GENETICA CLINICA

Autor: CHIRIVELLA GONZALEZ ISABEL.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE VALENCIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE VALENCIA.

Resumen: Determinar la prevalencia de las mutaciones BRCA1 y BRCA2 en el grupo de 124 mujeres con cancer de mama diagnosticado antes de los 41 aqos. Bzsqueda de grupos de riesgo (historia familiar de cancer de mama u ovario) de presentar mutacisn. Estudiar si existe relacisn con las caractermsticas clmnico-patolsgicas. Establecer si los mitodos de prediccisn de probabilidad conocidos son aplicables en nuestro medio. La prevalencia de mutaciones en nuestra muestra es de 5.6%. Las mutaciones en BRCA2 son mas frecuentes que en BRCA1. Dentro del gen BRCA2, son mas frecuentes en el exsn 23. Definimos un grupo de riesgo de presentar mutacisn, denominado "alto riesgo", constituido por pacientes con cancer de mama menores de 41 aqos y un familiar de 1: grado afecto de cancer de mama u ovario, o un varsn en la familia con cancer de mama. No hay diferencias clmnico-patolsgicas excepto en el estadmo. Los mitodos de Myriad II y BRCAPRO son aplicables en nuestra muestra.

Autor: GOMEZ LLORENTE CAROLINA.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Resumen: La Hemocromatosis Hereditaria (HH) es una enfermedad producida por una alteración genética del metabolismo del hierro. Es una de las enfermedades genéticas más frecuentes en la población europea, que afecta a 1 de cada 200-300 individuos. El término hemocromatosis se utiliza para designar aquella situación en la cual, la estructura y función de un órgano resultan dañados como consecuencia de la presencia de cantidades elevadas de hierro en las células parenquimales. La severidad clínica de esta enfermedad es muy variable, la presencia de fatiga es una de las características clínicas constantes, además se pueden encontrar otras manifestaciones clínicas como la artritis, arritmia o fallo cardiaco, diabetes mellitus, cirrosis hepática, hiperpigmentación, hipotiroidismo, hipogonadismo y menos frecuentemente carcinoma hepático.Las características propias de la enfermedad suelen aparecer después de la edad de los 50 años, los síntomas a edades más tempranas son muy heterogéneos y difíciles de detectar. Los síntomas anteriormente descritos son más acusados en varones que en mujeres, habiéndose descrito una proporción hombre: mujer de 3:1 [Moirand R et al; 1997]. En 1996 se descubrió el gen responsable de la HH, llamado HFE [Feder JN et al; 1996]. El gen HFE codifica una proteína integral de membrana de 343 residuos, semejantes a las del complejo mayor de histocompatibilidad de clase 1 tanto en secuencia como en estructura tridimensional. La proteína HFE se encuentra formando un complejo físico con la b2-microglobulina; esta asociación es necesaria para la correcta presentación de la proteína en la superficie celular. La proteína HFE regula la captación de hierro de las células mediante un mecanismo que implica la unión con un receptor de membrana homodimérico (receptor de la transferrina, TfR) dependiente de pH. Se han descrito diversas mutaciones en gen HFE responsables de la HH. La mutación más común descrita es una transición GA en el nucleótido 845, que produce la sustitución de una cisteína por una tirosina en la posición aminoacídica 282 (C282Y). Esta mutación impide la formación de una enlace bisulfuro en el dominio a3 de la proteína HFE, alterándose el plegamiento de la misma e impidiendo su asociación con la b2-microglobulina, y por lo tanto impidiendo su correcta presentación en la superficie celullar [Waheed A et al; 1997]. El 80% de los pacientes con HH son homocigotes C282Y. La asociación de homocigosis para la mutación C282Y con HH depende de la población estudiada, así por ejemplo dentro de la población con ascendencia europea los porcentajes oscilan entre el 64% en pacientes italianos a un 100% en pacientes australianos [Merryweather-Clarke AT et al; 2000]. Una segunda mutación, con una menor influencia clínica, es la mutación H63D que consiste en la transversión CG en el nucleótido 187 dando lugar a la sustitución de una histidina por un ácido aspártico en la posición aminoácidica 63. Esta proteína mutada sí se expresa en la superficie celular, pero no interacciona correctamente con TfR, aunque no se impide esta unión. La mutación H63D se presenta con una frecuencia de 10-20% en la población europea y se ha propuesto que esta mutación predispone para la acumulación de hierro sólo en combinación con otros factores genéticos (heterocigosis con la mutación C282Y) y condiciones medioambientales [Bacon BT et al; 1999][Adams P et al; 2000]. Otra mutación descrita es la S65C, consiste en el cambio de una serina por una cisteína en la posición aminoacídica 65. Se presenta con una frecuencia del 2-3% y es responsable de una forma leve de la enfermedad cuando se hereda en heterocigosis con la C282Y o la H63D [Mura C et al; 1999] La HH es una enfermedad genética con una alta prevalencia en determinadas poblaciones europeas y se caracteriza por un largo periodo latente antes de que se manifiesten las características clínicas. Una detección temprana de las mutaciones responsables de la HH antes de que se desarrolle la enfermedad así como el seguimiento clínico del paciente permite evitar las posible complicaciones derivadas de la deposición de hierro (complicaciones hepáticas, disfunciones cardíacas, endocrinas etc.). La presente tesis describe dos métodos que permiten la detección simultánea de una manera simple, rápida y con una alta discriminación de las mutaciones responsables de la HH usando la electroforesis capilar junto con la detección fluorescente. El primer método se basa en la reacción de extensión de una única base para la determinación simultánea (multiplex) delas mutaciones más comunes asociadas con la HH (C282Y, H63D y S65C). El segundo método se basa en el análisis de las mutaciones C282Y y H63D mediante la reacción de PCR copetitiva alelo-específica. El objetivo del presente trabajo se centra en la puesta a punto de ambos métodos de diagnóstico de las mutaciones responsables de la HH que permitan realizar un análisis genético tanto de pacientes HH como enpersonas de riesgo, o en la población en general con el objeto de poder usarse como una medida preventiva de esta enfermedad. CONCLUSIONES 1.- La elevada especifidad de la incorporación de un sólo ddNTP, catalizado por una DNA polimerasa junto con la electroforesis capilar y detección fluorescente, hace que la reacción de SnPshot sea un método adecuado para la determinación de los polimorfismos de un solo nucleótido responsables de la Hemocromatosis Hereditaria. 2.- El análisis de las mutaciones usando la amplificación alelo-específica desarrollada en este trabajo, junto con la electroforesis capilar y detección fluorescente, permite detectar de una forma rápida y sencilla las mutaciones responsables de la Hemocromatosis Hereditaria. 3.- De nuestro estudio se deduce que el 72,3% de los pacientes con Hemocromatosis Hereditaria son homocigotos C282Y. El estudio genético de las mutaciones C282Y, H63D y S65C junto con los marcadores bioquímicos ferritina sérica y el índice de saturación de la transferrina son elementos necesarios para un correcto diagnóstico de la Hemocromatosis Hereditaria.

