NEUROQUIMICA

Autor: BURGUEÑO HURTADO JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: Los receptores acoplados a proteína G o de siete dominios transmembrana constituye la mayor superfamilia de receptores de membrana. Controlan una gran variedad de procesos fisiológicos como el metabolismo celular, la diferencia celular, así como la nuerotransmisión. A partir de los años 90 resurgió con fuerza la idea de la oligomerización entre estos receptores. En algunos casos existe una relación entre el estado de oligomerización del receptor y su funcionalidad. En esta Tesis Doctoral se aborda la homo- y la heterodimerización entre receptores de adenosina, dopamina y glutamato desde las más variadas perspectivas y estrategias experimentales. Se ha estudiado la homodimerización del receptor A2a de adenosina y la presencia de dichos homodímeros a nivel de la superficie celular. Se han demostrado la formación de heterodímeros entre los receptores A1 de adenosina y metabotrópico de glutamato Ialfa, así como entre los receptores A2a de adenosina y D2 de dopamina. La oligomerización entre estos receptores puede ser tanto directa como indirecta. Para determinar las proteínas intracelulares que interaccionan con el receptor A2a de adenosina y que pudieran mediar sus interacciones con otros receptores, se han llevado a cabo experimentos de doble híbrido. Utilizando el dominio C-terminal del receptor A2a de adenosina como anzuelo para llevar a cabo un scrrening de una librería de cerebro de ratón, se ha podido determinar su interacción con una proteína citoesqueleto de actina juega un papel importante en el tráfico del receptor, tanto en su clusterización como internalización. Los lipid rafts son microdominios de membrana que contienen altas concentraciones de colesterol y de esfingolípidos, constituyen regiones de membrana de alta ordenación. Las caveolas son pequeñas investigaciones consideradas un subtipo de raft. Estas investigaciones se mantienen estructural y morfológicamente gracias a una familia de proteínas, las caveolinas. En estos microdominios de la membrana plasmática se segregan diferentes proteínas, muchas de las cuales, involucradas en la transducción de señal. Esto ha llevado a postular que dichos microdominios actuan como plataformas de señalización. Ene sta tesis doctoral, se ha podido demostrar la localización e internalización del receptor A1 de adenosina a través de vesículas de caveolas. Así mismo, también se ha demostrado una interacción funcional entre el receptor metabotrópico de glutamato 1alfa y las caveolinas. El receptor es capaz de modificar la localización subcelular de la caveolina-2beta desde los lipid droplets, acúmulos lipidicos, hacia la membrana plasmática, mientras que la caveolina-1 es capaz de regular la actividad basal del receptor.

Autor: CARREÑO MÜLLER ELOISA.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La enfermedad de Parkinson se produce por la pérdida selectiva y progresiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra junto con la presencia de cuerpos de Lewy en neuronas residuales. La causa de la muerte crónica de las células de la sustancia negra no está aún definida. La característica más significativa de la enfermedad de Parkinson es la presencia de estrés oxidativo y la actividad inflamatoria/inmune. En nuestro trabajo estudiamos la influencia de un componente fisiológico, la trombina, en la posible reacción inflamatoria y su efecto en las neuronas del sistema nigroestriatal. La trombina es una serina proteasa multifuncional, más conocida por su papel en las cascada de coagulación. Es interesante que el cerebro contenga esta y otras proteasas junto con los receptores activados por proteasas. En nuestro trabajo estudiamos si la activación glial que produce la trombina in vitro podíae reproducirse in vivo, ocasionando la producción de citoquinas y otros agentes proinflamatorios, y si esta activación glial está implicada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SN. Utilizamos la inyección de trombina en la vía nigroestriada como modelo experimental, estudiando su efecto sobre diversos parámetros que actúan como marcadores de la activación glial o la viabilidad neuronal. El primer hallazgo de nuestro estudio es que la inyección de trombina en el SNC induce un proceso inflamatorio. Este efecto fue más fuerte en la sustancia negra que en el estriado, ya que en esta estructura no se observaron ni la pérdida de astrocitos ni la fuerte reacción glial. En nuestros experimentos, la inflamación inducida por la trombina es debida a su actividad proteolítica, ya que la inyección de la trombina desnaturalizada mediante calor o de trombina junto a a-NAPAP (inhibidor específico de la trombina) no inducen estos procesos (ni la proliferación de astrocitos ni la activación de microglía), o lo hacen con menor intensidad. Nuestro trabajo es el primero en mostrar que la inyección de trombina en algunas áreas del SNC produce degeneración neuronal. Esto ocurre principalmente en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, donde observamos la pérdida de expresión de ARNm de TH alrededor del sitio de la inyección. Podemos decir que hay una pérdida selectiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, ya que las neuronas GABAérgicas no se alteran ni en la sustancia negra ni en el estriado. La inyección de trombina produjo la aparición de edema, y éste fue significativamente mayor en el estriado que en la sustancia negra. La inyección de 15 U de trombina en la sustancia negra y en el estriado produjo rotura de la BHE. La rotura de la barrera depende también de su actividad proteasa. La inyección de trombina produjo también la aparición de acúmulos de a-sinucleina, componente principal de los cuerpos de Lewy. La inyección de trombina en el estriado produjo la pérdida retrógada permanente de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. No se produjo ninguna protección cuando tratamos a los animales con dexametasona, un potente antiinflamatorio. Hallamos en los animales tratados con dexametasona un mayor número de células OX-42 y OX-6 positivas que en los animales inyectados solamente con 15 U de trombina. Sin embargo, en el área cercana a la lesión la morfología de las células de microglía no era de teipo fagocítica, sino que mantenía su característica morfología estrellada. El hallazgo más sorprendente en nuestro estudio fue la gran pérdida de inmunorreactividad frente a TH causada por la trombina en al sustancia negra de los animales tratados con dexametasona. Ésta fue mayor que en los animales tratados solamente con trombina. Estos resultados nos permite sugerir la posible implicación de la trombina como una neurotoxina endógena que podría estar implicada en la degeneración de neuronas dopaminérgicas. Estas características también son de relevancia para un amplio conjunto de enfermedades neurológicas que presentan señales patológicas de inflamación, tales como la enfermedad de Parkinson, enfermedades cerebrovasculares y trauma en el SNC.

