VIRUS RESPIRATORIOS

Autor: SASTRE ANTORANZ PATRICIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: El virus respiratorio sincitial humano (VRSH) es un neumovirus, responsable de la mayoria de las infecciones graves del tracto respiratorio inferior en niños de corta edad. También causa un número importante de infecciones respiratorias en ancianos y en individuos inmunodeprimidos. Hasta el momento no se ha encontrado una vacuna efectiva contra el mismo, aunque se sabe que la administración pasiva de anticuerpos neutralizantes, tanto monoclonales como policlonales en pacientes de alto riesgo (niños prematuros, inmunodeprimidos, con enfermedades cardiacas, broncopulmonares …) representa un método nuevo y efectivo de inmunoprofilaxis. El objetivo de esta tesis ha sido la caracterización de epítopos en las glicoproteínas F y G del virus, reconocidos por anticuerpos neutralizantes que se producen tras la infección natural en humanos. Para ello se procedió al fraccionamiento de inmunoglobulinas humanas por cromatografía de afinidad en columnas preparadas con proteína F, G o fragmentos de las mismas. Posteriormente se valoró en las distintas fracciones el título de anticuerpos anti- VRSH, así como su capacidad de neutralizar la infección viral. Como material de partida se dispuso de dos preparaciones comerciales de inmunoglobulinas purificadas de sueros de distintos individuos: RespiGam (RG) y Flebogamma (FG). Los resultados presentados en esta tesis ofrecen la posibilidad de buscar nuevos anticuerpos dirigidos frente a epítopos implicados en neutralización, que puedan utilizarse para el tratamiento profiláctico y/o terapeútico de las infecciones por el VRSH.

Autor: PARADA COBO CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El uso de virus modificados como agentes terapéuticos en pacientes de cáncer es actualmente un campo en desarrollo. Es la llamada terapia génica de cáncer. Para intentar mejorar las potencialidades de estas terapias, hemos desarrollado dos tipos de estrategias, el uso de adenovirus replicativos condicionales y la potenciación de las llamadas terapias suicidas, para lo cual hemos generado dos tipos de vectores, adenovirales y retrovirales. Los estudios que presentamos demuestran la capacidad de adenovirus Adl118 para eliminar metástasis en un modelo de cáncer de mama in vivo, y la capacidad de la proteína E1a, como agente inductor del ciclo celular, para potenciar el efecto oncolítico del sistema suicida HSV1-TK/GCV. Además hemos tratado de profundizar en la biología delos adenovirus, estudiando las rutas de transducción de señales activadas en respuesta a la infección, así como la capacidad de E1A 12S de inducir replicación viral en adenovirus E1 deficientes.

Autor: AREA GÓMEZ ESTELA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO NACINAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: El genoma del virus de la gripe está estructurado en forma de ribonucleoproteínas o RNPs, las cuales a su vez están constituidas por el RNA viral, de cadena sencilla y polaridad negativa, cuyos extremos parcialmente complementarios forman una estructura denominada en "Mango de sartén" o Panhandle. A lo largo de toda la longitud del Rna se sitúa la Nucleoproteína y en su extremo las 3 subunidades de la polimerasa PB1, PB2 y Pa, cerrando la estructura de la RNP. Se ha obtenido la estructura tridimensional de una ribonucleoproteína del virus de la gripe reconstituida in vivo a partir de proteínas recombinantes y un vRNA modelo. Esta estructura, derivada por microscopía electrónica de muestras teñidas es circular y contiene 9 monómeros de nucleoproteína y el complejo de la polimerasa conectado a dos de estas nucleoproteínas adyacentes. Se ha optimizado el proceso de purificación de ribonucleoproteínas mediante la introducción de un tag de histidinas en una de las proteínas recombinantes expresadas in vivo. El complejo así reconstituído fue purificado mediante cromatografía de afinidad a resina de níquel. La estructura de la polimerasa viral presente en el complejo de la ribonucleoproteína fue determinada mediante reconstrucción tridimensional de muestras de imágenes de microscopía electrónica de muestras teñidas. Con una resolución de 25A, la estructura obtenida muetra la presencia de sus tres subunidades. La localización de dominios específicos en la polimerasa fue determinada mediante análisis tridimensional de complejos de ribonucleoproteínas unidas a anticuerpos monoclonales específicos para el dominio aminoterminal de PB2 y el dominio carboxiterminal de PA. La presencia de masas extra en el complejo, que corresponden a los anticuerpos unidos, indica la posición de dichos dominios de las subunidades PB2 y Pa dentro de la polimerasa. La localización de dominios específicos de la subunidad PB1 se llevó a cabo mediante reconstrucción tridimensional de complejos de ribonucleoproteína conteniendo una PB1 unida a un tag de 20 Kda visible dentro de la molécula reconstruida.