Autor: ROYO SANCHEZ-PALENCIA JOSE LUIS.
Año: 2003.
Universidad: PABLO DE OLAVIDE.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES ( EXPEDIENTE TRASLADADO AL DEP. CC. AMBIENTALES).

Resumen: En la presente Tesis Doctoral se tratan distintas estrategias y aplicaciones de la superproducción de proteínas recombinantes en enterobacterias.En un primer capítulo se desarrolla la idea del sistema de expresión en cascada publicado por el Dr. Cebolla en 2001 (Cebolla A, et al; 2001). Seguidamente se implementa dicho sistema para la producción de colorante textil índigo, en cultivos discontinuos continuos, mientras se abordan distintos problemas relativos a la estabilidad del fenotipo superproductor, el fondo genético a usar y la posibilidad de realizar ingeniería metabólica para optimizar el proceso. En los siguientes capítulos se valida el sistema para controlar la expresión de proteínas recombinantes mediante una estirpe de Salmonella typhimurium instalada en su hospedador natural, el ratón. Esta aplicación ha servido para liberar proteínas marcadoras en tumores inducidos artificialmente, ya que estos son diana de determinado tipo de bacterias.Por último se mejora el sistema de expresión en cascada mediante la superimposición de un circuito de regulación de la transcripción a nivel de la elongación. Dicho sistema se conoce como atenuación de la transcripción. Mediante este sistema los niveles de inducción aumentan llegando a ser más de 1700 veces.

Autor: Rodríguez López Raquel C..
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Facultad de Medicina .
Centro de realización: Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas.

Resumen: El cancer de mama es la neoplasia más frecuente entre mujeres. En los últimos años el conocimiento de las bases moleculares de la enfermedad se ha ampliado de manera considerable, distinguiendo diferentes grupos de pacientes, relacionados con específicos perfiles genéticos de riesgo heredado a padecer la enfermedad. En el presene trabajo hemos analizado un total de 822 casos de cancer de mama no familiares, 136 casos clasificados como de agregación familiar y 68 casos familiares de alto riesgo, previamente analizados para los genes de alta susceptibilidad BRCA1 y BRCA2 relacionados con el síndrome de cancer de mama y/u ovario familiar, con el objetivo de buscar nuevos genes de predisposición al cancer de mama. En la población analizada, hemos identificado cuatro genes implicados en la enfermedad que podrían constituir una magnífica herramienta en clínica como marcadores biológicos utilizables en medicina predictiva (identificación de población a riesgo de enfermar, entre las población general) y en predicción de pronóstico y evolución en los grupos de pacientes (correlación entre los genotipos analizados y los fenotipos de la enfermedad identificados). Finalmente hemos demostrado la existencia de una base poligénica y en asociación con factores de riesgo no genéticos, como base de la gran mayoría de los casos no familiares, descritos en el total de casos de cancer de mama. Hemos establecido nuevos aspectos bioéticos relacionados con la práctica de la medicina predictiva, mediante el análisis de variantes genéticas comunes en grandes poblaciones.

Autor: ALONSO SANCHEZ ANGEL MIGUEL.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y HOSPITAL RAMON Y CAJAL.

Resumen: Antecedentes: La poliposis adenomatosa familiar (FAP) es una predisposición genética a la aparición de cientos a miles de adenomas en el intestino grueso de pacientes en los que la probabilidad de malignización es cercana al 100%. La FAP exhibe además una serie de manifestaciones extracolónicas como, poliposis gastrointestinal, hipertrofia congénita del epitelio pigmentario de la retina, tumores desmoides, osteomas y quistes odontogéicos y otros tumores extraintestinales que completan su espectro clínico. Mayoritariamente está causada por mutaciones germinales en el gen APC, de modo que la identificación presintomática de estas mutaciones permite el establecimiento de relaciones genotipo-fenotipo y el diseño de medidas de prevención y tratamiento profiláctico que evitan la aparición del cáncer colorrectal y aumentan la supervivencia de los sujetos en riesgo. Objetivos: 1.- Definir las características clínicas y moleculares de la FAP. 2.- Diseñar un test genético de screening de mutaciones en APC. 3.- Establecer relaciones genotipo-fenotipo. 4.- Evaluar la eficacia del estudio de mutaciones en APC para prevenir el cáncer colorrectal en la FAP. Material y Métodos: Información clínica de 405 individuos, 214 afectos y 191 sujetos en riesgo pertenecientes a 101 familias españolas con FAP clásica. Despistaje de mutaciones del gen APC mediante técnica de análisis de heteroduplex en 50% de región codificante o en regiones recurrentes. Resultados más relevantes y conclusiones: El número de adenomas del colon se asocia con una menor edad al diagnóstico de FAP, más alta incidencia y debut más precoz del cáncer, y una edad de fallecimiento más prematura. La probabilidad de desarrollar cáncer colorrectal en la FAP se asocia con una edad de diagnostico: P (probabilidad de presentar cáncer)= 1/1+ e -(-2,852+0,06x edad de diagnóstico) y de intervención quirúrgica más tardías: P (probabilidad de presentar cáncer)= 1/1+ e -(-2,792+0,094x edad de intervención). La valoración de la hipertrofia congénita del epitelio pigmentario de la retina mediante oftalmoscopia indirecta es una técnica útil como apoyo a la rectosigmoidoscopia flexible para anticipar la edad de diagnóstico de la FAP (VPP=95,5%; IC95=89,5-101,6), pero no puede ser utilizada como criterio único de exclusión en el diagnóstico presintomático de la FAP (Especificidad=73,9%; IC95=56-91,8). La técnica descrita en este estudio, basada en el estudio mediante análisis de heteroduplex de regiones seleccionadas del gen APC, es una técnica práctica y sencilla que permite identificar la mutación causal en el 38%; IC95=50,28-25,7 de las familias con FAP clásica analizadas. La mutación 4386delAGAG en el codon 1462 tiene una incidencia peculiarmente alta en la población española con FAP clásica con respecto a otras poblaciones analizadas, mientras que el resto de las mutaciones germinales en el gen APC tienen una incidencia y distribución semejante. La mutación 4386 del AGAG en el codon 1462 es la que causa el genotipo de poliposis colónica más severo de todas las analizadas, incluida la denominada 1309 (3926 del AAAAC), y la que causó una más amplia afectación multisistémica de las identificadas en esta serie. Se han identificado casos que manifiestan hipertrofia del epitelio pigmentario de la retina con mutaciones localizadas en el codon 1462, que está fuera de la región consenso asociada con esta manifestación. El estudio presintomático permite disminuir la edad de diagnóstico, y aumentar el tiempo de permanencia libre de cancer (p=0,04), en los sujetos en riesgo pertenecientes a familias con FAP clásica. El estudio presintomático de mutaciones en el gen APC y la evaluación oftalmoscópica del epitelio pigmentario de la retina, son dos técnicas que permiten disminuir la edad de diagnóstico en mayor medida, si bien solo la primera es capaz de establecer el diagnóstico de "no afecto" de modo presintomático con fiabilidad, a cualquier edad.

