ACIDOS NUCLEICOS

Autor: PAIOTTA VITTORIO.
Año: 2003.
Universidad: BURGOS.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Este proyecto de investigación aborda el estudio de la intercalación de unos ligandos con una molécula de ARN sintético en forma de triple hélice. El ARN utilizado es el Poly(A)opoly(2U), en el cual están presentes dos cadenas de ácido poliuridílico [Poly(U)], y una de ácido poliadenínico [Poly(A)]. Las reacciones objeto de estudio fueron investigadas por vía termodinámica y cinética. Se pueden aprovechar las características de los reactivos descritas anteriormente para realizar valoraciones espectrofotométricas y fluorimétricas, añadiendo un ligando a una disolución de ácido nucléico y observando la variación del espectro; esa variación es característica de los reactivos en estudio y permite determinar la constante de equilibrio de la reacción. Analizando los datos con los métodos matemáticos de Scatchard y McGhee-von Hippel pudo medirse el número de cavidades del polímero inactivadas por la intercalación de una molécula de bromuro de etidio en condiciones de saturación. Además, se pudieron encontrar datos cuantitativos sobre el tipo de cooperatividad de este proceso de reacción. La presencia del ligando, en efecto, altera la estructura de la triple hélice del ARN, y modifica las características químicas. Como cabe esperar, la cooperatividad resultó ser negativa, es decir, una molécula de bromuro de etidio que se intercala en el ácido nucléico, desfavorece la intercalación de otras moléculas del mismo ligando. Informaciones de tipo químico físico (temperatura de paso desde triple a doble, y desde doble a hélice simple) fueron también detectadas a partir de medidas de desnaturalización térmica del polímero y del complejo polímero- ligando. Las técnicas utilizadas para la investigación de la cinética del proceso de reacción fueron T-jump, y Stopped-flow. En esta última técnica se mezclan los dos reactivos en una cámara de mezcla por la que pasa una radiación monocromática, observando la variación de absorbancia de la muestra con el tiempo, lo que permite medir reacciones hasta 10-3 segundos. El salto de temperatura (T-jump) es una técnica en la cual están mezclados los dos reactivos (polímero y ligando) en una celda en equilibrio con los productos de reacción. Aplicando una descarga eléctrica, mediante un condensador, se provoca por efecto Joule un salto de temperatura de aproximadamente tres grados. Este salto de temperatura provoca una alteración del equilibrio de la reacción y lo que se mide es el tiempo necesario para alcanzar el nuevo estado de equilibrio. Este proceso puede ser observado gracias al empleo de una radiación que cruza la celda en la cual están los reactivos y midiendo la variación de absorción de los mismos. Gracias a estas técnicas es posible obtener los datos cuantitativos de las constantes de velocidad de la reacción y deducir el tipo de mecanismo. Además, con la investigación de las amplitudes de las curvas cinéticas obtenidas, es posible realizar un estudio que permite encontrar el valor de la variación de la entalpía de la reacción. Estos ligandos, además, tienen particulares características que permiten una investigación del proceso de reacción en el campo de la fluorescencia. El bromuro de etidio, en efecto, tiene una propiedad muy conveniente: en disolución acuosa el efecto de fluorescencia es casi inexistente, mientras que si el bromuro de etidio está intercalado en un ADN o ARN se observa un fuerte aumento (hasta un factor de 20) del valor de la fluorescencia. En particular, es útil para este proyecto de investigación aprovechar la capacidad del bromuro de etidio de aumentar su propia fluorescencia una vez que está ligado (o mejor dicho, intercalado) en un ácido nucleico. La proflavina y la Pt-proflavina son moléculas cuya fluorescencia cambia al reaccionar con los ácidos nucleicos. Los instrumentos del Área de Química Física de la Universidad de Burgos, conjuntamente con los instrumentos del Departamento de Química de Pisa han permitido desarrollar este proyecto de investigación.

Autor: ALFONSO PALACÍN M. PILAR.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La Enfermedad de Gaucher (EG) es una de las enfermedades heriditarias lisosomales más frecuentes, debida a un déficit en la enzima lisosomal glucocerebrosidasa. Se caracteriza clínicamente por un aumento visceral (principalmente del bazo e hígado), anemia, citopenia, lesiones óseas, y en algunos casos, se asocia a afectación neurológica. La EG presenta una gran variabilidad, tanto en la sintomatología, como en la respuesta de los pacientes al tratamiento enzimático sustitutivo (TES). Esta heterogeneidad se atribuye, en parte, al gran número de mutaciones que se encuentran en el gen de la glucocerebrosidasa. Por ello, el objetivo principal de esta tesis fue identificar las mutaciones responsables de la enfermedad, caracterizarlas y conocer la actividad residual de las enzimas recombinantes, para poder así predecir la evolución clínica de los pacientes con la EG y su respuesta al TES. Para conseguir este objetivo, se emplearon técnicas fluorométricas para medir la actividad enzimática, técnicas bioquímicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), conformación de polimorfismos de cadena sencilla (SSCP), secuenciación automática y análisis de restricción con endonucleasa para identificar y caracterizar las mutaciones. Se sintetizaron por el procedimiento de mutagénesis dirigida proteínas recombinantes portadoras de las nuevas mutaciones encontradas y se expresaron en células de mamífero de la línea COS para medir su actividad residual y conocer, así, la gravedad de las mutaciones estudiadas. Estos análisis ayudan a un mejor entendimiento de las bases moleculares y de la patogenia de la enfermedad de Gaucher. Sin embargo, los resultados de la expresión de las proteínas mutadas son necesarios, pero no suficientes, para explicar el fenotipo clínico de la EG. Para descifrar qué otros factores podrían influir en el fenotipo de la enfermedad se llevaron a cabo análisis empleando la tecnología de microarrays, los cuales mostraron que los pacientes con la EG sufren un cambio fenotípico que conlleva una expresión de genes peculiar, diferente a los sujetos sanos, principalmente en genes relacionados con la matriz extracelular, la modulación de la respuesta inmune, crecimiento y diferenciación de las células hematopoyéticas, regeneración tisular, angiogénesis y metabolismo óseo. Por otro lado se evaluó la utilidad de marcadores enzimáticos, concretamente la actividad de la enzima quitotriosidasa y el perfil lipídico en relación al grado de afección y respuesta al TES en pacientes con la enfermedad de Gaucher. Se observó que la actividad de la quitotriosidasa está influenciada por diferentes factores como la edad, el genotipo de la quitotriosidasa, gravedad clínica de la enfermedad y/o previa esplenectomía. La monitorización del TES basado en eta actividad debe ser evaluada individualmente en cada caso, teniendo en cuenta los valores iniciales de actividad y el genotipo del paciente. También se observó que el TES, además de mejorar la visceromegalia y las complicaciones hematológicas y óseas, produce un efecto beneficioso sobre el perfil lipídico, siendo menos aterogénico que el previo al tratamiento.

Autor: AUSÍN MORENO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA (UNIVERSIDAD DE BARCELONA).