Autor: FALCÓN ESCALONA ANA M..
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA, CSIC.

Resumen: El genoma del virus de la gripe tipo A está compuesto por ocho segmentos de RNA de cadena sencilla y polaridad negativa que codifican un total de diez proteínas. La proteína NS1 es una proteína no estructural que se localiza en el núcleo de las células infectadas a tiempos tempranos post-infección y también se encuentra en el citosol a tiempos tardíos post-infección. La proteína no estructural NS1 es una proteína de unión a RNA importante para la inhibición de la respuesta a interferón. Existen evidencias que sugieren que esta proteína está implicada en la modulación del splicing de mRNA, retención nuclear de mRNAs poli(A) y estimulación de la traducción de mensajeros virales. NS1 se encuentra asociada a las RNPs virales y podría estar implicada en los procesos de transcripción y replicación viral. Durante el desarrollo de un ensayo de doble-híbrido en el que se utilizó la proteína NS1 como cebo, se encontró un clon humano que codifica una proteína homóloga a la proteína Staufen de D.melanogaste (dmStaufen). Se ha descrito que la proteína dmStaufen interaccionan con, y localiza determinados mRNAs en lugares precisos en el oocito de mosca. El homólogo humano a dmStufen, hStaufen, es una proteína de unión a RNA de doble cadena que se encuentra asociada a polisomas y al retículo endoplásmico rugoso. Las proteínas NS1 y hStaufen interaccionan in vitro cuando son co-expresadas a partir de sus cDNAs clonados. Para estudiar las funciones de la proteína Ns1 durante la infección viral, se han generado virus mutantes puntuales o de delección de la proteína NS1. Los virus mutantes de deleción se han rescatado por el sistema ya descrito de cDNAs clonados, y los virus mutantes puntuales se han generado por un nuevo sistema de co-transfección de RNPs. Estos virus mutantes puntuales de la proteína NS1 se han generado co-transfectando RNPs purificadas de viriones y una librería de RNPs del segmento NS mutagenizadas al azar y reconstituidas in vivo. Estos virus recombinantes se plaquearon a 32ºC, y tras tres días de incubación se incubaron a 39ºC, para seleccionar aquellas placas que crecieron a temperatura permisiva, pero no a temperatura restrictiva. Las placas seleccionadas se plaquearon en paralelo a ambas temperaturas para comprobar si realmente presentaban un fenotipo termosensible. De este modo se han generado nuevos virus recombinantes con mutaciones termosensibles en el segmento NS. Los virus mutantes de delección de la proteína NS1 contienen los genes de la polimeraa, nucleoproteína (NP) y NS de la cepa Victoria, y los genes matriz (M), hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) de la cepa WSN. Estos virus codifican versiones mutantes de la proteína NS1 que contienen los 81 ó 110 aminoácidos N-terminales de la proteína y presentan un fenotipo termosensible. La síntesis de proteínas tardías en células infectadas por los virus NS1-81 y NS1-110 fue defectiva. Estos virus están afectados en los procesos de replicación y traducción de mensajeros tardíos. Además, presentan una retención de las RNPs en el núcleo a temperatura restrictiva. Estos mutantes se han ensayado en el modelo murino para el virus de la gripe. Los virus, están atenuados en ratón pero inducen una respuesta inmune normal que les permite proteger a los animales frente a una dosis letal del virus WSN silvestre. Por lo tanto, estos virus podrían ser considerados como candidatos a vacunas vivas atenuadas para el virus de la gripe.

Autor: MATA ROIG MANUEL.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSITAT DE VALÉNCIA.

Resumen: La producción anormal de moco constituye un serio problema socio-sanitario cobrando especial importancia en patologías como el asma, la fibrosis y la EPOC. En este trabajo hemos evaluado la acción de fármacos típicamente utilizados en la clínica, así como otros de nueva generación en diversos modelos, tanto in vivo como in vitro. Por otra parte, hemos analizado los mecanismos implicados en la producción de mucinas, econtrando la implicación del NFKB, la MAPKp38 y el EFG-R. El análisis de perfiles de expresión génica (Chips de ADN) indica la implicación de numerosos factores de transcripción, genes apoptoticos, genes implicados en la transducción de señales, que pueden ser considerados como nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento de patologías respiratorias.