Autor: DÍEZ GARCÍA JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: El hipocampo es una estructura cerebral cortical compuesta por células excitadoras glutamatérgicas e interneuronas GABAérgicas que modulan la señal excitadora. Las interneuronas se han clasificado en diversas poblaciones en base a sus características morfológicas y a la expresión de diferentes proteínas, las cuales son responsables de que cada población de interneuronas tenga unas propiedades electrofisiológicas particulares. Entre estas proteínas se encuentran diferentes tipos de receptores de glutamato, aunque por el momento no están estudiados en detalle los subtipos metabotrópicos de estos receptores. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue caracterizar la población de interneuronas que expresa el receptor metabotrópico de glutamato mGluR5. Con el empleo de técnicas de inmunofluorescencia observamos la co-expresión del receptor mGluR5 en interneuronas que contienen el canal de potasio Kv3.1 y la proteína quelante de calcio parvalbúmina. A nivel ultraestructural demostramos con técnicas inmunocitoquímicas preinclusión, que mGluR5 tiene una disposición perisináptica en las sinapsis que reciben las dendritas de interneuronas que expresan Kv3.1 y parvalbúmina.

Autor: HERMIDA AMEIJEIRAS ÁLVARO.
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: La dopamina es el neurotransmisor utilizado por las neuronas dopaminérgicas para la transmisión intercelular de señales nerviosas a nivel sináptico. Un importante grupo de estas neuronas dopaminérgicas se encuentra situado en la substancia nigra, proyectando sus axones hacia el estriado, que es en donde se encuentran localizadas las terminales nerviosas de estas células. Este grupo de neuronas constituye lo que se conoce como "sistema nigroestriatal". La enfermedad de Parkinson es un proceso neurodegenerativo causado por una destrucción selectiva y progresiva de las mencionadas neuronas. La sintomatología de la enfermedad aparece solo cuando se ha destruido un 70-80% de estas neuronas. Aunque la etiología de la enfermedad sigue siendo desconocida, un gran número de datos apuntan actualmente al estrés oxidativo como factor etiológico de esta enfermedad. Desde hace tiempo se sabe que la dompamina es una sustancia que en presencia de oxígeno sufre un proceso oxidativo en el que se genera peróxido de hidrógeno. Se considera que este peróxido de hidrógeno en presencia de hierro es capaz de generar estrés oxidativo, por la formación de radicales hidroxilo que pude producirse a través de la reacción de Fenton. Algunos trabajos publicados habían sugerido que la dopamina manifiesta propiedades antioxidantes y protege frente al estrés oxidativo. Así, a la vista de los mencionados resultados, aparentemente contradictorios, el objetivo básico de esta Tesis ha sido el valor la capacidad de la dopamina para generar estrés oxidativo, y estudiar los efectos derivados de su acción sobre mitocondrias de origen cerebral. Este estudio se llevó a cabo en dos etapas. En una primera etapa se realizaron toda una serie de experimentos in vitro en los que, utilizando mitocondrias de cerebro de rata, se investigó la producción de peróxido de hidrógeno y la formación de radicales hidroxilo durante la autooxidación de la dopamina, así como por el metabolismo de la dopamina por acción de la monoamina oxidasa (MAO). La MAO es un enzima localizado en la membrana mitocondrial externa, que esta implicado en el catabolismo de la dopamina, un proceso en el que también se genera peróxido de hidrógeno, y que por lo tanto puede contribuir a generar estrés oxidativo a través de la mencionada reacción de Fenton. En esta primera etapa, y en un intento de conocer los mecanismos moleculares responsables del estrés oxidativo generado por el metabolismo y la autooxidación de la dopamina, se estudiaron los efectos inducidos por la presencia de hierro (Fe2+ y Fe3+) sobre la producción de radicales hidroxilo y la acumulación de peróxido de hidrógeno. En esta etapa, se hizo un estudio de la capacidad de la dopamina para alterar la peroxidación lipídica producida sobre el estado oxidativo de las proteínas mitocondriales, así como los efectos derivados del metabolismo y autooxidación de la dopamina sobre el estado oxidativo de las proteínas mitocondriales (contenido de grupos carbonilo y grupos tiol) y sobre la actividad MAO. En la segunda etapa, se llevó a cabo un estudio in vivo de los efectos derivados de la administración de L-DOPA+carbidopa y de un inhibidor del metabolismo cerebral de la dopamina (pargilina) sobre los índices de estrés oxidativo detectados en las mitocondrias cerebrales, con el fin de comprobar si los mecanismos moleculares derivados de los estudios llevados a cabo in vitro pueden explicar los efectos observados in vivo. Los resultados obtenidos demostraron que durante el metabolismo y autooxidación de la dopamina se genera peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilos; sin embargo, los radicales hidroxilo no son producidos por la reacción de Fenton, sino que en este proceso esta implicada la dopamina y el peróxido de hidrógeno formado en la autooxidación. El mencionado proceso es catalizado por el Fe3+, mientras que el efecto observado con Fe2+ es consecuencia de su paso previo a F3+. Este estudio puso de manifiesto que la dopamina campleja al hierro, evitando así su participación en la reacción de Fenton. Por otra parte, la dopamina frena la peroxidación lipídica, un efecto que es debido a que el radical semiquinona que se forma en su autooxidación actúa bloqueando la propagación de la peroxidación lipídica. Aunque, el hierro estimula la peroxidación lipídica, la dopamina sigue manifestando un efecto reductor frente a este proceso. Sin embargo, la autooxidación de la dopamina da lugar a un aumento en el contenido de grupos carbonilo en proteínas mitocondriales y una disminución en el contenido de grupos tiol libres, que de nuevo vuelve a ser incrementada por la presencia de hierro. Cuando se utilizó pargilina para inhibier el metabolismo de la dopamina, el resultado fue una disminución en la producción de radicales hidroxilo, consecuencia directa de la capacidad de este inhibidor par atrapar este tipo de radicales y de prevenier la formación de ácido 3,4-dihidroxifenilacetico (DOPAC), un productor de los mencionados radicales más eficaz que la dopamina. Sin embargo, la pargilina contribuye a incrementar la peroxidación lipídica, lo que parece explicar algunos efectos secundarios observados con este tipo de inhibidores. En general, los resultados derivados de los experimentos in vivo confirmaron los mecanismos propuestos para explicar los efectos observados in vitro. De todo lo expuesto se concluye que la dopamina es un arma de doble filo, ya que si bien protege frente a la peroxidación lipídica y a la temida reacción de Fenton, es capaz de generar radicales hidroxilo, que entre otras cosas alteran el estado de oxidación de las proteínas, lo que afecta a sus funciones, tal como se comprobó con la actividad MAO. Los resultados obtenidos nos permiten entender los efectos secundarios derivados de altas concentraciones de dopamina que se mantienen de forma crítica en el tratamiento farmacológico de la enfermedad de Parkinson con L-DOPA+carbidopa.

