VIROLOGIA

Autor: SANJUÁN VERDEGUER RAFAEL.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: EDIFICIOS DE INVESTIGACIÓN.
Centro de realización: INSTITUTO CAVANILLES DE BIODIVERSIDAD Y BIOLOGÍA EVOLUTIVA.

Resumen: Mediante una aproximación basada en la evolución experimental. Así como la manipulación genética, se pretende estudiar la importancia de la mutación y las interacciones genéticas en la evolución de los virus de RNA. Para ello, se introdujeron sustituciones nucleótidicas conocidas en un clon infeccioso del virus de la estomatitis vesicular (VSV) y se midió el efecto que éstas tenían sobre la eficacia biológica. Los resultados reverlaron que VSV posee una tolerancia muy escasa a la mutación, siendo el coeficiente de selección en contra de los cambios introducidos, mayor que en cualquier sistema biológica de DNA. Además, las mutaciones, al ser combinadas por pares, mostraron una epistasia predominantemente positiva cuando se trataba de cambios deletéreos y negativa cuando se trataba de cambios beneficiosos. Estas propiedades son interpretadas como la consecuencia de una escasa robustez genética, Las implicaciones para le evolución del virus del RNA, su elevada tasa de mutación y adaptación son discutidas, y contrastadas mediante la evolución experimental del virus modelo empleado.

Autor: JIMÉNEZ HERNÁNDEZ NURIA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: INSTITUTO CAVANILLES .
Centro de realización: INSTITUTO CAVANILLES DE BIODIVERSIDAD Y BIOLOGIA EVOLUTIVA.

Resumen: La incidencia del virus de la hepatitis C en la Comunidad Valenciana es, aproximádamente, de un 3%. Este virus posee una gran heterogeneidad que permite su clasificación en seis genotipos, los cuales presentan distintos patrones de distribución geográfica, prevalencia y rutas de transmisión. En concreto en la Comunidad Valenciana, el genotipo más prevalente es el 1b, seguido del genotipo 1a. Nuestro principal objetivo es contestar a la pregunta de ¿Qué hace al genotipo 1b ser más prevalente que al 1a en la Comunidad Valenciana?. Para ello obtuvimos y secuenciamos un gran número de claves de dos fragmentos del genoma del virus correspondientes a las proteínas de la envuelta E1-E2 y a la proteína no estructural NS5A. Realizamos la inferencia de la historia demográfica del virus, y los resultados mostraban que la ruta de transmisión de ambos genotipos podía ser responsable de la mayor prevalencia de uno sobre otro. Los diferentes estudios genéticos-poblaciones que también realizamos, no mostraron diferencias entre genotipos. En cuanto a la búsqueda de selección positiva, los resultados muestran como en la región hipervariable hay algunoas posiciones aminoacídicas seleccionadas positivamente que permiten al virus escapar del ataque del sistema inmune.

Autor: CARRASCO CORNEJO M. LUISA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. BIOLOGÍA MOLECULAR. U. DE AARHUS, DINAMARCA.

Resumen: Durante las últimas décadas, los vectores de transferencia génica más usandos en terapia génica humana han sido basados en diferentes tipos de retrovirus. Estos vectores presentan, sin embargo, una capaciedad limitada en cuanto al tamaño del transgén que puede alojar. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de la capacidad maxima de transducción de vectores basados en el virus de la leucemia murina Akv para su posible utilización en terapia génica. Se han construido varios vectores basados en el virus Akv conteniendo genomas de tamaños crecientes, y se ha analizado su capacidad de replicación en function del tamaño genómico. Se ha utilizado para ello una técnica (Sistema de maxi-virus) desarrollada y reportada en nuestro laboratorio en 1999, que se basa en la inserción, en la región U3 del LTR, de un IRES que dirige la expressión del gen testigo neo insertado a continuación (Virus AkvBi-neo). A partir de este virus, y mediante la inserción en su parte previa de fragmentos de tamaño creciente de DNA del fago Lambda se generaron Mega-vectores cuya capacidad de transducción y estabilidad fueron estudiados. Cuando el tamaño del genoma viral sobrepasó las 10 kb, la eficiencia de transducción decreció de 10 5 to 10 1 DFU/ml, dependiendo del tamaño del inserto. En este trabajo se ha analizado los distintos pasos en el ciclo de replicación para determinar en que estado/s son deficientes estos vectores y así explicar la reducción obtenida en la capacidad de transducción. La segunda parte de la Tesis se centra en el estudio un maxi-virus quimérico, en el cual el promotor propio del virus Akv se ha sustituido por el correspondiente al virus SL3-3-MLV. Este maxi-virus contiene un "cassette" (formado por el IREs seguido del gen egfp), insertado en la región U3 del LTR. Se han analizado los cambios tanto en la replicación del vector como en la expresión del gen testigo durante seis pases del virus. En los cuatro primeros pases, el vector mantiene la estabilidad genómica, mientras que a lo largo de los dos últimos pases se observó la perdida del inserto. El análisis de estos mutantes ha conducido al hallazgo de dos variantes que contienen secuencias derivadas de tRNAS de origen celular. Se propone finalmente un modelo para explicar la formación de uno de estos recombinantes.