Autor: GASTAMINZA LANDART PABLO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El virus de la gripe posee un genoma de RNA segmentado de cadena sencilla y polaridad negativa que es replicado y transcrito en el núcleo de la células infectada. Dicho genoma se encuentra organizado en forma deribonucleoproteínas (RNPs), encapsidado por la nucleoproteína NP y asociado por sus extremos a la RNA polimerasa viral. La RNP viral es la unidad funcional mínima requerida para los procesos de replicación y transcripción, procesos que son llevados a cabo por un único complejo de RNA polimerasa formado por tres subunidades PB1, PB2 y PA. El proceso de iniciación de la transcripción tiene lugar por un mecanismos de robo de cap o cap snatching por el que la polimerasa reconoce, a través de PB2 el extremo 5' cap de mRNAs celulares, provocando un corte endunucleolítico a una distancia variable de entre 9-15nt del extremo 5' para dar lugar a un oligonucleótido con cap que es empleado como iniciador de la transcripción. Con el ánimo de identificar posiciones implicadas en el reconocimiento de la estructura cap en PB2, se generó una alineamiento de secuencias representativas de PB2 de distintos Orthomixovirus con otras proteínas capaces de reconocer dicha estructura. Se han generado mutaciones puntuales en el extremo N-terminal de PB2 en posiciones alineadas con residuos conservados de eIF4E, factor celular de unión a cap, implicados en el reconocimiento de dicha estructura. Dichos mutantes han sido analizados en un sistema de reconstitución in vivo de RNPs recombinantes que ha revelado que las mutaciones afectan selectivamente la actividad replicativa de las RNPs mutantes, como sugieren los análisis de RNA llevados a cabo mediante ensayos de protección de Rnasa de sondas específicas para detectar el intermediario de replicación de polaridad positiva (cRNA) y el RNA genómico (vRNA). Estas mutaciones no afectan, sin embargo la capacidad transcripcional de dichos mutantes, tal y como se determinó mediante análisis de transcripción y actividad endonucleasa in vitro con RNPs recombinantes purificadas. Para comprobar la relevancia funcional de estas mutaciones en un contexto más fisiológico, las mutaciones más relevantes fueron rescatadas en virus infecciosos mediante la reconstitución, por contrasfección de plásmidos, de cada una de la RNFs virales. Los virus mutantes presentaron alteraciones en sus cinéticas de crecimiento y de síntesis de proteínas que derivaban de alteraciones a nivel de la síntesis tanto de cRNA como de vRNA, tal y como se pudo comprobar mediante la cuantificación de dichas especies de RNA por RT-PCR en tiempo real. Para descartar que estas mutaciones estuvieran afectando la actividad polimerasa de forma generalizada, se analizó la capacidad transcripcional de las RNPs en el contexto de la infección, pero en ausencia de replicación. La transcripción primaria, la que tiene lugar a partir de las RNPs entrantes en los primeros estadíos de la infección, se prolonga hasta que comienza la replicación. Este proceso comienza con la síntesis de proteínas virales. Por lo tanto, se puede bloquear la replicación y prolongar artificialmente la transcripción primaria si se realizan las infecciones en presencia de un inhibidor de la síntesis de proteínas como la cicloheximida. En estas condiciones, la acumulación de mRNA en las células infectadas deriva exclusivamente de la actividad transcripcional de la RNPs independientemente de su capacidad para replicar. No se pudieron observar diferencias significativas en cuanto a al cinética ni a la cantidad final de mRNA acumulado en presencia de cicloheximida entre los diferentes mutantes y el virus paterno. Estos datos sugieren que las mutaciones generadas en PB2 provocan durante este proceso, se puede proponer que las mutaciones introducidas en el N-terminal de PB2 afectan al reconocimiento del promotor durante la replicación, si bien se ha comprobado que dicho reconocimiento tiene lugar de forma correcta durante la transcripción. Por otro lado, se ha propuesto que la interacción NP-polimerasa es esencial para inducir la replicación. Esta interacción tiene lugar esencialmente a través de PB2. Por lo tanto, se puede proponer que las mutaciones introducidas en PB2 dificultan esta interacción dando lugar al fenotipo observado. Sin embargo, y dada la hipótesisa de partida, no podemos descartar que las posiciones definidas por el alineamiento con eIF4E estén implicadas en el reconocimiento de cpa y que éste reconocimiento sea esencial para la replicación. Aunque se ha vinculado la estructura cpa con la iniciación de la transcripción, experimentos antiguos señalaban que la iniciación de novo, la que tiene lugar durante la replicación, puede ser estimulada alostéricamente in vitro con análogos de cap. El análisis de la susceptibilidad de las RNPs virales a la estimulación por análogos de cap in vitro reveló que los mutantes que daban lugar in vivo a defectos en la síntesis de productos iniciados de novo, requieren una mayor concentración de análogo de cap para alcanzar una estimulación máxima in vitro. Estos datos preliminares podría sugerir que las estructuras 5' cap estimulan la capacidad de iniciación de la polimerasa de forma genérica, actuando como iniciadores durante el cap snatching y estimulando alostéricamente la incorporación del primer nucleósido trifosato durante la iniciación de novo. Esto podría implicar la existencia de dos dominios diferenciados d eunión a cap: uno implicado en la iniciación de la transcripción, en la región C-terminal (o central según los autores) de PB2 y otro en la región N-terminal en las posiciones definidas por el alineamiento con eIF4E.

