VIROLOGIA ANIMAL

Autor: RAMÍREZ DE PAZ MIGUEL ÁNGEL.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Existen diversas vacunas frente a la mixomatosis basadas en cepas de virus mixoma atenuadas en cultivos celulares. También existen vacunas frente a la enfermedad hemorrágica del conejo basadas en virus inactivado. Dichas vacunas han demostrado su eficacia en el control de ambas enfermedades en explotaciones de conejos domésticos, pero no resultan adecuadas para proteger las posibilidades de conejos silvestres. La vacunación de animales silvestres resulta una tarea difícil puesto que en muchos casos no son viables los métodos convencionales de administración inidividual de la vacuna. Una alternativa posible es el empleo de vectores virales capaces de transmitirse a través de una población animal. Este abordaje resulta especialmente indicado para la administración de inmunógenos en aquellas poblaciones de animales silvestres cuya distribución, tamaño y tasa de renovación de la población considerada imposibilita el uso de las técnicas de captura o el empleo de cebos como métodos para administrar vacunas. El conejo Europeo (Oryctolagus cuniculus) es un ejemplo de éste tipo de población. Teniendo en cuenta éstas premisas, hemos estudiado la posibilidad de vacunación de conejos silvestres frente a mixomatosis y enfermedad hemorrágica del conejo mediante el empleo de un recombinante MV-VP60 capaz de difundirse por la población de conejos mediante transmisión horizontal. El virus recombinante mixoma-RHDV se basa en una cepa de campo del virus mixoma, denominada cepa 6918, que fue seleccionada por sus especiales características de resultar no virulenta en conejos y ser al mismo tiempo capaz de transmitirse de un conejo a otro. Para construir el virus recombinante se insertó el gen de la proteína VP60 del virus RHDV en el genoma de la cepa 6918 del virus mixoma. La VP60 es la proteína estructural mayoritaria del virus RHDV y ha demostrado ser altamente inmunógena y capaz de conferir protección total frente a dosis letales del virus RHDV, al ser suministrada a conejos inoculada o por vía oral. Junto con el gen de la proteína RHDV se insertó un marcador molecular que permitía la diferenciación de conejos inmunizados con la vacuna recombinante de los conejos infectados por cepas de campo del virus mixoma o el virus RHDV. Se han evaluado algunos aspectos de la seguridad del virus recombinante en condiciones de laboratorio, como la administración de una sobredosis, la administración de la vacuna en conejos inmunodepreimidos, y se ha hecho un análisis de la estabilidad biológica de la vacuna. Por último se ha realizado una evaluación de la seguridad recombinante 6918VP60T2 durante un ensayo de campo en una zona acotada a tal efecto. El objetivo a lograr sería que la captura, vacunación directa y suelta de unos pocos ejemplares de la población considerada, conllevara la inmunización de una fracción suficiente de los animales de la población como para reducir la incidencia de ambas enfermedades en el campo.

Autor: FERNÁNDEZ ZAPATERO PATRICIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El virus de la Peste porcina africana (VPPA) es el único miembro actualmente clasificado dentro de la familia Asfarviridae. Provoca una severa enfermedad en los cerdos de granja que induce la muerte del animal infectado en menos de 10 días. Esta enfermedad se caracteriza por una inmunosupresión y una inducción del proceso apoptótico tanto en las células diana del virus (monocitos y macrófatos) como en los linfocitos (Ramiro-Ibáñez y col., 1996; Ramiro-Ibáñez y col., 1997). Esta tesis doctoral se centra en el estudio de los mecanismos reguladores desarrollos por el virus para el control del proceso apoptótico. Se conocen varias proteínas codificadas por el virus que inhiben la muerte celular programada en las células infectadas (genes A179L, A224L, DP71L). El gen A179L codifica la proteína p21 (Neilan y col., 1993; Brun y col., 1996; Brun y col., 1998) que es homóloga a la proteína Bcl-2 celular (familia Bcl-2/Cd-9). En esta tesis doctoral se describe la interacción de ésta con los fragmentos activos de la proteína pro-apoptótica Bid (familia Bcl-2/Ced-9). Bid actúa a nivel de la cascada de transducción de señales inducida por los receptores de muerte celular (TNFR, Fas, etc) que activa la vía mitocondrial de la apoptosis. El virus utilizaría la proteína viral p21 para protegerse de la activación del proceso de la muerte celular programada incitado por citoquinas como el TNFalfa, que son sintetizadas por el sistema inmune del animal infectado. En este trabajo también se describe, por primera vez en la literatura, uno de los posibles mecanismos utilizados por el VPPA para la inducción temprana de la apoptosis en la célula infectada. Durante las primeras etapas del ciclo viral hemos detectado el desplazamiento de la proteína pro apoptótica Bim (familia Bcl-2/Ced-9) de su unión a microtúbulos. Esta liberación permite la translocación de Bim hacia las mitocondrias dónde activará la salida de los mediadores mitocondriales (Citocromo c, AIF, Smac) que inducirán el proceso apoptótico. En esta tesis se describe la interacción directa entre la proteína viral p54 y la Dineína celular de cadena ligera DLC8. El dominio de interacción de p54 con DLC8 (Alonso y col., 2001; Rodríguez-Crespo y col., 2001) es también compartido por Bim (Puthalakath y col. 1999) lo que provoca su secuestro e inactividad en el citoplasma. Por otro lado, el VPPA provoca la activación de la apoptosis en linfocitos (Ramiro-Ibañes y col., 1996, Oura y col., 1998). En esta tesis se describe cómo la síntesis, por parte de macrófagos infectados, de diferentes mediadores solubles pro-apoptóticos son una de las posibles causas de este proceso. Se demuestra, además, que la citoquina TNFalfa es uno de los responsables de la muerte linfocitaria.

Autor: GARCÍA ARRIAZA JUAN FRANCISCO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM.