Autor: PUIG-BASAGOITI FRANCESC.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA U.B..

Resumen: Hasta el momento varias regiones de la proteína NS5A y el del virus han sido relacionadas con la respuesta al tratamiento antivírico en función a su variabilidad genética y al número de mutaciones presentes en ella. Además, en estas regiones (PKR-bd, ISDR, V3 y PePHb) la estructura y evolución de las quasiespecies podría tener un papel importante para determinar el tipo de respuesta al tratamiento antivírico. En la presente tesis se analizan dichas regiones en un amplio grupo de pacientes infectados con genotipo Ib y tratados con IFN o con IFN+Ribovirina. El número de mutaciones en ISbR, PkR-bd y V3 parece estar relacionado con el tipo de respuesta siendo estas más numerosas en las secuencias de los -- pacientes respondedores que en las de los no respondedores. Tanto la estructura como la evolución de las quasiespecies es diferente entre el grupo de respondedores y no respondedores siendo estas diferencias mucho mayores en la región V3 que en el resto de las regiones analizadas en la NS5A.

Autor: GALLEGO GÓMEZ JUAN CARLOS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Los virus recombinantes basados en mutantes atenuados del Virus Vaccinia (VV), están siendo ahora considerados como candidatos vacunales contra un amplio espectro de enfermedades en humanos y animales. El principal objetivo de esta tesis fue analizar los estados de morfogenésis y los cambios morfológicos, que los virus inducen en las células humanas infectadas, usando los tres mutantes atenuados del VV (MVA, M65 and M101), en comparación con las células infectadas con la cepa salvaje el virus WR. Un detalle análisis por microscopía electrónica de transmisión de células humanas HeLa infectadas con los mutantes, mostró diferencias importantes en la ultraestructura fina y en las cantidades de intermediarios virales comparados con las células infectadas con los virus silvestres WR. Los estudios de microscopía electrónica revelaron que hay tres distintos cambios en el proceso de morfogénesis para los tres mutantes atenuados. Nuevas formas virales o intermediarios fueron hallados entre los estados de virus inmaduros (IV: immature virus) y las formas maduras (IMV: intracellular mature virus), representando estados de transición donde aún el core está en proceso de ensamblaje. La morfogénesis del MVA estuvo bloqueada principalmente en el estado de IV, pero algunas formas maduras fueron observadas, y los IMVs producidos tuvieron formas más redondeadas que el virus silvestre WR. Estos "IMVs" tuvieron una estructura interna anormal (referidos como "virus Atípicos"), con potenciales alteraciones en las interacciones del core viral con la envuelta, y son incapaces de adquiir una segunda envuelta para producir los virus maduros con envuelta (IEVs: intracellular envelope virus). En el caso de los mutantes M65 y M101 la morfogénesis estuvo interrumpida en etapas más tardías, llegándose a formar los virus maduros (IMVs) que se acumulan dentro de la célula pero no pueden progresar hasta las formas extracelulares con envuelta (EEV: Extracellular enveloped virus). Análisis de las proteínas virales en los mutantes mostraron alteraciones en algunas proteínas estructurales que están implicadas en la ruta morfogenética. La microscopía confocal reveló que los mutantes atenuados tuvieron fenotipo de placa pequeño con microcometas y no produjeron lisis celular. Mientras el WR indujo polimerización ded colas de actina, los mutantes no generaron las colas de actina y no pudieron salir de la célula. Además, los mutantes produjeron cambios morfológicos y bioquímicos en las células hospederas compatibles con una transición epitelial a mesenquimatosa (EMT: Epithelial to mesenchymal transition), posiblemente facilitando la dispersión de los virus entre las células. Ratones inmunizados con los mutantes recombinantes expresando el antígeno del estado de circunsporozoito (CS) de Plasmodium yoelii, fueron capaces de inducir significante protección contra malaria. Nuestros hallazgos son importantes en el desarrollo de vacunas basadas en los mutantes atenuados del Virus Vaccinia.

Autor: BERENGUER HAYM MARINA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: La cirrosis por el virus de la hepatitis C constituye la principal indicación de trasplante hepático en la mayoria de centros trasplantadores. Pese a la recurrencia universal de la infección o viremia, la supervivencia a 5 años, tanto del injerto como del paciente, no difiere de la de grupos controles no infectados. Sin embargo, la mayoria de los pacientes desarrolla hepatitis cronica que con el tiempo progresa a cirrosis y fallo del injerto hasta en un 30% de casos tras cinco años de seguimiento. Es probable que con seguimientos más prolongados aumenta la incidencia de fallo hepático secundario a la hepatitis C recurrente. En efecto, la progresión histológica es significativamente más rapida en los paciente trasplantados que en aquellos inmunocompetentes, lo cual sugiere que el tiempo necesario para el desarrollo de cirrosis sea menor. Esta progresión histológica es, no obstante, variable y depende de la presencia o no de ciertos factores de riesgo, tales como la carga vírica pre-trasplante y el grado de inmunosupresión. Otros factores, tales como la coinfección por el virus de la hepatitis G, no desempeñan ningun papel en esta evolución. Los cambios en la inmunosupresión con la introducción de nuevos y potentes farmacos inmunosupresión con la introducción de nuevos y potentes farmacos inmunosupresores parece ser responsable del empeoramiento de la progresión de la hepatitis C recurrente observado en años recientes.