Autor: HUARTE MARTÍNEZ MAITE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La subunidad PA de la polimerasa del virus de la gripe es una fosfoproteína que induce la degradación proteolítica de proteínas coexpresadas con ella. Mutantes puntuales de la subunidad PA en sitios de fosforilación por la enzima casín kinasa II están afectados en su actividad inductora de proteólisis. Además las RNPs reconstituídas in vivo con dichos mutantes están afectadas en la replicación del genoma viral, más concretamente en el paso de síntesis de cRNA a partir de vRNA. En esta tesis se demuestra que la proteína PA presenta actividad proteasa in vitro sobre sí misma y sobre otros substratos. También se generaron virus de la gripe recombinantes con mutaciones en Pa que están afectadas en proteólisis. El virus con una mutación en la treonina 157 resulta tener afectado el transporte al núcleo de la proteína PA y ser defectivo en la replicación además de estar atenuado en su patogénesis en ratones. Se identificó también una nueva proteína celular que interacciona con PA in vivo e in vitro. Esta proteína, denominada hCLE, se nucelariza en células que sobreexpresan la subunidad PA de la polimerasa y colocaliza con las RNPs activas del virus de la gripo., hCLE es homóloga a la parte central del factor de transcripción de levaduras Cdc68, siendo capaz de recuperar el fenotipo de levaduras termosensibles para dicha proteína.

Autor: BRACHO LAPIEDRA M. ALMA.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: La evolución molecular viral es una disciplina heredera de la evolución molecular y la virología. La evolución experimental invierte ciertos términos de la investigación en genética de poblaciones y evolución porque permite controlar parámetros como el tamaño poblacional o los coeficientes de selección. Las poblaciones virales se encuentran sometidas al balance de las fuerzas evolutivas que son la mutación, la selección, la deriva y la migración. El trinquete de Muller es un modelo de deriva continuada que ocurre en poblaciones asexuales y pequeñas con resultado de disminución de la eficacia biológica y probable extinción de la población. Una de las premisas necesaria para que se cumpla este modelo es la irreversabilidad de las mutaciones. La caracterización molecular parcial, mediante RP-PCR y secuenciación de una población del virus de la estomatitis vesicular (VSV) debilitada por efecto del trinquete de Muller, demuestra que la mutación más probable responsable de la disminución de la eficacia es una acumulación de inserciones y deleciones en una zona reguladora de la transcripción. Esta población debilita se sometió a expansión poblacional y recuperó rápidamente eficacia hasta un valor cercano al anterior a la aplicación de los cuellos de botella poblacionales. La retromutación en esta zona reguladora es probablemente responsable de la recuperación de eficacia. Este resultado compromete una de las premisas del trinquete de Muller que es la pérdida de la clase de genomas no mutados, ya que la retromutación puede operar en poblaciones de ribovirus. Por otra parte, bajos niveles de polimorfismo molecular pueden ser explicado satisfactoriamente por arrastre genético asociado a fenómenos de selección estabilizante y selección purificadora. Finalmente las estimas de tamaño poblacional efectivo de las poblaciones de virus de RNA resultaron muy inferiores al tamaño poblacional estimado por recuento de viriones.

Autor: BORRAJO LITÓN PALOMA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL RAMÓN Y CAJAL - DEPARTAMENTO VIROLOGÍA.