Resumen: En esta Tesis doctoral se ha documentado la selección de variantes virales del virus de la fiebre aftosa (VFA) C3Arg/85 después de un solo proceso de infección en células BHK-21 parcialmente resistentes, procedentes de células persitentemente infectadas, en las que ha sido eliminado el VFA mediante tratamiento con ribavirina (células denominadas BHK-Rb). Tras 8-10 días post-infección se liberaron virus variantes, denominados virus C3-Rb. Los virus C3-Rb seleccionados mostraron un incremento de virulencia para células BHK-21, fueron capaces de superar la resistencia a la infección por parte de las células BHK-21 modificadas (BHK-Rb) y adquirieron la capacidad de unir heparina e infectar células CHO. Una comparación de las secuencias genómicas completas del virus parental C3Arg/85 y de los virus variantes C3-Rb, reveló solo dos cambios de aminoácido (Asp-9 Ala en VP3 y o bien Gly-110 Arg o His108 Arg en VP1), localizados en la superficie de la partícula viral, en el eje de simetría de orden 5, representando un aumento de cargas positivas en la superficie del virión. También se ha documentado, por primera vez, la generación y caracterización de partículas defectivas interferentes que complementan entre sí, obtenidas tras 260 pases seriados del clon de VFA C-S8c1 a alta multiplicidad de infección en células BHK-21. Se ha estudiado una población, denominada C-S8p260, rica en genomas defectivos, que muestra niveles indetectables de genomas de tamaño estándar (los genomas defectivos son, al menos, 10000 veces más abundantes que los genomas de tamaño estándar). El análisis de secuencia reveló que esta población contiene tres diferentes RNAs defectivos que incluyen deleciones dentro de la región codificante de la proteasa L y de la región codificante de las proteínas de la cápsula, y retienen el marco de lectura abierto del genoma viral. Un análisis mediante gradiente de sacarosa y microscopia electrónica mostró que los genomas defectivos están encapsidados en partículas cuyo tamaño es indistinguible del de las partículas estándar. La comparación de la cantidad de RNA mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real y la cantidad de partículas virales mediante microscopía electrónica cuantitativa, indicó que cada partícula viral encapsida un genoma defectivos. Estos genomas defectivos encapsidados son partículas defectivas interferentes (DIs), puesto que son capaces de interferir con al replicación de virus estándar. Hay una correlación inversa entre el grado de interferencia y la eficacia biológica relativa del virus estándar interferido. Las partículas DIs pueden formar placas en una monocapa de células BHK-21 y varias líneas de evidencia prueban que las partículas DIs pueden complementar entre sí y producen una infección productiva en ausencia de virus estándar la infectividad fue reproducida mediante electroporación de células BHK-21 con dos transcritos defectivos de RNA, en ausencia de RNA estándar, esta es la primera descripción de partículas DIs del VFA que pueden replicar y mantenerse establemente y tras pases seriados a alta multiplicidad de infección en cultivos celulares mediante complementación en ausencia de partículas infecciosas estándar. Estos resultados representan una primera evidencia experimental de la transición evolutiva hacia segmentación múltiple de un virus RNA no segmentado.

Autor: PARIENTE PEÑAMARÍA NONICA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHEA".

Resumen: Estudios anteriores hechos en el laboratorio con el virus de la fiebre aftosa (VFA) demostraron la posibilidad de extinguir el virus de forma estocástica en presencia de mutágenos. La extinción del VFA estaba acompañada por un incremento en frecuencia de mutación y era más frecuente cuanto menores eran la eficacia biológica del virus y la carga viral empleada. Estos resultados sugerían que la combinación de un mutágeno con inhibiciones podría incrementar la eficiencia de extinción viral. La demostración de esta predicción ha sido el objetivo principal de esta Tesis Doctoral. Tratamientos con combinaciones del mutágeno 5-fluorouracilo (FU) y los inhibidores cloruro de guanidino (G) y heparina (H) produjeron extinciones sistemáticas incluso de VFAs de alta eficacia biológica. Para analizar la posible ventaja, en cuanto a la eficiencia de extinción del VFA, de tratamientos que contienen un mutágeno frente a tratamientos que no, se comparó la extinción del VFA en presencia de tratamientos que contenían Fu, G y/o o de combinaciones de sólo G y H. En poblaciones de baja eficacia biológica se aislaron mutantes resistentes a G y/o H sólo en ausencia de FU. El tratamiento con FU, G y H previno la selección de mutantes de escape en todos los casos analizados, y la extinción de VFA de alta eficacia biológica no se pudo conseguir con combinaciones de G y H, a pesar de que ejerciesen el mismo efecto inhibitorio en un pase. Además, se identificaron cuatro mutaciones que confieren resistencia a G en la proteína no estructural 2C mediante su inserción en clones infecciosos de VFA y estudio del fenotipo de los virus recombinantes. Se analizó la contribución a la extinción de la inhibición de la síntesis de RNA viral mediada por FU; descensos de 100 veces en la producción viral fueron acompañados de descensos de 10 veces en la cantidad de RNA viral, sugiriendo que la mayor parte del RNA obtenido tras un pase en presencia de FU no es infeccioso. El análisis del espectro de mutantes de varias regiones del genoma del VFA de una población preextinción mostraron un aumento estadísticamente significativo del número de mutaciones en comparación con un virus crecido en paralelo en ausencia de mutágeno. Un análisis de los niveles intracelulares de ribonucleótidos trifosfato demostró que, en presencia de FU, los niveles de UTP están disminuídos, los de GTP algo aumentados y el ATP y CTP permanecen en niveles normales. FU es eficientemente incorporado en células BHK-21 y convertido en FUTP, alcanzando niveles entre 12 y 15 veces superiores a los de UTP.

