacar la presencia de Artemisia Barrilieri. A lo largo del estudio se ha podido constatar una progresiva disminución de los pólenes totales sufriendo el mayor retroceso los tipos polínicos herbáceos y los correspondientes a plantas silvestres, lo que creemos debido a la persistente sequía durante el periodo estudiado y a factores antrópicos. Se ha efectuado el estudio de las correlaciones entre los datos meteorológicos y los diferentes tipos polínicos y pólenes totales, siendo en general, la humedad relativa y la presión atmósferica los que se han correlacionado negativamente con las concentraciones de pólenes, y positivamente con la radiación solar. El NOVA por rumbos de viento pone de manifiesto la localización de las diferentes fuentes emisoras de pólenes y la correcta ubicación del captador. Por rangos de vientos se pone de manifiesto la influencia de la flora local con vientos flojos y el efecto de arrastre del viento conforme aumenta su velocidad. Se han identificado un total de 98 esporas fúngicas por el método de Hirst incluidas en los grupos de los Deuteromicetos, Basidiomicetos, Ascomicetos, Oomicetos y Zigomicetos, y se describen 120 aislamientos en base a los caracteres culturales de las colonias fúngicas realizados con el método viable Suárez-Cervera. Se ha elaborado el Calendario Fúngico con los 21 géneros más representativos, Cladosporium, Alternatia y Ustilago son los más abundantes, definiendo nuestro bioaerosol como típico del aire seco. La estación de máximo crecimiento es la primavera y la de menor crecimiento del invierno, en la estación otoñal se observa claramente el pico de las esporas de los Agaricales y en verano dominan las esporas termorresistentes como Usilago, Epicoccum, Aleternaria y Puccinia. Se ha realizado el estudio de la evolución horaria de las esporas totales a lo largo del año que presentan un mínimo al atardecer. Se observa por grupos el comportamiento nocturno de ascosporas y basidiosporas y el pico máximo a medio día de Alternaria. Los ANOVA efectuados entre las esporas y los parámetros meteorológios ponen de manifiesto su comportamiento estacional y su variabilidad intradiurna.
  • COMPARACIÓN DE TECNICAS GENOTIPICAS Y FENOTIPICAS PARA EL ANALISIS DE LA DIVERSIDAD EN HONGOS, APLICADAS A EPICOCCUM NIGRUM LINK Y VARIAS ESPECIES DEL GENERO SPORORMIELLA ELL.& EV.
    Autor: ARENAL YAGUE FRANCISCO.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Resumen: El trabajo compara los datos obtenidos con diversas técnicas genotípicas, basadas todas ellas en PCR (ARDRA, AP-PCR, MP-PCR, Tdna-PCR y AFLP), y fenotipicas (HPLC, Actividades antibacterianas, Actividades antifungicas, Actividades citotóxicas e Isoenzimas), desde el punto de vista de su aplicación a un "screening" de productos naturales. También se comparan los datos obtenidos con ambos tipos de técnicas, de forma conjunta. Epicoccum nigrum fue elegido como ejemplo para el estudio de los polimorfismos a nivel infraespecifico, y el genero Sporormiella como ejemplo para el estudio de los polimorfismo a nivel interespecifico. También se realizó un análisis filogenético de los fragmentos ITS1-5.8s-ITS2 y los dominios variables D1 y D2 del gen rRNA 28s, de varias especies del genero Sporormiella. Se secuenció el fragmento ITSI1-5.8s-ITS2 de varias cepas de Epicoccum nigrum y Phoma epicoccina, donde se afirma que son la misma especie biologica.
  • FILOGENIA Y CARACTERIZACION MOLECULAR DE HONGOS ASCOMICETOS DE LA FAMILIA DIATRYPACEAE.
    Autor: ACERO PEREZ FRANCISCO JAVIER.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.