Resumen: El Virus del Sarampión (VS) es un patógeno altamente contagioso caracterizado por: 1,- Originar una infección sistémica multiorgánica. 2,- Inducir una inmunosupresión transitoria. 3,- Ser capaz de persistir en el organismo, siendo la persistencia del VS en el Sistema Nervioso Central responsable de la aparición de dos enfermedades neurodegenerativas letales (PES y MIBE). Estas tres características hicieron que nos preguntásemos si el VS pudiera haber desarrollado estrategias de evasión frente al sistema inmune (SI) celular, campo en el que no se contaban con estudios previos. 1,- Describimos por primera vez que la infección por VS induce resistencia a la ácción del IFN-alfa al interceptar en la cascada de señalización del IFN-alfa. Hemos observado que la interrupción de la señal es debida a una inhibición de la expresión de las proteínas quinasas Jak1 y Tyk2 en las células infectadas, encontrándose inhbida la fosforilación de la proteína Stat1 en respueta al tratamiento celular con IFN-alfa y la formación del complejo transcripcional ISGF3. Asimismo se ha observado una inhibición de la translocación de las proteína p48 al núcleo. Ambos efectos impiden la inducción de la transcripción de los genes efectores de la acción del IFN-alfa. Por otro lado se ha observado una inhibición de la producción de IFN-alfa en infecciones líticas y persistentes por los aislados primarios del VS, al contrario de lo observado en las infecciones por la cepa vacunal Edmonston, cuya infección induce la secrección continuada de IFN-alfa con actividad antiproliferativa y antiviral. 2,- Se describe en este trabajo una inhibición de la secreción de IgA e IgE en la infección lítica y persistente por VS. Este efecto es debido a defectos en la maduración de IgA. En estas células fue detectada una unión estable entre la glicoproteína viral H con los chaperones moleculares BiP y Grp94, así como una estimulación de la respuesta de stress celular indicativo de una saturación del retículo endoplásmico (RE). La inhibición de la secreción de IgA podía ser revertida con el tratamiento con sustancias estimuladoras de la respuesta de estrés celular, sugieriendo que la acumulación de las glicoproteínas virales en el RE unidas de forma estable a los chaperones podía ser responsable de la ineficiente maduración de IgA. Asimismo, se describe por primera vez que la infección por Vs altera la expresión en superficie de la molécula de activación linfocitaria (SLAM o CDw150), recientemente descrita como molécula receptora de las estirpes linfotrópicas del VS. 3,- Se describe que el VS es capaz de reducir la expresión en la superficie celular de HLA-I lo que podría hacer a las células infectadas resistentes frente a las células T citotóxicas. Hemos detectado una interacción entre las proteínas virales nucleoproteína (N) y proteína de matriz (M) con moléculas de HLA-I. Asímismo se descarta un posible requerimiento de la expresión de HLA-I en la superficie celular o en la envuela viral para la infección y citopatogenia por VS.

Autor: MARTINEZ SOBRIDO LUIS ALBERTO .
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: En este trabajo se han reevaluado las interacciones entre los componentes de la ribonucleocápsida del virus respiratorio sincitial humano (VRSH), utilizando el sistema del doble hídrido de mamíferos. Se obervaron las interacciones homólogas NP-NP, P-P y 22k-22k y se confirmó la interacción NP-P. Además, se observó la interacción P-22k que no se había detectado anteriormente por otros métodos. La incorporación al sistema del doble híbrido de proteínas virales sin fusionar corroboró la especificidad de la interación p-22k y la formación de un posible puente formado por la proteína P entre las proteínas NP y 22k. La proteína 22k expresada en ausencia de otros componenetes virales tiene una movilidad menor que la observada en células infectadas. Sin embargo la coexpresión de la fosfoproteína restauró la movilidad electroforética de la proteína 22k, mimetizando la situación encontrada en células infectadas por el VRSH. Además de estos resultados pudimos ver como la proteína no estructural NSL del VRSH tenía características comunes a los activadores de la transcripción celular, siendo el VRSH el único caso descrito con esta actividad en un virus RNA citoplasmático.

Autor: ZAMBRANO DUARTE ALBERTO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOLOGIA FUNDAMENTAL.

Resumen: El virus respiratorio sincitial humano (VRSH) es el agente infeccioso más importante que causa neumonías y bronquiolitis en niños pequeños. En este trabajo se han puesto a punto sistemas basados en "minigenomas" para llevar acabo el análisis de secuencias del virus importantes para la replicación del mismo. Así mismo se ha empleado uno de los sistemas desarrollados para analizar la función y estructura de la glicoproteína F del virus. Mediante la obtención de mutantes de la proteína F se han estudiado residuos importantes para la maduración, estructura y funcionalidad de la misma.

Autor: PEREZ BREÑA M. PILAR.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: El presente trabajo de tesis se centra en el estudio de las cepas Virus Respiratorio Sincitial circulantes en la población pediátrica de varios hospitales de Madrid, entre las temporadas 1988-1989 y 1995-1996. Se ha planteado en primer lugar la caracterización genotípica de estos virus mediante el desarrollo y evaluación de métodos que permiten estudiar un gran número de virus para seleccionar aquellos que deban ser secuenciados. Se basa en el análisis del gen de F, de gran trascendencia en la infectividad del virus. Existen dos subgrupos y diversos linajes de VRS, lo que podría reflejarse en las características de la infección o en aspectos epidemiológicos. Hasta el momento no se han conseguido esclarecer estos puntos. Este estudio aporta un gran n de casos ocurridos en una larga serie de brotes y por primera vez incorpora una clasificación genotípica de los linajes identificados en cada subgrupo. Los resultados sugieren que algunos genotipos pueden estar más relacionados con gravedad clínica y comportamientos epidemiológicos indicativos de mayor virulencia. Para poder disponer de estos virus ha sido necesario profundizar en las técnicas de diagnóstico, completándolo con la incorporación del tipado e introduciendo y evaluando técnicas para el análisis de ácidos nucleicos.