Autor: SÁNCHEZ MORGADO JOSÉ MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: En esta memoria se describe la amplificación del RNA de minilgenomas sintéticos derivados de RNA defectivos del virus TGEV por distintos virus complementadores con especificidad de tejido. Se seleccionaron un virus complementador totalmente atenuado con tropismo exclusivamente respiratorio, el aislado PUR46-PTV, y un virus complementador atenuado con tropismo respiratorio y entérico, el aislado PUR46-MAD. La amplificación del RNA del minigenoma M39 se asoció con los virus complementadores que replicaban con altos títulos y con la presencia de un motivo estructural de RNA alrededor del nucleótido 344 en el extremo 5' del RNA del minigenoma. Mediante la construcción de virus TGEV recombinante, se determinó que el determinante del tropismo entérico en el virus TGEV se localiza entorno al aminoácido 219 de la proteína S. Asimismo, se demostró que diferentes aislados del virus TGEV infectan células derivadas de mono (Vero) lo que significa un salto de la barrera de especie. Dependiendo del aislado del virus TGEV, se observó una infección lítica (PUR46-C11) o persistente (PUR46-MAD y PUR46-PTV). La infección lítica se asoció a la inducción de sincitios, mientras que en la infección persistente no se detectó una alteración aparente de las células infectadas. La proteína de la espícula fue la responsable de la inducción de sincitios. Utilizando las construcciones de los virus TGEV recombinantes, se determinó que un cambio de aminoácido, de glutamina a histidina, en el residuo 32 es sufienciente para conferir el fenotipo de fusión de membranas al aislado PUR46-PTV del virus TGEV. Para realizar estudios sobre las bases moleculares del tropismo y al mismo tiempo para generar un vector que induzca inmunidad frente a la infección por el virus PEDV se construyó un clon infectivo del virus TGEV con la proteína S del virus PEDV (TGEV-SPEDV/C11).

Autor: ESCORS MURUGARREN DAVID.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC).

Resumen: El virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV) es un miembro de la familia de los coronavirus y contiene un RNA genómico de 28.5 kb unido a la proteína N, formando una nucleocápsida helicoidal que a su vez se organiza en una cápsida interna esférica. La cápsida está envuelta por la membrana del virus en la que se encuentran la proteína S, que forma la peplómeros del virus, la proteína E (de envuelta) y la proteína M (de membrana). En 1996 nuestro grupo identificó una cápsida interna del virus, compuesta por el RNA del virus y las proteínas estructurales N y M. Este resultado fue inesperado dado que la proteína M es una proteína integral de membrana, y con el objetivo de explicarlo se llevó a cabo esta tesis doctoral. Durante la tesis se ha demostrado que existen dos poblaciones de moléculas de proteína M en la envuelta del virus, atendiendo a la topología que adoptan. Dos tercios de las moléculas adoptan una topología Nexo-Cendo, es decir, con el extremo amino de la proteína expuesto en la superficie del virión y el extremo carboxilo en el interior, y un tercio en topología Nexo-Ceno, con los extremos amino y carboxilo expuestos en la superficie del virión. Se demostrón que el extremo carboxilo de la proteína Nexo-Cendo forma parte estructural de la cápsida interna, ya que interacciona con ella y estabiliza su estructura. Al eliminarse la proteína M de las cápsidas purificadas, estas se desensamblaron dando lugar a la nucleocápsida helicoidal del virus. En cambio, la proteína M con topología Nexo-Cexo se pierde durante la disolución de la envuelta del virus debido a que expone el extremo carboxilo en la superficie del virión. Adicionalmente se estudiaron las posibles modificaciones post-traduccionales de la proteína de la nucleocápsida (N) en las distintas estructuras del virus. Se encontraron dos posibles fosforilaciones en la proteína N, una de ellas presente en todas las estructuras del virus y situada en un dominilo central importante para la unión de la proteína con el RNA, y la otra situada en el extremo amino, en un 15% de las moléculas de proteína N del virión. Adicionalmente se abordó la composición en RNA del virión, y en concreto, la encapsidación del RNA. Se demostró que el virus encapsidaba específicamente el RNA genómico y no los RNAs mensajeros del virus. Se identificó una señal de encapsidación en el extremo 5' del genoma del virus. A partir de los datos obtenidos en esta tesis doctoral se ha propuesto un modelo de trabajo de la estructura del virión TGEV. En este modelo se propone que dos tercios de la proteína M de la envuelta, con topología Nexo-Cendo, interaccionan con la cápsida interna a través del extremo carboxilo de la proteína M, siendo esencial para la estabilidad de la cápsida interna. Un tercio de las moléculas de proteína M, con topología Nexo-Cexo no interaccionan con la cápsida interna y se pierden durante la disolución de la envuelta viral y purificación de la cápsida. Además, se discute la implicación de las posibles fosforilaciones detectadas en la proteína N, que pudieran regular su unión con el RNA del virus. Finalmente se propone la generación de vectores bioseguros basados en la genoma del virus en el que se delecionan genes estructurales esenciales y se relocaliza la señal de encapsidación en las deleciones.

Autor: ALONSO VILLANUECA SARA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA. CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC) .

Resumen: En esta memoria se describe la caracterización de las secuencias reguladoras de la transcripción (TRSs) del virus TGEV utilizando un sistema de expresión basado en minigenomas dependientes de virus complementador, así como el desarrollo de vectores de expresión capaces de inducir una respuesta inmune frente a antígenos de interés en salud animal y humana. La optimización de la expresión de genes heterólogos con minigenomas derivados del virus TGEV se hizo mediante la optimización de las secuencias TRS, estudiando el efecto de las secuencias que flanquean a la secuencia conservada (CS) en su extremo 5' (5' TRSs) y 3' (3' TRSs) y el efecto de la posición de un módulo de expresión en el minigenoma. Se ha estudiado la estabilidad de los minigenomas que expresan genes heterólogos y la inducción de respuesta inmune in vivo frente a los genes GUS y la ORF5 del virus PRRSV utilizando minigenomas derivados del virus TGEV. Se ha diseñado un vector viral basado en el genoma del coronavirus TGEV utilizando un cDNA infectivo de este virus y se ha analizado la expresión de genes heterólogos bajo el control de distintas secuencias TRS.