    Resumen: Los hongos del orden Diatrypales, pertenecientes a la división Ascomycota, se agrupan actualmente en una sola familia, la familia Diatrypaceae. Los aspectos taxonomicos que definen y delimitan esta familia han variado a lo largo del tiempo. Para obtener las relaciones filogenéticas dentro de esta familia y con respecto a familias cercanas, se determinó la secuencia completa de la region de ADN ribosomico, que incluye los espaciadores transcritos internos (ITS) y el gen ARNr 5.8S, de 53 aislados de esta familia y 2 de la familia Xylariaceae. Las secuencias se alinearon y procesaron, y se compararon con la información taxonomómica disponible. El análisis molecular establece la existencia de 9 grupos monofiléticos y una cepa aparte (Eutypella quaternata) dentro de la familia diatrypaceae. Esta distribucion no encaja perfectamente con la taxonomía clasica basada en la observación de caracteres morfologicos. De los cinco generos incluidos en el estudio, sólo cuatro de ellos se pudieron correlacionar con uno o más grupos monofileticos, de acuerdo a lo observado por algunos autores, mientras que para el género Diatrypella no se obtuvo esta correlación. Para estudiar con más detalle la variabilidad encontrada en alguno de los grupos se realizó un estudio con tecnicas de huella genetica (AP-PCR y mp-PCR). Además se discute la posición e influencia de las secuencias repetidas en tandem (STR) encontradas en la region ITS1 dentro de la familia Diatrypaceae.
  • ASPECTOS FISIOLÓGICOS Y MOLECULARES DE LA DECOLORACIÓN ENZIMÁTICA DE EFLUENTES DE DESTILERÍA CON EL BASIOMICETO TRAMETES SP. I-62 .
    Autor: GONZÁLEZ DÍAZ DE VILLEGAS TANIA.
    Año: 2000.
    Universidad: ALCALA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: DPTO. DE MARKETING MOLECULAR - CIB (CSIC).
    Resumen: Los efluentes generados por la producción de alcohol a partir de melazas de caña de azúcar: las vinazas, son los más agresivos de los producidos por las industrias del azúcar y sus derivados. Es muy difícil eliminar el intenso color marrón de estos residuos que se debe a la presencia de la melanoidinas, polímeros tóxicos para los microorganismos utilizados en los métodos convencionales de tratamiento de efluentes industriales. En este trabajo se tratan vinazas de destilería con el basidiomiceto Trametes sp. I-62 y se analiza la participación de las enzimas ligninolíticas en la decoloración. Se demuestra que las lacasas producidas por este hongo desempeñan un papel fundamental en el proceso de tratamiento. Se llevaron a cabo estudios de inducción de estas enzimas por diferentes monómeros aromáticos, varios de ellos isómeros, y por el propio efluente de destilería. Varios de los compuestos aromáticos probados se revelaron como muy buenos inductores de la actividad lacasa. Se diseñó y puso a punto un método de RT-PCR múltiple que permite estudiar la expresión de los genes lcc1, lcc2 y lcc3 de Trametes sp. I-62. Los tres genes se expresan de manera diferente en presencia de los monómeros aromáticos, incluso isómeros y también las propias melanoidinas presentes en el efluente son capaces de inducir la expresión de los genes lcc1 y lcc2. Trametes sp. I-62, y sus lacasas, se revelan como una buena alternativa para el tratamiento de las vinazas de destilería.
  • AISLAMIENTO DE UNA COLECCIÓN DE MUTANTES TERMOSENSIBLES (TS) DE ASPERGILLUS FUMIGATUS. DESARROLLO DE LAS PRINCIPALES TÉCNICAS DE GENÉTICA CLÁSICA Y MOLECULAR EN ESTE HONGO FILAMENTOSO .
    Autor: DOMÍNGUEZ SÁNCHEZ ANA ISABEL.
    Año: 2000.
    Universidad: ALCALA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA (UNIVERSIDAD DE ALCALÁ).
    Resumen: El género Aspergillus incluye numerosas especies dehongos filamentosos ampliamente distribuidos en la naturaleza. De todas las especies pertenecientes al género Aspergillus, la más importante desde el punto de vista sanitario es Aspergillus fumigatus, implicada en la mayoría de las infecciones causadas por especies de este género. La elevada mortalidad derivada de estas infecciones en humanos y la ausencia de antifúngicos eficaces para controlar la infección sugieren el desarrollo de programas de investigación básica en este hongo con el objeto de identificar nuevas dianas como base para el desarrollo de una terapia que culmine con el descubrimiento de uno o varios antifúngicos altamente eficaces frente a aspergilosis. Se planteó el aislamiento de una colección de mutantes Ts de A.fumigatus y el desarrollo de distintas herramientas en la caracterización de los mismos a nivel de genética clásica y molecular. Finalmente se ha desarrollado un sistema de transformación homóloga en Aspergillus fumigatus basado en el gen sC que codifica para la enzima ATP sulfurilasa, enzima implicada en la ruta de asimilación del sulfato.
  • BIOGENESIS DE LA PARED CELULAR FUNGICA: UTILIZACIÓN DE MUTANTES .