Autor: OTEGUI ZABALO M. MAGDALENA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: OBJETIVOS Puesta a punto de la técnica de reducción del número de placas (PRA), para el estudio de la sensibilidad in vitro al ganciclovir (GCV) y al foscarnet (FOS) de las cepas de herpesvirus humano tipo 5 (HHV-5) y al aciclovir (ACV) y al FOS de las cepas de herpesvirus humano tipo 3 (HVV-3). Puesta a punto de las técnicas de reducción del efecto citopático (REC) y de coloración vital (DUA), para el estudio de la sensibilidad in vitro al ACV y al FOS de las cepas de herpesvirus humanos tipo 1 y 2 (HHV-1 y HHV-2). Análisis de los valores de sensibilidad a los antivíricos de las cepas de HHV-1, HHV-2 y HHV-5 y comparación con la evolución clínica de los pacientes tras el tratamiento. MATERIAL Y MÉTODOS Se ha estudiado la sensibilidad de 204 cepas de HHV-1 y HHV-2 aisladas, por cultivo celular, de diferentes muestras de 165 pacientes inmunodeprimidos con manifestaciones clínicas de infección herpética. Los valores de sensibilidad al antivírico se expresan como dosis inhibitoria 50% (DI50) y se calculan mdiante el método de Spearman-Kärber cuando la técnica utilizada es la de REC y por un cálculo estadístico mediante una estimación lineal cuando se utiliza la de DUA. Asimismo, se ha estudiado la sensibilidad de 80 cepas de HHV-5 aisladas, por cultivo celular, de 73 pacientes con o sin patología de base y de nueve cepas de HHV-3 aisladas en cultivo celular de las muestras tomadas de las lesiones cutáneas de nueve pacientes. Los valores de DI50 se calculan mediante el método de Reed-Muench modificado descrito por Hoskins. RESULTADOS El 96% de las cepas de HHV-1 y HHV-2 estudiadas fueron sensibles a valores de DI50 del ACV inferiores a 3 ug/ml y todas fueron sensibles a valores de DI50 del FOS inferiores a 200 ug/ml. El 98% de cepas de HHV-5 fueron sensibles a valores de DI50 de GCV inferiores a 12 uM e inferiores a 400 uM en el caso del FOS. Todas las cepas de HHV-3 fueron sensibles tanto al ACV como al FOS. CONCLUSIONES 1,- La técnica de REC es sencilla y útil para estudiar la sensibilidad de los HHV-1 y HHV-2. 2,- La técnica de REC presenta una reproducibilidad del 87%. 3,- La adición de colorante vital en la técnica de REC añade complejidad a la técnica. 4,- Los valores obtenidos con las técnicas de REC y de PARA correlacionan con la evolución clínica de los pacientes. 5,- La frecuencia de HHV-1 y HHV-2 resistentes al ACV en pacientes inmunodeprimidos es baja (4%) y cuando se observa no es necesariamente indicativa de fallo terapéutica. 6,- La técnica de PRA para el estudio de la sensibilidad de los HHV-5 y HHV-3 es sencilla y requiere entre seis y ocho semanas lo que limita parcialmente su utilidad. 7,- La frecuencia de cepas de HHV-5 resistentes in vitro al GCV (4%) y al FOS (4%) en pacientes no tratados previamente es baja. 8,- No se detectó ninguna cepa de HHV-3 resistente al ACV o al FOS. 9,- Nuestra experiencia confirma que no es necesaria la realización de estudios de sensibilidad de los herpesvirus de forma rutinaria. El estudio de la sensibilidad de estos virus estaría indicado en las cepas aisladas de pacientes con alteraciones inmunológicas graves cuyas lesiones siguen evolucionando o empeoran estando en tratamiento con el antivírico.

Autor: DONOSO CUENCA INMACULADA.
Año: 2000.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MALAGA.

