BIOQUIMICA FISICA

Autor: CASARES ATIENZA SALVADOR .
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se han estudiado las relaciones existentes entre la estabilidad termodinámica local y global de las proteínas así como entre la energética de sus interacciones internas o con ligandos externos y la transmisión cooperativa de tales interacciones a través de su estructura. Para ello se ha escogido el dominio SH3 de alfa-espectrina (SH3-Spc). Se han empleado técnicas de mutagénesis dirigida para la obtención de diferentes mutantes del dominio y se ha estudiado su estabilidad y su plegamiento mediante intercambio hidrógeno-deuterio (IHD) seguido por resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN-2D), junto con experimentos de desplegamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Por otro lado, se ha estudiado la interacción entre el dominio SH3-Spc (mutante R21A) con el decapéptido p41 (APSYSPPPPP) utilizando esepctrofluorimetría (EF), calorimetría isotérmica de titulación (ITC) y DSC combinadas con estudios de IHD seguidos por RMN-2D. Las conclusiones más importantes a las que conduce este estudio son las siguientes: 1,- Las mutaciones en diferentes puntos de su superficie producen cambios en la estabilidad global del dominio SH3-Spc de diversa magnitud y signo, determinables por DSC. Los cambios en la estabilidad global son coherentes con las predicciones teóricas existentes en la bibliografía para los efectos locales producidos en la región de la mutación. 2,- El análisis comparativo entre las estructuras de rayos X de la variante natural del dominio SH3-Spc y algunos de los mutantes (N47A, N47G, A56G y A56S) junto con el análisis de los desplazamientos químicos de RMN de la cadena principal indican que los efectos de las mutaciones sobre la estructura del dominio son muy reducidos y se limitan a la región de la mutación. 3,- El estudio de los efectos de las mutaciones sobre el IHD indica que los cambios de estabilidad local se transmiten cooperativamente en mayor o menor grado a la práctica totalidad de la estructura del dominio SH3-Spc, incluyendo regiones muy alejadas de la mutación. No obstante cambios energéticos se transmiten más eficientemente a las regiones más estables del dominio y de forma menos eficaz a las zonas flexibles del mismo. 4,- La transmisión cooperativa de estabilidad presenta rutas bien definidas a través de las interacciones presentes en la estructura del dominio que dependen de la posición de la mutación realizada. No existe, además, bidireccionalidad en éstas rutas de transmisión de cooperatividad, de forma que una perturbación energética se transmite de forma muhco más eficiente de una región flexible a una región estable que a la inversa. 5,- Los datos de IHD proporcionan gran detalle en los cambios energéticos locales producidos por las mutaciones, observándose en algunas zonas del dominio fenómenos supercooperativos o anticooperativos con la mutación, que se explican adecuadamente mediante la hipótesis de que las mutaciones producen una redistribución de las poblaciones de los estados conformacionales del dominio. Estos efectos son una manifestación del carácter estadístico de las proteínas. 6,- La realización de mutaciones en dos puntos difernetes del sitio de unión (posiciones 21 y 56) del dominio SH3-Spc, tiene efectos variados sobre su afinidad de unión por el ligando p41 (APSYSPPPPP) dependiendo del carácter de la mutación. Las mutaciones realizadas en posición 47, alejada del sitio de unión, provocan invariablemente una reducción de afinidad por el ligando p41, indicando la conexión cooperativa entre el giro distal y el sitio de unión. 7,- No existe una correlación entre la estabilidad termodinámica y la afinidad de unión a p41 para los diferentes mutantes del dominio SH3-Spc, lo que indica que una mutación determinada puede estar estabilizando o desestabilizando selectivamente ciertos microestados conformacionales del dominio que no tienen por qué ser los más competentes para la unión de ligando. 8,- La afinidad de unión del ligando p41 a SH3-Spc es consecuencia de una compensación entre una entalpía de unión favorable muy elevada y una entropía de unión desfavorable también considerable, lo que indica un papel importante de las interacciones de naturaleza polar. No obstante, el incremento de capacida calorífica de unión es negativo consecuencia del enterramiento acusado de superficie hidrfóbica con la unión. 9,- Uno de los mutantes, el R21A posee una afinidad claramente incrementada por el ligando en comparación con la variante natural, que se explica por la eliminación con la mutación de impedimentos esféricos para la interacción del ligando con el sitio de unión. La mutación incrementa la magnitud de la entalpía de unión favorable a costa de una malyor disminución de entropía con la unión magnitudes compatibles con el aumento de interacciones de naturaleza predominantemente polar. 10,- La unión del ligando al mutante R21A del dominio SH3-Spc produce cambios en los desplazamientos químicos de RMN poco acusados, limitándose a la región del sitio de unión a zonas adyacentes al mismo, al lazo RT y, en menor medida, el lazo n-Src. 11,- Se forma similar al efecto de las mutaciones puntuales, las interacciones en el sitio de unión con el ligando p41 se transmiten cooperativamente a la práctica totalidad de la estructura del dominio, de forma más acusada a las regiones más estables y en menor medida a las zonas de menor estabilidad. 12,- El análisis termodinámico-estadístico del efecto de la unión del ligando sobre el IHD del dominio SH3-Spc proporciona información sobre las afinidades promedio de unión del ligando de los diferentes estados conformacionales del dominio SH3-Spc. En general, los desplazamientos extensos que afectan a las regiones más estables producen una reducción de la afinidad por el ligando hasta valores despreciables, mientras que los desplegamientos más locales de las zonas menos estables únicamente producen una reducción parcial de la afinidad. 13,- El sitio de unión del dominio SH3-Spc está compuesto por dos regiones: Una intrínsecamente estable, con una afinidad residual para secuencias ricas en prolina, flanqueada por una región conformacionalmente flexible, cuya contribución a la afinidad de unión puede ser modulada a través de un mecanismo de selección de conformaciones. Esta selección puede producirse bien por interacción directa de un ligando con dichas regiones flexibles, o bien por la transmisión cooperativa de una interacción en una región alejada del sitio de unión.