    Autor: CAÑIZARES DOMENECH JOSE VICENTE.
    Año: 1999.
    Universidad: VALENCIA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.
    Resumen: Los hongos en la actualidad poseen una tremenda importancia ya que están causando infecciones graves en multitud de pacientes, por ello, muchos grupos de investigación estan estudiando estos microorganismos. El fin de este estudio es, además de el de conocer mejor estos microorganismos, el de intentar descubrir estrategias para el desarrollo de nuevos antifúngicos, fundamentalmente para las candiddiasis sistemáticas. Por ello es importante conocer la pared celular en profundidad, variaciones moleculares que se producen en la transformación de levadura a micelio y factores que intervienen en la virulencia de este microorganismo. En este trabajo nos hemos centrado en la obtención de mutantes morfológicos con el objeto de intentan detectar moléculas que intervengan en sus morfogénesis, se intentaron detectar las posibles modificaciones que se producen a nivel molecular en la pared celular de estos y comprobar su posible relación con la virulencia. Para ello, se analizaron la composición cuantitativa de las paredes celulares, tanto de proteínas como de material glucídico, se estudió electroforéticamente el material unido y no unido covalentemente a esta estructura. Por último se efectuaron estudios de virulencia, para comprobar la posible relación tanto de la morfología como de las diferencias detectadas a nivel molecular y la patogenicidad.
  • DIVERSIDAD DE HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ARBUSCULARES EN SUELOS CONTAMINADOS CON METALES PESADOS.
    Autor: VAL MUÑOZ M. CORAL DEL.
    Año: 1999.
    Universidad: GRANADA.
    Centro de lectura: CIENCIAS .
    Resumen: Las micorrizas son una asociación mutualística que se establecen entre hongos simbiontes estrictos del género Glomales (Zygomicotina) y mas del 90% de las plantas vasculares. Los hongos formadores de micorrizas se encuentran presentes en la mayoría de los climas y hábitats y constituye el nexo de unión entre el suelo y las plantas, al ser la parte funcional de la raíz que colonizan. Sin embargo, se conoce muy poco sobre como se afecta la diversidad de estos hongos como consecuencia de elevadas concentraciones de metales pesados en el suelo y sobre como estos cambios a su vez pueden interferir en los posibles efectos beneficiosos de la simbiosis. El objetivo de esta investigación fue determinar los efectos a largo plazo de la aplicación de lodos contaminados, sobre las poblaciones de hongos micorrícicos, su diversidad y su funcionamiento. En la parcela experimental se encontraron seis especies de hongos micorrícicos con distinto grado de tolerancia a los metales pesados, que variaba desde una sensibilidad extrema hasta un cierto grado de tolerancia y adaptación al estrés por metales pesados. El número total de esporas descendió a medida que aumentaron los niveles de metales en el suelo. Sin embargo, tanto el índice de diversidad de Shannon-Weaver como la riqueza de especies incrementaron a niveles intermedios de contaminación. De la parcela experimental se consiguieron aislar cuatro ecotipos de hongos micorrícicos: i) Glomus claroideum, aislado de la parcela control; ii) Glomus claroideum, aislado de la parcela mas contaminada; iii) Glomus sp. III, presente solo en los suelos menos contaminados y iv) Glomus mosseae, aislado de los suelos medianamente contaminados. Se encontraron diferencias consistentes de comportamiento entre ellos, en relación a la colonización producida en suelos contaminados y no contaminados. Se concluye la existencia de una potencial adaptación al estrés por metales pesados de G. claroideum y una gran sensibilidad a la presencia de metales de Glomus. sp.III, que resultó afectado principalmente a nivel del micelio externo inhibiendose su desarrollo. De forma paralela y dada la importancia ecológica de este grupo microbiano y su carácter de simbiontes estrictos, no cultivables en ausencia de planta hospedadora, se evaluó la posibilidad de utilizar los genes como marcadores moleculares. Ello nos permitiría evaluar con más facilidad la diversidad en el suelo de estos organismos. Los resultados obtenidos apoyan el uso de las secuencias del gen ribosómico 18S para la identificación taxonómica de los hongos micorrícicos pero no para el seguimiento "in situ" de estos hongos mediante PCR-RFLP debido al alto grado de conservación que presenta el gen. Sería encontrar otros genes diana que permitieran la identificación y el seguimiento de los hongos formadores de micorrizas mediante herramientas moleculares.#
  • "BIOSINTESIS DE LISINA EN PENICILLIUM CHRYSOGENUM: CARACTERIZACION GENICA Y MOLECULAR DE LA ENZIMA HOMOCITRATO SINTASA".