Autor: JIMENEZ TREVIÑO LUIS.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA Y HOSPITAL RAMON Y CAJAL.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y HOSPITAL RAMON Y CAJAL.

Resumen: Introducción: El suicidio es un problema de gran impacto en la sociedad occidental y se encuentra entre las 10 causas de muerte más frecuentes en la mayoría de los países occidentales. Las conductas suicidas emergen de la combinación de una predisposición genética y la actuación de determinados estresantes ambientales. El presente trabajo trata de buscar una posible asociación entre las conductas suicidas y el gen de la subunidad a3 del receptor GABA-A (GABRA3), al ser el GABA el neurotransmisor principal en la ansiedad y respuesta a estrés en el ser humano. El gen GABRA3 se localiza en la región Xq28 del cromosoma X, y se ha identificado un polimorfismo por repetición de nucleótidos. Material y métodos: Se trata de un estudio de asociación de las variantes alélicas del gen GABRA3, comparando intentos de suicidio con controles sanos. La muestra está compuesta por 371 casos (66% mujeres, 34% varones) y 488 controles (39.8% mujeres, 60.2% varones). Resultados: No hay una distribución genotípica diferente entre los casos y controles en cuanto a las variantes alélicas más frecuentes del gen GABRA3, tanto en hombres como en mujeres. Existe una relación entre la homocigosis para el alelo 169 y la impulsividad de los intentos en las mujeres (p menor que 0.05). No se observa una distribución genotípica diferente entre los intentos en función de la letalidad ni de la presencia de clínica depresiva. La variante alélica 169/167 está infrarrepresentada en los pacientes con un trastorno de ansiedad asociado (p menor que 0.05), trastornos de personalidad cluster B asociados (p menor que 0.05), y en el grupo de alta respuesta a estrés (p menor que 0.005). Conclusiones: Ninguno de los genotipos GABRA3supone un marcador de riesgo de cometer una tentativa suicida. La presencia del genotipo 169/167 se asocia a un tipo de intento de suicido específico, sin trastornos de ansiedad o personalidad concomitantes y en ausencia de un acontecimiento desencadenante.

Autor: CANTOS APARICIO MIGUEL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ.

Resumen: En este trabajo se analiza la relación del genotipo de apolipoproteína E con la cardiopatía isquémica atendiendo a su distribución en cuatro regiones españolas con muy diferentes tasas de mortalidad coronaria: Madrid, Orense, Cádiz y Murcia. Se trata de una población infantil (6-8 años) y amplia (1255 niños). Se constató que la prevalencia del genotipo e3e4 y del alelo e4 en España es baja, como corresponde a un país con baja mortalidad coronaria, pero a la ez es heterogénea, pudiendo hablarse de la existencia de un gradiente norte-sur en la prevalencia de la cardiopatía isquémica que coincide con el gradiente norte-sur de este genotipo e3e4 y del alelo e4. Pese a que la influencia del genotipo de la apolipoproteína E en la aterosclerosis coronaria se realiza a través de las concentraciones de lípidos deben existir además otros mecanismos de acción. En todo caso es indudable la relación entre este genotipoe3e4 y la hiperlipemia.

Autor: GARCÍA RUIZ JOSE MIGUEL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El cáncer colorrectal (CC) constituye aproximadamente el 15% de los tumores diagnosticados en el hombre. Existen una serie de factores de riesgo bien establecidos, como son: edad superior a 40 años, existencia de adenomas previos, colitis ulcerosa, colitis granulomatosa y predisposición genética, aunque aproximadamente el 90% de los casos de CC son esporádicos. El 10% restante son hereditarios, presentándose bajo dos formas bien caracterizadas, poliposis adenomatosa familiar y cáncer hereditario no polipósico, aunque existen otros síndromes que incluyen entre sus caracaterísticas el desarrollo de CC, así en estudios epidemiológicos se observó mayor incidencia de CC en familias relacionadas con el gen BRCA1. Este gen codifica una proteína multidominio de 1863 aminoácidos que aparece involucrada en una gran cantidad de procesos celulares como son: mantenimiento de la integridad genómica, control del ciclo celular, duplicación de los centrosomas, regulación transcripcional, regulación de la proliferación celular y remodelación de la cromatina. En el presente trabajo hemos estudiado la frecuencia de pérdidas alélicas en el locus de BRCA1 en una serie de pacientes diagnosticados de CC y su valor como factor pronóstico de la enfermedad. El 39.8% de los pacientes presentaban pérdidas de heterocigosidad (LOH) en el locus de BRCA1, siendo la frecuencia de recaídas en este grupo significativamente mayor que en el grupo sin LOH (p=0,0003). De la misma manera la superviviencia libre de enfermedad fue significativamente mayor entre los pacientes sin LOH (p=0,0004), resultados que se mantenían en estadíos I (p=0.03) y II (p=0.001). La presencia de LOH también se asoció con una menor supervivencia global (p=0.02). El análisis multivariante en la serie completa mostró que el estadío y la afectación ganglionar eran factores pronósticos independientes, sin embargo el estudio por estadíos reveló que la LOH en BRCA1 era unf actor pronóstico independiente en estadíos I y II. El 31.7% de los tumores presentaban patrones heterogéneos para la distribución de las LOH en los marcadores de la región 17q21, mientras que la heterogeneidad llegaba hasta el 72% en marcadores de la región 10q23, una región elegida como punto de refernecia. Las LOH en ambas regiones estaban altamente relacionadas (p menor 0,001) y parecían seguir unpatrón secuencial de aparición. Posteriormente observamos que esta gran heterogeneidad en la distribución de las anomalías podía ser la causa de las discordancias entre los resultados obtenidos en el análisis de las anomalías en ADN libre en plasma y lo obtenido en los respectivos tumores. También hemos analizado la expresión del gen, comprobando que existe una expresión diferencial de los extremos del mismo en un 50% de los casos estudiados, frecuencia que asciende hasta el 86,7% entre los tumores con LOH. Además, hemos observado una correlación estadística entre la pérdida de expresión de BRCA1 y el estadío del tumor (p=0,01). Por último hemos comprobado que la metilación del promotor de BRCA1 no es un mecanismo de silenciamiento de este gen. Tampoco se ha observado que exista ninguna relación entre los niveles de expresión de BRCA1 y de ZBRK1 , proteína sobre la que actúa como cofactor.