Autor: CANALS GAMONEDA SANTIAGO.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: HOSPITAL RAMÓN Y CAJAL.

Resumen: En este trabajo hemos estudiado el efecto del óxido nítrico (NO) sobre las neuronas dopaminérgicas en cultivo primario de rata y sobre neuronas dopaminérgicas de neuroblastoma humano NB69. El no mostró un efecto bifásico dependiente de su concentración, siendo neurotrófico a bajas dosis y neurotóxico a alta concentración. El efecto neurotrófico es selectivo para las neuronas dopaminérgicas y consiste en un aumento en la síntesis y captación de dopamina, un incremento en la ramificación neurítica y la expresión de novo de células con fenotipo dopaminérgico. El efecto tóxico consiste en un proceso de muerte celular programada y necrosis. El efecto tóxico es totalmente prevenido por factores solubles liberados por la glía y con antioxidante tiólicos. Además, hemos demostrado que la concentración intracelular de glutation (GSH) condiciona el efecto del NO. Una disminución en los niveles de GSH, transforma el efecto neurotrófico del NO en tóxico. En esta ocasión, la toxicidad es revertida con inhibidores de la guanilato ciclasa, de la proteína Kinasa G, así como de la lipoxigenasa 12 y las MAPKs ERK-1/2. Finalmente hemos demostrado que el NO activa selectivamente las ERK-1/2 en células de la glía y que esta activación inicia una cascada de señalización que mata a las neuronas dopaminérgicas.

Autor: SÁNCHEZ-CAMACHO BLAZQUEZ CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: El presente trabajo analiza la organización y hodología de los sistemas catecolaminérgicos (dopamina, noradrenalina y adrenalina) en el Sistema Nervioso Central de especies representativas de los tres órdenes de anfibios (Anuros, Urodelos y Ápodos), tanto en individuos adultos como durante el desarrollo embrionario y larvario. Así, mediante métodos de doble marcaje combinando técnicas de trazado axonal con la inmunodetección de la enzima tirosina hidroxilasa, hemos estudiado los grupos catecolaminérgicos que proyectan tres estructuras encefálicas diferentes: la médula espinal, el techo mesencefálico y la región septal. Asimismo, analizamos en detalle la distribución de las fibras y terminales catecolaminérgicos que inervan dichas estructuras. Nuestro trabajo ha demostrado la existencia de una amplia variedad de conexiones ascendentes y descendentes desde distintos grupos catecolaminérgicos (CA) que alcanzan numerosas regiones encefálicas. En particular, se ha demostrado que la organización de la inervación CA en la médula espinal y la región septal de anfibio, comparte muchas características en común con la de mamíferos. Por otro lado, el origen de dichas aferencias CA al techo mesencefálico en anfibios se localiza fundamentalmente en la región pretectal y el locus coeruleus. Este patrón de conexiones es más similar al existente en aves que en mamíferos. En cuanto a la organización de las proyecciones descendentes a la médula espinal, existe un patrón común en todos los anfibios. Asimismo, el estudio de la ontogenia de estas vías descendentes, demuestran que estas conexiones se desarrollan desde estadios muy tempranos de acuerdo con una secuencia temporal de aparición, y siguiendo un patrón básico que sería comparable entre los vertebrados. Todos estos resultados sugieren que las catecolaminas podrían tener una gran importancia funcional, estando implicadas en el procesamiento de la información sensorial y el contro motor, en el comportamiento visual y visumotor, y posiblemente durante el desarrollo, en la neurogénesis y maduración de las neuronas espinales. Además, nuestros datos apuntan a que las catecolaminas constituyen un grupo de neurotransmisores altamente filogenéticamente del encéfalo de vertebrados.