Autor: FERNÁNDEZ GARCÍA AURORA.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La Tesis Doctoral se ha dirigido a la expresión de la proteína GP5 del Virus del Síndrome Reproductor y Respiratorio Porcino (VSRRP) en diferentes sistemas y su caracterización. La proteína GP5 está codificada por la ORF5 del genoma del VSRRP, es la glicoproteína mayoritaria de la envoltura del virión y posee epítopos antigénicos implicados en la inducción de anticuerpos que neuralizan la infección por el VSRRP, por lo que es de gran interés para el desarrollo de posibles vacunas frente a la enfermedad. El primer objetivo de esta Tesis se centró en la producción de la proteína GP5 en un sistema eucariota que asegurar las modificaciones postraduccionales de la misma. Para ello se utilizó como vector de expresión un virus de la enfermedad de Aujeszky (ADV) recombinante de fenotipo TK negativo y gE negativo, de similares características a las vacunas atenuadas utilizadas en la actualidad en las campañas de control de la enfermedad. Así se insertó mediante recombinación homóloga la ORF5 de una cepa española del VSRRP bajo el control del promotor de la proteína temprana gG de ADV, en el lugar del gen que codifica la gE del ADV, y se obtuvo el virus PRV7. La expresión de la proteína se pudo determinar por inmunoflurescencia indirecta en células PK 15 infectadas con el virus. Los resultados obtenidos sugieren que el virus PRV7 podría ser utilizado como un posible producto vacunal bivalente frente a las dos enfermedades. Aun así la expresión de la proteína GP5 obtenida en sistemas eucariotas es poco eficiente y esto podría relacionarse, al menos en parte, con la capacidad de inducir apoptosis de la citada proteína dleVSRRP. Así se abordó el siguiente objetivo de la Tesis Doctoral con el fin de estudiar las regiones de la proteína GP5 implicadas en la inducción de apoptosis y obtener mutantes que carecieran de las mismas y no fueran letales para las células para mejorar la eficiencia de la expresión. Para ello se construyeron diferentes mutantes de deleción a partir de la ORF5 de una cepa española del VSRRP y se midió su inducción de apoptosis en células BSC-40 utilizando un ensayo de infección-transfección en el que el virus de la vacuna dirige la expresión de las proteínas de interés junto a dos proteínas marcadoras: luciferasa y cloranfenicol acetil transferasa (CAT). La medida de inducción de muerte se realizó en función del efecto que la expresión de las regiones de la proteína GP5 tenía sobre las proteínas marcadoras. De este modo se pudo concluir que las secuencias implicadas en la inducción de apoptosis por parte de la proteína GP5 del VSRRP, se encuentran situadas en los 119 aminoácidos iniciales de la misma y que los 82 aminoácidos no son necesarios para inducir el fenotipo de muerte. Sin embargo la expresión de estos últimos aminoácidos no demostró una mayor eficiencia que los demás. Por este motivo así como las ineficiente expresión descrita para la proteína GP5 del VSRRP al utilizar sistemas eucariotas se abordó el último objetivo de la Tesis Dcotoral basado en la produción de la proteína GP5 en un sistema procariota, en células de C. Coli y su caracterización antigénica. La proteína obtenida por electroelución se utilizó para inmunizar conejos a partir de los cuales se obtuvo un suero policlonal dirigido frente a la proteína GP5r procesa en condiciones desnaturalizantes. Este suero reconoció la proteína GP5 en células MARC-145 infectadas por el VSRRP en forma dependiente de la dosis y neutralizó la infección del VSRRP in vitro. Estos resultados sugieren que la proteína GP5 del VSRRP puede ser una buena candidata para el desarrollo de vacunas frente a la enfermedad, aspecto que en el futuro ha de ser evaluado.

Autor: ESCRIBANO ROMERO ESTELA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: El virus de la enfermedad vesicular del cerdo (VEVC) es un enterovirus de la familia Picornaviridae. En la actualidad se dispone de pocos datos acerca de los mecanismos implicados en la entrada de este virus en la celula. El heparán sulfato (HS) interviene en la unión celular de un numeroso grupo de virus animales y humanos entre los que se encuentran otros picornavirus, como el virus de la fiebre aftosa (VFA) y el echovirus 6, además de varios representantes de la familia de los herpesvirus (VZV, HSV-1,etc), virus de la hepatitis C y papilomavirus 11. Los experimentos realizados en este trabajo indican que el VEVC se une a este glicosaminoglicano (GAG) en el proceso de la entrada a la célula hospedadora. Esta interacción es fundamentalmente de naturaleza electrostática, siendo mucho menor cuando el GAG esta desulfatado. La adición de HS/heparina soluble al medio antes o durante la adsorción inhibe la infección, pero no si se añade despues de esta, lo que indica que la interación con el HS tiene lugar en un proceso temprano de la entrada. Al igual que sucede con otros virus, el HS de la membrana actuaría como un co-receptor celular, siendo el receptor principal el CAR. Con el fin de localizar y caracterizar el sitio de la unión del GS al en la capsida viral, se generaron mutantes del VEVC que escapan de la inhibición de la infección por heparina. Se analizó la unión de estos mutantes al HS y a la heparina mediante la técnica del BIAcore TM, observando que todos ellos habian perdido la afinidad por estos GAGs. Tras secuenciar la region del RNA correspondiente a las proteinas estructurales de estos mutantes, se localizó y carácterizó el sitio de la capsida del virus implicado en la unicón a heparina y a HS.