Autor: PRAT RESINA XAVIER.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: En esta tesis se han diseñado y aplicado diferentes herramientas teóricas y computacionales para el estudio de la reactividad de la enzima Mandelato Racemasa. La enzima Mandelato Racemasa cataliza la interconversión de los dos enantiomeros (S) y (R) del ácido mandélico a una velocidad parecida. El mecanismo de reacción que se postula experimentalmente pasa por la abstración de un protón muy poco ácido. Esta reacción tan poco favorable en medio acuoso la enzima la cataliza a una velocidad sorprendentemente alta. Haciendo un estudio QM/MM de la reactividad de la enzima se han encontrado los intermedius y las barreras de reacción que permiten deducir tres mecanismos a traves de los cuales el sustrato natural mandelato y otros dos sustratos análogos pueden racemizar. Explicamos de qué manera la enzima puede llevar a cabo una catálisis tan efectiva y equivalente para los dos enantiómeros. Partiendo de la necesidad de mejorar el estudio QM/MM antrior, sobretodo por lo que respecta a una precisa localización de los estados de transición (barreras de reacción), se ha diseñado un método de optimización de estructuras para ser aplicado a sistemas de miles átomos como lo es nuestra enzima. El método llamado micro-iterativo se basa en la búsqueda según las ecuaciones Rational Function Optimization (RFO) en una zona reducida mientras se minimiza el entorno con un método computacionalmente barato como el LBFGS. Este método micro-iterativo ha sido formulado, implementado y testado en sistemas moleculares grandes y pequeños. Se ha estudiado las diferentes opciones y se ha dado una receta práctica para su uso en otro tipo de reacciones. También se ha justificado su desarrollo poniendo de relieve las mejores obtenidas con este nuevo método cuando se comparan los nuevos resultados con los obtenidos en el estudio QM/MM inicial. Finalmente, la energía libre de la reacción enzimática se ha calculado con técnicas de la dinámica molecular y de Umbrella Sampling. Para este tipo de cálculo es imprescindible escoger a priori una coordenada de reacción que permita ir de reactivos a producto, en otras palabras, es necesario saber como tiene lugar la reacción. Gracias a la previa localización de estados de transición con el método micro-iterativo podemos conocer el mecanismo de reacción. Y por lo tanto podemos usar una coordenada de reacción adecuada que nos permita calcular la energía libre de reacción de forma efectiva.

Autor: VIVES BLAZQUEZ MONTSERRAT.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido el estudio de los equilibrios conformacionales y de interacción con diferentes ligados de diversos oligonucleótidos y polinucleótidos sintéticos modelos de RNA y DNA, en varias condiciones experimentales. El segundo objetivo de esta tesis doctoral ha consistido en la puesta a punto de procedimientos experimentales para el estudio de dichos equilibrios en solución, fundamentalmente basados en la utilización de métodos de espectroscopía de absorción molecular, de fluorescencia, de dicroísmo circular y de 1H-RMN. Finalmente, el tercer objetivo de esta tesis doctoral ha sido la aplicación y puesta a punto de procedimientos quimiométricos de tratamiento de los datos experimentales obtenidos en los estudios anteriormente mencionados. El análisis de los datos experimentales mediante procedimientos quimiométricos ha permitido la resolución e interpretación de los sistemas estudiados. En la primera parte de esta tesis doctoral se estudian los equilibrios conformacionales de polinucleótidos, de oligonucleótidos y de un ácido nucleico natural en función de varios factores: temperatura, pH, fuerza iónica y presencia de iones metálicos en el medio. A partir de la aplicación de métodos espectroscópicos y de métodos quimiométricos de análisis de datos adecuados se pretende ampliar la información sobre los procesos ya estudiados por otros autores y también sobre nuevos procesos estudiados por primera vez en esta tesis. Asimismo, en esta primera parte se realiza el estudio de oligonucleótidos modificados por la incorporación de una base nitrogenada no natural a su secuencia con el objetivo de determinar el tipo de conformación que ésta adopta en condiciones fisiológicas. También se ha realizado la parte de síntesis de oligonucleotidos modificado, tanto por la incorporación de bases nitrogenadas no naturales como por la interacción con transplatino. En la segunda parte de esta tesis doctoral se estudia la interacción de un ligando orgánico (bromuro de etidio) y de un ligando inorgánico (cis-dicloro-(1,2-dietil-3-aminopirrolidina) de plantino(II)) con polinucleótidos.