Autor: MARION ALONSO ROSA M..
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La proteína Ns1 del virus de la gripe se comporta como un factor modulador de la expresión génica viral y celular. Para analizar los mecanismos mediante los cuales esta proteína realiza sus funciones se han construido una serie de mutantes de la proteína con los que se han podido mapear dominios funcionales de NS1. Además, se han identificado proteínas y RNAs virales que se asocian a NS1 durante la infección con el virus de la gripe. Por otra parte, se ha clonado y caracterizado una nueva proteína humana por su capacidad de interacionar con la proteína Ns1 en su ensayo de doble híbrido. La nueva proteína humana es el homólogo humano de la proteína Staufen de Drosophila melanogaster, por lo que se ha denominado hStaufen o Staufen humano. hStaufen es una proteína capaz de unir RNA de doble banda, se localiza principalmente en el retículo rugoso de las células humanas y se encuentra asociada a los polisomas. En conjunto, este trabajo ha permitido localizar regiones de la proteína NS1 implicadas en sus distintas funciones, así como identificar factores tanto celulares como virales que se asocian a esta proteína..

Autor: CARABANA ESCUDERO JUAN.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Se ha caracterizado el genoma completo del virus persistente encontrado en cerebro de tres pacientes con PES. Tanto a nivel del genoma viral como de su expresión se ha pretendido poder explicar la causa o causas que provocan el desajuste del ciclo viral infectivo transformando una infección lítica en persistente. Se ha llevado a cabo un estudio de muestreo importante de virus aislados naturales en el área de Madrid, con el fin de establecer un valor real de la variabilidad genética exhibida por estos virus, así como intentar relacionar los cambios genéticos acontecidos con características fenotípicas importantes, orientado a la determinación de determinantes involucrados en la atenuación, inmunosupresión, y neuropatogénesis de este virus.

Autor: PEREZ MARTINEZ M. MAR.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La proteína SH de la cepa Long del Virus Respiratorio Sincitial Humano (VRSH) tiene 64 aminoácidos y posee una región central rica en aminoácidos hidrofóbicos. Esta proteína posee analogías estructurales con proteínas pequeñas e hidrofóbicas de otros virus de RNA, capaces de alterar la permeabilidad de la membrana de las células en las que se expresan. La inducción de la síntesis de la proteína SH en Escherichia coli conduce a la permeabilización de la membrana bacteriana a compuestos de bajo peso molecular. La construcción de una colección de genes mutados y su expresión en bacterias ha permitido identificar regiones y residuos de la proteína SH necesarios para la permeabilización de la membrana. El extremo C-terminal de la proteína y el mantenimiento del carácter hidrofóbico de la región central son fundamentales. Tanto la proteína SH "wild type" como las diferentes proteínas SH mutadas se asocian a las membranas, tanto ecuariotas como procariotas, y presentan un patrón de solubilidad que corresponde al de una proteína integral de membrana. En las células infectadas la proteína se acumula intracelularmente en cuatro formas diferentes, dos de ellas glicosiladas. La proteína SH posee dos sitios potenciales de N-glicosilación, uno a cada extremo de la región hidrofóbica. Se sustituyeron por residuos de aspártico cada uno de estas dos posiciones, o ambas. Las proteínas correspondientes se sintetizaron empleando el sistema de expresión transitoria de vaccinia-T7 o diferentes sistemas libres de células en ausencia o presencia de microsomas. Los resultados obtenidos indican que la proteína SH se modifica por la adición de una única cadena de azúcares unida por enlaces N-glicosídicos a residuos de asparagina. La glicosilación puede producirse en dos sitios alternativos, siendo la asparagina en posición 3 el sitio preferente. La orientación topológica que la proteína adopta en la membrana se analizó mediante digestiones con tripsina de la proteína sintetizada en un sistema libre de células en ausencia o presencia de microsomas. La estructura de la proteína es tal que el extremo N-terminal es intrínsecamente resistente a la digestión con tripisina, mientras que el extremo C-terminal es sensible. La digestión de proteínas mutadas que carecían de uno u otro extremo indicó que la proteasa corta en un sitio o sitios localizado entre los 19 aminoácidos carboxilo terminales de la proteína. Se proponen dos posibles modelos para la orientación de la proteína SH en la membrana plasmática de las células infectadas. En uno de ellos, ambos extremos de la proteína estarían orientados hacia el medio extracelular. El segundo implicaría la coexistencia de dos formas moleculares de la proteína SH con orientaciones alternativas, una población mayoritaria estaría orientada con el extremo amino hacia el exterior y el carboxilo hacia el interior, y una población menos abundante con la orientación contraria.