Resumen: Los geminivirus son virus de plata con un genomio de DNA circular de cadena sencilla, que contiene entre 6-8 genes. El gen Rep es el único gen viral esencial para su replicación. Este gen codifica una proteína multifuncional que se une específicamente al origen de replicación viral. La presencia de esta proteína en células vegetales induce la aparición de proteínas específicas de fase S. Esta indución se asemeja a la que ocurre en algunos virus animales (adenovirus, poliomavirus.etc.). Como en estos virus, la desregulación del ciclo celular podría implicar interacciones de la proteina Rep con proteínas celulares implicadas en control del ciclo. Utilizando la técnica de Two Hybrid System, hemos aislado una proteína de S. Pombe que interacciona con pRep, a la que hemos denominado Gip1. Se ha llevado a cabo el estudio funcional del gen en S. Pombe, donde se ha visto que su deleción es leta. La construcción de un mutante condicional para este gen ha permitido hacer un análisis funcional de la proteína. Mediante este análisis se ha observado que el mutante condicional, cultivado en condiciones de no expresión de Gip1, presenta un bloqueo en la fase G1 y además es incapaz de realizar citocinesis. Este fenotipo se corresponde con mutantes en la transición mitosis-interfase, también denominados sns(mutantes septados-no en fase S). Otra característica del mutantes condicional es la presencia de un septo más grueso que el control. El análisis en detalle de la estructura del septo mediante microscopía electrónica muestra esta anormalidad en la estructura del septo se manifiesta ya en los primeras etapas de su formación. La estructura y localización de la actina no presenta, sin embargo, anormalidades. La búslqueda de homólogos de este gen tanto informática como físicamente ha permitido concluir que el gen que codifica esta proteína está conservado en todos los eucariontes. Además se ha comprobado que el gen homólogo de A. Thaliana es capaz de complementar la deleción de gip1 em S.pombe, demostrando que existe una homología funcional entre ambos genes.

Autor: MARTINEZ NORA MARIELA.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: TT virus(ITV) es un virus descrito en 1997 que fue asociado como agente responsable de enfermedades hepaticas, se trata de un virus ADN monocatenario circular, carece de envoltura y tiene una longitud aproximada de 3800 nucleotidos. Puede ser transmitidos mediante una via parenteral, pero otras vias de transmision estan en estudio. Entre los objetivos figura conocer la prevalencia de TTV en poblaciones con y sin riesgo de transmisión parenteral en nuestro medio, su asociacion con enfermedad hepatica y con la confeccion con otros virus productores de hepatitis; el comportamiento ante el tratamiento con interferon. Asi como investigar la distribucion de genotipos, la variabilidad genetica y la persistencia viral. Se estudia la prevalencia de TTV en poblacion general, hemodializados, pacientes VIH, individuos con hepatitis B,C y de etiologia desconocida examinando y comparando los resultados obtenidos según se utilicen los primeros que detectan la region conservada 5´UTR o la region variable N22 confirmandose que la prevalencia es mayor cuando se detecta la region conservada. A su vez estos resultados se relacionaron con distintos parametros epidemiologicos y bioquimicos. Los individuos adictos a drogas por via parenteral infectados por VIH presentan una mayor prevalencia que la poblacion general. La comparacion entre distintas tecnicas como la secuenciacion y la RFLP demuestra que esta es una buena tecnica de screening que permite la deteccion de infecciones mixtas que podrian pasar desapercibidas por la secuenciacion. El genotipo 1 seguido del 2 se encuentra mayoritariamente en los aislamientos estudiados pudiendo quizas estar implicados en infecciones persistentes, a pesar de no haber encontrado una relacion significativa, parece que la infeccion por el genotipo 1 no protege frente a la infección por otros genotipos. Cuando se procede la detección del ADN en celulas mononucleares de sangre periferica se demuestra que pueden albergar variantes de TTV que no se encuentran en plasma. Se constata que la infeccion por TTV, no empeora el curso de la infeccion provocada por otros virus hepaticos.

Autor: PÉREZ ZARZALEJO M. CARMEN F..
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: MICROBIOLOGÍA I, FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Los PVH pueden estar relacionados con lesiones malignas que afectan al tracto anogenital, por ello es importante establecer su diagnóstico lo más precozmente posible. OBJETIVOS Poner a punto un protocolo para la detección y tipado de PVH y determinar la incidencia de la infección entres grupos: pacientes sospechosos de infección por PVH, coinfectados con VIH o no coinfectados y pacientes sin sospecha de infección. METODOS Hemos estudiado un total de 417 muestras genitales que pertenecen a 355 pacientes distribuídas en tres grupos de estudio. En todas ellas, después de extraer el ADN realizamos una PCR utilizando iniciadores consenso MY09 y MY11, que amplifican una región común de 450 pb. La tipación se llevó a cabo mediante la hibridación con sondas tipo específicas del producto amplificado y la utilización de enzimas de restricción. RESULTADOS Todas las muestras positivas lo fueron por los dos métodos de amplificación. El tipo predominante en el grupo de sospechosos no coinfectados con el VIH fue el PVH 6. Se encontró PVH 16, de alto riesgo, entre los no sospechosos de infección por PVH. Existen pacientes asintomáticos infectados. La presencia de PVH fue mayor en zonas con dilomatosas en que zonas con otro tipo de lesión y menor en zonas no lesionadas. CONCLUSIONES La PCR por su sensibilidad es apropiada para el diagnóstico de PVH en poblaciones asintomáticas. La tipificación llevada a cabo con sondas de hibridación es más objetiva aunque más laboriosa. La presencia de PVH es mayor en pacinetes VIH+. El estado de gestación no parece favorecer la infeccion por PVH. La toma de muestras no invasiva también es útil para el diagnóstico de PVH.