    Autor: BAÑUELOS HORTIGUELA OSCAR.
    Año: 1999.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: BIOLOGIA .
    Resumen: El aminoácido lisina es sintetizado a través de la ruta de ácido alfa-aminoadípico en Penicillium chrysogenum. En este microorganismo, la ruta del alfa-aminoadipato juega un papel adicional, además de la biosíntesis de lisina, ya que suministra alfa-aminoadipato para la formación de penicilina. El primer paso de la ruta de biosíntesis de lisina, la formación de homocitrato por la enzima homocitrato sintasa, parece ser un punto clave en la regulación del flujo metabólico a través de la ruta. En esta memoria se recoge la caracterización genética y molecular de este paso enzimático. El gen que codifica la homocitrato sintasa, primera enzima de laruta de formación de lisina, de P. chrysogenum fue clonado, mediante hibridación heteróloga, y posteriormente secuenciado. Mediante electroforesis en geles de pulsos se separaron los cromosomas de varias estirpes de P. chrysogenum, y mediante hibridación se determinó la localización cromosómica del gen lys1 en las cepas estudiadas. La función del gen lus1, como gen que codifica la homocitrato sintasa, fue demostrada mediante la obtención de tres mutantes interrumpidos en dicho gen, mediante la técnica de doble recombinación. Los tres mutantes exhibieron auxotrofía de lisina y, únicamente, niveles residuales de actividad homocitrato sintasa. Se estudió mediante hibridación de ADN total de tres cepas de P. chrysogenum, el número de copias del gen lys1 en el genoma, comprobándose la existencia de una sola copia del gen lys1 en las tres cepas objeto de estudio. Esto, junto a los resultados obtenidos en los experimentos de interrupción genética, demostró que solamente existe un gen que codifique la enzima homocitrato sintasa en P. chrysogenum. En Saccharomyces cerevisiae existen dos isoenzimas de la homocitrato sintasa, ambas localizadas en el núcleo celular. Para estudiar la localización celular de la homocitra sintasa de P. chrysogenum, se construyó ungen híbrido que contenía el gen lys1 fusionado al gen GFP de Aequorea victoria. La expresión de este gen en P. chrysogenum nos permitió observar que la fluorescencia debida al gen híbrido se encontraba principalmente en el citoplasma de las cepas hospedadoras. Por lo tanto, a diferencia de lo que ocurre en S. cerevisiae, la homocitrato sintasa de P. chrysogenum se encuentra localizada en el citoplasma. Para comprobar si la homocitrato sintasa de P. chrysogenum constituía un paso limitante en el suministro de alfa-aminoadipato para la biosíntesis de penicilina, el gen lys1 fue sobreexpresado en varias cepas. Los mayores niveles de transcrito del gen lys1 y de actividad homocitrato sintasa, observados en algunas de las cepas obtenidas, no condujeron a una mayor tasa de producción de penicilina ni a un mayor aporte de alfa-aminoadipato. La regulación por lisina de la tanscripción de gen lys1 también fue objeto de estudio. Se observó que concentraciones elevadas de lisina extracelular ejercían un efecto represor sobre la transcripción de este gen. Sin embargo, este aspecto de la regulación del primer paso de la ruta del alfa-aminoadipato no parece ser un mecanismo importante de regulación. En estudios preliminares se observó que mutantes auxótrofos de lisina no eran capaces de crecer en medios de cultivo en los que hubiera presente sales de amonio. El estudio con profundidad de este fenómeno permitió demostrar que el amonio inhibe el transporte de aminoácidos básicos a través de los sistemas específicos de transporte en P. chrysogenum.#
  • RESPUESTA CINÉTICA Y ULTRAESTRUCTURAL DE CANDIDA ALBICANS Y OTRAS ESPECIES NO ALBICANS FRENTE A CITOSTATICOS, ANTIFÚNGICOS E INMUNODEPRESORES.
    Autor: DOVIGO PRIETO CARMEN AMALIA .
    Año: 1999.
    Universidad: A CORUÑA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: UNIDAD DE GENÉTICA HOSPITAL JUAN --.