Autor: SANZ EZQUERRO JUAN JOSE.
Año: 1996.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: DURANTE LOS INTENTOS DE OPTIMIZACION DE UN SISTEMA DE RECONSTITUCION IN VIVO DE LA TRANSCRIPCION-REPLICACION DEL VIRUS DE LA GRIPE OBSERVAMOS UN EFECTO TOXICO ASOCIADO A LA EXPRESION DE LA SUBUNIDAD PA DE LA REPLICASA VIRAL. LA CARACTERIZACION DE ESTE EFECTO PERMITIO OBSERVAR QUE ES GENERALIZADO Y QUE ES INDEPENDIENTE DE LA EXPRESION DE OTRAS PROTEINAS DEL VIRUS DE LA GRIPE, DEL SISTEMA DE EXPRESION Y DE LA LINEA CELULAR EMPLEADOS; AFECTA A PROTEINAS VIRALES Y CELULARES, TIENE UNA CINETICA DE APARICION RAPIDA Y NO REQUIERE LA SINTESIS DE NOVO DE PROTEINAS. EL NIVEL MOLECULAR AL QUE ACTUA ES POST-TRADUCCIONAL, INDUCIENDO LA PROTEOLISIS DE LAS PROTEINAS QUE SE COEXPRESAN CON PA. LOS DATOS SON COMPATIBLES TANTO CON LA EXISTENCIA DE UNA ACTIVIDAD PROTEASA EN PA COMO CON LA INDUCCION DE UN SISTEMA PROTEOLITICO CELULAR ESTABLE. ESTE EFECTO INDUCTOR DE PROTEOLISIS PODRIA ESTAR RELACIONADO CON LA INDUCCION DE APOPTOSIS MEDIADA POR EL VIRUS DE LA GRIPE. MEDIANTE EL MAPEO DE LAS REGIONES DE LA PROTEINA IMPLICADAS EN ESTE PROCESO HEMOS PODIDO COMPROBAR QUE EL TERCIO AMINO-TERMINAL DE PA ES SUFICIENTE PARA LA INDUCCION DE PROTEOLISIS, Y QUE SU LOCALIZACION NUCLEAR PODRIA SER UN REQUISITO INDISPENSABLE PARA ESTE EFECTO. ESTA REGION AMINO DE LA PROTEINA ES DISPENSABLE PARA SU INTERACCION CON LA SUBUNIDAD PB1. POR OTRO LADO, LA APARICION DE ISOFORMAS DE PA IN VIVO Y SU CAPACIDAD DE SER FOSFORILADA IN VITRO SUGIEREN QUE PA PODRIA SER UNA FOSFOPROTEINA. POR ULTIMO, SE HA IDENTIFICADO MEDIANTE UN SISTEMA DE DOBLE-HIBRIDO UNA SECUENCIA HUMANA CAPAZ DE INTERACCIONAR CON PA, Y SE ESTA CARACTERIZANDO LA POSIBLE RELEVANCIA FUNCIONAL DE ESTA INTERACCION MEDIANTE EXPERIMENTOS BIOQUIMICOS.

Autor: LOPEZ RIESTRA DIGNA M..
Año: 1992.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA FUNCIONAL.

Resumen: SE TOMARON 168 SUEROS MATERNOS Y OTROS TANTOS NEONATALES CORRESPONDIENTES A TODAS LAS MADRES INGRESADAS POR PARTO ENTRE EL 4 Y 22 DE MAYO DE 1989. SE UTILIZARON 4 AG. DEL VIRUS INFLUENZA A Y 1 DEL B, TODOS DE ORIGEN HUMANO. EL ESTUDIO PROPORCIONO DATOS SOBRE LA ESTRUCTURA INMUNOLOGICA DE LAS MADRES Y SUS NEONATOS. LA POSITIVIDAD ( -1:10) DE LOS SUEROS FUE DEL 75% PARA LAS MADRES Y 76,7% PARA LAS R.K. (POR LA TECNICA DE J.H.). LA MAYOR SEROPOSITIVIDAD FUE PARA LA CEPA A/HABANA/299/88 (H3N2). LA M.G.T. FUE SIMILAR PARA MADRES Y R.N. LA INMUNIDAD ( -1:40) FUE DEL 10.1% Y 8.3% TABAQUISMO MATERNO Y HACINAMIENTO EN EL HOGAR ESTUVIERON ASOCIADOS ESTADISTICAMENTE CON LA POSITIVIDAD TANTO EN LOS SUEROS MATERNOS COMO NEONATALES.