Resumen: Se han sintetizado oligonucleótidos cíclicos que han mostrado actividad citotóxica sobre células de hámster chino, presumiblemente por un mecanismo antisentido de inhibición de la expresión de la DHFR. La actividad, mucho mayor que la de los correspondientes oligonucleótidos lineales es atribuible al carácter cíclico y a la consecuente resistencia a las exonucleasas. Se ha ampliado la resistencia de los oligonucleótidos cíclicos también a las endonucleasas demostrando que se pueden obtener con enlaces fosforotioato en todas las posiciones menos una. Por otro lado, se han obtenidos dos nuevos monómeros de PNA que incorporan nucleobases análogas de citosina (abrazaderas de guanina) que son capaces de llegar a formar hasta cuatro y cinco enlaces de hidrógeno con la guanina. Se han preparado diversos décameros de PNA conteniendo tanto las nucleobases naturales como incorporando las abrazaderas deG en sustitución de citosinas. Se ha conseguido optimizar el rendimiento de las reacciones de acoplamiento mediante la utilización de energía de microondas. Por último, se ha evaluado, mediante espectroscopía de UV, la hibridación de los decámetros de PNA a secuencias de DNA complementarias. Se observa una buena correlación lineal entre las temperaturas de fusión y el número de pares citosina-guanina de dúplex cuando todas las nucleobases son naturales. Sin embargo, la incorporación de las abrazaderas de guanina provoca una desestabilización de los correspondientes dúplexs, interpretándose que la capacidad de hibridación de estas nucleobases dependen de su entorno (secuencia y tipo de ácido nucleico).

Autor: GUDE RODRÍGUEZ LOURDES .
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE QUÍMICA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA (UNIVERSIDAD DE ALCALÁ)..

Resumen: El diseño y la síntesis de compuestos capaces de unirse al ADN con el objetivo de obtener derivados provistos de actividad biológica es un tema de gran interés y presenta numerosas aplicaciones. En este trabajo se ha llevado a cabo la síntesis y el estudio estructural de derivados del sistema de 2,2'-bipiridina que se unen al ADN a través de un mecanismo de intercalación y de sus complejos metálicos de Pt(II), algunos de los cuales muestran un modo de unión con el ácido nucleico que supone la formación de enlaces covalentes. Por otra parte, los compuestos sintetizados contienen cromóforos en su estructura (naftaleno, antraceno y acridina) aptos para efectuar la rotura fotoquímica del ADN. Se ha realizado una aproximación multidisciplinar al estudio de estos sistemas. Además de la descripción de los procedimientos de síntesis y de la caracterización estructural detallada de todas las estructuras preparadas, se han realizado distintos ensayos biofísicos, así como estudios teóricos como simulaciones de dinámica molecular, para establecer la naturaleza de la interacción de estos sistemas con el ADN, encontrando que los compuestos sintetizados muestran un comportamiento como intercalantes y agentes de fotorrotura. Tambien se han preparado y caracterizado una serie de derivados del sistema de 1,10-fenantrolina aptos para la coordinación con Cu(II) y por otra parte, una serie de derivados bisimidazólicos de acridina que forman complejos metálicos con cationes del grupo 12. Se han realizado procesos de fotorrotura de distintos ligandos en presencia de Cu(II) y Eu(III), obteniendo nuevos sistemas capaces de romper el ADN por vía fotoquímica en procesos que pueden ser modulados por la concentración y la presencia del metal. Finalmente se aportan datos de actividad biológica de los compuestos sintetizados frente a diferentes lineas tumorales.

Autor: CARAVACA GUASCH JUAN MANUEL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Nuestro grupo ha estudiado la estructura de la cromatina de núcleos de eritrocitos de pollo (Bartolomé et al., 1994; Bartolomé et al., 1995; Bermúdez et al., 1998). La consecuencia de estos estudios ha sido la elaboración de un modelo para el plegamiento de la fibra de cromatina con una elevada concentración local del DNA (Daban y Bermúdez, 1998; Daban, 2000). Sin embargo, el nivel máximo de condensación en la cromatina, se encuentra en el interior de los cromosomas metafásicos. Aunque la bibliografía ha planteado diferentes modelos para el plegamiento de la cromatina en el interior de éstos, existe un conocimiento muy escaso acerca de la estructura molecular de la cromatina en los cromosomas condensados. Se ha realizado un estudio exhaustivo de microscopía electrónica de transmisión sobre la estructura de los cromosomas metafásicos de células HeLa. Se han estudiado un total de 4410 micrografías de cromosomas metafásicos, que en su mayor parte han sido tratados con diversos medios parcialmente desnaturalizantes, para pode analizar su estructura interna. Morfológicamente, los cromosomas estudiados en este trabajo pueden agruparse en tres tipos diferentes: compactos, granulados y fibrilados. La morfología más abundante es la compacta y se observa en presencia de cationes monovalentes y divalentes a concentración similar a la presente en la cromatina metafásica (Mg2+ 1.7-40 mM). Estos cromosomas tienen las cromátidas muy densas y en sus bordes se aprecian una serie de estructuras planas superpuestas. En condiciones de menor concentración de cationes (Mg2+ menor 1.7 mM), la morfología dominante es la granular. Estos cromosomas están compuestos principalmente por gran cantidad de cuerpos circulares de 30-40 nm de diámetro. Únicamente en condiciones de fuerza iónica extremadamente baja podemos encontrar la morfología fibrilar, la cual se caracteriza por la abundancia de fibras de 30-40 nm. Los resultados obtenidos con cromosomas parcialmente desnaturalizados nos permite concluir que existen tres elementos estructurales en el interior de los cromosomas metafásicos: la fibra, el gránulo y la placa. La fibras gruesas con diámetros que oscilan entre los 100 y los 500 nm son el resultado de la deformación plástica de las cromátidas durante los diferentes procesos de preparación de las muestras. En función de las condiciones iónicas del medio las fibras gruesas muestran gránulos o placas en su interior. Las fibras delgadas están formadas por una sucesión de cuerpos de 30-40 nm de diámetro unidos irregularmente mediante interacciones cabeza-cola. Las fibras delgadas se observan dominantemente en condiciones de concentración salina extremadamente baja. Los gránulos son unos cuerpos circulares compactos de unos 30-40 nm de diámetro. Estos cuerpos compactos descritos previamente por nuestro grupo y se interpretaron como una forma de plegamiento solenoidal de la fibra de 30 nm (Daban y Bermúdez, 1998). Se encuentran presentes en todas las condiciones estudiadas en este trabajo, siendo especialmente abundantes en presencia d eiones divalentes a concentración baja y en muestras tratadas con nucleasas micrococal. La placa es un elemento estructural característico de los cromosomas cuando éstos se encuentran en su forma más compacta, en presencia de concentraciones elevadas de cationes divalentes. Esta estructura no había sido descrita previamente por otros laboratorios. Es una estructura cromatínica de gran regularidad y con una superficie muy lisa. Hemos estimado la altura de estas placas a través de muestras sombreadas unidireecionalmente con platino. El promedio de los valores obtenidos es de 6.7 +- 1.4 nm. En conjunto los resultados obtenidos en esta tesis permiten sugerir que el componente principal de la cromatina en los cromosomas metafásicos es el gránulo de 30-40 nm. Dependiendo de las condiciones iónicas, este elemento estructural fundamental se agrega a través de uniones cabeza-cola para formar fibras (fuerza iónica muy baja), o bien se agrega mediante interacciones laterales para formar placas (condiciones salinas próximas a las de la cromatina metafásica).

Autor: AGUILAR SILVA FRANCISCO JOSE.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Resumen: El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune sistémica, en la que se sospechan que intervienen factores hormonales, ambientales y genéticos. Se aborda el estudio de estos factores genéticos mediante la selección de genes candidatos situados en regiones de ligamento o genes candidatos por su función, utilizando un estudio de casos y controles. En general, se observaron asociaciones tanto en lo que refiere a susceptibilidad como a manifestaciones clínicas y evaluación de la enfermedad.