    Resumen: INTRODUCCION En los últimos 20 años ha aumentado la tasa de infecciones producidas por levaduras del género Gandida. Esta ha tenido una correlación directa con el incremento de enfermos inmunodeprimidos. Algunos de estos enfermos están a tratamiento con citostáticos. OBJETIVOS Estudio de la respuesta cinética de levaduras aisladas de enfermos inmunocompetentes, expuestas a citostáticos. Estudiar si estas levaduras, una vez expuestas a citostáticos y otros inmunodepresores, modifican su sensibilidad a antigúngicos. Desarrollo de un método ultraestructural para el estudio de núcleos de levaduras, con el fin de comparar resultados morfológicos con los analíticos. MATERIAL Y METODOS Las muestras se obtuvieron de la boca de enfermos no inmunodeprimidos. Se identificaron con API 20C AUX: Para estos estudios de CMI frente a antifúngicos (Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Clotrimazol, Anfotericina B y Nistatina) e inmunodepresores (Ciclofosfamida, Ciclosporina A, Mitomicina C, Azastioprina, 6-Metilprednisolona, Hidrocortisona y Dexametasona), se empleó la metodología del test de microdiluciónpropuesta por el NCCLS, con las modificaciones propuetas por el Grupo Europeo de estudio de sensibilidades para levaduras Para estudio de la ultra estructura empleamos Lucicasa y choque hipotónico conClK. Obtenidos los núcleos, se visualizaron a microscopia electrónica de transmisión. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se recogieron 136 muestras. Fueron positivas para Candida 50 muestras. Se identificaron 7 especies: la más frecuente fue Candida albicans, seguida de C. Famata. Las sensibilidades a los antifúngicos no dificieron de lo documentado enla literatura sobre levaduras aisladas de muestras clínica de enfermos con candidaiasis. Ninguna levadura fue sensible a las dosis estudiadas de los inmunodepresores, salvo a la Dexametasona, que parece ser sinérgica con los antifúngicos.La ultraestructura complementa los resultados analíticos y es cómoda y rápida de realizar.
  • ESTUDIO EPIDEMIOLOGICO DE LA PREVALENCIA Y FACTORES DE RIESGO DE ONICOMICOSIS Y TINEA PEDIS EN LA POBLACION GENERAL ESPAÑOLA.
    Autor: PEREA DEL PINO SOFIA.
    Año: 1998.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Resumen: El presente estudio se llevó a cabo de forma prospectiva para evaluar la prevalencia y factores de riesgo de onicomicosis y tinea pedis en la población general española. Se examinó una muestra de mil personas, tomándose muestra de uña y escamas del espaciointerdigital del pie de aquellos que presentaron signos o síntomas de onicomicosis y tinea pedis respectivamente. En todos ellos se tomó muestra del cuarto espacio interdigital del pie empleando la técnica de Mariat. Se definió onicomicosis como aquellos casos en los que el examen directo y el cultivo fue positivo. Se definió tinea pedis como aquellos con cultivo positivo en la muestra del pié. La prevalencia de onicomicosis fue 3.1% y de tinea pedis de 2.9%. El porcentaje de población que presentó ambas patologías fue de un 1.1%. En el análisis multivariante de factores de riesgo, la edad y el sexo en el caso de onicomicosis y la variable sexo en tinea pedis permanecieron como predictores independientes para padecer dichas patologías. En dicho análisis el padecimiento de uno de los procesos se asoció con un mayor riesgo de padecer el otro.
  • MANIPULACIÓN GENÉTICA DEL HONGO FITOPATÓGENO BOTRYTIS CINERREA: CLONACIÓN DEL GEN ADHA.
    Autor: SANTOS HERNÁNDEZ MILAGROSA.
    Año: 1998.