Autor: SIERRA ARAGÓN SALETA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: Infecciones sucesivas del virus de la fiebre aftosa (VFA) en cultivos celulares en presencia de los agentes mutagénicos 5-fluorouracilo ó 5-azacitidina produjeron descensos de la infectividad viral y, ocasionalmente, fenómenos de extinción del virus. Las cargas virales bajas aumentaron la frecuencia de extinción del virus. Infeciones de varios clones de VFA con distintos valores de eficacia biológica relativa (valores que diferen en hasta 10 5 veces) en presencia o ausencia de 5-fluorouracilo ó 5-azacitidina pusieron de manifiesto que bajos valores de eficacia biológica relativa también aumentaron la frecuencia de extinción del virus. La asociación de 5-fluorouracilo con clorhidrato de guanidino, un inhibidor de la replicación d epicornavirus que reduce la carga viral, permitió extinciones sistemáticas de virus de eficacia biológicamente media o baja. Los tratamientos mutagénicos produjeron aumentos de 2 a 6,4 veces en la frecuencia de mutación de las regiones genómicas estudiadas: zona codificante de la proteína capsídica VP1 y la región codificante del replicasa viral (3D). Además, se observaron incrmentos de hasta 3 veces en la complejidad del espector de mutantes (medida como entropía de Shannon). Los mayores incrementos de frecuencia de mutación se observaron en la región codificante de 3D, que se encuentra muy conservada en las poblaciones de VFA no tratadas con agentes mutagénicos, de manera que la heterogeneidad nucleotídica de esta región se hizo muy similar a la de la región VP1, muy variable en aftovirus.

Autor: LOPEZ VAZQUEZ ANA BELEN.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: La región codificadora de la RNA polimerasa dependiente de RNA del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo(RHDV) (aislado AST/89) se expresó en Escherichia coli mediante la utilización de un vector basado en la glutation S-transferasa, lo cual permitió obtener miligramos de proteína homogénea de 58 kDa, que se correspondía con la masa molecular esperada. El polipéptido recombinante era activo como poli(U) polimerasa dependiente de poli(A) y oligo(U), actividad que resistía el tratamiento con los antibióticos rifampicina y actinomicinaD y era específica de substrato. El enzima actuaba como RNA polimerasa en reacciones in vitro utilizando como molde un RNA sintético de secuencia idéntica a la del RNA subgenómico del RHDV en presencia o ausencia de un cebador oligo(U). Esta actividad también era resistente a ambos antibióticos. En las reacciones cebadas por oligo(U) se sintetizaban productos del tamaño del molde, mientras que en ausencia de cebador se formaban productos de RNA cuya longitud era doble con respecto a la del molde. Los RNAs de doble tamaño eranbicatenarios e hibridaban con sondas de polaridad positiva y negativa. La estructura de estos productos se caracterizó utiliando un molde bloqueado en su extremo 3' y se propone una hipótesis para el mecanismo de su formación, meiante cebado en el grupo hidroxilo 3'Dpol del RHDV, se empleó una aproximación experimental mediante mutagénesis sitio-dirigida, centrada en la secuencia aminoacídica altamente conservada GDD. Cada uno de los residuos de aspartato del motivo se sustitutyó por glicina, glutamato o asparragina. Las seis proteínas mutantes se produjeron en E. coli y sus actividades se midieron mediante un ensayo poli(U) polimerasa dependiente de poli(A). Los resultados demuestran la implicación de ambos aspartatos en la interacción con metales que ocurre durante el proceso catalítico.#

Autor: CALVETE MARGOLLES CARLOS.
Año: 1998.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.

Resumen: Se ha procedido al estudio y seguimiento de diferentes parámetros de la VHD en una población de conejos silvestres a lo largo de varios ciclos reproductivos, con el fin de profundizar en su epidemiología. Los datos obtenidos han permitido desarrollar un modelo matemático que recogiendo las principales características de la biología del conejo y de la epidemiología de VHD, nos han permitido reproducir y explicar diferentes aspectos de su epidemiología, así como simular diferentes herramientas de gestión, y su aptitud para la recuperación de la especie. Los resultados obtenidos en campo han mostrado un incremento de la prevalencia de anticuerpos frente a VHD, así como una disminución de la mortalidad producida por esta enfermedad. La mortalidad por dicha enfermedad ha presentado un patrón anual cíclico asociado a los ciclos de reproducción de la especie. Los resultados obtenidos con el modelo matemático predicen la existencia de poblaciones silvestres que, a pesar de la elevada virulencia del virus, pueden mostrar elevada densidad poblacional, elevada prevalencia de anticuerpos y una baja mortalidad por VHD. Asimismo, predice que la herramienta más eficaz para recuperar las poblaciones son las repoblaciones.

Autor: ALONSO FERNANDEZ PACHECO MARTA.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: En este trabajo se han estudiado las características biológicas, antigénicas, genéticas y de virulencia del virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa y del virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa en una coinfección identificada en alevines de trucha arco iris cultivada. Ambos virus son de gran interés en la acuicultura, el primero está muy extendido en la truchicultura española y el segundo solo se ha descrito en esta ocasión en nuestro país. La caracterización de los virus implicados en esta coinfección vírica en España, es importante para el diagnóstico y para el conocimiento de la biología de la infección mixta. La información que aporta este trabajo, especialmente el estudio de las proteínas implicadas en la respuesta inmune y sus determinantes antigénicos, es importante para el diseño de vacunas antivirales. También se han estudiado las interacciones de los virus implicados en la infección mixta; los resultados ayudaron a comprender la interferencia heteróloga, que a pesar de ser frecuente en virología está poco estudiada en ictiopatología y ha permitido comprender la patogenia de estas infecciones virales.