Autor: GARCÍA RUBIO INÉS.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los citocromos son hemoproteínas de transferencia de electrones que se encuentran en todo tipo de organismos y participan en numerosos procesos de gran importancia biológica (fotosíntesis, respiración celular …). El hecho de que en estado oxidado los citocromos sean paramagnéticos hace de la espectroscopia de resonancia paramganética electrónica (EPR) una herramienta muy útil para el estudio de estas proteínas, ya que proporciona información sobre el centro paramagnético, que es el centro activo de la proteína. En la primeraparte de la tesis se ha abordado el estudio de los estados electrónicos de los citocromos b559 de espinaca y c6 de Anabaena mediante EPR en onda continua y EPR inducido por eco. Este estudio ha revelado la influencia del detergente en la estructura electrónica del grupo hemo del citocromo b559 en muestras de centro de reacción. Asímismo, en el caso del citocromo c6 se pone de manifiesto la existencia de dos formas de citocromo c6 se pone de manifiesto la existencia de dos formas de citocromo que difieren en la orientación relativa de los ligandos axiales del hierro hemínico. En la segunda parte del trabajo, se ha investigado la distribución espacial del electrón desapareado a través del estudio de las interacciones hiperfinas del espín electrónico con los núcleos del entorno. Para ello se ha empleado la espectroscopia ESEEM (especialmente la espectroscopia bidimensional HYSCORE). La interpretación de los espectros de los citocromos se ha realizado con ayuda de compuestos modelo marcados selectivamente con 15N. Se ha determinado la orientación de los ejes principales del tensor g y los tensores de interacción hiperfina y cuadrupolar. En el caso del citocromo b559, a partir de estos tensores se ha obtenido la orientación de los anillos de imidazol que coordinan axialmente al hierro. Como conclusión de este estudio se ha puesto de manifiesto que tanto el citocromo b559 como las dos formas de citocromo c6 mantienen el electrón altamente confinado en orbitales no enlazantes del hierro. Esto induce a pensar que los mecanismos de reacción de este tipo de proteínas no son directos, sino que involucran algún aminoácido de la cadena polipeptídica.

Autor: ANGULO ÁLVAREZ JESÚS.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se presentan los estudios estructurales de oligosacáridos modelos de glicosaminoglicanos (GAGs) que se han sintetizado para abordar el estudio de las bases moleculares de la activación de los factores de crecimiento para fibroplastos (FGFs). Se han resuelto las estructuras tridimensionales de 4 hexasacáridos con diferentes patrones de sulfatación mediante espectroscopía de RMN y Modelización Molecular. Mediante la detección de señales de efecto Overhauser nuclear (NOE), y las predicciones teóricas de la Mecánica Molecular, se ha podido determinar una estructura global en términos de una hélice a derechas a nivel del esqueleto covalente oligosacarídico, similar para los 4 hexasacáridos y análoga a la descrita paral a heparina natural. El análisis de constantes de acoplamiento vecinales homonucleares ha evidenciado un equilibrio de confórmeros para los anillos de ácido idurónico constituyentes. Los datos de relajación homo- y heteronuclear han puesto de manifiesto una orientación hidrodiámica anisotrópica de estos productos en disolución, así como una marcada rigidez de dicha conformación helicoidal. Para el estudio dinámico de estas moléculas se ha realizado una investigación metodológica de distintas condiciones de simulación de dinámica molecular. Para el acuerdo con los datos de RMN ha sido necesaria la aplicación del ametodología Partícula. Malla de Ewald en dichas simulaciones. Esta metodología ha permitido la obtención de dinámicas moleculares en las que los confórmeros del anillo de idurónico son estables, revelando la importancia del tratamiento electrostático adecuado para estos sistemas moleculares con una elevada carga negativa.

Autor: CONTRERAS JURADO SILVIA CONSTANZA.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEP. FISIOLOGÍA.