    Universidad: CADIZ.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Resumen: Debido a la importancia de los daños causados por Botrytis cinerea, así como a su amplia distribución y elevado número de cultivos que afecta, se han realizado numerosos estudios fisiológicos, bioquímicos, epidemiológicos, genéticos, etc., con el fin de conocer los distintos mecanismos que el hongo desarrolla durante el proceso infectivo. Muchas técnicas de Biología Molecular se han aplicado desde 1980 en este fitopatógeno, encaminadas en su gran mayoría, al estudio de enzimas que puedan intervenir en el ataque a su huésped tales como cutinasas, pectinasas, catalasas, o la producción de diversos metabolitos, o bien dedicados al estudio de la variabilidad genética presente entre las distintas poblaciones. Sin embargo, y a pesar de todos estos trabajos no se conocen aspectos fundamentales del hongo como el control y los mecanismos de patogenicidad, la base molecular de las resistencias a fungicidas, etc. El presente trabajo recoge un sistema de transformación desarrollado en Botrytis cinerea, mediante la utilización de dos tipos de vectores, uno de carácter integrativo (pUT737) y otro de carácter autónomo (pAMPF21). La transformación de un hongo como Botrytis es una herramienta poderosa que permite entender como se expresa el genoma fúngico, y como controlan los genes, todas las actividades biológicas. La utilización del vector pUT737 ha revelado la presencia del plásmido libre en la célula receptora.La estabilización del plásmido se produce como consecuencia de reordenaciones a través de recombinación in vivo. La utilización de vector pAMPF21, el cual porta la región AMA1 que confiere capacidad de replicación autónoma el hongo tales como Penicillium, Aspergillus, pero no en otros como Acremonium, confirma que dicha región también permite la replicación independiente en este hongo sin necesidad de ningún tipo de reorganización. La segunda parte del trabajo recoge la clonación de un gen implicado en la incorporación de amonio. Para este fin se han llevado a cabo los siguientes apartados: 1,- Construcción de una genoteca en el vector de sustitución del fago lambda, -GEM- 12. 2,- Secuenciación del gen y análisis de la región promotora. 3,- Localización cromosómica del gen. 4,- Análisis del transcrito obtenido y por último. 5,- Estudios de expresión, regulación y actividad enzimática. Como resultado se ha identificado, clonado y secuenciado el gen gdhA, que codifica para la enzima glutamato deshidrgenasa dependiente de NADP. Dicha enzima cataliza la formación del aminoácido esencial glutamato. El gen gdhA presenta un tamaño de 1.493 nucleótidos con un marco abierto de lectura de 1350 que determina una proteína de 450 aminoácidos. En su región 5' incorpora 2 intrones de 58 y 82 nucleótidos respectivamente. La proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos revela una alta homología con otras glutamatos deshidrogenasas presentes tanto en organismos procariotas como ecucariotas. Se han identificado dos posibles copias del gen gdhA localizadas a nivel cromosómico y mitocondrial. La localización cromosómica del gen gdhA en todas las cepas de Botrytis estudiadas permanece constante en la banda que presenta un tamaño aproximado de 2 Mb. El gen gdhA se transcribe dando lugar a una ARNm de 1,7 kb cuyo extremo 5' terminal más probable se halla a 56 nucleótidos por delante del codón de iniciación. La expresión del gen gdhA está regulada principalmente a nivel transcripcional mediada por la presencia de distintas fuentes de carbono y nitrógeno. La expresión del gen gdhA de Botrytis cinerea complementa la deficiencia en la actividad glutamato deshidrogenasa en los mutantes gdh de Aspergillus nidulans A686 y A699.
  • ESTUDIO MICOLOGICO DE 114 CEPAS DE DERMATOFITOS AISLADOS EN GRANADA (1995-1997).
    Autor: ABAD ROMERO BALMAS JOSE.
    Año: 1997.
    Universidad: GRANADA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: DEPARTAMENTO: MEDICINA PROGRAMA DE DOCTORADO: DERMATOLOGIA.
    Resumen: Entre Enero de 1995 y Mayo de 1997, de un total de 15.512 pacientes, realizamos 581 toma micológica, con 229 postivas; correspondiendo a dermatofitos 114 cepas. Efectuamos un estudio de las mismas encontrando los siguientes resultados: Tineae Unguiun (24'56%), tinea Corporis (23'68%), Tinea capitus (21'92%). Entre las especies aisladas destacan: T. Rubrum (35'96%); T. Mentagro Phytes y M. Canis (21'19% respectivamente). Se discuten nuestros resultados con cifras de publicaciones anteriores. En Granada desde 1.962 a 1989 y con cifras españolas de trabajos recientes.
  • CARACTERIZACION DE HONGOS DE INTERES BIOTECNOLOGICO.
    Autor: DURAN CASCALES CONSUELO.
    Año: 1997.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.
    Resumen: La tesis consta de tres partes: estudio de los perfiles de resistencia a metales pesados de hongos y su capacidad de secuestro de los mismos, así como la aplicación industrial del proceso en recuperación selectiva de cationes de interés o en procesos de descontaminación de efluentes industriales y biorremediación. La segunda parte resume el estudio de las actividades antibacterianas, antifúngicas y antitumorales a partir de extractos de los hongos estudiados y su aplicación en la industria farmacéutica. La última parte del trabajo fue el desarrollo de una metodología rápida y fiable para la adscripción taxonómica de nuevos aislados y que permitiera la diferenciación de cepas con propiedades biotecnológicas del resto de cepas de nuestra colección. El desarrollo de una nueva técnica de identificación de aislados se basó en el estudio comparativo de los patrones de digestión de las secuencias espaciadoras transcritas del operón de RNA ribosomas de hongos.