Autor: GONZÁLEZ RODRÍGUEZ DE CASTRO SARA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Esta Tesis doctoral pretende, como objetivo global, evaluar el papel que desempeña el sistema cannabinoide endógeno en la adicción a drogas de abuso. Para ello nos planteamos dos objetivos básicos. El primero consiste en evaluar la posible existencia de mecanismos de dependencia a cannabinoides similares a los descritos para otras drogas de abuso. El interés que generan los cannabionoides en relación a su posible uso terapéutico en determinadas patologías ha incrementado el debate acerca de los problemas de salud resultantes de su consumo prolongado. En este sentido, es importante determinar si el consumo crónico de cannabionoides induce el desarrollo de tolerancia a cannabionoides conlleva la aparición de dependencia física con manifestaciones de abstiencia comparables a las que producen otras drogas cuando se abandona su consumo crónico, con objeto de evaluar tanto las consecuencias de la interrupción del tratamiento a largo plazo con agentes cannabinomiméticos de una patología, como los peligros de salud reales derivados del uso lúdico. Otro de los focos de estudio que ha generado una gran controversia es la posibilidad de que el consumo de cannabionoides favorezca el consumo de drogas con mayor poder adictivo. A ese respecto, existen evidencia de que el consumo de heroína, tabaco y alcohol es más habitual en individuos consumidores de cannabis. Sin embargo, las conclusiones que se obtienen en estos trabajos se basan en estudios de correlación y no en causación por lo que son necesarias ulteriores investigaciones en este ámbito. El segundo objetivo básico de esta tesis doctoral consiste en establecer desde un punto de vista bioquímico y/o farmacológico la implicación del sistema cannabinoide endógeno en la dependencia a drogas de abuso diferentes del cannabis. La localización anatómica del receptor CB1 sugiere una implicación indirecta del sistema cannabinoide endógeno en la modulación de la ruta depaminérgica mesocorticolímbica que podría ser la responsable de las acciones de los cannabinoides en los procesos de refuerzo y respuestas motivacionales pero que también pdoría afectar a la capacidad reforzante de otras drogas de abuso. Si esto es así, cabría esperar que la exposición crónica a diferentes drogas de abuso afectara a la actividad endocannabinoide sobre todo en las regiones cerebrales implicadas en la adicción. Asimismo, la manipulación farmacológica del sistema cannabinoide endógeno podría ser efectiva en los que se refiere a la atenuación del comportamiento de búsqueda compulsiva de una droga como sugieren algunos estudios.

Autor: VALOR BECERRA LUIS MIGUEL .
Año: 2002.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS.

Resumen: El receptor nicotínico neuronal de acetilcolina presenta múltiples subtipos compuestos por determinadas combinaciones de subunidades con diferentes patrones de distribución en el organismo. Una aproximación para tratr de comprender los mecanismos transcripcionales por los que se expresan estas subunidades ha consistido en el análisis y aislamiento de promotores, con el fin de caracterizar los elementos presentes en el DAN responsables de la actividad transcripcional y de las proteínas con las que interaccionan. Para ello se ha hecho uso de una metodología básica como la manipulación de ácidos nucleicos, y de una metodología específica como el escrutinio de genotecas, ensayos de protección frente a Rnasas, transfección transitoria de cultivos celulares, ensayos de luciferasa y beta-galactosidas, ensayos de retraso (EMSA) y de impresión de huellas o footprinting. Los resultados y conclusiones más relevantes han sido los siguientes: 1,- La región entre 111 y 39 del promotor de la subunidad alfa5 bovina es esencial para su actividad transcripcional basal en células de origen neuronal y no neuronal, por la presencia de cinco cajas GC que pueden unir el factor Sp1, al parecer responsable de un mecanismo sinérgico de activación de la maquinaria transcripcional de la RNA polimera II. Además, el promotor de la subunidad alfa5 es activado en células C2C12 en presencia de señales inductoras de diferenciación muscular en células C2C12, en parte por mediación de las cajas GC. 2,- Existen regiones en el promotor de la subunidad beta4 que se encuentran conservadas en bovino y humano a nivel de secuencia (60-90% de identidad), aunque los elementos importantes en la regulación transcripcional basal en células de origen nueronal y no neuronal se localizan fuera de las regiones conservadas (-99/-63 en el caso del promotor bovino y -74/-40 en el caso del promotor humano). A pesar de todo, en ambas regiones se detecta la presencia de los factores de transcripción Sp1 y NF-Y. No se han encontrado este tipo de similitudes en el promotor descrito para rata. 3,- El factor de transcripción Sp1 parece ser clave en la regulación de la expresión concertada de los genes de alfa3, alfa5 y beta4 para formar el receptor nicotínico mayoritario del sistema nervioso perifñerico. Otros factores podrían funcionar de moduladores más específicos de actividad de Sp1. 4,- Los estudios del promotor de la subunidad alfa9 humana indican una regulación compleja de la actividad transcripcional de dicho gen, con la existencia de diversas regiones reguladoras, aunque la región de mayor contribución está comprendida dentro de la región 5' no traducible del gen (+66/+77), que es transcripcionalmente activa por sí sola y que contiene dos elementos capaces de unir el dominio de unión a DAN características de las proteínas SOX.