Autor: FERRER JESÚS ELIZABETH.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UAM/FAC. DE CIENCIAS/INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: La cisticercosis es la infección parasitaria producida por la larva o cisticero de Taenia solium, afecta principalmente al sistema nervioso central causando neurocisticercosis (NCC). El inmunodiagnóstico es de gran importancia para detectar esta patología, aunque presenta limitaciones en cuanto a sensibilidad y especificidad. Teniendo en cuenta este problema, el objetivo de trabajo fue la caracterización y evaluación de las propiedades diagnósticas de antígenos de oncosferas y metacestodos de Taenia solium/T. Saginata a través del cribado dirigido de genotecas de expresión de dichos estados. Se caracterizaron los genes de T.solium correspondientes a una proteína de choque térmico de bajo peso molecular (clon H11b), un antígeno principal de tegumetno (clon H17g), y un antígeno de exreción/secreción de bajo peso molecular (clon M13h), además se buscaron en las genotecas otros miembros relacionados a M13h mediante PCR y se obtuvieron 2 antígenos nuevos B1 y M4. También se estudiaron antígenos de T.saginata previamente clonados como paramiosina, antígeno principal de oncosferas (HP6) y los péptidos sintéticos Tovis1, tovis5, HP6-3,TEG-1, Cow-10, derivados de antígenos protectores. Todos los genes se expresaron en sistemas procariotas y además B1 y HP6 en el sistema Baculovirus. Se evaluaron las propiedades diagnósticas de todos los antígenos meidante ELISA para ello se emplearon sueros de pacientes con cisticercosis confirmada (activa e inactiva) y con diagnóstico probable de cisticercosis, con parasitosis relacinadas y controles negativos, así como también líquidos céfalo-raquídeos (LCR) y sueros porcinos provenientes de cerdos infectados y sanos. Además, los péptidos sintéticos se evaluaron con sueros bovinos. Todos los antígenos recombinantes estudiados mostraron una elevada sensiblidad en los pacientes con NCC activa a excepción de H17g. En esta fase el mejor antígeno fue B1, independientemente del sistema de expresión utilizado lo que sugiere un epítopo peptídico. En NCC inactiva los mejores resultados se obtuvieron con H11b, B1 expresado en los dos sistemas y HP6 expresado en el sistema Baculovirus, producto que exhibió una sensibilidad doble de la obtenida con el sistema procariota, deduciéndose un reconocimiento diferencial de epítopos a medida que progresa la enfermedad. Con LCR los mejores valores de sensibilidad se registraron con las moléculas HP6 y B1 en los dos sistemas en NCC activa. Con los sueros porcinos H11b y B1, en los dos sistemas de expresión, mostraron los mejores resultados. De los péptidos HP6-3 fue elm ás reconocido por las muestras humanas y porcinas y en el sistema bovino todos los péptidos mostraron valor diagnóstico. La especificidad fue elevada en los antígenos estudiados. Los valores de sensibilidad y especificidad obtenidos con estos antígenos los hacen buenos candidatos para el diagnóstico de la enfermedad especialmente en su fase activa.

Autor: GÓMEZ PINTO IRENE.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE QUÍMICA FÍSICA ROCASOLANO. CSIC.

Resumen: El objetivo general de esta Tesis es el de profundizar en el conocimiento de la estructura de los ácidos nucleicos en disolución, así como de las interacciones ADN-ADN y proteína-ADN. Para ello, se exploró el uso de oligonucleótidos con modificaciones químicas, que permitan estudiar de manera conveniente diversas facetas de los procesos de reconocimiento molecular. En concreto, se analizaron conjugados péptido-oligonucleótido como modelos para estudiar interacciones proteína-ADN. El proceso de reconocimiento proteína-ADN en la célula es fundamental en muchísimos procesos biológicos. Normalmente, los complejos proteína-ADN están estabilizados por un gran número de interacciones que, consideradas por separado, son débiles y difíciles de analizar cuantitativamente. Precisamente por su "debelidad", algunas interacciones con difíciles de estudiar aisladas en sistemas modelo pequeños. Uno de estos casos es la interacción entre amioácidos con cadenas aromáticas y las nucleobases del ADN. Para ello se estudió un sistema modelo consistente en unir covalentemente un oligonucleótidos con un péptido que contiene un residuo de triptófano. Muchos procesos de reconocimiento entre moléculas de ADN y proteínas se pueden facilitar si las dos moléculas que interaccionan están unidas covalentemente. Una posibilidad de estabilizar un dúplex de ADN es unir las dos cadenas covalentemente mediante un cross-link. Un nuevo tipo de cross-link, consiste en utilizar un conjugado péptido-oligonucleótido, en el que cadena peptídica contiene un residuo de cisteína, susceptible de formar un enlace disulfuro. Con objeto de explorar este tipo de uniones, en el capitulo 6 se estudia la estructura y estabilidad de un nucleopéptido autocomplementario, donde el cross-link peptídico une los dos extremos del dúplex. Como se ha mencionado anteriormente, los procesos de reconocimiento proteína-ADN son de gran importancia. Entre ellos figura el reconocimiento de lesiones en el ADN. Se conocen muchas de las enzimas encargadas de reparar el ADN celular pero su modo de acción está lejos de ser comprendido completamente. Uno de los aspectos que se desconoce es cuales son las características estructurales en el ADN que estas enzimas reconocen para disparar el mecanismo de reparación. Este aspecto es particularmente intrigante si se tiene en cuenta que algunos sistemas de reparación. Este aspecto es particularmente intrigante si se tiene en cuenta que algunos sistemas de reparación, como el de escisión-reparación, reconocen un gran número de lesiones diferentes que no parecen tener ninguna relación en su estructura química. Con objeto de contribuir a entender el proceso de reconocimiento de ADN dañado, en el capítulo 7 se estudia la estructura de un oligonucleótido que contiene un aducto con un derivado de colesterol. El reconocimiento entre moléculas de ADN es un campo particularmente interesante. Además del reconocimiento "clásico" entre cadenas complementarias, las moléculas de ADN pueden interaccionar de otras maneras, dando lugar a diversos motivos estructurales. Un motivo de interés es el reconocimiento entre pares de bases, que da lugar a tétradas y a la formación de estructuras de cuatro hebras. Éste puede ser un motivo de reconocimiento general entre dúplex de ADN y puede estar involucrado en procesos biológicos como los de recombinación génica o de empaquetamiento del ADN. Con objeto de estudiar los diversos modos de interacción entre pares de bases y explorar la formación de distintas tétradas, en el capítulo 8 se estudia la estructura de varios oligonucleótidos cíclicos de diferente secuencia.

Autor: RUIZ CHICA ANTONIO JOAQUÍN.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UNIVERSIDAD DE MÁLAGA).