Resumen: Debido a la diversidad de opiniones existentes acerca de la posible estequiometrías del intercambiador Na/Mg, así como sobre los efectos de inhibición faramacológica y no farmacológica sobre éste, en esta memoria de Tesis estudiamos ambos aspectos. Los métodos empleados han sido: 1,- Espectroscopía de Absorción atómica. 2,- fluorescencia. Los objetivos planteados: 1,- Estudio de la estequiometría del intercambiador Na/Mg. 2,- Efecto inhibitorio de la amilordia, imipramina y Mg extracelular sobre los flujos de Na y Mg. 3,- Desarrollo de un método más rápido y que emplee menor número de células que mediante absorción atómico. El método desarrollado es a través de fluorescencia. 4,- Análisis de los mecanismos de inhibición de la imipramina en el intercambiador Na/MG. 5,- Detección del intercambio Na/Mg en células del epitelio renal (MDCK).

Autor: HIERRA AYUELA AITOR.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UPV/EHU.

Resumen: La Nucleoplasmina es una chaperona molecular de carácter ácido y muy termoestable presente en ocitos y huevos de Xenopus laevis cuya función es apantallar la carga positiva de las histonas y mediar en el ensamblaje de los nucleosomas tras la fecundación. Su actividad parece estar regulada por la masiva fosforilación que se produce en la maduración del oocito a huevo. En este trabajo se ha comparado estructural y funcionalmente tanto la Nucleoplasmina obtenida de fuentes naturales como la expresada en E.coli, además de dos mutantes de delección. Los resultados muestran como la fosforilación no produce modificaciones en la estructura secundaria de la proteína pero sí parece influir en su estructura terciaris y/o cuaternaria. Las fosforilalción de ciertos residuos en la región C-terminal, favorece la exposición de una región rica en glutámicos (poli-glu) capaz de interaccionar con proteínas básicas. Por otro lado la mayor fosforilación de esta proteína se produce en el dominio N-terminal, el cual adquiere la capacidad de descondensar cromatina espermática y unir proteínas básicas asociadas al DNA espermático.

Autor: HERNÁNDEZ LAMAS M. CARMEN.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: En un primer apartado de generalidades se tratan de exponer los principios básicos de criobiología, con los conocimientos teóricos de lo que es la criopreservación, congelación programada, crioprotectores, controles biológicos correspondientes de un laboratorio de criobiología: serológicos, bacteriológicos, viabilidad, histocompatibilidad celular junto a un apartado de almacenamiento con las medidas de seguridad. En una segunda parte se realiza una introducción a los progenitores hematopoyéticos describiendo las principales líneas celulares partiendo de la hematopoyesis en estado embrionario y adulto. Como puesta al día se plantea las características de la SCU y la situación actual de los BSCU y los requisitos para garantizar la calidad: Iso 9002 + Estándares Netcord. Se describe el perfil de la donante de SCU y los aspectos éticos y legales al mismo. PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO OBJETIVOS La valoración de la posible transmisión de enfermedades infectocontagiosas no solo tras la vía vertical: madre-feto-cordón sino la posibildiad de contaminación en el proceso. En la actualidad al ser un tema muy novedoso se carece de estudios estadísticos en este sentido. MATERIAL Y MÉTODOS Se ha realizado un estudio sobre 633 las donaciones de SCU correspondiente al año 2000. En ella se han analizado las enfermedades transmisibles de control obligatorio y las realizadas según recomendaciones de estándares Netcord. Se han utilizado otras variables de la SCU, como la edad de la madre, la población, el volumen de congelación la celularidad total, el % de mononucleadas para establecer la posible relacion entre ellas y la incidencia de enfermedades transmisibles. Cómo método estadístico se ha realizado un test de descriptivo tanto de las variables cualitativas como cuantitativas. En el estudio estadístico comparativo se aplicó un tests de regresión lineal simple, y un test de regresión logística binaria. RESULTADOS Incidencia de HBsAg 0%, HCVAc 0,6%, VIH-Ac 0,3%, Agp-24HIV 0%, ARNHCV 0,3%, CMV+4,2% Toxoplasmosis +0,2. Cultivos +2,5%. Test de regresión logística simple no se encontró correlación entre la edad y el volumen junto a las células. En el test de regresión logística binaria no hubo asociación para CMV entre la edad y la infección a CMV. Se presenta un 58% más de riesgo de presentar la infección la embarazada de otras poblaciones en relación a Málaga capital. Para Toxoplasmosis por cada años de edad de más de la embarazada aumenta un 12% el riesgo de presentar infección por toxoplasmosis, siendo este riesgo del 77% superior en los pueblos de interior que el de los pueblos costeros. DISCUSIÓN Se trata de justificar el método de trabajo seguido así como un estudio comparativo con otros autores. CONCLUSIONES Se demuestra de forma general y en nuestro entorno la baja incidencia de enfermedades transmisibles. La importancia de una información adecuada a la madre y de una formación idónea a las matronas. La importancia de las medidas durante el proceso para evitar contaminación. La necesidad de un estudio multicéntrico para establecer el riesgo mínimo residual de transmisión es este tipo de donantes. La necesidad de disponer de serotéca. La embarazada como exigencia de un derecho futurible a la donación de sangre de cordón.