Autor: MOSTANY IBAÑEZ RICARDO.
Año: 2001.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA, UNIVERSIDAD DE LEON.

Resumen: En el presente estudio se realiza una comparación de los perfiles farmacológicos de diversos ligandos muscarínicos a lo largo del encéfalo de los individuos de la especie meriones unguiculatus (jerbo) mediante estudios de fijación de radioligandos a membranas, asi como la caracterizacion de la fijacion del radioligando [3H]N-metil-escopolamina en estos individuos mediante estudios autorradiograficos. Además, dada la susceptibilidad que presentan los individuos de esta especie a desarrollar episodios epilépticos inducidos por estímulos sensoriales externos, se ha realizado un estudio autorradiográfico de los cambios que tienen lugar en los receptores muscarínicos como consecuencia de las convulsiones epilépticas. Mediante autorradiografía funcional con GTP-y-35S se estudiaron la fijación basal y estimulada mediante oxotremorina (agonista), de la actividad de las proteinas Gi antes y posteriormente al desencadenamiento de la crisis epilépticas. Los cambios detectados tanto por autorradiografía cuantitativa como autorradiogafia funcional se atribuyen a un mecanismo de regulación de los receptores asociados a proteínas G. Así, como consecuencia de las convulsiones, hay un aumento del número de receptores en la membrana plasmática.

Autor: ALONSO ESCOLANO DAVID.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: En situaciones de isquemia se producen especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, y el consiguiente estrés oxidativo y nitrosativo parece contribuir significativamente al daño tisular. Este trabajo ha investigado los efectos que la privación de oxígeno y glucosa tienen sobre la regulación de las isoformas neuronal e inducible de la enzima óxido nítrico sintasa en la corteza cerebral de rata, así como el efecto nitrante que sobre las proteínas tienen las especies reactivas formadas, especialmente el peroxinitrito producido por la combinación del NO con el superóxido. El modelo experimental consistió en la perfusión in situ del cerebro con una privación de oxígeno y glucosa durante 30 minutos, seguida o no por varios periodos de reperfusión. Las técnicas empleadas para el estudio fueron: inmunocitoquímica, Western blotting, actividad enzimática de la NOS y difusión por resonancia magnética. El daño cerebral producido por la isquemia y posterior reperfusión quedó demostrado por las imágenes de difusión obtenidas por resonancia magnética. Este daño se vio disminuido tras la administración del inhibidor de NOS, L-NAME. Después del periodo de isquemia y durante las primeras horas de reperfusión, se observó un progresivo aumento en la cantidad de nNOS, demostrado por Western blotting, que se correlacionó inmunocitoquimicamente con un aumento del número de neuronas y prolongaciones inmunorreactivas para nNOS. A partir de las 6 horas de reperfusión hubo un descenso en la cantidad de nNOs, con una disminución en el número de interneuronas inmunorreactivas y un deterioro morfológico de estas a lo largo del tiempo. La iNOS apareció en neuronas piramidales de las capas IV-V tras 4 horas de reperfusión. Demostramos la presencia de nitrotirosina en neuronas y células gliales en la corteza cerebral de ratas control. Se observó un aumento de la expresión y modificación de su distribución intracelular tras el periodo de isquemia. El aumento en la producción de NO y peroxinitrito durante la isquemia/reperfusión contribuye dramáticamente al daño cerebral, dado que la inhibición de la síntesis de NO por L-NAME parece atenuar la mayoría de los cambios observados. La extensa nitración de proteínas observada puede deberse al aumento de la producción de NO, principalmente por la iNOS.