Resumen: En esta Tesis se ha aplicado las espectroscopías vibracional (IR y Raman) y electrónica (CD y UV-visible) al estudio de las interacciones entre ADN genómico y poliaminas biógenas y sintéticas, demostrándose que la interacción presenta importantes dependencias estructurales tanto de las poliaminas como del ADN. Así, hemos obtenido evidencia de que la interacción con espermina se establece preferiblemente por el surco mayor, mientras que espermidina y putrescina interaccionan por el surco menor. A partir del estudio espectroscópico de la interacción de las poliaminas derivadas de ornitina con el oligonucleótidos GC de doble hebra, se han detectado cambios en la estructura secundaria del oligonucleótidos indicativos de la existencia de ADN-Z y cambios en la estructura terciaria indicativos de la presencia de una estructura ADN-* y ADN agregado, la cual posee un orden estructural similar al de un cristal liquido. A diferencia del efecto de comparación y estabilización de secuencias GC inducido por esta poliaminas biógenas, en el oligonucleótido AT se provoca una relajación de las fuezas inter-hebra. Este resultado es altamente significativo si se tiene en cuenta que los procesos de replicación y transcripción del ADN tiene su inicio e la apertura de la doble hélice en regiones ricas en AT. Por primera vez se ha demostrado la existencia de sitios preferibles de unión de la amina biógena histamina al ADN, confirmando la estabilidad energética de modelos de interacción por el surco menor. Se ha estudiado la interacción ADN y tres análogos aminoxi de las poliaminas derivadas de la ornitina, confirmándose las principales conclusiones obtenidas del estudio de la interacción con poliaminas biógenas. Como resultado de relevante, se ha demostrado la diferente contribución de los grupos amino primarios de espermidina en su interacción con ADN. Mediante estudios de dicroísmo circular electrónico, se ha caracterizado la formación de ADN-* en presencia de estos análogos aminoxi. Se ha confirmado asímismo que este proceso se ve favorecido por la disminución de la longitud de la cadena de ADN, por el aumento de la carga de la poliamina y por las características estructurales de la poliamina.

Autor: RAMÍREZ GARCÍA SONIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Resumen: Dado el creciente desarrollo de nuevas moléculas orgánicas de cadenas hidrocarbonadas cada vez más largas, y por lo tanto cada vez más insolubles en agua, ha aparecido la necesidad de desarrollar nuevas técnicas analíticas capaces de determinarlas directamente en medios orgánicos. Con este objetivo, se han desarrollado nuevos materiales compósitos conductores rígidos que sean compatibles con medios orgánicos para su aplicación en la construcción de sensores y biosensores amperométricos. Estos materiales consistieron en una mezcla de grafito y polímero, generando un nuevo material conductor dentro del cual se pueden inmovilizar diferentes substancias químicas o de origen biológico de manera que se puede integrar todo el proceso analítico dentro de un único dispositivo. Además, esta configuración permite renovar la superficie del sensor simplemente puliéndolo sin que sea necesario realizar la inmovilización de los modificadores cada vez. Por otro lado, estos materiales actúan como cápsulas que protegen el material biológico, de manera que el tiempo de vida de los biosensores se puede prolongar considerablemente utilizando estos materiales como transductores. Utilizando diferentes tipos de resinas epoxi, silicona, poliuretano y poliéster se optimizaron los porcentajes de grafito de los compósitos que permitieran obtener materiales con una máxima estabilidad física y una máxima conductividad electrónica. Mediante microscopía electrónica se vio que a medida que se aumentó el porcentaje de grafito dentro de los compósitos, las partículas de grafito cada vez se encontraron más cercanas entre si y disminuyeron los agujeros del material orginados por aire atrapado durante el proceso de polimerización. Esta observación concuerda con la teoría de la percolación que explica el proceso de conducción de estos materiales mediante la formación de caminos de percolación, o caminos preferenciales de conducción que están formados por tiras de partículas de grafito que están en contacto entre si y que atraviesan el material en todo su volumen, de manera que contectan ambas superficies del material. Se estudió el tiempo de vida de estos materiales en diversos disolventes mediante la realización de voltamperogramas cíclicos y calibrados amperométricos a lo largo de diferentes períodos de tiempo de tener estos materiales guardados secos o en contacto con cada uno de los disolventes, de manera que se encontraron cuatro tipos de resinas epoxi y un atipo de resina de silicona que mantuvieron buena estabilidad química en acetona, acetonitrilo, etanol, metanol y hexano a lo largo de diferentes períodos de tiempo de 1 ó 2 meses. La reproducibilidad de las superficies sucesivas obtenidas puliendo los transductores también fue muy elevada, cosa que implica una buena homogeneidad de los materiales. El estudio del tiempo de vida de estos materiales también se realizó mediante microscopía electrónica, de manera que se observó la aparición de pequeñas grietas cuando el material se puso en contaco con los disolventes donde fue químicamente compatible. Sin embargo, estas grietas aparecieron a partir del primer día de poner el material en contacto con el disolvente y no crecieron en tamñao o número a lo largo de la totalidad del tiempo estudiado. Sin embargo, algunos disolventes y no disolventes y no crecieron en tamaño o número a lo largo de la totalidad del tiempo estudiado. Sin embargo, algunos disolventes como el cloroformo o el tetrahidrofurano, fueron capaces de disolver una de las componentes del polímero, destruyendo completamente la estructura del compósito y rompiendo los caminos de conducción. Estos materiales se caracterizaron electroquímicamente mediante voltamperometría cíclica y cronoamperometría y también se comparó su comportamiento con el de electrodos de grafito y de carbono vitrificado. Se vio que el comportamiento de los compósitos presentó características superiores a las de un electrodo de grafito y comparables a las de un electrodo de carbono vitrificado, aunque los compósitos presentaron mejores relaciones señal/ruido. Dado su comportamiento electroquímico, este fenómeno se atribuyó a un comportamiento de haz de microelectrodos. Esta hipótesis se confirmó mediante microscopía electroquímica mediante la cual fue posible la obtención de imágenes de las microzonas de los compósitos donde se producía transferencia electroquímica. Una vez desarrollados y caracterizados, se aprovechó la versatilidad en cuanto a formas y tamaños de los electrodos que se pueden construir utilizando estos materiales para desarrollar y caracterizar microelectrodos de 25 um de diámetro. Los microelectrodos mostraron un comportamiento más similar al de un microelectrodo de superficie continua, pero debido a los elevados valores de las constantes de celda no fue posible realizar medidas a tiempo lo suficientemente cortos como para poder discernir una difusión independientemente para cada microzona electroactiva en caso que realmente existiera una estructura de haz de microelectrodos. Sin embargo, se vio que estos microelectrodos fueron capaces de realizar medidas amperométricas en medios orgánicos en ausencia de electrólito soporte, y se consiguió disminuir el límiete inferior de respuesta lineal de estos materiales en prácticamente un orden de magnitud. Por último, y como ejemplo, se desarrolló y caracterizó un biosensor enzimático basado en peroxidasa de rábano picante compatible con acetonitrilo para la determinación de peróxido de lauroil, que es un peróxido orgánico que se genera en aceites de oliva debido a su descomposición oxidativa, y es una sustancia muy tóxica.