Autor: FOGEA MORENO MARTA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la replicación del virus GBV-C en tejido hepatico y celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP), así como la posible existencia de variantes del virus con diferente tropismo. Se analizó la presencia de la cadena genómica y antigenímica del ARN del GBV-C en muestras de suero, biopsias hepáticas y CMSP de pacientes con hepatopatias cronicas. La cadena genómica se detectó en 10/56 (18%) de los sueros analizados, pero en ningun suero se encontró la cadena antigenómica. Posteriormente se estudió la presencia de ambas cadenas en las muestras de hígado y CMSP de 7 de los pacientes con GBV-C ARN en suero. Mientras que la cadena genómica estaba presente en todas estas muestras, la cadena antigenómica solo se detecto en 6 de 7(85%) de las biopsias hepaticas. Demostrada la presencia de este virus en CMSP se estudió si estas celulas podian ser infectadas in vitro y si el GBV-C replicaba a esas condicoines. Se incubaron CMSP de 4 donantes sanos con un suero GBV-C ARN positivo. A las 4 horas post-incubación se detectó en las celulas la presencia de la cadena genómica, incrementándose su concentración durante la segunda y tercera semana de cultivo y permaneciendo detectable hasta el ultimo dia del mismo. La caena antigenomica se detectó a partir del septimo dia, siendo sus titulos 10 veces menores que los de la cadena genómica. Por hibridació in situ se observó que el GBV-C ARN se localizaba en el citoplasma celular. Tambien se comprobó que se liberaban el medio particulas virales completas. El analisis de las secuencias del GBV-C aisladas de los 4 cultivos de CMSP mostro que en todas ellas predominaba la misma secuencia, que era tambien la predominante en las CMSP del paciente cuyo suero fue utilizado como inoculo. Por último,al estudiar la composición de variantes del GBV-C aisladas en suero, higado y CMSP de 2 hepatopatas cronicos, que no habian recibido ningun tratamiento antiviral o inmunosupresor, se observó la existencia de variantes del GBV-C especificas para cada tipo celular estudiado. Estos resultados indican que el GBV-C es un virus hepatotropo capaz de infectar celulas hematopoyeicas y de replicar en las mismas al menos bajo condiciones experimentales. Además, existen variantes de este virus con dstinto tropismo tisular, tanto in vitro como in vivo.

Autor: AMARO ALONSO M.JOSE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En estudios previos se ha comprobado que en el higado de pacientes infectados con hepatitis cronicas viricas, hay un aumento del mRNA de la óxido nitrico sintasa inducible (iNOS), enzima responsable de la sintesis del oxido nitrico (NO) en los hepatocitos. Sin embargo, los mecanismos moleculares responsbles de este aumento en la transcripción del gen de la iNOS se desconoce. En la presente tesis doctoral, mediante el análisis de los niveles de mRNA de la iNOS, estudios de transactivacion del promotor y ensayos de retardo de la movilidad electroforética, se ha demostrado que la proteina pX del virus B de la hepatitis y la proteina core del virus C de la hepatitis transactivan el promotor de la iNOS hepática a traves de la via de señalizacion del factor de transcripción NF-kB. El aumento de los niveles del NO como consecuencia de la activación de la iNOS en las infecciones por ambos virus, podria tener importantes consecuencias patofisiologicas. En primer lugar, el NO provoca la disminución de la sintesis tanto de proteinas viricas como celulares, lo cual podria ayudar a estos virus a escapar a su detección por el sistema inmunológico, contribuyendo a la cronificación de estas infecciones. Por otro lado, niveles altos de No pueden alterar diversas proteinas y lipidos celulares, contribuyendo al daño hepatico en los pacientes con hepatitis cronicas viricas. Por útlimo, el incremento en lo niveles intrahepatocitarios de NO puede tener importantes consecuencias en relación al desarrollo de hepatocarcinoma, ya que el NO puede dañar directamente el DNA celular, inhibir los sistemas reparadores del daño en el DNA celular, inhibir la apoptosis e inducir cambios conformacionales y funcionales en la proteina supresora de tumores p53.

Autor: IGLESIAS DE USSEL PEREZ M.DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS U.A.M..