Autor: BENAVENTE CUESTA CELINA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: INTRODUCCIÓN La anemia de Fanconi (AF), es una enfermedad congénita transmitida por herencia autosómica recesiva, caracterizada por múltiples anomalías músculo-esqueléticas y cutáneas, fracaso de la médula ósea y predisposición del cáncer. El diagnóstico estándar se basa en el incremento de la fragilidad cromosómica espontánea de las células de estos enfermos ante la presencia de agentes alquilantes como la mitomicina C o diepoxibutano. En los últimos años se han identificado 8 subtipos genéticos (FAA-FAH). El primer gen secuenciado fue el gen FANCC, el subtipo genético FA-C engloba un 12-15% del total de los enfermos con AF, siendo las mutaciones más frecuentes de este gen la IVS4+4 A>T y 322 del G (84%). El segundo gen que se secuenció fue el gen FANCA, el subtipo genético FA-A es el más frecuente y engloba en torno a un 60-66% de los pacientes con AF y presenta una amplia variabilidad en cuanto a las mutaciones encontradas, hasta más de 70 mutaciones descritas. OBJETIVO Introducción de técnicas de Biología Molecular para el estudio de las mutaciones más frecuentes de los genes FANCC y FANCA de los pacientes españoles con AF. MATERIAL DNA genómico extraído de sangre periférica de 21 pacientes diagnosticados de AF mediante características clínico/hematológicas y test de fragilidad cromosómica inducida positivo (5 de los cuales tenían alta sospecha diagnóstica con test cromosómico no concluyentes). MÉTODOS Para el estudio de las mutaciones IVS4+4-T y 322delG del gen FANCC se utilizó la técnica PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Para el estudio del gen FANCA se utilizó la técnica RNA-SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) para el screening de mutaciones de cada exón y en caso de sospecha se realizó secuenciación directa del mismo. RESULTADOS No se ha identificado ninguna de las dos mutaciones estudiadas del gen FANCC en ningún paciente. Del gen FANCA se han identificado un total 7 mutaciones diferentes en 12 de los 21 pacientes estudiados (uno de los cuales no tenían test de fragilidad cromosómica inducida concluyente). CONCLUSIONES En una serie de 21 pacientes españoles diagnósticados de AF no se ha detectado ninguna de las mutaciones más frecuentes del gen FANCC (IVS+4 A-T y 322delG) lo cual nos hace sospechar que la fecuencia de este subtipo genético es muy baja en nuestro país o bien las mutaciones que presentan son diferentes a las estudiadas. La técnica RNA-SSCP es una técnica sensible para detectar pequeñas mutaciones (total de 15 mutaciones en 21 pacientes estudiados, 13 en 16 pacientes con AF con test cromosómico positivo), cuyos resultados son comparables a la de otros grupos. Se ha detectado una mutación que produce AF en un paciente con test de fragilidad cromosómica negativo por lo que estaría indicado el estudio molecular en los pacientes con una alta sospecha clínica aunque este test no sea positivo.

Autor: FERNÁNDEZ HOJAS ROBERTO .
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA .

Resumen: Las glucogenosis musculares, constituyen un amplio grupo de enfermedades, poco frecuentes, genéticamente determinadas y causadas por el déficit de determinadas enzimas que intervienen en el metabolismo del glucógeno. Actualmente se conocen más de diez tipos diferentes de glucogenosis musculares, cuya herencia en su mayoría es AR. Las mutaciones en los genes que codifican estas enzimas, originan déficits o ausencia total de expresión enzimática, originando depósitos de glucógeno en diversos tejidos, dependiendo del tipo de glucogenosis. En esta Tesis Doctoral se han estudiado los apsectos clínico-patológicos y genéticos de la glucogenosis II y V. La glucogenosis II o déficit de maltasa ácida, de herencia AR , presenta tres fenotipos clínicos, diferenciados por la edad de inicio, progresión de la enfermedad y edad de muerte, siendo ésta la única glucogenosis de depósito intralisosomal. La forma infantil o enfermedad y edad de muerte, siendo ésta la única glucogenosis de depósitos intralisosomal. La forma infantil o enfermedad de Pompe, es multisistémica, los tejidos más afectados son el micoardio, músculo esquelético, hígado y SNC. La glucogenosis V, déficit de miofosforilasa o enfermedad de McArdle, de herencia AR, es una miopatía de inicio en la adolescencia, cuyo principal síntoma clínico es la intolerancia al ejercicio. El déficit enzimático cuasante de esta enfermedad, origina depósitos de glucógeno libre de estructura normal que afectan única y exclusivamente a las fibras del músculo esquelético. Se han estudiado tres pacientes con la clásica forma infantil de la glucogenosis II o enfermedad de Pompe, dos fetos, en los que se realizó diagnóstico prenatal de esta enfermedad a través de biopsia de vellosidades coriónicas, a nivel ultraestructural, bioquímico y genético, un paciente con la forma del adulto y 30 casos de enfermedad De McArdle. Se realizó un estudio clínico y neurofisiológico exahustivo junto con las biopsias de músculo esquelético, piel y otros tejidos obtenidos postmorten. Se extrajo DNA de sangre o tejido congelado, tras consentimiento informado, para estudio de los genes de la maltasa ácida (GAA, 17q23) y de la miofosforilasa (PYGM, 11q13), mediante PCR y secuenciación automática por electroforesis capilar, para determinar la/s mutaciones responsables de la enfermedad en los pacientes y familiares que lo desearon para establecer o no la condición de portadores heterozigotos. En las familias en las que previamente se habían identificado la/s mutaciones responsables de la enfermedad, el diagnóstico de otros miembros afectos se estableció directamente a través del estudio genético, evitando de esta forma la realización de biopsias. Los pacientes con glucogenosis II, presentaron un cuadro clínico y neurofisiológico homogéneo similar al descrito en la literatura. El principal hallazago histopatológico es la presencia en diversos tejidos y células de acúmulos masivos de glucógeno intralisosomal. En los pacientes infantiles se identificaron seis nuevas mutaciones de distintos tipos en el gen GAA (Y191X, G219R, E262K, M408V, A1408-1410, IVS 18 +2t-a), no pudiéndose establecer una correlación fenotipo-genotipo. Estos hallazgos son concordantes con los descritos en la literatura, siendo una enfermedad genéticametne muy heterogénea. El cuadro clínico y neurofisiológico en los pacientes con enfermedad de McARdle es relativamente homogéneo. Todos los pacientes muestran curva plana de láctico tras el ejercicio del antebrazo en isquemia. A nivel histopatológico presentan una miopatía vacuolar con negatividad para la miofosforilasa. Genéticamente es una enfermedad heterogénea, sin embargo, la mutación R49X se ha identificado en el 70% de los pacientes, en al menos uno de los alelos del gen PUGY, seguida de la mutación W797R (16,5%), únicamente descrita hasta el momento en pacientes españoles y en tercer lugar la mutación G204S. En uno de los pacientes se identificó una nueva mutación privada (L115P). De igual forma que en la glucogenosis II, no existe una correlación clara entre el fenotipo y genotipo. PALABRAS CLAVE Enfermedad de Pompe, glucogenosis tipo II, maltasa ácida, enfermedad de McArdle, miofosforilasa, glucogenosis tipo V.