Autor: SANZ PARRA ARANTZA.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La fiebre aftosa (FA) es una de las enfermedades animales más temidas por las pérdidas económicas que origina. El agentecausal, el virus de la fiebre aftosa (VFA), es un picornavirus que se compone de una molécula de RNA de banda sencilla y polaridad (+) que está rodeada de una capsida icosaédrica formada por 60 copias de cada una de las 4 proteínas estructurales del virus: VP1-VP4. En esta tesis hemos analizado la respuesta inmune celular utilizando virus vaccinia y adenovirus recombinantes que expresan las proteinas estructurales del VFA; y para ello hemos inmunizado cobayas, vacas y cerdos con los recombinantes obtenidos. En dichos estudios hemos llegado a las siguientes conclusiones: 1.- Es posible conferir protección frente a la FA sin inducir respuesta de anticuerpos; 2.- Tanto el virus vaccinia como adenovirus recombinantes que expresan las proteínas estructurales del VFA son capaces de inducir una respuesta inmune linfoproliferativa específica del VFA. Además mediante ensayos paralelos a los anteriores se han llegado a las siguientes conclusiones: 1.- El VFA induce una disminución de la expresión de moléculas de clase I en las células infectadas; 2.- La proteína VP1 parece asociarse bien directa o indirectamente a las queratinas de los filamentos intermedios del ciroesqueleto; durante el ciclo infectivo del VFA.

Autor: REBORDOSA TRIGUEROS FRANCISCO JAVIER.
Año: 1996.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA I BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOTECNOLOGIA BIOQUIMICA I DESENVOLUPAMENT DE PROCESSOS.

Resumen: LA PRESENTE TESIS SE CENTRA EN EL DESARROLLO DE UNA VACUNA MARCADORA CONTRA EL BHV-1 BASADA EN UNA CEPA VIRAL QUE NO EXPRESA LA GLICOPROTEINA E(GE). PARA LOCALIZAR E IDENTIFICAR EL GEN DE LA GE EN EL GENOMA DEL VIRUS, SE HA SECUENCIADO UN FRAGMENTO DE LA US DEL BHV-1 EN EL QUE SE HA HALLADO UN ORF QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO DE 575 AAS (61,2 KDA), CUYA SECUENCIA AMINOACIDICA PRESENTA UNA GRAN SIMILUD CON LA GE DEL HSV-1 Y DE OTROS ALPHAHERPESVIRUS, INDICANDO QUE ESTE ORF CORRESPONDE AL GEN DE LA GE DEL BHV-1. UTILIZANDO TECNICAS DE RECOMBINACION HOMOLOGA IN VIVO, SE HA OBTENIDO UNA CEPA DEL BHV-1 QUE PRESENTA UNA DELECION EN EL MARCO DE LECTURA DE LA GE (BHV-IGE-) Y COMO CONSECUENCIA NO EXPRESA ESTA GLICOPROTEINA. LA VIRULENCIA DEL BHV-1GE- HA SIDO VALORADA TANTO IN VIVO COMO IN VITRO. LOS DATOS OBTENIDOS IN VIVO MUESTRAN QUE LA CEPA GE-, A PESAR DE PRESENTAR UNA VIRULENCIA MUY REDUCIDA, PROTEJE A LAS TERNERAS DE LA CONFRONTACION CON EL VIRUS SALVAJE. ASI MISMO, LA INFECCION EXPERIMENTAL CON EL BHV-1GE- NO INDUCE LA APARICION DE ANTICUERPOS CONTRA LA GE, PERMITIENDO LA DIFERENCIACION SEROLOGICA ENTRE ANIMALES INFECTADOS Y ANIMALES VACUNADOS. LOS RESULTADOS OBTENIDOS IN VITRO INDICAN QUE LA GE ES UNA GLICOPROTEINA IMPRESCINDIBLE PARA QUE EL VIRUS PUEDA TRANSMITIRSE DIRECTAMENTE DE CELULA A CELULA. LA CARENCIA DE ESTE MECANISMO DE INFECCION PODRIA EXPLICAR LA MENOR CAPACIDAD DEL BHV-1GE- PARA PROPAGARSE EN LOS TEJIDOS, ASI COMO SU MAYOR SENSIBILIDAD A LA ACCION DEL SISTEMA INMUNITARIO DEL ANIMAL INFECTADO.

Autor: VALERO RUSTARAZO M. LUZ.
Año: 1996.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUIMICA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: QUIMICA ORGANICA PROGRAMA DE DOCTORADO: QUIMICA FUNDAMENTAL: QUIMICA ORGANICA.