Resumen: Nos planteamos el objeto de estudior, en un modelo in vitro, el proceso de aparición de variantes del VIH-1 resistentes frente a distintas combinaciones de antirretrovirales. Para estudiar el proceso de emergencia de variantes resistentes hemos llevado a cabo la generación y selección de variantes mediante pases seriados en presencia de concentraciones crecientes de distintos antivirales (inhibidores de la retrotranscriptasa análogos y no análogos de nucleósido, inhibidores de la proteasa y la hidroxiurea), tanto individualmente como en algunas de las posibles combinaciones dobles y triples. Las variantes obtenidos fueron caracterizados genotípicamente, por secuenciación manual de las dos hebras del gen en estudio, tanto de la población global como, en algunos casos, de la cuasiespecie. También se llevó a cabo la caracterización del fenotipo, mediante titulación, determinación de la susceptibilidad a los inhibidores y, en algunos casos, determinación de la eficacia biológica. Hemos descrito un patrón de desarrollo de resistencia en el que la emergencia de variantes resistentes aparece generalmente asociado a un retraso en la aparición del efecto citopático. Este proceso parece tener un componente estocástico, seguir distintos caminos evolutivos, aunque próximos, y ser dinámico, por lo que una vez que se seleccionan variantes con una mutación de resistencia el proceso continúa hacia la adquisición de más mutaciones de resistencia al mismo pero también a otro de los inhibidores empleados en la combinación. Así, hemos podido comprobar que siempre que se utiliza la nevirapina emerge resistencia a este inhibidor y que, por el contrario, no hemos seleccionado ninguna variante resistente a estavudina. También hemos seleccionado variantes con mutaciones de resistencia no descritas previamente in vitro, aunque sí en pacientes tratados. En concreto, es de destacar la emergencia de una mutación de multirresistencia (Q151M), por primera vez descrita in vitro y tras la selección con un único inhibidor. Además, hemos obtenido una variante resistente a nevirapina más eficaz que el virus silvestre de partida en presencia pero también en ausencia del inhibidor.

Autor: OÑA BLANCO ANA M..
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: La infección picornavirus produce profundas alteraciones en las membranas celulares, tanto en la membrana plasmática como en las intracelulares. Dentro de estos cambios se pueden destacar los cambios de permeabilidad de la membrana plasmática, de forma que pierde su capacidad de barrera selectiva a determinados solutos, y la inhibición del tráfico vesicular, probablemetne debido al reclutamiento de membranas que forman los orgánulos de la ruta secretora. Se han implicado varias proteínas del virus de la polio como responsables de estos cambios. En el trabajo de la tesis doctoral se han expresado las proteínas del virus de la polio 2B, 2BC, 3A y un mutante de deleción de 2BC denominado 2Bc128 emdiante la utilización de un clon infeccioso del virus sindbis. La expresión de la proteína 2B y de la proteína 2BC y su mutante 2Bc128, producen un incremento en la permeabilidad de la membrana plasmática. La expresión de la proteína 3A, la proteína 2BC y su mutante 2Bc128 produce defectos en el procesamiento, maduración y transporte de glicoproteínas a lo largo de la ruta secretora hasta la membrana plasmática. El aumento de permeabilidad inducido por las proteínas 2B y2BC es inhibido específicamente por el inhibidor de la ruta secretora brefeldina y no por otros inhibidores. Este resultado indica una relación entre el incremento de permeabilidad inducido por el virus y la necesidad de un proceso de transcurre en la ruta secretora y que es específicamente inhibido por el compuesto brefeldina.

Autor: ALVAREZ LAFUENTE ROBERTO.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARIO SAN CARLOS.

Resumen: La esclerosis múltiple es una enfermedad inflamantoria del SNC que afecta a personas jóvenes predispuestas genénicamente y que estarían expuestos en la infancia a un agente ambiental de cáracter viral que ocasionaría una disfunción del sistema unmunológico, que desarrollaría una acción autolesiva dirigida fundamentalmente contra la sustancia blanca, que llevaría a la inflamación y desmielinización propias de este enfermedad. Para detectar este posible agente ambiental se ha realizado la reacción en cadena de la polimerasa(PCR) en muestras de sangre total en enfermos diagnosticados de esclerosis múltiple para detectar la presencia de genomas de virus herpes. Los resultados obtenidos se compararon con los conseguidos al realizar la PCR en muestras provenientes de donantes de sangre sin ninguna disfunción neurológica. Como controles positivos externos se emplearon los genomas purificados de los virus estudiados; como controles positivos internos, la amplificación del gen de la beta globina, y control negativo, agua en lugar de muestra. El apareamiento de las muestras se realizó teniendo en cuanta el sexo y la edad de los pacientes y de los donantes. Los resultados obtenidos nos mostraron que existia una diferencia estadísticamente significativa(p=0,0001)entre la prevalencia de ADN para el Herpesvirus humano6(HVH6) en enfermos de esclerosis múltiple y el grupo control formado por donantes de sangre: 49,02% frente a un 21,57%. Esto nos lleva a concluir que HVH6 puede ser el factor ambiental desencadenante de la esclerosis múltiple. No existen diferencias en cuanto a sexo y edad.