Autor: HERNANDO ACERO INÉS.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FAC. DE MEDICINA DE OVIEDO.

Resumen: La enfermedad de Huntington (EH) es un trastorno neurogenerativo autosómico dominante caracterizado por movimientos anormales involuntarios (generalmente en forma de corea), demencia progresiva y alteraciones psiquiátricas. La mutación subyacente es una expansión de un trinucleótido repetitivo CAG en la región 5' del gen IT15 por encima del rango normal de 35 ó menos repeticiones. Hemos recogido los datos clínicos de 64 pacientes asturianos con EH confirmados mediante genética molecular: el comienzo en la edad adulta fue el más frecuente (n=36; 56,25%) mientras que el resto se manifestaron como formas de comienzo juvenil (n=5; 7,8%) o Tardío(n=23; 36%). Se realizó el análisis molecular del segmento repetitivo en los pacientes y en controles normales. El número de repeticiones osciló entre 38 y 92 en los sujetos afectados y entre 12 y 34 en los controles normales. Se encontró una correlación significativa inversa entre el número de repeticiones CAG y la edad de comienzo de la enfermedad (r= -0,684). El tamaño de la expansión se mostró inestable en el 60% de las transmisiones meióticas, siendo mayores las expansiones en los casos de transmisión a través del padre. Los pacientes que heredaron la enfermedad a través de sus padres tuvieron un número de repeticiones medio superior a los que la heredaron a través de su madre. Por otro lado, se analizaron los polimorfismos CCGn y A2642 del gen encontrando un desequilibrio de ligamiento entre la expansión del triplete CAG y el alelo de siete repeticiones CCG. La EH tiene unas tasas de prevalencia variable en diferentes partes del mundo siendo más frecuente en países de origen europeo occidental con tasas de prevalencia entre 5 y 10 por 100.000. En España se han realizado pocos estudios epidemiológicos de la enfermedad, ninguno de ellos en Asturias. En este estudio, hemos encontrado una tasa de prevalencia de la EH en Asturias en 1996 de 5,8 x 100.000 y una incidencia de 0,34 x 100.000. Hemos realizado un estudio retrospectivo de nuestra experiencia en Diagnóstico Presintomático para EH. En el periodo comprendido entre 1993 y 2001, se han realizado 41 estudios genético moleculares en individuos con riesgo para la enfermedad cuya edad media fue de 31,6 años, 27% ya tenían descendencia en el momento de acceder al estudio. Se encontró que el 39% eran portadores de una expansión relacionada con la enfermedad y no hubo eventos catastróficos, como pudiera ser un incremento de la frecuencia de suicidio, tras la revelación del resultado.

Autor: CHILLÓN SANTOS M. CARMEN.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: OBJETIVOS Estudio molecular de las t(15;17), t(8;21), inv(16) y de las alteraciones de la región 11q23 (gen MLL) en una serie de leucemias mieloblásticas agudas (LMA) para analizar su incidencia y sus correlaciones clínico-biológicas, morfológicas (FAB), fenotípicas y pronósticas. PACIENTES El estudio molecular se realizó en una serie de 265 pacientes con LMA de nuevo diagnóstico; los estudios de supervivencia se analizaron en 241 casos que fueron tratados con intención curativa, y finalmente, el análisis de incidencia se llevó a cabo en 145 LMA que fueron remitidas a nuestro laboratorio de forma consecutiva y sin ningún tipo de selección morfológica y/o clínica. MÉTODOS El estudio de las t(15;17), t(8;21) e inv(16) se realizó a partir de ARMm transformado en ADNc mediante transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR), de acuerdo con las recomendaciones del grupo europeo de estandarización BIOMED-1 (Leukemia, 1999, 13: 1901-1928). El estudio de la región cromosómica 11q23 se efectuó mediante Southern-blot utilizando una sonda de ADNc de 0,8Kb correspondiente al gen MLL. RESULTADOS La incidencia de la t(15;17), t(8;21), inv(16) y alteraciones de 11q23 fue de 23,5%, 1,4%, 6,2% y 3,4%, respectivamente. Se detectó asociación morfológica entre la presencia del tránscrito PML-RARa y LMA-M3 en el 99% de los casos, existiendo un 12% de falsos positivos morfológicos, asociación entre el AML1-ETO y LMA-M2 en el 100%, entre el CBFb-MYH11 y LMA-M4Eo en el 92% y entre los reordenamientos del gen MLL y LMA monocitarias en el 50%. La supervivencia global (SG) a los 3 años, fue significativamente mejor en los pacientes PML/RARa y CBFb/MYH11 positivos (66% y 50%, respectivamente), que en el resto de grupos (40%, 33%, 24% para AML1/ETO, MLL y negativas, respectivamente). En el análisis multivariante, las variables que se asocian con una SG más prolongada fueron: t(15;17) (p

Autor: BROCH MONTANÉ MONTSERRAT.
Año: 2002.
Universidad: ROVIRA I VIRGILI.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA I CIÈNCIES DE LA SALUT.

Resumen: Esta tesis está formada por 4 artículos originales publicados en revistas internacionales. La Diabetes mellitus tipus 2(DM2) es una enfermedad heterogenea causada principalmente por la disminución de la acción de la insulina (lo que llamamos resistencia a la insulina) y por el deterioramiento de la función de las células beta. La DM2 y la obesidad se hallan íntimamente relacionadas. Así, el tejido adiposo es capaz de sintetizar y secretar diversas moléculas que se han visto implicadas en la modulación de la sensibilidad a la insulina de los diferentes tejidos insulino sensibles. Entre estas moléculas, llamadas en general adipoquinas, estan las citocinas factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa y la interleucina (IL-6). El TNFalfa actua a través de dos receptores de membrana (TNFR1 y TNFR2). La unión de la citocina a sus receptores forma, mediante la proteolisis de la región citoplasmática de estos, las fracciones solubles (sTNFR1 y sTNFR2). Los estudios "in vitro" (células adipocitarias, musculares o líneas preestablecidas) demuestran que la infusión de esta citocina inhibe, a través de diversos mecanismos moleculares, el transporte de glucosa al interior de la célula mediada por insulina. Estudios "in vivo" en experimentación animal con obesidad y/o diabetes inducida genéticamente confirman una sobreexpresión de la citocina en el tejido adiposo y niveles circulantes de la proteína mas elevados. Hasta el momento, en humanos, se ha demostrado una sobreexpresión de TNF(y de su receptor 2 en tejido adiposo y niveles de las sTNFR2 circulantes aumentados. Esta sobreexpresión de relación a positivamente con el indice de masa corporal y los niveles de insulina, dos marcadores de resistencia a la insulina. Enb ase a estos estudios mencionados, presentamos dos trabajos los objetivos de los cuales fueron estudiar el sistema TNFalfa y su relación con la sensibilidad a la insulina. - En una población obesa (BMI>30C el cual se asocia a diferentes tasas de transcripción. Los estudios que se presentan en relación a esta citocina son: - En esta población obesa (BMI< 40 kg/m2) se analiza el polimorfismo derestricción -174G>C del gen de la IL-6 en relación a la composición corporal y la sensibilidad a la insulina. Los individuos protadores del alelo G, a pesar de ser comparables en edad, masa grasa y masa muscular, presentan niveles de disminución de la sensibilidad a la insulina. - La misma población que el estudio anterior se caracteriza de un perfil lipídico y se determinan los niveles de la IL-6. Los individuos portadores del alelo G presentan niveles mas altos de trilicéridos y de ácidos grasos libres antes y después del test OGTT comparados con los no portadores. Los niveles de IL-6 correlacionaron positivamente con estos parámetros lipídicos. Las conclusiones de esta tesis son: 1.- Determinación de los niveles de sTNFR2 podría ser marcador de resistencia a la insulina. 2,- La región 3'UTR del gen del TNFR2 podría ser marcador genético asociado al síndrome metabólico 3,- El polimorfismo de restricción -174G>C del gen de la IL-6 podría participar en la predisposición genética del grado de resistencia a la insulina y de los niveles lipídicos.