Autor: OÑA NAVARRO MARIA DE.
Año: 1991.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: MICROBIOLOGIA.

Resumen: SE APLICO UNA NUEVA TECNICA DE DIAGNOSTICO PRECOZ EN LA INFECCION POR CITOMEGALOVIRUS (CMV) MEDIANTE LA UTILIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES DIRIGIDOS FRENTE A ANTIGENOS DE CMV PRESENTES EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFERICA, EN UN PROTOCOLO PROSPECTIVO DE SEGUIMIENTO DE PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL. SE COMPARO ESTA TECNICA CON OTRAS YA CONOCIDAS COMO LA VIREMIA, VIRURIA Y DETECCION DE ANTICUERPOS. SE ESTUDIARON 121 PACIENTES EN UN PERIODO DE 4 AÑOS. LAS MUESTRAS PROCESADAS FUERON SANGRE COMPLETA, ORINA Y SUERO Y SE RECOGIERON SEMANALMENTE DURANTE LOS DOS PRIMEROS MESES, MENSUALMENTE HASTA EL SEXTO MES Y POSTERIORMENTE EN CADA REVISION CLINICA. EL TOTAL DE ELLAS FUE DE 4.473, REALIZANDOSE 10.457 DETERMINACIONES ANALITICAS. RESULTADOS: 75 PACIENTES TUVIERON INFECCION Y 18 ENFERMEDAD. EL ESTUDIO DEMOSTRO QUE LA ANTIGENEMIA FUE EL TEST MAS UTIL EN EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD, YA QUE FUE DE APARICION MUY PRECOZ, SENSIBLE, ESPECIFICO, PRECEDE A LA ENFERMEDAD EN LA MITAD DE LOS PACIENTES Y SUS RESULTADOS PUEDEN ESTAR DISPONIBLES A LOS 150 MINUTOS DE LA RECEPCION DE LA MUESTRA.

Autor: ROJAS GONZALEZ ALMUDENA.
Año: 1991.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: MEDICINA LEGAL, PSIQUIATRIA Y SALUD PUBLICA PROGRAMA DE DOCTORADO: MICROBIOLOGIA DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS.

Resumen: SE HAN EVALUADO LOS MEDIOS DE TRANSPORTE DE VIRUS Y EL EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA CONSERVACION DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO. SE HA VALORADO EL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS RESPIRATORIAS PARA INCREMENTAR LA SENSIBILIDAD DE LAS TECNICAS DE CULTIVO CELULAR. SE HAN EVALUADO METODOS INMUNOLOGICOS EN EL DIAGNOSTICO RAPIDO DE LA INFECCION POR SINCITIAL PROBANDOSE VARIOS TESTS DE ENZIMOINMUNOENSAYO COMERCIALES ASI COMO LA TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA. SE HAN ESTUDIADO LAS CONDICIONES OPTIMAS DE REALIZACION DE LA TECNICA DE SHELL-VIAL PARA DIAGNOSTICO DE VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO. FINALMENTE SE REALIZO UN ESTUDIO EPIDEMIOLOGICO PARA BUSCAR PORTADORES ASINTOMATICOS DEL VIRUS.

Autor: DIEZ ANTON JUANA.
Año: 1989.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO BIOLOGIA MOLECULAR CSIC-UAM.

Resumen: DURANTE LA INFECCION PERSISTENTE DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA) SE PRODUCEN MULTIPLES CAMBIOS GENETICOS, ANTIGENICOS Y FENOTIPICOS EN EL VIRUS. VARIAS DE LAS SUSTITUCIONES FIJADAS NO SE ENCUENTRAN EN NINGUN AISLADO VIRAL DEL VFA SECUENCIADO HASTA AHORA. SE PRODUCEN CAMBIOS EN ZONAS ESTRUCTURALMENTE IMPORTANTES DE LA CAPSIDE QUE PROBABLEMENTE REPERCUTEN EN UNA DESESTABILIZACION GENERAL DE LOS VIRINES. MUTACIONES EN LA ZONA QUE CODIFICA LA PROTEINA LIDER PODRIAN ESTAR IMPLICADOS EN LA PARADA DE LA SINTESIS DE PROTEINAS CELULARES. ESTAS VARIACIONES, A SU VEZ, PODRIAN RELACIONARSE CON LA HIPERVIRULENCIA DEL VIRUS PARA LAS CELULAS BNK-21. LOS VIRUS SELECCIONADOS DURANTE LA PERSISTENCIA VIRAL SON ATENUADOS PARA RATON Y BOVINO. EL VIRUS VR100 TIENE UNA VENTAJA SELECTIVA SOBRE EL VIRUS PARENTAL C-58C1 EN INFECCIONES SERIADAS.