Autor: MORENO HERRERO FERNANDO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: En esta memoria de tesis doctoral se resume el trabajo realizado por el autor en el Laboratorio de Nuevas Microscopías de la Universidad Autónoma de Madrid. Su labor investigadora se centró en la aplicación de la microscopía de fuerzas al estudio de sistemas de moléculas biológicas individuales. La memoria está dividida en 4 capítulos y 2 anexos. El primer capítulo está dedicado a las técnicas de medida del microscopio de fuerzas orientadas a la visualización de moléculas biológicas. En este capítulo se comparan los métodos clásicos de medida de esta microscopía aplicados a los sistemas biológicos. Los otros tres capítulos se refieren a tres aspectos que intentan abarcar el amplio espectro de aplicaciones de la microscopía de fuerzas a sistemas biológicos. El primero de ellos es un concepto físico y trata sobre el estudio de las propiedades eléctricas de la molécula biológica por excelencia: el ADN (capítulo 2). El segundo aspecto usa una capacidad esencial del AFM como es la visualización de superficies. En este caso aplicado a un polímero de una proteína llamada tau que forma unos filamentos de estructura característica que son responsables en parte de la demencia senil de Alzheimer (capítulo 3). El tercer tema abordado en esta tesis es puramente bioquímico y se refiere a las interacciones entre biomoléculas. En concreto entre proteínas y entre ADN y proteínas (capítulo 4). Los tres temas están ordenados de forma que vamos de un problema más físico hacia un problema más bioquímico. El primero de los anexos que incluyo intenta proporcionar unas nociones básicas de biología molecular, especialmente orientadas a quellos lectores no familiarizados con los términos y la nomenclatura bioquímica básica y muy útiles para comprender esta tesis en su totalidad. Hacia la parte final de ese anexo incluyo parte de los trabajos realizados con pinzas ópticas en diferentes estancias en el laboratorio del Prof. Carlos Bustamante en la Universidad de California en Berkeley. El otro anexo muestra una manera alternativa para calibrar el microscopio de fuerzas que consiste en usar moléculas de ADN de tamaño conocido. La tesis finaliza con las correspondientes secciones de conclusiones, publicaciones, bibliografía y agradecimientos.

Autor: TOUS RIVERA CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En esta Tesis se han abordado cuatro objetivos parciales para profundizar en el conocimiento del mecanismo catalítico de la RNasa tanto in vivo como in vitro. Se ha clonado, purificado parcialmente y caracterizado la subunidad proteica de la RNasa P de la cianobacteria Pseudanabaena sp. PCC6903, demostrándose que tiene capacidad para reconstruir la actividad RNasa P con la subunidad RNA de diversas bacterias. Se ha clonado y caracterizado la subunidad proteica de la RNasa P de Thermus thermophilus, habiéndose detectado un solapamiento entre la secuenciaque codifica dicha proteína y la proteína ribosómica L34. El producto del gen rnpA de T.Thermophilus podría sufrir procesamiento proteolítico en su extremo amino para generar la proteína madura. Se ha realizado un estudio funcional detallado del lazo L15 de la subunidad RNA de la RNasa P de Pseudanabaena sp. PCC6903 y Synechocystis sp. PCC6803. La deleción de nucleótidos en este lazo no altera significativamente la estructura o la actividad del RNA catalítico. Este resultado indica que estos RNAs utilizan mecanismos alterantivos a lainteracción con el lazo L15 para unir el sustrato. La actividad in vivo de la Rnasa P se ha estudiado mediante un mutante con expresión condicional de la subunidad RNA desde un promotor regulado. La depleción de la RNasa P permite detectar la acumulación de precursores de los pre-tRNAs y otros RNAs que son sustratos de la RNasa P. El patrón de acumulación de precursores in vivo nos ha permitido estudiar el orden de procesamiento de un sustrato dimérico y determinar que el procesamiento en 3' puede ocurrir probablemente antes de que actúe la RNasa P.

Autor: CORRALES HERRÁN ROSA M..
Año: 2002.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD DE VALLADOLID.

Resumen: Desde 1990, el Grupo de Superficie ocular del IOBA viene desarrollando una línea de investigación sobre ciertos aspectos del Síndrome de Ojo Seco (SOS). Este campo es de especial importancia en oftalmología, fundamentalmente por las siguientes razones; Es una de las enfermedades oftalmológicas más frecuentes, es una causa frecuente de intolerancia a lentes de contacto, constituye una complicación de las enfermedades crónicas inflamatorias de la conjuntiva y de la córnea, por lo que dificulta la recuperación funcional de la superficie ocular, las formas graves generan un gran deterioro de la córnea y, por lo tanto, amenazan la función visual. El SOS se produce como consecuencia de alteraciones en la película lagrimal tanto cualitativas como cuantitativas. La mayoría de los tratamientos del SOS pretenden sustituir o estimular la producción de la capa acuosa, ya que ésta es la estructura más conocida, y la que se encuentra alterada en la mayoría de los casos de Ojo Seco. Pero en situaciones tan frecuentes como conjuntivitis crónicas, uso de lentes de contacto, medicaciones tópicas crónicas o la degeneración involutiva senil, existe una alteración muy importante del componente mucínico. Sin embargo, no hay ninguna terapia adecuada que abrode la imitación o regulación de la producción de esta estructura, por lo que su desarrollo constituiría un avance importante en el tratamiento de dicha enfermedad. Este es precisamente el objetivo principal de este trabajo, el conseguir modular la secreción de mucinas, de manera que pudiera ofrecerse un tratamiento adicional al SOS. Hasta ahora, se conocen cinco genes de mucinas que se expresan en la superficie ocular. Si se consiguiera cuantificar dicha expresión, se podría definir el grado de alteración de esta estructura en distintas patologías, además de poder evaluar la posible modulación mediante la aplicación de diferentes fármacos, como por ejemplo, la ciclosporina A. De esta manera los objetivos de este trabajo de investigación son los siguientes: 1,- Comprobar que la citología por impresión conjuntival (CIC), técnica no invasiva, es útil para estudiar la expresión de los genes de mucinas del epitelio conjuntival humano. 2,- Definir los patrones de mormalidad de la expresión de los genes de mucinas conjuntivales humanos en muestras obtenidas por CIC en voluntarios sanos. 3,- Comprobar el mantenimiento de la expresión de dichos genes de mucinas en: Cultivos primarios de epitelio conjuntival procedentes de biopsias de invidivuos sanos. Una línea celular de conjuntiva humana normal. 4,- Estudiar la modulación de la expresión de genes de mucinas conjuntivales humanos con ciclosporina A en: CIC en pacientes con SOS. Células conjuntivales epiteliales humanas normales in vitro. Con los resultados obtenidos en este trabajo, se puede concluir lo siguiente: 1,- La CIC es una técnica no invasiva válida para estudiar los genes de mucinas oculares, ya que se pueden detectar todas las descritas hasta la actualidad en condiciones normales. 2,- La CIC se puede utilizar en la valoración de los genes de mucinas en el Síndrome de Ojo Seco, ya que se han podido establecer valores umbrales de normalidad. 3,- Los cultivos celulares pueden ser útiles para el ensayo de fármacos que modulen el nivel de ARNm de genes de mucinas.

Autor: SIFRES CUERDA ALICIA.
Año: 2002.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: CENTRO DE CONSERVACIÓN Y MEJORA DE LA AGRODIVERSIDAD VALENCIANA.