Autor: GÓMEZ ESQUER FRANCISCO ANTONIO.
Año: 2002.
Universidad: REY JUAN CARLOS.
Centro de lectura: CIENCIAS DE LA SALUD.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: El cáncer de mama humano es en la actualidad la neoplasia femenina más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Aunque no se conoce la verdadera etiología de la enfermedad, si se han establecido una serie de factores de riesgo que intentar seleccionar aquellas personas con mayor probabilidad de desarrollar esta patología. Sin embargo una vez que la enfermedad que se ha establecido, es necesario la existencia de una serie de factores pronóstico que sirvan para predecir la evolución de la enfermedad, y por tanto de la paciente. Aunque existen una gran variedad de factores pronóstico en cáncer de mama, hay que tener en cuenta que el cáncer en general y el cáncer de mama en particular es una enfermedad sumamente compleja y multifactorial, por lo que la información obtenida a partir de un solo fctor pronóstico nos aporta una información muy limitada sobre la biología de la enfermedad. Esto hace que muchos esfuerzos se estén centrando en descubrir nuevos factores de riesgo que por si solos o en conjunto permitan predecir la evolución de la enfermedad de una forma exacta. En este contexto, en el presente trabajo se ha tratado de evaluar los niveles de expresión del gen RBMX como posible factor pronóstico en cáncer de mama humano. Resultados obtenidos recientemente en nuestro laboratorio con un gen homólogo, RBM10, así como una serie de antecedentes existentes en la literatura, hacían factible este objetivo. Los estudios de expresión se han realizado mediante la utilización de la técnica de RT-PCR semicuantitativa, y los resultados obtenidos se han sido enfrentado a factores pronósticos utilizados de forma rutinaria en cáncer de mama. Los resultados han encontrado una fuerte correlación estadística entre tejido tumorales con elevada expresión del gen RMMX y tumores que presentaron baja expresión del gen de la endoglina humana (EDG/CD105). Elevados niveles de expresión de EDG/CD105 han sido correlacionado con una mayor posibilidad de desarrollar metástasis a distancia y con una menor supervivencia de las pacientes en cáncer de mama. Estos resultados, junto a los obtenidos en el caso de RBM10 parecen relacionar unos elevados niveles de expresión de estos genes, con la expresión de un fenotipo tumoral menos agresivos en cáncer de mama humano.

Autor: AGUDO GARCILLÁN DAVID.
Año: 2002.
Universidad: REY JUAN CARLOS.
Centro de lectura: CIENCIAS DE LA SALUD.
Centro de realización: UNIVERSIDAD REY JUAN CARLOS.

Resumen: El cáncer de mama es la neoplasia femenina más frecuente y la causa más común de muerte por cáncer en mujeres a lo largo de todo el mundo. Más del 9% de las mujeres desarrollan esta enfermedad a lo largo de su vida. En la actualidad no se conocen las causas que originan el cáncer de mama, pero existen factores, tanto exógenos como endógenos, que se asocian con un incremento de la enfermedad. Dentro de estos factores, podemos destacar la existencia de alteraciones benignas previas, factores ambientales, genéticos y hormonales. El conocimiento de la extensión de la enfermedad es muy importante para una primera aproximación al pronóstico. Para saber cuál es el grado de extensión de carcinoma de mama, contamos con una serie de factores pronósticos que nos indican el estadio en que éste se encuentra. De todas maneras, para cada paciente en particular el curso de la enfermedad es impredecible; unas mueren por enfermedad metastática en un año, mientras que otras con tumores con características aparentemente similares sobreviven durante décadas. Debido a esta marcada variabilidad, hay un considerable interés en la identificación de características predictivas del comportamiento del tumor que ayuden a establecer una terapéutica más racional y efectiva. Nup88 El denominado "complejo del poro nuclear" está constituido por una serie de proteínas, que parecen ser tanto puramente estructurales, como funcionales. El gen que codifica para una de ellas. Nup88 (de "88 KDa nuclear pore complex protein") ha sido recientemente clonado. Poco tiempo después, se demostró que dicha proteína está sobreexpresada tanto en líneas celulares tumorales, como en tumores sólidos humanos, y más concretamente en el cáncer de ovario. Nup88 s ehalle en 17p13, región que se pierde por delección con frecuencia durante la oncogénesis, y que contiene, entre otros genes oncosupresores, p53. Nuestra hipótesis de trabajo, por tanto, es que Nup88 puede estar así mismo implicada, directa o indirectamente, en mecanismos de oncosupresión. En un trabajo piloto, demostraron que Nip88 está sobreexpresada en cáncer de mama, donde su papel no parece ser estrictamente superponible al que juega en cáncer de ovario. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la expresión del gen Nup88 en una serie de muestras tumorales, para comprobar si tenía alguna relación con el desarrollo de un carcinoma típicamente femenino, como es el de mama. Para alcanzar el objetivo planteado, utilizamos la RT-PCR como técnica analítica; además realizamos el estudio de factores pronósticos en las muestras tumorales; - De primera generación; variedad histológica, grado histológico, grado nuclear, invasión ganglionar. - De segunda generación; expresión de receptores de estrógeno y progesterona. - De tercera generación; expresión del oncogén c-erb-B2, del oncosupresor p53 y del factor de proliferación ki67. - Ciclo celular. - Genes expresados exclusivamente de mama, indicativos de buen pronóstico (h-MAM). Finalmente, estudiamos la correlación de la expresión de Nup88 con los factores pronósticos antes mencionados mediante RT-PCR semicuantitativa, hemos posido comprobar como la sobreexpresión de Nup88 se relaciona con un tipo histológico ductal infiltrante, un alto grado histológico y nuclear, con la ganglionar axilar, con tumores aneuploides y que presenten un alto índice de proliferación (Ki67), sobreexpresión de c-erb-B2, p53 mutado y que presenta una relación inversa con la expresión de receptores hormonales (de estrógenos y progesterona) y con la expresión del gen de la mamaglobina. Por tanto la elevada expresión de Nup88 en neoplasias infiltrantes de mama se correlaciona con un fenotipo tumoral más agresivo, por lo que podría ser considerado como un nuevo factor predictivo en cáncer de mama. No obstante será necesario profundizar en el estudio de la función de Nup88 para poder explicar la causa de esta inesperada relación con el cáncer.