Autor: MIRANDA BAÑOS M. ELENA.
Año: 2000.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El órgano subcomisural(OSC) es una glándula del cerebro de todos los vertebrados, localizada en el techo del tercer ventrículo, cuyas células secretan glucoproteínas de alto peso molecular al líquido cefalorraquídeo, donde polimerizan y forman la fibra de Reissner(FR),que atraviesa el acueducto cerebral, el cuarto ventrículo y el canal central de la médula espinal. Hasta este trabajo de Tesis Doctoral, se disponía de anticuerpos monoclonales anti-FR, con los cuales se desarrolló un ELISA sandwich para la detección y cuantificación de la secreción del OSC. Como primer objetivo de esta Tesis Doctoral, se ha puesto a punto un protocolo de purificación por cromatografía de inmunoafinidad con dos de los anticuperos monoclonales anti-Fr, con el que se ha logrado purificar casi a homogeneidad la secreción intracelular del OSC de vaca. Las tres bandas purificadas, indentificadas en electroforesis y anteriormente descritas en la bibliografía como de 540,450 y 320 kDa, sehan utilizado conjuntamente como antígeno para la generación de un nuevo grupo de anticuerpos monoclonales anti-OSC, Así,se han establecido quince líneas de hibridomas productoras de quince anticuerpos monoclonales, que se han caracterizado por inmunocitoquímica, varios tipos de ELISA e immunoblot. En inmunocitoquímica, todos los anticuerpos monoclonales reconocen el OSC y la FR de vaca, y la mayoría de ellos reaccionan con el OSC de conejo y cerdo; por primera vez, se han obtenido además dos anticuerpos que reconocen con intensidad el OSC de rata y de ratón. La caracterización por ELISA ha mostrado que los anticuerpos monoclonales generados reconocen con alta afinidad las glucoproteínas del OSC y la FR(ELISA mediado por antígeno), reaccionando con epitopos diferentes entre sí(ElISA competitivo), que no se repiten y que coexisten(ELISA sandwich) en las glucoproteínas de secreción. En immunoblot de extractos de OSC de vaca, cinco de los anticuerpos anti-OSC reconocen las tres bandas de secreción, mientras que dos de ellos reconocen solamente las bandas de 540 y 450 kDa. Finalmente, la secrección de mayor pureza obtenida se ha aplicado a cultivos de la línea de neuroblastos de rata B104 para ensayar su posible actividad biológica in vitro, obteniendo resultados preliminares que apuntan a la posible influencia de la secreción del OSC sobre procesos de diferenciación neuronal a través de la emisión de neuritas y la agregación celular.

Autor: DOLCET ROCA FRANCISCO JAVIER.
Año: 2000.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA, UNVIERSITAT DE LLEIDA.

Resumen: Las motoneuronas, como otras poblaciones neuronales, requieren de factores neurotróficos para su superivencia y diferenciación. Diversas familias de factores neurotróficos de diferente origen y procedencia tisular, resultan tróficos para las motoneuronas in vivo y in vitro. Tres de las familias de factores neurotróficos mejor caracterizadas con la familia de las neurotrofinas (Nerve Growth Factor, NGF; Brain-Derived Nedurotrophic Factor, BDNF; Neurotrophin-3, NT-3 y Neurotrophin-4/5, NT-4/5, la familia del GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor, GDNF; Neurturin, NTN; Persephin, PSP y Artemin, ART) y la familia de las citoquinas del tipo IL-6 (Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF y Cardiotrophin-1, CT-1). En este trabajo, hemos demostrado que la capacidad que BDNF, GDNF, NTN, PSP, CNTF y CT-1 tienen capacidad para promover la supervivencia de las motoneuronas de embrión de pollo in vitro. Todos estos factores, con diferente eficacia, mantienen la supervivencia de las motoneuronas en cultivo. Los factores neurotróficos realizan sus efectos biológicos mediante la interacción con receptores específicos presentes en la superficie celular. Las neurotrofinas ejercen sus efectos mediante la interacción con los receptores con actividad tirosina quinasa Trk y el receptor p75. Los miembros de la familia del GDNF reconocen un receptor multicomponente integrado por un receptor con actividad tirosina quinasa llamado Ret y un miembro de la familia de coreceptores ligados a membrana con un enlace glicosilfosfatidilinositol (GPI) llamados genéricamente GDNF family receptor (GFRalfa). Las citoquinas de la familia de la IL-6, CNTF y CT-1 actuan mediante la unión a receptores de membrana multiméricos interados por dos subunidades transmembrana sin actividad tirosina quinasa intrínseca (gp 130 y LIF beta) y una subundiad anclada a membrana con un enlace GPI. La interacción de las neurotrofinas, de los miembros de la familia del GDNF o las citoquinas con sus respectivos receptores, activa diferentes vías de señalización intracelular que transmiten les efectos biológicos de los diferentes vías de señalización intracelular que transmiten les efectos biológicos de los diferentes factores. En este trabajo, hemos caracterizado las principales vías de señalización activadas por estos tres tipos de factores y hemos analizado la relevancia o contribución de éstos en la señalización de la supervivencia de las motoneuronas en cultivo. Dos de las vías intracelulares activadas por receptores tirosina quinasa más bien caracterizadas son las vía de la P13K/PKB (fosfatidilinositol-3 quinasa/proteina quinasa B) y la vía de la ERK/MAPK (extracelular regulated kinase/mitogen activated protein kinase). Nuestros estudios demuestran que el tratamiento de las motoneuronas con neurotrofinas BDNF o miembros de la familia del GDNF (GDNF, NTN o PSP) provoca la activación vía de la P13/PKB y la vía ERK/MAPK. La activación de la vía P13K/PKB, pero no la de la vía ERK/MAPK, es necesaria en la señalización de la supervivencia de las motoneuronas inducida por neurotrofinas y miembros de la familia del GDNF. La inhibición de esta vía, resulta en la muerte de las motoneuronas con características bioquímicas y morfológicas de la apoptosis, similares a las observadas en la muerte por deprivación trófica. La interacción del CNTF yla CT-1 con sus receptores induce la activación de la vía JAK/STAT y la vái ERK/MAPK. En este caso, la activación de la vía JAK/STAT, pero no la activación de la vía ERK/MAPK, es necesaria para señalizar los efectos de supervivencia inducidos por estos dos factores. Además de la vía JAK/STAT (Janus Kinase/signal transducer and activator of transcription), la supervivencia inducida por CNTF y CT-1 requiere de la activación tardía de la vía P13K que es dependiente de síntesis proteica.