Resumen: El tomate es una hortaliza de importancia mundial. La producción intensiva de esta hortaliza y la gran diversificación de tipos y usos ha condicionado las estrategias de mejora. Dada la estrecha base genética de la especie cultivada, las especies silvestres del género Lycopersicon son recursos imprescindibles para la obtención de nuevas variedades de tomate. La caracterización y evaluación de estos recursos es un requisito previo necesario para su utilización. La caracterización morfológica juega un papel muy importante en el análisis de la variación en poblaciones de plantas. Sin embargo, el empleo de estos marcadores presenta algunas limitaciones, suponiendo sólo una media indirecta del nivel de variabilidad fenotípica observable. El estudio de la variabilidad genética cuenta hoy con la ayuda de técnicas moleculares, que permiten obtener una estima de la variabilidad genómica de forma rápida y consistente. En el presente trabajo se estudia la variabilidad, tanto morfológica como molecular, de una colección de entradas de Lycopersicon pimpinellifolium (Jusl.) y Lycopersicon hirsutum Humb & Bonpl., colectadas por el COMAV (Centro de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana) en el sur de Ecuador y norte de Perú tras el aumento poblacional ocasionado por el fenómeno de El Niño de 1998. La variabilidad encontrada en estas poblaciones se ha comparado con la encontrada en otras entradas colectadas en años en los que no ocurrió este fenómeno, cedidas por el TGRC (Tomato Genetics Resources Center, UC Davis, EEUU). Se han analizado un total de 64 entradas de L.pimpinellifolium y 38 entradas de L.hirsutum, utilizando como fuera de grupo entradas de diferentes especies del género. En el estudio de la variabilidad a nivel molecular se han empleado los marcadores molecuares AFLP, SRAP y microsatélites, que proporcionan informaciones complementarias. El análisis morfológico realizado indica que los caracteres más variables en la colección de Lypcopersicon pimpinellifolium son los relacionados con el tamaño de las estructuras florales, color de fruto y vigor de la planta. En la colección de L.hirsutum lo son el tamaño e intensidad del color del fruto y el tamaño de las inflorescencias, flores y hojas. En la caracterización morfológica de la colección de L.pimpinellifolium no se observó agrupación por procedencia geográfica, encontrándose diversidad de tipos en todas las zonas estudiadas. Destaca una zona de confluencia de barrancos en Olmos, donde se observaron tipos muy diferenciados. En esta zona se identificó un grupo de entradas que no se encuentra representado en en la colección enviada por el TGRC. Estas entradas presentan un furto de mayor tamaño que el resto, de coloración amarilla, reducida exerción estigmática, menor tamaño de la flor, y plantas con elevada pubescencia. No se observó similitud entre las entradas de L.pimpinellifolium colectadas tras el efecto de El Niño 98 y las seleccionadas en el TGRC, colectadas en la misma zona, a excepción de una de las regiones donde El Niño tuvo menor influencia. Tanto para SRAP como para microsatélites, se observó una agrupación de las entradas del TGRC, lo que apoya la idea de que en esta especie la variabilidad encontrada antes y después de El Niño de 1998 es diferente, siendo mucho mayor en este último caso. Los tres tipos de marcadores separaron las entradas de tomate cultivado delas de L.pimpinellifolium. Dentro de esta especie no se observó una diferenciación regional, separándose únicamente las entradas de futuro amarillo pertenecientes a la zona I del resto de entradas. Estas entradas presentan una gran diversidad, aunque bajo heterocigosidad, lo que demuestra que se trata de líneas casi puras diferenciadas entre sí. La caracterización molecular confirmó la existencia de un continuo poblacional desde el sur del río Piura hasta Olmos, ocasionado posiblemente por el arrastre de semillas provocado por las fuertes inundaciones. El cálculo de la tasa de autogamia para L.pimpinellifolium a partir de los valores de F IS obtenido empleando microsatélites muestra que existe una gran endogamia, siendo del 84% para el total de entradas y del 95% para las entradas de furto amarillo de la zona I, lo que se corresponde con el bajo nivel de heterocigosidad. En la caracterización morfológica de la colección de L.hirsutum se observó una agrupación de las entradas por su zona de colecta, siendo las entradas de Loja (Ecuador) y Huancabamba (Perú), las que presentaron mayores diferencias morfológicas. Las entradas de las poblaciones colectadas a mayores altitudes resultaron ser más similares, posiblemente por la adaptación a condiciones amibientales similares. El análisis de la colección de L.hirsutum mediante AFLP agrupó claramente las entradas por zonas de colecta, separando las entradas de Huancabamba del resto. Algunas de estas entradas son de máximo interés por presentar resistencia a diferentes virosis. Utilizando microsatélites se separaron las entradas en función del país de origen. El índice de diferenciación entre las diferentes poblaciones calculado con estos marcadores fue muy alto, confirmando que se trata de poblaciones relativamente aisladas. La diversidad genética calculada para las diferentes regiones de L.hirsutum fue mucho mayor en las entradas de las regiones de Huancabamba y Canchaque (Perú). La tasa de autogamia calculada a partir de F IS fue la menor; estas entradas pertenecen a la forma typicum, que es autoincompatible. La mayor diversidad genética fue la encontrada en el grupo de entradas del TGRC colectadas en Ecuador pertenecientes a la forma glabratum que son autocompatibles. Nuestras entradas colectadas en Loja (Ecuador), que también presentaron bajo nivel de variabilidad, también pertenecen colectadas en Loja (Ecuador), que también presentaron bajo nivel de variabilidad, también pertenecen a esta forma. Las entradas colectadas en Célica, Ecuador, presentaron un nivel de diversidad y una tasa de autogamia intermedios por lo que suponemos que son formas intermedias. La correlación entre el grado de alogamia y la exerción estigmática para las entradas de L.pimpinellifolium fue baja. No se encontró una correlación positiva entre el grado de alogamia y la diversidad genética. Sin embargo, en L.hirsutum se encontró una alta correlación entre el tamaño de la flor, el grado de alogamia y el nivel de variabilidad, confirmando resultados previos que afirmaban que las entradas autoincompatibles presentan un mayor tamaño de las flores, más atractivas para los insectos polinizadores, y una mayor variabilidad. Los marcadores microsatélites resultaron ser muy útiles en el estudio de la estructura poblacional de las diferentes especies, así como el estudio de la variabilidad y evolución de los sistemas de reproducción a partir del grado de autogamia. Sin embargo, los marcadores AFLP o SRAP analizan un mayor número de loci con lo cual está representado una mayor parte del genoma y son más útiles en el estudio de la variabilidad entre entradas. Hay que tener en cuenta al distinto tipo de regiones analizadas con ambos marcadores, que son neutrales en el caso de AFLP y relacionados con regiones génicas en el caso de SRAP.

Autor: CAMPÀS HOMS MÒNICA.
Año: 2002.
Universidad: ROVIRA I VIRGILI.
Centro de lectura: INGENIERÍA QUÍMICA.
Centro de realización: ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA QUÍMICA.