Autor: NUÑEZ VILLAR M. JOSE.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El gen de la mamoglobina codifica para una proteína de 10 Kda, que en tejidos humanos adultos tan solo ha sido detectada en la mama. Nuestro objetivo ha sido la detección del gen h-MAN en muestras tumorales y la correlación de dicha expresión con parámetros biológicos de primera generación (variedad histológica, grado histológico y nuclear, e invasción ganglionar), segunda generación (receptores de estrógenos y progesterona) y tercera generación (p53, Ki67 y c-erbB-2), así como con la ploidía y el contenido de DNA, y marcadores de angiogénesis (VEGF) y apoptosis (Bcl-2 y Bax).

Autor: YUGUEROS FERNANDEZ M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, UNIV. DE VALLADOLID.

Resumen: Se han estudiado una serie de factores genéticos (polimorfismos de genes de citoquinas) e inmunológicos en pacientes con esclerosis múltiple, población sana y también se han relacionado con las formas evolutivas de la enfermedad (formas recurrentes-remitentes, progresivas primarias, progresivas secundarias y recurrentes-progresivas). Los polimorfismos de genes de citoquinas estudiados son: TNFalfa(-308), TNFbeta(+249), TGFbeta1 (CODON 10 y 2,5), IFNy (+874), IL-6(-174) E IL-10(-1082), también se han determinado los niveles séricos de los siguientes factores solubles: IL-12 (p40), IL-10, IFNy E ICAM-1, además de relacionar los factores genéticos e inmunológicos entre sí. No se han encontrado diferencias en ningún marcador genético entre el grupo de pacientes y la población control; sin embargos sí se han encontrado diferencias al comparar las distintas formas evolutivas entre sí, especialmente en los polimorfismos del TNFalfa y TNFbeta: La presencia aislada del alelo 2 del TNFalfa y del ALELO1 del TNFbeta suponen un factor de reisgo para desarrollar una forma evolutiva de inicio progresivo de la enfermedad. Este riesgo es mayor por la presencia simultánea de ambos alelos ó de alguno de ellos con el ALELO a de la IL-10 ó el ALETO T del IFNy. El ALELO2 del TNFalfa se asocia además a un mayor índice de progresión de la enfermedad y especialmente en el caso de homozigosis. Respecto al estudio sérico,los pacientes tienen menor nivel de IL-10 que la población control, y especialmente aquellos con formas progresivas primarias y progresivas secundarias. No hay diferencias entre el resto de los factores estudiados entre pacientes y población control, aunque los niveles de ICAM-1 son mayores en las formas recurrentes-remitentes. No hay, sin embargo, relación entre los niveles de los factores solubles estudiados y el índice de progresión en ninguna de las formas clínicas de la enfermedad. En resumen, la presencia de algunos polimorfismos de genes de citoquinas estudiados, de forma aislada ó simultánea podrían ser utilizados como marcadores de riesgo ó indicadores de la evolución de la enfermedad.

Autor: RODRÍGUEZ SÁNCHEZ M. BELEN.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En la iniciación y desarrollo de un turmo participan por igual factores ambientales y ciertas características genéticas que permiten a la célula contrarrestar los efectos producidos por los primeros. La fosfoproteína codificada por el gen supresor de tumores TP53 se expresa en respuesta al daño producido en el DNA, activando genes reparadores del DNA o inductores de la apoptosis. Por otro lado, ciertos compuestos lipofílicos presentes en el medio ambiente o producidos durante el metabolismo celular, son capaces de unirse al ADN y producir cambios en su estructura que podrían llevar a la aparición del fenotipo tumoral. El hígado, principal órgano encargado de la eliminación de estos compuestos, posee un conjunto de enzimas que llevan a cabo reacciones de reducción, oxidación, transferencia de grupos azufre, glutation, etc, con el fin de convertir estos compuestos en otros más fáciles de eliminar. En este trabajo hemos analizado la presencia de mutaciones en las regiones conservadas evolutivamente del gen TP53 en 119 tumores del Sistema Nervioso Central (SNC), así como la incidencia de polimorfismos en los intrones, 1,3,6 y 7 y en el exón 4 de dicho gen, asociados con una mayor predisposición a padecer otros tipos de cáncer. También hemos estudiado la incidencia de los polimorfismos presentes en cuatro enzimas metabolizadoras de compuestos cancerígenos (CYP2D6, GSTM1, GSTP1 y GSTT1). Los resultados obtenidos indican que las mutaciones en el gen TP53 son poco frencuentes y, por tanto, desempeñan un papel secundario en el desarrollo de estos tumores. Además el alelo Pro72 de este gen está más representado en individuos sanos, lo que parece indicar que este alelo confiere cierto efecto protector frente al desarrollo de estos tumores. Por último, portar simultáneamente el gen GSTT1 y el alelo A1 ("buen metablizador") del gen CYP2D6 se asocia con una mayor predisposicion a padecer tumores del SNC.

Autor: GARCIA GARCIA ANA-BARBERA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CITOLOGICAS.