Autor: ENCIMAS MARTÍN MARIO.
Año: 2000.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA, UNIVERSITAT DE LLEIDA.

Resumen: La génesis y mantenimiento del sistema nervioso están regulados por una serie de factores neurotróficos, de entre los que destacan las neurotrofinas (NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5) y los ligandos de la familia del GDNF o GFLs (GDNF, NRTN, PSPN y ARTN). Durante los útlimos años, se han ido caracterizando las cascadas de señalización intracelular responsables de los efectos biológicos ejercidos por estos factores, con especial atención al NGF y las vías MEK/MAPK y PI 3-K/Akt, dos de las mejores caracterizadas. En el presente trabajo se han analizado las vías de traducción de señal iniciadas por TrkB (el receptor de BDNF y NT-4/5) y Ret (el componente común del receptor para todos los GFLs) en su participación en los procesos de supervivencia y crecimiento neurítico en diversos paradigmas experimentales. En el caso de TrkB, y utilizando como modelo células de neuroblastoma humano SH-SY5Y pretratadas con ácido retinoico (RA), se ha determinado que la vía P13-K/Akt es el principal mediador de la superivencia celular, mientras que la vía MEK/MAPK es necesaria para los procesos de crecimiento neurítico. Además, se ha caracterizado el fenotipo de las células SH-SY5Y pretratadas con RA y expuesta durante tiempos largos a BDNF, observándose que ésta se diferencian hacia un fenotipo neuronal, expresando varios marcadores neuronales específicos y quedando detenidas en la fase G1 del ciclo celular. En el caso de Ret, se ha observado que la actividad PI 3-K es necesaria para la supervivencia de motoneuronas espinales de pollo, neuronas granulares del cerebro y neuronas del ganlio cervical superior, mientras que la vía MEK/MAPK no parece ser importante en los procesos de supervivencia. Además, c-Src parece ser un mediador importante en la señalización por GFLs, estando implicado tanto en la supervivencia (actuando por encima d ePI 3-K) y el crecimiento neurítico. La implicación de c-Src en estos procesos, además, podría ser específica de los GFLs, dado que esta proteina no parece estar implicada en la supervivencia mediada por NGF.

Autor: YUSTE MATEOS VÍCTOR JOSÉ.
Año: 2000.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La apoptosis es un programa de suicido celular fisiológico que resulta crítico para el desarrollo y el mantenimiento de tejidos y órganos. La alteración de las vías que conducen a la muerte de la célula provoca patologías como el cáncer, enfermedades autoinmunes e inmunodeficiencias y desórdenes neurodegenerativos. Existe una gran variedad de moléculas químicas capaces de provocar apoptosis, como, por ejemplo, el alcaloide natural estaurosporina, un potente e inespecífico inhibidor de quinasas, inductor de una muerte apotótica rápida y sincrónica en multitud de sistemas celulares. Esta moléculas poseee también la particularidad de promover una diferenciación inicial en líneas celulares derivadas de neuroblastomas. Las vía intracelulares que utiliza la estaurosporina para provocar uno u otro efecto, es un tema que ha suscitado un gran interés entre los investigadores del campo. El ánimo del presente estudio, ha sido el de contribuir a aclarar los mecanismos moleculares por los que la estaurosporina es capaz de provocar ambas acciones. Para ello utilizamos cuatro líneas neuroblásticas humanas como modelos celulares, permitiéndonos constatar que esta droga induce el crecimiento neurítico en todas ellas y que, cuando se sobrepasa la dosis de 50nM en el medio de cultivo, el alcaloide es capaz de provocar muerte celular. Asimismo, las características morfológicas y bioquímicas de la muerte inducida por estaurosporina nos han permitido verificar que se trata de un proceso típicamente apoptótico. Sin embargo, en dos de las líneas celulares utilizadas en el estudio, IMR-5 e IMR-32, la droga, pese a causar eficientemente la muerte de las células, no consiguió provocar dos de los sucesos más característicos que acontecen durante el transcurso de la apoptosis: la degradación oligonucleosomal del DNA y la típica condensación cromatínica descrita en este proceso. De estos resultados se han derivado dos de las hipótesis de trabajo que completan el estudio. Por un lado, hemos utilizado la línea SH-SY5Y como modelo celular en un intento de justificar los mecanismos por lo que la estaurosporina es capaz de estimular el crecimiento neurítico. Para ello abordamos diferentes estategias, basadas todas ellas en la supresión del potencial apoptótico de dicha droga. La expresión forzada del gen bcl-x ha demostrado ser el procedimiento más efectivo para bloquear la muerte inducida por estaurosporina, aún utilizando dosis micromolares de la misma, permitiendo que el alcaloide induzca una importante y espectacular red de neuritas en este intervalo de concentración. La segunda línea de trabajo, tenía como objetivo la caracterización de la muerte celular inducida por la estaurosporina sobre las líneas neuroblásticas IMR; utilizándose, para ello, las IMR-5 como modelo celular. Los experimentos realizados demuestran que estaurosporina provoca apoptosis, ya que existe activación de caspasas y la inhibición de las mismas retrasa la muerte inducida por el alcaloide. Hemos podido constatar, del mismo modo, que otros agentes inductores de apoptosis tampoco son caapces de promover la aparición del fenotipo apoptótico, hecho que sugiere un defecto intrínseco en estas células. Experimentos diseñados con el fin de justificar de dicho déficit, han demostrado que las IMR-5 provocan la desaparición de la endonucleasa CAD durante el transcurso de la apopotosis y que la sobreexpresión de ésta les devuelve la capacidad de exhibir un fenotipo típicamente apoptótico después del tratamiento con estaurosporina un otra droga.