  • ESTUDIO DEL METABOLISMO SECUNDARIO DEL HONGO FITOPATOGENO BOTRYTIS CINEREA: CINETICA DE PRODUCCION Y BIOTRANSFORMACIONES QUIMICAS.
    Autor: DURAN PATRON ROSA M..
    Año: 1997.
    Universidad: CADIZ.
    Centro de lectura: CIENCIAS .
    Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR, MICROBIOLOGIA... Q. INORGA. PROGRAMA DE DOCTORADO: MICROBIOLOGIA MEDICA Y APLICADA.
    Resumen: Botrytis cinerea es un hongo fitopatógeno responsable de la enfermedad conocida como podredumbre gris, que ataca especialmente a uvas, aunque también puede causar serios daños en cultivos hortículas como lechugas, tomates, tabaco y fresas. La frecuencia e intensidad de los ataques de esta enfermedad han hecho de ella una de las más temidas en la viticultura europea. Los daños se traducen no sólo en la pérdida de cosechas, sino también en una cierta degradación de la calidad de los vinos, fundamentalmente con la aparición de gustos desagradables y pérdidas de color. Con el fin de combatir esta enfermedad, nuestro grupo de investigación viene trabajando en los últimos años en el diseño biosintético de fungicidas selectivos. Esto implica el conocimiento profundo de las rutas metabólicas del hongo en estudio, de ahí que en el presente trabajo se haya llevado a cabo un estudio exhaustivo del metabolismo secundario del hongo B. cinerea. Para ello se lleva a cabo en primer lugar, un estudio de la cinética de crecimiento y producción de metabolitos secundarios del hongo B. cinerea, lo que ha permitido conocer la curva de crecimiento de este microorganismo, así como los días de fermentación en los que éste produce la mayor cantidad de metabolitos secundarios. En segundo lugar, se realizó el aislamiento de los metabolitos secundarios producidos y excretados al caldo de cultivo por dos cepas de B. cinerea: 2100 y UCA 992, aislándose un total de quince nuevos productos naturales, algunos de los cuales nos han permitido confirmar y completar la ruta metabólica a botridial. En tercer lugar, se ha llevado a cabo la incubación de B. cinerea con cariofileno, óxido de cariofileno y (4E,8R)-cariofil-4-en-8-lo, obteniéndose veinticuatro productos de biotransformación. En cuarto lugar, se ha realizado la incubación de B.cinerea con sustratos marcados con 13C y 2H, experimento que junto al aislamiento anteriormente comentado, nos ha permitido ampliar una de las rutas metabólicas del hongo en estudio. Finalmente, se ha evaluado la actividad fitotóxica y antibiótica de los productos naturales aislados en el presente trabajo, obteniéndose productos que muestran una elevada actividad.
  • SENSIBILIDAD ANTIFUNGICA DE CANDIDA SPP.: EVALUACION DE LAS CONDICIONES OPTIMAS PARA LA REALIZACION DE PRUEBAS IN VITRO.
    Autor: RAMIREZ DE OCARIZ LANDABEREA INMACULADA.
    Año: 1997.
    Universidad: ZARAGOZA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGIA, MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PUBLICA PROGRAMA DE DOCTORADO: MICROBIOLOGIA.