Autor: LÓPEZ CORTAJARENA AITZIBER.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En la tesis se han abordado distintos aspectos del mecanismo de actuación de la alfa-hemolisina de Escherichia coli (HlyA). En concreto, se ha estudiado la interacción específica de la toxina con membranas de eritrocitos y la implicación de distintas regiones en la actividad de la proteína. Del estudio de la interacción de la toxina con membranas de eritrocitos se concluye que la actividad de la toxina está mediada por la interacción específica de la misma con la glicoforina, que actúa como receptor específico de HlyA en esté tipo celular. Además se define la región entre los aminoácidos 914-936 como implicada en esta interacción específica entre ambas proteínas. Por otra parte, al determinar el papel que desempeñan los triptófanos de HlyA, se observa que los triptófanos no parecen implicados en la capacidad de inserción en membranas. Al mismo tiempo, de la mutagénesis dirigida del triptófano 914 deduce que es el único que participa en el cambio de fluorescencia intrínseca que se observa cuando se produce el cambio conformacional que provoca el calcio en la proteína. Finalmente, se aborda el papel de la histidina 859, que se encuentra en la penúltima de las repeticiones del dominio de unión a calcio, concluyéndose que es un residuo esencial para la actividad de la toxina, afectando a los equilibrios de agregación de la toxina, además de ser responsable de la dependencia con el pH de la actividad de HlyA.

Autor: PÉREZ RUIZ YOLANDA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: En el espectro de RMN de Protón de células tumorales, de tumores experimentales inducidos en cerebro de rata y de tumores cerebrales humanos, se ha observado la presencia de una intensa resonancia a 1,26 PPM, que ha sido asignada a las cadenas de ácidos grasos de triglicéridos (Lípidos Móviles, ML). Para establecer la posible utilidad como marcadores tumorales de estas resonancias de ML es preciso conocer su origen bioquímico y localización subcelular y/o extracelular. Hasta el momento, se ha propuesto dos orígenes subcelulares; I- Microdominios, de diámetro 25-28 NM, embebidos en la membrana plasmática II- Gotículas lípidicas citoplasmáticas en células intactas (0,5-1,5 uM) III- Gotículas lípidicas extracelulares en zonas necróticas de tumores (8-10uM). En el presente trabajo se ha utilizado la espectroscopía de RMN de difusión para caracterizar el origen subcelular de la señal de lípidos neutros visible en el espectro de RMN de protón de células C6 de glioma de rata postconfluentes. Se ha medido el tamaño del compartimento en el que se origina dicha resonancia a partir del estudio de la restricción a la difusión libre de la señal de ML. Para las gotículas lípidicas citoplasmática en células C6 postoconfluentes, los valores obtenidos por RMN (1,88+0,004uM) no difieren de forma significativa de los obtenidos por microscopía de fluorescencia (1,7+0,33 uM). Por tanto, los experimentos de difusión nos han proprocionado la evidencia directa de que la resonancia de ML a 1,26 PPM presente en el espectro de RMN de protón de células C6 postconfluentes está constituida mayoritariamente por lípidos neutros almacenados en cotículas lípidicas citoplasmática. Por otro lado, hemos realizado un estudio exhaustivo de los valores de T2 para las resonancias de ML de diferentes muestras: aceite de borraja, goticulas artificiales, células C6 en fase exponencial/popstconfluente y esferoides de células C6. El objetivo era investigar si una diferencia en el tamaño de gotícula podría producir una diferencia en el T2 de los grupos CH2 y CH3 de las cadenas de ácido graso de los ML, lo que permitiría sugerir un sistema para diferenciar in vivo zonas hipóxicas (caracterizadas por la presencia de gotículas de pequeño tamaño) de zonas necróticas. Los resultados obtenidos parecen descartar la utilización de un filtro de T2 para separar zonas necroticas de zoas hipoxicas de un tumor.

Autor: ESTEVE MOYA VICENT.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA .
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUIMICAS .

Resumen: Los estudios iniciales de CD y el analisis de los espectros obtenidos de experimentos de RMN utilizando DMSO como disolventes indicaban que los peptidos de secuencia Ac-L WRIL W-NH2 y Ac-1wrilw-NH2 poseian cierta tendencia a formar helices alfa. En el primer caso helices alfa a derechas y en el segundo hélices alfa a izquierdas. Los dos hexapeptidos resultaron activos e la inhibicion de calmoldulina. Los estudios de busqueda conformacional realizados siempre llevaron a helices alfa como las estructuras mas estables para estos hexapeptidos. En disolucion acuosa se observa un aumento de la poblacion de conformaciones en helice alfa. Los espectros de CD, los desplazamientos quimicos, constantes de acoplamiento y NOEs de medio alcance, indican que en presencia de un 30% de TFE la estructura en helice alfa es predominante. Los datos de RMN se utilizaron como restricciones para generar, utilizando la tecnica de templado simulando, una familia de estructuras. El analisis de posibles interacciones intramoleculares en esta familia de estructuras muestra que son posibles numerosos puestes de hidrogeno con las cadenas laterales y grupos de "capping". Asi mismo, las cadenas laterales de los residuos hidrofobos(leucinas e isoleucina) se encuentran proximas formando un pequeño nucleo hidrofobo. Las cadenas laterales de los triptófanos pueden interaccionar con las zonas hidrofóbicas o con el grupo amino cargado de la cadena lateral de la arginina (interaccion del tipo cation-orbital r), aunque no se ha encontrado una evidencia experimental clara al respecto. Tambien se han contrastado los determinantes de la estabilizacion estructural estudiando una familia de analogos con algunas sustituciones en los residuos originales. Todos ellos fueron estudiados por RMN y CD. Entre ellos es de destacar el importante papel de acetilo N-terminal como "iniciador" de la helice. Su eliminacion comportaba la perdida de cualquier indicio de estructura. Todas las sustituciones por glicina provocan la disminucion o perdida de estructura, ya que este residuo introduce un grado mayor de flexibilidad en la cadena. Proteina de movimiento del virus CarMV Los estudios de RMN sobre un péptido sintético correspondiente al dominio de union a RNA de la proteina p7 del CarMV muestran una conformacion desordenada en disolucion acuosa, aunque se manifiesta una pequeña tendencia a estructurarse como helice alfa en su extremo C-terminal que puede tener un significado funcional. La adicion de TFE provoca la induccion de estructura en helice alfa de la mayor parte del dominio. Cierta mutacion en el interior de la secuencia en que se sustituye uno de los residuos por prolina(conocido desestabilizador de hélice alfa) permite todavia la union al RNA de este peptido. El estudio por RMN de estos peptidos sustituidos muestra que la helice alfa podria arrancar de la prolina introducida. Es mas, la curvatura provocada por la prolina podria facilitar su union al RNA al tiempo que podria estabilizar el comienzo de la helice. Proteina diseñada de novo A partir de los péptidos con capacidad de formar un haz de hélices con actividad enzimatica, se seleccionaron los que habian sido optimizados utilizando las SCL. Se ha estudiado por RMN la capacidad de autoensmblaje de tres de ellos y se han comparado con el peptido original utilizado como plantilla. Los resultados muestran como solamente aquellos peptidos con un numero suficiente de posibles interacciones en el lado hidrofilo de haz de helices es capaz de mantener el complejo cuaternario deseado aun cuando comparten los mismos aminoacidos con potencialidad de formar el nucleo hidrofobo.

Autor: SUÁREZ CORTÉS TATIANA M..
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DEL PAÍS VASCO.

Resumen: Los virus con envoltura, tales como el virus de la Inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1) o el virus Ebola, necesitan promover la fusión de su membrana con la membrana celular para infectar sus células blanco. Dicho proceso es catalizado por la acción de pépticos de fusión localizados en las glicoproteínas de superficie. Recientemente se ha demostrado que durante el proceso de refusión viral se produce el plegamiento de algunas secuncias de las glicoproteínas, destinado a facilitar la inserción de péptidos de fusión en la membrana blanco. Este mecanismo ha despertado el interés por la determinación de secuencias con potencialidad para interaccionar con las membranas como un paso crucial en el proceso de fusión y por tanto en la infectividad de los virus. Hasta el momento, la identificación de secuencias con carácter fusogénico se ha basado principalmente en determinar su hidrofobicidad. En esta Tesis hemos desarrollado una nueva metodología para la detección de péptidos de fusión basándonos en la determinación de la afinidad de las secuencias por la interfase de la membrana. Aplicando este fundamento, hemos identificado secuencias con estas características localizadas inmediatamente adyacentes a la región transmembrana, las cuales no habían sido anteriormente caracterizadas en su capacidad para interaccionar con bicapas lipídicas. En nuestras investigaciones hemos utilizado péptidos sintéticos que representan dichas secuncias y hemos determinado su actividad de membrana utilizando sistema modelo de membrana. Adicionalmente, hemos investigado el mecanismo molecular por el cual una mutación en la posición 2 del péptido de fusión amino terminal del virus VIH-1, elimina su actividad fusogénica. Los resultados obtendios en esta Tesis son relevantes en el campo del diseño de posibles vacunas con miras al bloqueo del proceso de fusión viral.

Autor: SÁEZ CIRIÓN ASIER.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, U.P.V..

Resumen: A lo largo de esta Tesis se ha tratado de profundizar en el conocimiento del mecanismo de fusión de las membranas celular y viral, que tiene lugar durante el ciclo infectivo de los virus con envuelta, empleando herramientas biofísicas, tanto experimentales como teóricas. En primer lugar se estudió la plasticidad estructural asociada al péptido de fusión de la glicoproteína gp41 del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1. Este péptido presenta al menos dos estados conformacionales cuando se encuentra asociado a membranas. Cada una de estas conformaciones produce perturbaciones diferentes en la estructura de la membrana. Con ayuda de una nueva herramienta de predicción basada en la escala de hidrofobicidad desarrollada por Wimley y White (Nat. Struct. Biol., 1996, 3, 842-848) se detectaron nuevos dominios de interacción con membranas en gp41, en GP2 del virus Ébola y en la proteína priónica bovina. Esta misma herramienta permitió además establecer el hipotético mecanismo de inserción en las membranas de dichas secuencias. Algunas de estas predicciones fueron confirmadas experimentalmente, empleando péptidos sintéticos y membranas modelo.