Autor: JOFRÉ FRADERA ANNA.
Año: 2002.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las sHsps son las HSPs más abundantes y diversas en plantas. Se acumulan frente al estrés y también en varias fases del desarrollo donde se cree que actúan de chaperonas moleculares evitando la agregación irreversible de proteínas desnaturalizadas. El análisis de las sHsps-Cl del alcornoque mediante imununodetección en electroforesis bidimensionales ha mostrado un patrón de acumulación complejo, formado por dos grupos mayoritarios de especies proteicas de ca. 10 i 17 kDa que muestran una inducen por temperatura de las ca. 10 kDa lo hacen por estrés oxidativo. Además, las sHsps-Cl de ca. 10kDa constituyen las sHsps más pequeñas descritas hasta el momento. La complejidad del patrón proteico de las sHsp-Cl en alcornoque y el carácter multigénico de las sHsps-Cl de otras plantas apuntaban a una familia multigénica. Experimentos de PCR y RT-PCR permitieron clonar parcialmente tres nuevos miembros de esta familias además de la previamente clonada QsHsp17.4-Cl y confirmaron que la familia multigénica de las sHsp10-Cl, que presenta una importante trncuación situada en medio del dominio alfa-cristalino que codifica por una proteína de unos 10 kDa. Ensayos de RT-PCR han mostrado que Qshsp10-Cl se expresa específicamente por estrés oxidativo pero no por temperatura. Aprovechando la importante truncación que presentaba Qshsp10-Cl, ésta fue utilizada como modelo para el estudio de la importancia del dominio alfa-cristalino y la extensión C-terminal en la actividad protectora frente al estrés evaluando su capacidad de aumentar la viabilidad de células de E.coli en condiciones de estrés térmico (55ºC) y oxidativo (paraquat). Los resultados indican que la proteína recombinante AsHsp10-Cl, pese a la importante truncación que tiene, es capaz de aumentar la viabilidad de células de E.coli en condiciones de estrés térmico y, remarcablemente, en condiciones de estrés oxidativo y confirman la importancia de la región de consenso II del dominio alfa-cristalino. El estrés oxidativo provoca lesiones al DNA que pueden producir errores den la replicación, transcripción o traducción y generar proteínas aberrantes. El estudio de la variabilidad del gen Qshsp17.4-Cl en DNA y RNA en las células del felema o súber en comparación con el ápice radicular, un tejido joven y en crecimiento activo, ha mostrado unas tasas de mutación sorprendentemente altas en felema. En mRNA de ápice de raíz, la tasa de mutación es inferior a 1/12252 pb. Por el contrario, las tasas de mutación del felema, 1/1784 pb en mRNA i 1/1520 pb en DNA genómico, son las mas altas descritas en un genoma nuclear ecuariota y son similares a las de los virus de RNA de evolución rápida como el de la Hepatitis C. Con éstas tasas de mutación, un tercio de los mRNA de las células de felema contendrían mensajes aberrantes y la supervivencia de las células se vería comprometida. De esta forma, el felema tendría que considerarse como un mosaico de células genéticamente heterogéneas donde una sola secuencia no define en toda su amplitud un gen. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento de las mutaciones que se acumulan en las células del felema y el ápice de raíz y hacer un análisis cualitativa más completa que permitiese especular sobre su origen, se aplicó un método que permite seleccionar secuencias mutadas utilizando diferentes enzimas de restricción. Los resultados muestran que el tipo de mutaciones predomiantes en el felema han sido también detectadas en otros sistemas (plásmidos, fagos y DNA bacteriano) en relación al estrés oxidativo. Consecuentemente, el estrés oxidativo al que se encuentran sometidas las células del felema podría ser el causante de la elevada tasa demutación detectada. Además, el análisis químico de las bases del Dna oxidasas que se acumulan en brotes de plántulas de alcornoque trtadas con peróxido del hidrógeno ha mostrado la acumulación de bases modificadas con propiedades premutagénicas. El tipo de modificaciones predominantes se correlaciona con el tipo de mtuaciones detectadas en el mRNA de Qshsp17.4-Cl en felema. La elevada sensibilidad del método ha permitido también detectar mutaciones en el mRNA de Qshsp17.4-Cl en ápice de raíz. Unas mutaciones no relacionadas con el estrés oxidativo sino con errores en la preparación de los ácidos nucleicos.

Autor: TENORIO MATANZO ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: Los herpesvirus herpes simplex tipos 1 y 2, varicela-zoster, citomegalovirus, herpesvirus humano 6 y el virus de Epstein-Barr son importantes patógenos humanos y son responsables etiológicos de diferentes sindromes neurológicos. Como el resto de los herpesvirus, establecen latencia tras la infeccion primaria y pueden reactivar periodicamente. La gravedad de las enfermedades que producen y su elevada incidencia en los pacientes inmunoeprimidos ha impulsado el desarrollo de tratamientos antivirales y de nuevos metodos diagnosticos, principalmente los basados en la amplificacion genómica. Sin embargo, la frecuencia con la que diferentes virus pueden producir sindromes similares, obliga al laboratorio a dedicar un gran esfuerzo para la realizacion del diagnostico diferencial de la infeccion. Para la deteccion e identificacion simultanea de herpesvirus humanos, se ha diseñado un nuevo abordaje de amplificacion genomica multiple. Para la primera reaccion se utilizan dos mezclas equimolares de oligonucleotidos no degenerados, que alinean en sus extremos 3´-con una de las dos regiones conservadas seleccionadas de entre las presentes en los genes ADN polimerasa de los herpesvirus y que se extienden en sus extremos 5´- a secuencias no conservadas y especificas de cada especie viral que se pretende detectar. La elevada concentracion de productos obtenidos tras la primera reaccion de amplificacion, permite el uso de una segunda reaccion de amplificacion multiple, que se diseña de modo que cada herpesvirus produzca un fragmento de ADN de diferente tamaño y utilizando oligonucleotidos que tienen en cuenta la variabilidad natural de cada herpesvirus. Para excluir los resultados falsos negativos, las reacciones de amplificacion multiple incluye, ademas, un fragmento de ADN del herpesvirus porcino 1 y sus correspondientes oligonucleotidos. El metodo se muestra capaz de detectar al menos 10 moleculas de cada ADN de herpesvirus. En estudios internacionales de control de calidad demuestra tener una sensibilidad y una especificidad iguales o superiores a la de otros metodos de amplificacion convencionales utilizados en Europa. La reacion de amplificacion multiple detecto ADN de herpesvirus en 460/3644 muestras de liquido cefalorrquideo de pacientes con enfermedad neurológica, especialmente en los sindromes agudos presentes en los individuos inmunocompetentes o inmunodeprimidos. El tipo de herpesvirus detectado y la frecuencia de deteccion de herpesvirus depende del sindrome analizado y del estado inmunologico del paciente.

Autor: HERRERO SANTACRUZ JOSEFA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE VALENCIA.

Resumen: Algunos sarcomas de alto grado pueden presentarse como tumores pobremente diferenciados sin rasgos fenotípicos distintivos, lo cual puede plantear serios problemas de diagnóstico diferencial. La técnicas moleculares pueden proporcionar nuevos factores complementarios al diagnóstico y diagnóstico diferencial aplicables en un laboratorio de Anatomía Patológica. De esta forma, se ha boservado que la t(11;22) aparece en el 95% de los sarcomas de la familia Ewing y la t(X;18) se ha asociado a un 90% de los sarcomas sinoviales. En nuestro trabajo de investigación nos hemos planteado estudiar ARN procedente de material crioconservado y material en parafina aplicando técnicas moleculares con el objetivo de apoyar el diagnóstico histopatológico en sarcomas humanos, concretamente hemos estudiado sarcomas sinoviales y sarcomas de la familia Ewing. Entre los objetivos de este trabajo figuraban la recuperación de ácidos nucleidos de tejido archivado en bloques de parafina para la realización de estudios retrospectivos amplios con métodos sensibles de biología molecular y establecer procedimientos rutinarios de extracción de ácidos nucleicos en el laboratorio de Anatomía Patológica. Se han estudiado: 48 Sarcomas Sinoviales, 92 Sarcomas de la Familia Ewing y 29 corresponden a otros tumores. En primer lugar se realiza un estudio histopatológico y a continuación la determinación de las fusiones moleculares SYT-SSX y EWS-FLI1 a partir de ARN obtenido de 169 bloques de parafina. Destacan de los resultados que en el grupo de tumores en el que se analizó ARN de tejido crioconservado y ARN de tejido conservado en parafina, se obtienen resultados similares para la fusión SYT-SSX mientras que el rendimiento para la fusión EWS-FLI1 es mucho menor para el estudio de material incluido en parafina (de un 50% a un 100%) y en material procedente de parafina se obtuvo: en los sarcomas sinoviales amplificación de los transcritos de fusión SYT-SSX en más de un 75% de los casos en los que había ARN valorable y en los sarcomas de la familia Ewing se encontró, también en material incluido en parafina, transcritos de fusión EWS-FLI1 en más del 80% de los casos en los que se obtuvo ARN valorable. Esto puede suponer una importante ayuda para el diagnóstico y el diagnóstico diferencial de estos tumores. En cuanto a los procedimiento técnicos utilizados hay que destacar un rendimiento mayor, analizando los productos de PCR mediante Southern-Blot, con diferencias estadísticamente significativas, en dos grupos de estudio, que utilizando solamente PCR como procedimiento de amplificación. Demostramos que es posible obtener ARN de tejidos incluidos en parafina y utilizarlo, mediante técnicas de Biología Molecular, para determinar alteraciones genéticas, que pueden ser útiles, junto al estudio histopatológico e inmunohistoquímico, para el diagnóstico y el diagnóstico diferencial de neoplasias humanas, especialmente el grupo de sarcomas indiferenciales de hueso y partes blandas.