    Resumen: A pesar de la introducción en 1992 por el NCCLS de un método estándar para estudiar la sensibilidad a los antifúngicos y de los muchos avances realizados en la adecuada estandarización de estas pruebas, quedan algunos inconvenientes pendientes de resolver. Por ello, y a la luz de la literatura existente, evaluamos las condiciones para optimizar la realización de las pruebas in vitro frente al género Candida dentro del contexto del método de microdilución y siguiendo las especificaciones del NCCLS. De este modo comparamos la lectura visual frente a la espectrofotométrica, antes y después de aplicar agitación, tiempo de incubación, teniendo en cuenta el medio de cultivo, tipo de pocillo, asimismo evaluamos el método de difusión en agar, menos laborioso y más accesible por la mayoría de laboratorios. Finalmente, habiendo seleccionado el método más adecuado para el estudio de susceptibilidad, determinamos la sensibilidad a los antifúngicos de uso sistémico de aislamientos procedentes de pacientes del HCUZ. Los resultados obtenidos se han analizado de acuerdo a las siguientes variables: a) Condiciones de lectura, comprobando cómo la agitación no modifica las CIMs, si bien en el caso de la lectura visual puede facilitar su realización. Por otra parte, las CIMs obtenidas visual y espectrofotométricamente son muy similares en el caso de la anfotericina B y 5-fluorocitosina por lo que éstas pueden determinarse visual y espectrofotométricamente; sin embargo, en el caso de los azoles es necesaria la lectura espectrofotométrica. b) Tiempo de incubación, verificando cómo el periodo de incubación de 48 h es el más apropiado, evitando así falsos informes de susceptibilidad en algunas especies. c) Medio de cultivo, observando que el medio adicionado de 2% de glucosa favorece la lectura sin modificar las CIMs. d) Forma del pocillo, confirmamos que el pocillo con fondo plano es más adecuado para la realización de pruebas in vitro. e) El método de difusión con tableta, si bien podría servir de orientación en determinadas circunstancias, en lo posible debe determinarse la CIM. f) El estudio de sensibilidad de nuestros aislados y su correlación con la procedencia de la muestra, refleja cómo la mayoría de los aislamientos resistentes al fluconazol proceden de cuadros de candidiasis orofaríngea, debido a que en su mayor parte provienen de pacientes con SIDA.
  • CLONACION Y CARACTERIZACION DEL GEN DE CANDIDA ALBICANS (CACYC3) QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA CITOCROMO C HEMO LIASA.
    Autor: CERVERA ZAMORA ANA M..
    Año: 1996.
    Universidad: VALENCIA.
    Centro de lectura: FARMACIA .
    Centro de realización: DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGIA Y ECOLOGIA PROGRAMA DE DOCTORADO: 275-A.
    Resumen: MEDIANTE INMUNORASTREO DE UNA GENOTECA DE CDNA EN EL VECTOR DE EXPRESION LAMBDA GT11 CON UN ANTICUERPO MONOCLONAL (MAB 4C12) QUE RECONOCE UN EPITOPO PRESENTE EN DOS ESPECIES MANOPROTEICAS DE 180 Y 260 KDA PRESENTES ESPECIFICAMENTE EN LA PARED CELULAR DE LA FORMA MICELIAL DEL HONGO, SE AISLARON DOS CDNAS IDENTICOS QUE CODIFICAN PARA EL EPITOPO RECONOCIDO POR MAB 4C12. EL EMPLEO DE ESTE CDNA COMO SONDA PERMITIO CLONAR EL GEN COMPLETO A PARTIR DE UNA LIBRERIA GENOMICA. DICHO GEN RESULTO CODIFICAR PARA LA ENZIMA MITOCONDRIAL CITOCROMO C HEMO LIASA (CCHL), COMO SE DEDUCE DE SU ANALISIS ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL, Y SE DENOMINO CACYC3. EL ANALISIS DEL MUTANTE NULO PARA DICHO GEN, OBTENIDO MEDIANTE INTERRUPCION GENICA SECUENCIAL, DEMOSTRO QUE EL GEN CACYC3 CODIFICA PARA DOS PROTEINAS, UNA DE 33 KDA LOCALIZADA EN LA MITOCONDRIA (CCHL), Y OTRA, DE 40 KDA, PRESENTE EN LA PARED CELULAR. DICHO MUTANTE MUESTRA ADEMAS UN DEFECTO EN LA FORMACION DE TUBOS GERMINATIVOS, POR LO QUE SE SUGIERE SU IMPLICACION EN EL PROCESO DE TRANSICION MORFOLOGICA LEVADURA-MICELIO. LA RELACION ENTRE LOS PRODUCTOS DEL GEN CACYC3 Y EL EPITOPO RECONOCIDO POR EL MAB 4C12, AUNQUE AUN ESTA POR DETERMINAR, PARECE CLARA, YA QUE EL PATRON INMUNOREACTIVO CON EL MAB 4C12 ESTA ALTERADO EN EL MUTANTE NULO (LA BANDA DE 180 KDA DESAPARECE Y LA DE 260 KDA PIERDE POLIDISPERSIDAD). TAMBIEN SE HA DEMOSTRADO QUE EL GRUPO HEMO INDUCE LA FORMACION DE TUBOS GERMINATIVOS EN C. ALBICANS, POR LO QUE UNA DE LAS POSIBLES FUNCIONES DEL PRODUCTO DEL GEN CACYC3 PRESENTE EN LA PARED CELULAR SERIA LA DE RECEPTOR DE GRUPOS HEMO.
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