Autor: GARCIA VILOCA MIREIA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSITAT AUTONOMA DE BARCELONA/FACULTAT DE CIENCIES..

Resumen: El objetivo de la tesis se centra en el estudio teórico de un caso especial de puentes de hidrógeno llamado Puentes de Hidrógeno de barrera baja(Low-Barrier Hydrogen Bonds, LBHBs en ingles), a los que se atribuye un papel catalítico muy importante en algunas reacciones enzimáticas. Hemos estudiado las propiedades electrónicas y nucleares de sistemas modelo que contienen un LBHB en fase gas, mediante cálculos cuánticos electrónicos i nucleares. También se ha investigado el efecto del disolvente en la simetria de un puente de hidrógeno intramolecular que és un LBHB en fase gas. Hemos comparado los resultados de un modelo que representa el disolvente como un continuo polarizable con los resultados de un modelo donde se representan explícitamente las moleculas de disolvente. El modelo discreto se ha construido mediante la metodología QM/MM. Finalmente hemos simulado la reacción catalizada por el encima mandelato racemasa. Concretamente, se han calculado los perfiles de energia potencial QM/MM de diferentes mecanismos de reacción en el centro activo del enzima nativo de un mutante. El objetivo de este último estudio ha sido clarificar el papel catalítico de un puente de hidrógeno que se ha propuesto como LBHB.

Autor: LOPEZ CARBAJALES MERCEDES.
Año: 1998.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En esta Tesis Doctoral, se lleva a cabo el aislamiento y carcaterización parcial de dos tipos de enzimas vegetales, las quitinasas y las beta-1,3-glucanasas, presentes las primeras en sauco y ambas en remolacha azucarera. Las quitinasas de sauco no se parecen a las descritas en la bibliografía, pero sí a las lectinas de hojas de la misma planta. No poseen además actividad antifúngica sobre seis hongos. La quitinasa de remolacha no se parece a las descritas en la bibliografía, pero sí a tres proteínas relacionadas con la patogénesis. Los dos enzimas aislados de las hojas de remolacha poseen actividad antifúngica sobre el crecimiento de varios hongos. Esta actividad es sinérgica, y es mayor si además está presente una RIP. El hongo más afectado fue un patógeno de la remolacha (Cercospora beticola). Estos enzimas, podrían ser la primera línea de defensa de la planta ya que se acumulan en el líquido apoplástico. La expresión de ambos es inducida por la infección de plantas de remolacha con varios virus (virus del amarilleo, virus del mosaico) y hongos (Uromyces betae y Oidium betae). Logramos observar también la inducción artificial de estas proteínas con mediadores de la respuesta antipatogenica como son el ácido salicílico y el inhibidor de catalasas vegetales 1,3-aminotriazol.

Autor: TABOADA ANTELO PABLO.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FISICA.

Resumen: En el presente trabajo se han estudiado una serie de fármacos, concretamente las penicilinas: cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina y nafcilina, que presentan una estructura molecular anfifílica. Debido a esta naturaleza anfifílica, las propiedades de estos fármacos en disolución acuosa varían sensiblemente con la concentración, afectando plausiblemente a su modo de acción y efectividad en su uso terapéutico. Por tanto, el primer objetivo de este trabajo ha sido la determinación de las propiedades físicas en disolución acuosa de estas penicilinas, así como la modelización de la estructura molecular de los agregados formados. Adicionalmente, se pretendió profundizar en los mecanismos mediante los cuales actúan estas penicilinas y qué tipos de complejos forman con otras sustancias, ya que estudios previos han mostrado la existencia de reacciones alérgicas a las penicilinas en algunos pacientes, así como la presencia de haptenación por conjugación de las moléculas de penicilina con las proteínas sanguíneas, dando lugar a la formación de anticuerpos. Por ello, se estudiaron las interacciones entre estos fármacos y un biopolímero muy común en el organismo humano: la seroalbúmina. El estudio se ha dividido en tres partes. La primera de ellas se ha dedicado a la investigación del proceso de agregación de las citadas penicilinas en disolución acuosa mediante distintas técnicas experimentales: conductividad eléctrica, microcalorimetría, dispersión de luz estática y dinámica, tensión superficial y resonancia magnética nuclear. Todas ellas nos han dado gran información sobre el modo de agregación, los parámetros de agregación característicos, las funciones termodinámicas del proceso de asociación y sobre la estructura molecular de los agregados formados. En la segunda parte, se ha intentado completar la caracterización del comportamiento en disolución de estas penicilinas, estudiando las interacciones que se producen en el seno de disoluciones mezcla binarias de estos fármacos, y cómo repercuten estas en la idealidad del proceso de mezcla, en la composición de los agregados mezcla, y en la estructura que estos presentan. Por último, en la tercera parte de este trabajo se recoge el estudio de las interacciones entre las cuatro penicilinas y la seroalbúmina humana, con el fin de conocer el mecanismo de unión y los efectos de estos fármacos cuando se ligan a esta proteína, realizándose, para ello, medidas experimentales de equilibrio de diálisis, microcalorimetría y potencial zeta.