Resumen: EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA) ES EL AGENTE CAUSAL DE LA FIEBRE AFTOSA, UNA DE LAS ENFERMEDADES MAS TEMIDAS EN SANIDAD ANIMAL. EN LOS VFA DE SEROTIPO C EL SITIO ANTIGENICO A ES EL DETERMINANTE ANTIGENICO PRINCIPAL IMPLICADO EN NEUTRALIZACION, POR LO QUE POSIBLEMENTE PEPTIDOS SINTETICOS QUE MIMETICEN SUS PROPIEDADES PODRIAN INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE CAPAZ DE RECONOCER Y NEUTRALIZAR EL VIRUS. PARA ELLO, DICHOS PEPTIDOS TENDRIAN QUE MIMETIZAR LA ESTRUCTURA DEL SITIO A Y ADEMAS SU ELEVADA VARIABILIDAD ANTIGENICA, QUE DETERMINA EN GRAN MEDIDA EL ESCAPE AL RECONOCIMIENTO POR ANTICUERPOS. PARA MIMETIZAR ESTRUCTURALMENTE EL SITIO A DEL AISLADO C-S8C1 SE HAN SINTETIZADO PEPTIDOS CICLICOS Y SE HA EVALUADO EL EFECTO DE LA CICLACION Y DE LA ESTRUCTURA DEL CICLO EN LA REACTIVIDAD CON ANTICUERPOS MONOCLONALES (AM) ANTI-SITIO A. POR UN LADO SE HAN OBTENIDO PEPTIDOS CICLICOS ANALOGOS DE A 15 (SECUENCIA 136-150 VP1) CON TOPOLOGIA CABEZA-COLA. PARA SU OBTENCION SE HAN EVALUADO TRES APROXIMACIONES SINTETICAS, DOS DE ELLAS CONSISTENTES EN LA CICLACION EN FASE SOLIDA DEL PEPTIDO; Y SE HA OPTIMIZADO DE ESTAS LA BASADA EN UNA QUIMICA BOC/BZL/OFM. EL OTRO TIPO DE ANALOGOS CICLICOS DE A15 SINTETIZADOS CONSISTE EN PEPTIDOS DISULFURO CICLICOS. LOS CICLOS INCORPORAN DIFERENTES RESIDUOS ENTRE LOS EXTREMOS, POR TANTO POSEEN DISTINTAS DISTANCIAS Y GRADOS DE FLEXIBILIDAD ENTRE AMBOS. SE HA EVALUADO LA REACTIVIDAD DE LOS PEPTIDOS CICLICOS CON AM ANTI-SITIO A POR ENSAYOS DE ELISA COMPETITIVO Y POR ESTUDIO DE INTERACCIONES BIOESPECIFICAS EN TIEMPO REAL CON RESONANCIA DE PLASMON SUPERFICIAL COMO BIOSENSOR. AMBOS METODOS, COMPLEMENTARIOS ENTRE SI, NOS HAN PERMITIDO COMPROBAR QUE UNO DE LOS ANALOGOS DISULFURO CICLICO MIMETIZA EL SITIO A MEJOR QUE NINGUN OTRO OBTENIDO HASTA AHORA. LA CICLACION A TRAVES DE UN PUENTE DISULFURO NO SOLO MEJORA LA ANTIGENICIDAD DE LOS PEPTIDOS, ADEMAS, AUMENTA SU CARACTER INMUNOGENICO EN COBAYAS. ASI DOS CICLOS DISULFURO, UN 22-MERO Y UN 16-MERO RESPECTIVAMENTE, INDUCEN TITULOS DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES NO MUY INFERIORES A LOS OBTENIDOS INMUNIZANDO ESTOS ANIMALES CON PEPTIDOS CONJUGADOS A UNA PROTEINA PORTADORA ALTAMENTE INMUNOGENICA (KLH), Y MEJORES QUE SUS ANALOGOS LINEALES.PARA EVALUAR EL EFECTO DE LA VARIABILIDAD GENETICA DEL VFA EN LAS PROPIEDADES DEL SITIO A, SE HA OBTENIDO UNA BIBLIOTECA NO COMBINATORIAL DE PEPTIDOS LINEALES ANALOGOS DE A15, LA CUAL SE HA ESTUDIADO AMPLIAMENTE POR EM MALDI-TOF. CON ESTA BIBLIOTECA PEPTIDICA SE HA PODIDO DETERMINAR QUE LA VARIABILIDAD ANTIGENICA INTRATIPICA DE LOS VIRUS DE SEROTIPO C SE DEBE A CAMBIOS SUTILES EN LA ESTRUCTURA DEL SITO ANTIGENICO EN SU INTERACCION CON ANTICUERPOS, Y QUE EN LA INTERACCION CON EL RECEPTOR CELULAR (PRIMER PASO EN LA INFECCION DEL VIRUS) LOS RESIDUOS DEL TRIPLETE RGD (141-143 VP1) SON FUNDAMENTALES, ESPECIALMENTE ARG Y ASP. ADEMAS EL SEGMENTO 144-147 TIENE UN PAPEL INDIRECTO EN LA INTERACCION CON EL RECEPTOR CELULAR. SE HA CORRELACIONADO, MEDIANTE ESTUDIOS DE DICROISMO CIRCULAR Y RMN-1H BIDIMENSIONAL, LAS PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LOS DIFERENTES PEPTIDOS CON SU ESTRUCTURA.

Autor: CAMARERO PALAO JULIO ANTONIO .
Año: 1995.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: QUIMICA ORGANICA PROGRAMA DE DOCTORADO: QUIMICA FUNDAMENTAL - QUIMICA ORGANICA.

Resumen: LA PRESENTE TESIS TRATA SOBRE LA SINTESIS, ANALISIS CONFORMACIONAL Y EVALUACION INMUNOLOGICA DE MODELOS CICLICOS DEL SITIO A DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA.A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN ESTE TRABAJO SE HAN PODIDO OBTENER LAS SIGUIENTES CONCLUSIONES. 1) LA SINTESIS EN FASE SOLIDA DE CICLOS DE GRAN TAMAÑO ES ABORDABLE MEDIANTE UN CONJUNTO MUY VARIADO DE ESQUEMAS DE PROTECCION. 2) LA OBTENCION DE CICLOS GRANDES EN FASE LIQUIDA ACOSTUMBRA A PROPORCIONAR MEJORES RENDIMIENTOS QUE EN FASE SOLIDA. SIN EMBARGO, EL MENOR NUMERO DE ETAPAS CROMATOGRAFICAS REQUERIDAS EN ESTA ULTIMA APROXIMACION CONSIGUE QUE LOS RENDIMIENTOS GLOBALES SEAN SIMILARES: 3) LA INTRODUCCION DE UNA RESTRICCION CONFORMACIONAL ADECUADA EN UN PEPTIDO LINEAL CON VISTAS A MIMETIZAR UNA CIERTA SUBESTRUCTURA PROTEICA PUEDE MEJORAR SU COMPORTAMIENTO INMUNOGENICO, TAL COMO SE HA DEMOSTRADO CON UN PEPTIDO CICLICO DISULFURO.