Resumen: LA HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR (HF) ES UNA ENFERMEDAD AUTOSOMICA MUY FRECUENTE QUE FAVORECE EL DESARROLLO DE ARTERIOSCLEROSIS. EN LA MAYORIA DE LOS CASOS SE DEBE A MUTACIONES EN EL GEN QUE CODIFICA EL RECEPTOR DE LDL (RLDL). EL DIAGNOSTICO RUTINARIO ES CLINICO-BIOQUIMICO, Y DADOS LOS INCOVENIENTES QUE PRESENTA, SE COMPLEMENTA CON EL DIAGNOSTICO GENETICO (DIRECTO O INDIRECTO) Y EL FUNCIONAL. EL DIAGNOSTICO GENETICO INDIRECTO ESTUDIA LA CONSEGREGACION DE MARCADORES CON LA PRESENCIA DE LA ENFERMEDAD. UN MARCADOR MUY INFORMATIVO ES EL POLIMORFISMO APALI EN EL INTRON 15 DEL GEN RLDL, PERO SI SE ANALIZA POR PCR (Y NO SOOTMERN) APARECE COMO CONSTANTE.EN ESTA TESIS HEMOS DETERMINADO QUE ESAS INCONSISTENCIAS SEDEBEN A QUE LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO PARA APA LI ES CONSTANTE, SIENDO POLIMORFILA LA BASE POSTERIOR, ATG, DE FORMA QUE SE INDUCE O NO LA METILACION DE LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO Y ADA LI NO PUEDE CORTAR. A TRABAJAR CON PLR EL ADN NO ESTA MODIFICADO Y LA ENZIMA SIEMPRE PUEDE CORTAR. EL DIAGNOSTICO GENETICO DIRECTO IDENTIFICA MUTACIONES EN EL GEN RLDL, EN ESTA TESIS SE HA COMPLETADO EL BARRIDO DE GRANDES REORDENAMIENTOS MEDIANTE SOUTMERN CON 2 DIGESTIONES,CON LAS QUE SE HAN DETECTA 5 ALELOS DIFERENTES EN 6 PROBANDOS, LO QUE SUPONE QUE SU FRECUENCIA EN NUESTRA POBLACION ES DEL 7% TRES DE ELLOS PRESENTAN EL PROMOTOR Y PRODUCEN ARNm QUE ESTAN ES PAUTA, Y EL PUNTO DE RUPTURA EN EL ADN SE ENCUENTRA DENTRO DE SECUENCIAS ALU. POR OTRA PARTE, SE HAN DETECTADO (POR PCR-SSCP) 44 PEQUEÑAS MUTACIONES EN 76 DROGANDOS HF. ESTAS MUTACIONES SON MUY VARIADAS Y SE DISTRIBUYEN POR TODO EL GEN, SIENDO LA MAS PREVANTE 112 INS A, CON UN FRECUENCIA DEL 11%, SEGUIDA DE C95R Y C3584 (5%). EL RESTO MUTACIONES SUPONEN UNA FRECUENCIA DEL 1-3%. EL DIAGNOSTICO FUNCIONAL ESTUDIA SI EL RECEPTOR DEL LDL QUE EXPRESAN CELULAS DE PACIENTES TIENE DIMINUIDA SU ACTIVIDAD. EN ESTA TESIS SE HA PUESTO A PUNTO UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE CUANTIFICAR LA FUNCIONALIDAD DEL RLDL EXPRESADO POR LINFOCITOS DE INDIVIDUOS PORTADORES DE MUDACIONES. EMPLEA COO LIGANDO DEL RECEPTOR CONJUGADOS DE ORO COLOIDAL CON LDL, Y LA CANTIDAD DE ORO UNIDA E INTERNALIZADA SE CUANTIFICA MEDIANTE ESPECTROMETRIA DE ABSORCION ATOMICA. SU PRINCIPAL VENTAJA (FRENTE AL ENSAYO TRADICIONAL, QUE EMPLEA LDL MARCADA CON 125 I) ES QUE EVITA EL USO DE RADIACTIVIDAD Y ES UN ENSAYO SENCILLO, QUE PERMITE OBTENER LOS RESULTADOS EN UNA SEMANA. LOS LINFOCITOS SE AISLAN DE SANGRE PERIFERICA Y SE ESTIMULAN CON FITOMEMAGLUTININA. LA PRESENCIA DE UNA MUTACION EN EL GEN RLDL NO ASEGURA QUE SEA RESPONSABLE DE LA ENFERMEDAD EN LOS PACIENTES PORTADORES, Y EL DIAGNOSTICO FUNCIONAL PERMITE CUANTIFICAR LA ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES EN ESTA TESIS SE HAN ANALIZADO LAS MUTACIONES ITL545 MPN MEDIANTE EL ENSAYO DISEÑADO Y AMBAS TIENEN UNA FUNCIONALIDAD MENOR. LA MUTACION E256 F SE HA ENSAYADO TANTO CON LINFOCITOS COMO CON ABROBLASTOS DE UN INDIVIDUO PORTADOR QUE NOS PRESENTA SINTOMAS DE HF, OBTENIENDOS EN AMBOS CASOS QUE SU ACTIVIDAD ESTA DISMINUIDA. ESTE HECHO PONE DE MANIFIESTO LA IMPORTANCIA DE ESTE TIPO DE DIAGNOSTICO COMO COMPLEMENTO DEL CLINICO-BIOQUIMICO Y GENETICO.

Autor: CANALS PARERA ALBERT.
Año: 2000.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAT DE CIÉNCIES.

Resumen: La ribonucleasa prancreática humna (HP-Rnasa, ó RNasa1; EC 3.1.27.5) es una proteína de 128 aminoácidos que pertenece a la familia de las ribonucleasas pancreáticas, y que cataliza la degradación del RNA de manera esepcífica en el extremo 3' de las bases de priimidina. Aunque tanto su producción heteróloga como su purificción habián sido descritas por diferentes grupos siguiendo diferentes procedimientos, se disponía de pocos datos estructurales sobre este enzima, i en espeical sobre su estructura tridimensional. Este desconocimiento suponía un impedimento para el diseño de variantes de la RNasa1 que muestren las actividades citotóxicas que se han descrito para otras ribonucleasas de origen no humano. La posibilidad de utilizar una proteína de origen humano para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer hace que la robonucleasa pancreática humana sea objeto de estudio en muchos laboratorios. Con el objetivo final de hacer un estudio estructural completo de la Rnasa, se ha llevado a cabo, mediante técnicas de DNA recombinante, el diseño y contrucción de diferentes variantes de esta proteína.Dichas variantes permiten evitar algunos de los problemas que se observan tanto durante la producción como durante la purficación de la RNasa1 recombinante. Paralelamente se han llevado a cabo una serie de modificaciones de los residuos de prolina de la RNAsas1 que no están presentes en su homóloga voina, la ribonucleasa A. Una vez establecidos los métodos óptimos de producción y purificación de las diferentes variantes construidas mediante técnicas de DANa recombiannte, se ha llevado a cabo su carcterización, tanto desde el punto de vista estructural como bioquímico. Se han realizado estudios de desnaturalziación térmica, dicroísmo cirucular, espectrometría de masas, y de determinación de parámetros cinéticos con diferentes substratos. Gracias a los elevados niveles de producción, y a al homogeneidad de la muestra final, se han conseguido cristales de dos de las variantes construidas y se han procesado los datos derivados de la difracción de rayos X. La consecución de la estructura de la primera de las variantes supone la primera aproximación a la estructura de la RNasa1 salvaje, y puede permitir en el futuro el diseño de variantes de dicha proteína que sean citotóxicas. La segunda variante muestra una estructura dimérica por intercambio de dominios que aporta inforamción sobre las posibles rutas seguidas durante lae volución de proteínas monoméricas hacia estructuras oligoméricas.