Autor: CASADO HERRERO CONCEPCION.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El trabajo realizado se ha centrado en el análisis de la variabilidad genética asociada al VIH-1 mediante el análisis de las secuencias nucleotídicas del virus obtenidas de distintos pacientes infectados. Para ello se realizaron tres estudios: - En primer lugar se analizó la diversidad genética existente entre los virus circulantes en dos Comunidades españolas. A partir de los datos obtenidos determinamos que mayoritariamente en nuestro país están circulando virus pertenecientes al subtipo B del VIH-1, y que la diversidad genética existente entre los virus analizados es muy elevada con un valor de divergencia media del 13.9%. - En un segundo estudio analizamos la evolución de los virus circulantes en España con respecto al tiempo y a la posible circulación de distintas variantes víricas en pacientes con distintas prácticas de riesgo. Este análisis nos permitió establecer que en la población analizada se estaba produciendo un incremento en la diversidad genética con respecto al tiempo del 0.5% por año. Además, constatamos que este incremento se estaba produciendo fundamentalmente a través de la acumulación de mutaciones no sinónimas. Establecimos también que en nuestro país no existe una diferenciación genética entre las variantes que están circulando en pacientes con distintas prácticas de riesgo, en clara contraposición con lo que ocurre en otros países europeos. - Por último, analizamos la diversidad genética del virus presente en distintos pacientes y su evolución a lo largo de la infección. Este tipo de análisis nos permitió establecer dos modelos de evolución del virus en los pacientes infectados. El modelo I se caracteriza por la coexistencia de subpoblaciones independientes y altamente divergentes en la cuasiespecie. La replicación y evolución de estas subpoblaciones parece ser independiente indicando una posible compartimentalización de la infección en estos individuos. Este tipo de evolución se asocia a pacientes con mayor tiempo de infección por VIH-1, lo que podría indicar un mejor pronóstico clínico para los individuos encuadrados dentro de este modelo de evolución. El modelo II se caracteriza por la presencia de cuasiespecies altamente heterogéneas constituidas por variantes víricas altamente relacionadas, en las que no es posible definir subpoblaciones independientes. En este modelo todas las variantes víricas parecen haberse originado a partir de un único ancestro común.

Autor: MUÑOZ LABIANO M. DELIA.
Año: 1998.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: El Nucleopolyhedrovirus de Spodoptera exigua tiene especificidad absoluta para las larvas de su huésped natural, y se encuentra entre los baculovirus con mayor actividad insecticida. Esta tesis presenta la caracterización genética biológica de algunas de las cepas salvajes de este virus. El objetivo ha sido analizar las características insecticidas de las variantes genotípicas particulaes que las componen y evaluar el impacto que produce la introducción de cepas foráneas en poblaciones del huésped afectadas por cepas autóctonas del virus. Se contruyó el mapa físico del genotipo más frecuente de la cepa tipo y se utilizó como referencia para localizar las alteraciones genéicas que componen una cepa originaria de Almería y una cepa originaria de Florida (EEUU), esta última forma el ingrediente activo del bioinsecticida Spod-X. En la cepa de Florida se detectó la presencia de dos variantes defectivas y se demostró que actuaban como variantes parásitas en la población viral. Otras variantes mostraron diferencias de patogenicidad y virulencia. El análisis de la descendencia viral resultante de coinfecciones con una mezcla de dos cepas distintas puso de manifiesto: (1) que si en una de las cepas existen variantes defectivas, éstas prevalecen en la población viral llegando a alcanzar frecuencias elevadas que afectan a la actividad insecticida del virus, y (2) que como resultado de la recombinación entre variantes genotípicas se producen nuevos genotipos que, en determinadas condiciones, llegan a desplazar a los genotipos parentales.

Autor: GALINDO BARREALES INMACULADA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo hemos estudiado la naturaleza del receptor celular del virus de la peste porcina africana y el ciclo de infección viral en varias líneas celulares permisivas y resistentes, con objeto de correlacionar la expresión del receptor en las células y su susceptibilidad a la infección por el virus. Los datos obtenidos indican que el receptor celular del VPPA es una proteína y que ni lípidos ni carbohidratos están implicados en la interacción entre la proteína de adosrción viral y el receptor celular. El estudio de los pasos sucesivos en el ciclo de infección de 16 líneas celulares distintas procedentes de diversas especies susceptibles o no a la infección demostró que la presencia de receptores específicos es necesaria, pero no suficiente, para garantizar la susceptibilidad de las células al VPPA y que la infección viral puede ser bloqueada en diferentes pasos del ciclo infectivo. Por otro lado, hemos caracterizado dos genes virales que contienen en su secuencia el tripéptido Arg-Gly-Asp, esta secuencia se ha descrito en algunas proteínas de origen viral implicadas en adsorción o intermalización del virus. El gen B438L codifica una proteína de 49.3 kDa que se traduce a tiempos tardíos de la infección y se localiza en las factorias virales. Hemos demostrado su presencia en la partícula viral purificada, no encontrándose evidencias de su posible papel en la entrada del VPPA. El gen EP153R codifica una glicoproteína de membrana de tipo II con una región C-terminal extracelular que contiene un dominio tipo lectina C animal. Hemos generado un VPPA recombinante con el gen EP153R inactivado, demostrando así que este gen es dispensable para la replicación del virus en cultivo. Aunque la inactivación del gen no afectó a la replicación viral si afectó a la capacidad del VPPA de inducir la adsorción de eritrocitos de cerdo a las células infectadas, sugiriendo un papel de la proteína en la hemadsorción. Dada la homología de la proteína con las moléculas CD44 hemos propuesto una función similar a la descrita para estas moléculas en el sistema de eritrocitos y linfocitos humanos, como es la de estabilizar la unión entre el CD2 viral y su correspondiente ligando en el eritrocito de cerdo..