Autor: VALLEJO CREMADES M. TERESA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La neurostatina se ha descrito como un inhibidor de la división de astroblastos y astrocitomas presente en extractos de cerebro de rata. El análisis de su estructura sugiere que la neurostatina es un disialogangliósido, GD1b, que presenta una O-acetilación en la posición 9 del ácido siálico terminal. La neurostatina puede tener gran importancia en la proliferación glial en el sistema nerviosos central (SNC) durante el desarrollo y también en la regulación de la gliosis en procesos tumorales o tras una lesión. Previamente, nosotros establecimos dos anticuerpos monoclonales contra el inhbidor glicolipídico, R1D y R2B. Los anticuerpos monoclonales, R1D y R2B, generados contra la neurostatina, reconocen específicamente el epítopo O-acetilado del glicolípido inhibidor y más débilmente otros gangliósidos que comparten el mismo epitopo. Ambos anticuerpos anti-neurostatina son capaces de bloquear la actividad inhibitoria de la proliferación de astroblastos del glicolípido inhibidor. Los resultados obtenidos indican que la neurostatina se expresa en el cerebro de rata embrionaria de 18 días (E18). La inmunoreactividad disminuye durante la primera semana postnatal (P0-P5) para aumentar posteriormente durante la segunda semana postnatal (P7-P14) hasta la edad adulta. El patrón de marcaje en P9 y adulto es de superficie, definido por un marcaje difuso en todas las regiones del cerebro estudiadas y definido sobre la membrana externa de células neurales en corteza e hipocampo. El nivel de neurostatina varía en el cerebelo durante el desarrollo, pero a diferencia del cerebro, el nivel de neurostatian post-natal se mantiene constante hasta P9, aumentando después hasta alcanzar la máxima inmunoreactividad en P30. La capa granular y la de las células de Purkinje reunen la mayor inmunoreactividad en ratas de edades desde P15 a adulto. El período de máxima inmunoreactividad anti-neurostatina en el cerebelo de rata coincide con el momento en que cesa la división de la glía de Bergman. Tanto la inmunoreactividad anti-neurostatina como la actividad inhibitoria se localizan preferentemente en la fracción de membranas y a edades desde E 18 hasta adulto la inmunoreactividad anti-neurostatina corresponde o a neurostatina o a moléculas con epítopos relacionados con la neurostatina. Las neuronas son las principales células productoras de la neurostatina en el SNC. El glicolípido inhibidor se localizan mayoritariamente en las membranas neuronales y en menor proporción en el citosol. Los cultivos de neuronas presentaban mayor inmunoreactividad y actividad inhibitoria de la proliferación de astroblastos que los astrocitos. La neurostatina inhibe la proliferación de astroblastos de dos formas diferentes: inhbición por contacto debida a la neurostatina de las membranas neuronales e inhibición por neurostatina liberada al medio. Este resultado implica una regulación en la síntesis/liberación de la neurostanina por el contacto con astrocito/neurona. Existe una relación óptima neurona/astroblasto para la producción de inhibidor de la proliferación de astroblastos in vitro que depende del tipo neuronal. Neuronas de diferentes regiones del SNC de rata poseen diferente capacidad inhibitoria.

Autor: VALE GONZÁLEZ M. CARMEN.
Año: 1997.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: El objetivo general de la tesis ha sido el estudio de los mecanismos de acción de los policlorocicloalcanos (PCCAs) en sistemas in vitro de células nerviosas en relación con la función de los receptores de aminoácidos inhibitorios (GABA y glicina) expresados en las mismas se ha estudiado las interacciones de los isómeros delta y gamma del hexaclorocicloheanos (depresor y convulsivante) con los lugares de reconocimiento de GABA, benzodiazepinas y picrotoxinina del receptor GABA-A. Se ha estudiado también el efecto de la exposición prolongada de los cultivos neuronales a policlorocicloalcanos. Se ha investigado además la existencia de receptores GABA C en cultivos neuronales primarios con el fin de estudiar la acción de PCCAs sobre el canal de C1 asociados a este receptor. Además se estudio el efecto de los PCCAs sobre el canal de C1 asociado al receptor inhibitorio de glicina. Por último se estudio la participación de la neurotransmisión GABA érgica de la citotoxicidad de lindano.