Autor: BORREGO RIVERO M. BELEN.
Año: 1993.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: HEMOS EVALUADO LA RESPUESTA INMUNE INDUCIDA POR DISTINTOS ANTIGENOS BASADOS EN EL SITIO ANTIGENICO PRINCIPAL DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA. POR OTRO LADO, HEMOS ANALIZADO COMO EVOLUCIONAN LAS POBLACIONES DE UFA AL VERSE SOMETIDAS A SELECCION POR ANTICUERPOS ESPECIFICOS. HEMOS DETERMINADO QUE EL REPERTORIO DE SUSTITUCIONES DE AMINOACIDO QUE SE FIJAN EN CONDICIONES DE PRESION INMUNE ES DISTINTO AL QUE SE FIJA EN POBLACIONES NO SOMETIDAS A PRESION INMUNE: EL EFECTO ANTIGENICO DE LOS CAMBIOS QUE SE PRODUCEN EN CADA UNA DE ESAS CONDICIONES ES DISTINTO; TAMBIEN ES DIFERENTE SU EFECTO EN LA EFICACIA BIOLOGICA DE LAS POBLACIONES.

Autor: DIEGO DE LA TORRE M. ISABEL DE.
Año: 1993.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA CELULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: INMUNOLOGIA.

Resumen: SE HA ESTUDIADO LA ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS CIRCULANTES Y SECRETORES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA PROTECTORA FRENTE AL VIRUS DE LA GASTROENTERITIS PORCINA TRANSMISIBLE (VGPT). EL ESTUDIO HA SIDO REALIZADO CON CERDAS GASTANTES VACUNADAS CON EL VGPT O EL ANTIGENICAMENTE RELACIONADO CORONAVIRUS RESPIRATORIO PROCINO (CVRP). LA VACUNACION CON VGPT RESULTO EN MAYOR PROTECCION PASIVA Y UNA MAYOR RESPUESTA INMUNITARIA SECRETOPRA, LO QUE ESTABA CONDICIONADO POR LA RUTA DE PRESENTACION ANTIGENICA DEBIDO AL DISTINTO TROPISMO DE LOS VIRUS EMPLEADOS. LOS EPITOPOS PRESENTES EN LA PROTEINA S, ESPECIALMENTE LOS DEL SITIO A, FUERON MAS INMUNOGENICOS QUE NETRUALIZACION DELVIRUS, ES EL SITIO IMUNODOMINANTE EN CERDAS GESTANTES QUE CONFIEREN PROTECCION LACTOGENICA. POR OTRA PARTE, SE HA INVESTIGADO LAS ESPECIFICADAS DE CLASES Y SUBCLASES DE IMUNOGLOBULINA SOBRE EPITOPS PERTENECIENTES A SITIOS ANTIGENCIOS RELACIONADOS CON LA NETRUALIZACION DE VIRUS. SE HA ENCONTRADO DIFERNENTES EN LA INDUCCION DE IGA SECRETORA, LA PRINCIPAL RESPONSABLE DE LA PROTECCION IN VIVO, POR LOS DIFERENTES SITIOS Y SUBSITIOS ANTIGENICOS DE LA PROTEINA S DEL VIRUS. LOS SITIOS ANTIGENICOS A Y D FUERON LOS MEJORES INDUCTORES DE IGA SECRETORA EN AMBOS DE CERDAS VACUNADAS. SIN EMBARGO, CUANDO LA ESTIMULACION ANTIGENICA SE REALIZO EN EL TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO AL DISGESTIVO O EN EL ASOCIADO EL TRACTO RESPIRATORIO, INDUCCION DE IGA SECRETORA. TODOS LOS SUBSITIOS DEL SITIO A ESTIMULANDO EN EL TRACTO DIGESTIVO INDUJERON CANTIDADES SIMILARES DE IGA, MIENTRAS QUE EL SUBSITIO AB FUE EL PRINCIPAL INDUCTOR DE IGA CUANDO LA PRESENTACION ANTIGENICA FUE EN EL PULMON POR EL CVRP. SE ANALIZARON TAMBIEN LAS CONSECUENCIAS IN VITRO E IN VIVO DEL RECONOCIMIENTO POR LOS ANTICUERPOS DE LOS SITIOS ANTIGENICOS EN PROTECCION. LOS RESULTADOS SUGIEREN QUE PARA QUE LA PROTECCION IN VIVO AL MENOS AMBOS SITIOS A Y D SON RELEVANTES MIENTRAS QUE PARA LA PROTECCION IN VITRO SOLAMENTE UN SITIO ANTIGENICO (A O D) ES NECESARIO.

Autor: HERNANDEZ GIL FRANCISCO JAVIER.
Año: 1993.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: DE BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: EN EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA DE SEROTIPO C HAY TRES SITIOS ANTIGENICOS INDEPENDIENTES. EN EL SITIO A EXISTE UNA COMPLEJA DINAMICA CON LA APARICION Y DESAPARICION DE EPITOPOS, ADEMAS ESTA IMPLICADO EN EL RECONOCIMIENTO POR EL RECEPTOR CELULAR. EN EL SITIO D EXISTEN FUERTES RESTRICCIONES ESTRUCTURALES A LA VARIACION Y LA FRECUENCIA DE FIJACION DE SUSTITUCIONES DE AMINOACIDO ES UN ORDEN DE MAGNITUD INFERIOR QUE EN EL SITIO A. LA VARIACION ANTIGENICA EN ESTE SEROTIPO ES DEBIDA A SUSTITUCIONES DE AMINOACIDO EN UNAS POCAS POSICIONES CRITICAS EN CADA UNO DE LOS SITIOS ANTIGENICOS IDENTIFICADOS, AQUELLAS QUE SON MAS TOLERANTES AL CAMBIO. EN EL SITIO A CAMBIOS EN DOS POSICIONES CRITICAS Y CONSERVADAS PRODUCEN CAMBIOS MUY DRASTICOS DE ESPECIFICIDAD ANTIGENICA. EL VIRUS C GC ES EL AISLADO MAS ANTIGUO DE ESTE SEROTIPO Y CONSTITUYE UNA LINEA EVOLUTIVA PROBABLEMENTE EXTINTA. ESTE ES UN CLARO EJEMPLO DE FALTA DE CORRELACION ENTRE DISTANCIA GENETICA Y ANTIGENICA.