Autor: GARRIDO JURADO JUAN JOSE .
Año: 1997.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Y FISIOLOGIA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR Y FISIOLOGIA.

Resumen: Las neuronas cocleovestibulares transmiten los estítulos auditivos desde el epitelio sensorial del oído interno hasta el sistema nervioso central. El desarrollo de las neuronas cocleovestibulares y la interacción con el epitelio sensorial está regulado por factores neurotróficos. Los resultados obtenidos muestran que las neuronas cocleares y las vestibulares dependen del BDNF para su supervivencia. Esta dependencia se adquiere a los 7 días de desarrollo y la respuesta neuritogénica es máxima a los 8 días. En estadios posteriores la respuesta de BDNF disminuye y es muy débil a los 15 días de desarrollo. La transferencia de los genes de las neurotrofinas y sus receptores mediante vectores víricos basados en el virus herpes permite una eficaz expresión de los mismos. Los resultados muestran que las neuronas cocleares sobreviven al ser infectadas con un virus bdnf. El estudio muestra que las neuronas cocleares no dependen del NGF para su supervivencia. La transferencia del gen de su receptor de alta afinidad, TrKA, permite generar una respuesta biológica al NGF. El FGF básico se expresa en el epitelio sensorial vestibular y es un factor de supervivencia para las neuronas vestibulares en estadios de desarrollo posteriores a los de actuación de BDNF (12 y 13 días) y ambos factores (BDNF y FGFb) tienen efectos aditivos en el mantenimiento de la supervivencia hasta los 13 días de desarrollo de las neuronas vestibulares. El hecho de que a partir del día 14 de desarrollo estos factores no mantengan la supervivencia de las neuronas cocleares y vestibulares sugiere la necesidad de una interacción funcional con el epitelio sensorial.

Autor: RODRIGUEZ RIVERA ANTONIO.
Año: 1997.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: MICROBIOLOXIA E PARASITOLOXIA PROGRAMA DE DOCTORADO: ECOLOXIA, PATOLOXIA E BIOTECNOLOXIA MICROBIANAS.

Resumen: El conocimiento de la diversidad genética del virus de la Hepatitis C tiene una especial relevancia, no solo en el aspecto epidemiológico, sino también por su utilidad clínica. La respuesta a los tratamientos de que disponemos actualmente (en especial al Interferón Alfa) y la evolución clínica, parecen depender del genotipo vírico que infecta al paciente. El objetivo del presente estudio fue conocer los genotipos del VHC presentes en Galicia, determinar su prevalencia según el factor de riesgo, estudiar las diferencias en la respuesta serológica según el genotipo y serotipo y realizar un análisis comparativo de un método de genotipado y otro de serotipado. Se incluyeron en el estudio un total de 162 pacientes procedentes del área sur de Galicia diagnosticados de Hepatitis C. Todos presentaban anticuerpos frente al VHC y RNA del virus detectable en suero mediante RT-PCR. El genotipo predominante en nuestra área sanitaria fue el 1b, siguiendo en orden de prevalencia los genotipos 1a, 3a, 4a y 2. El subtipo 1a predominó en ADVP, mientras que el 1b fue más frecuente en los pacientes de riesgo no conocido y en los que habían recibido transfusiones. De los pacientes a los que se practicó la prueba de serotipado, en el 78,8% se encontraron anticuerpos frente a uno o más serotipos. De ellos el más frecuente fue el 1, siendo asimismo el prevalente en todos los grupos de riesgo, seguido de los serotipos 3 y 4. Fue significativamente superior el número de pacientes no serotipados (21,2%) que los no genotipados (2,3%), y también se detectó mayor número de infecciones mixtas con el serotipado que con el genotipado. La sensibilidad global de la prueba de serotipado (capacidad para detectar anticuerpos tipoespecíficos en pacientes con genotipo conocido) fue del 79,8%, sin diferencias significativas entre genotipos, siendo la concordancia entre ambas pruebas próxima al 100%. El método de serotipaje, que es mas sencillo de realizar, puede ser un abordaje atractivo para simplificar la detección del tipo de VHC que infecta al paciente, sin embargo la imposibilidad de distinguir subtipos dentro de cada serotipo constituye una limitación de la prueba que puede afectar tanto al conocimiento de la epidemiología como a su utilidad clínica, debido a la incapacidad de diferenciar la infección por el subtipo 1b que parece asociarse a una peor respuesta al Interferón y tiene mayor tendencia a desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.