Autor: MORENO MIRALLES ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La talasemias corresponden a las enfermedades monogénicas más frecuentes en el mundo siendo los países del área mediterránea, entre ellos España, una de las zonas con mayor incidencia. Aunque se han descrito numerosas mutaciones solamente un grupo de unas 20 mutaciones son las causantes del 80% de los alelos talasémicos en el mundo. Además se ha observado una marcada hetrogeneidad en cuanto a la distribución geográfica de las mismas. Los estudios realizados en la península muestran también una gran heterogeneidad en cuanto a la incidencia y a las alteraciones moleculares de talasemia, sin embargo, hasta el momento no se habían realizado estudios sobre la población de la Comunidad Valenciana, donde existe una elevada incidencia de talasemia. Además es especialmente interesante el estudio de la relación entre la alteración molecular y el fenotipo hematológico que ésta produce ya que esto podría ayudar a predecir la gravedad del cuadro clínico de los pacientes homocigotos o doble heterocigotos. En este trabajo se ha propuesto estudiar el espectro de mutaciones causantes de las diferentes formas de talsemia, alfa beta y -beta talasemia, comparándolo con el descrito en otras áreas geográficas de la península. Así como estudiar la relación entre el fenotipo y la alteración molecular con el fin de establecer en qué medida ésta relación se ve afectada por otros factores. El estudio se ha realizado sobre los pacientes talasémicos de diferentes hospitales de la Comunidad Valenciana. El estudio molecular comprende diferentes procedimientos de PCR, digestión enzimática, secuenciación y southern blot para la identificación de las alteraciones más frecuentes en España y el área mediterránea. Se han estudiado un total de 252 pacientes talasémicos y 180 familiares de éstos que nos ha permitido establecer las alteraciones más frecuentes en nuestra región: deleción -alfa3.7 en las alfa talasemias, mutaciones CD-39, IVS I-6 y CD-6 en las betas talasemias y deleción (-beta)0 Spanish en las -beta talasemias. Además el estudio de la relación entre el fenotipo hematológico y la mutación responsable indica que el tipo de mutación causante de beta talasemia (beta+ 0 beta0) no es suficiente en todos los casos para explicar la gravedad clínica de los pacientes homocigotos y doble heterocigotos.

Autor: PIVIDORI GURGO M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Resumen: La creciente demanda de información genética en campos cada vez más variados ha llevado al desarrollo de nuevas metodologías de análisis de DNA. El Proyecto Genoma Humano ha contribuido en primer lugar en favorecer la creación de metodologías analíticas que den información genética de manera rápida y fiable para poder culminarlo. En segundo lugar, la información obtenida y los resultados derivados del PGH ha generado nuevos mercados para la genética, abriendo las puertas a nuevas posibilidades analíticas. Para continuar con estos avances y explotar estos conocimientos, los dispositivos de análisis futuros deben reunir ciertas características tales como alta eficacia, rapidez, simplicidad y bajo coste. En este contexto, en la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de genosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional. Por este motivo, los transductores electroquímicos fueron nuestros candidatos de estudio por sobre otras transducciones como la óptica. Nuestros esfuerzos se dirigieron hacia la inmovilización por adsorción física del DNA debido a que es compatible con el desarrollo de dispositivos de fabricación masiva y de bajo coste. Así, se han estudiado y caracterizado distintos transductores para conseguir este fin, y el que mostró propiedades físicas y electroquímicas extraordinarias fue el composite grafito-epoxi. En una primera instancia nos planteamos la construcción de genosensores amperométricos de membranas recambiables en las que el DNA se inmovilice sobre el nylon, que es el soporte por excelencia en los métodos de análisis clásicos de DNA. Los protocolos de inmovilización, hibridación y marcación enzimática sobre este soporte son muy conocidos y utilizados de manera masiva. Por primera vez una membrana de nylon modificada con DNA se integró el transductor grafito-epoxi para la detección del evento de hibridación. Otro hecho que vale la pena destacar es que debido a las falencias en las metodologías de detección del DNA en genosensores electroquímicos, se utilizó por primera vez un sistema de marcación basado en la enzima HRP, acoplada al DNA mediante la interacción biotina-estreptavidina, hasta ahora no utilizado en genosensores electroquímicos. Los resultados obtenidos se compararon con genosensores en los cuales el DNA se inmovilizó por adsorción física sobre un composite grafito-exposi. El genosensor basado en este tipo de transductor mostró unas propiedades excelentes. En comparación con los genosensores de membranas recambiables, las señales amperométricas fueron sensiblemente superiores con el composite grafito-exposi, el tiempo de hibridación se consiguió reducir desde 15 horas a 45 minutos, se pudieron detectar de 10 a 100 veces menos cantidad de analito, y la adsorción inespecífica fue notablemente inferior. Finalmente, el genosensor basado en un composite grafito-epoxi se ha aplicado también a diversos formatos. El que ha mostrado mejores resultados ha sido el formato de captura. El formato de captura es el más idóneo para ser implementado en forma de kit, ya que permite tener pre-preparados los dispositivos genosensores con la sonda de captura inmovilizada. Los genosensores en un futuro se podrían fabricar con procedimientos planares de fabricación masiva, lo que aumentaría más sus perspectivas comerciales. Finalmente, se ha demostrado la utilidad de los dispositivos genosensores desarrollados en la determinación de Salmonella, mediante el acoplamiento de la PCR y la detección de amplicón con el genosensor amperométrico. El procedimiento total de análisis fue de 6 a 8 hs., en contraste con los 3 a 5 días requeridos para la determinación con métodos microbiológicos clásicos. El nuevo dispositivo genosensor que se ha desarrollado, basado en un composite grafito-exposi, cumple con todos los requerimientos que se habían planteado en los objetivos: es robusto, sensible, de bajo coste, capaz de ser miniaturizado y de ser construido en distintas configuraciones, su uso es sencillo y su respuesta es rápida, se ha demostrado su capacidad de ser utilizado para medidas de campo, y es viable su implementación en kits genosensores. Además, puede aplicarse a diversas situaciones analíticas -sólo se debe diseñar el experimiento con la secuencia del problema analítico que se pretenda resolver- en campos de análisis genético tan variados como medicina, biotecnología y biología molecular y en determinaciones forenses, medioambientales y, principalmente, industriales.