Autor: MONLEON SALVADO DANIEL.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: La acelerada evolución de los proyectos de secuenciación y análisis del material genético ha producido una creciente necesidad de mejorar tanto en velocidad como en precisión las técnicas de obtención de estructuras de protéinas. El presente trabajo ha sido realizado con este objetivo principal. En concreto, se ha determinado la estructura de una metaloproteína, tanto mediante modelización por homología como por RMN, implicada en procesos de transferencia electrónica para elucidar algunos aspectos de su mecanismo de reacción. De este modo, además de mostrar la aplicación de la determinación de estructuras a la resolución de problemas bioquímicos, se ha comprobado la validez de un método teórico de prediccioón de estructura. Por otra parte, se ha desarrollado y utilizado metodología de obtención de ángulos diedros tanto en proteínas (programa HYPER) como en oligonucleótidos (simulación teórica de espectros) y se aplicado dichas restricciones en la determinación de la estructura 3D del hexanucleótido d(CCGCGG)2, presente en mutaciones críticas del gen del retraso mental hereditario.

Autor: SOPENA BARONA JUAN.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: En este trabajo hemos ideado y desarrollado un método propio capaz de detectar y cuantificar la presencia del RNA mensajero de la tirosinasa en sangre venosa periférica y ganglios linfáticos de pacientes afectos de melanoma maligno, mediante transcripción reversa y una única PCR de 45 ciclos en un solo tubo, evitando muchos de los inconvenientes de la denominada "nested" PCR. El análisis cuantitativo se realizó con ayuda de una molécula mutante de RNA ("standard HTYR RNA") generada mediante transcripción in vitro de un fragmento de cDNA del gen de la tirosinasa obtenido por RT-PCR y mutagénesis dirigida. Así mismo, dicho "standard" resultó de utilidad en el control de posible contaminación de las muestras de PCR. La aplicación de esta técnica en la detección de células circulantes de melanoma permite la identificación de un grupo de pacientes con un elevado riesgo de progresión de su enfermedad desde estadios iniciales y se ha mostrado relacionada con un peor pronóstico de los pacientes pertenecientes a los estadios avanzados de la enfermedad.

Autor: BOULAICH MOHAMMED CHAKIR.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: 1) Se ha demostrado mediante el estudio de un sistema modelo apropiado (plegamiento-desplegamiento de ribonucleasa a pH ácido) que, tanto la calorimetría isoterma de reacción como la calorimetría de flujo, pueden utilizarse para estudiar la cinética de plegamiento-desplegamiento de proteínas. 2) Con este propósito, resulta más conveniente, desde el punto de vista de tiempo y material, la calorimetría isoterma de reacción. 3) Se ha aplicado la calorimetría de reacción cinética a la caracterización del plegamiento-desplegamiento de lisozima de clara de huevo en concentraciones comparativamente altas de cloruro de guanidinio, lo que nos ha permitido obtener valores de entalpía de desnaturalización a esas concentraciones altas de desnaturalizante, datos que sería muy difícil obtener de otra manera. 4) El disponer de valores de entalpía de desnaturalización para lisozima a altas concentraciones de guanidina ha permitido evaluar cinéticamente la validez de los modelos de unión e intercambio, que se utilizan habitualmente para explicar el efecto de agentes desnaturalizantes sobre la estabilidad de proteínas. Se encuentra que, aun cuando ambos modelos son capaces de explicar cualitativamente los datos experimentales, desde un punto cuantitativo el acuerdo entre teoría y experimento es pobre. Se encuentra también que una simple relación lineal entre entalpía de desnaturalización y actividad de guanidina proporciona una buena descripción fenomenológica de los datos experimentales.

Autor: VEIGA ALAMEDA PILAR.
Año: 1998.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Los resultados experimentales de esta Tesis se pueden agrupar en dos bloques principales, uno referente al papel de los esfingolípidos en el comportamiento de fase de los fosfolípidos y otro a su papel en la generación de dominios en el plano de la bicapa. Se han estudiado los efectos de la ceramida, esfingosina y sus derivados fosforilados sobre dos transiciones de fase de fosfoglicéridos: la lamelar gel-fluida y la lamelar-hexagonal. El distinto comportamiento de alguna de estas especies se relaciona con su geometría molecular. También se ha estudiado el comportamiento de mezclas lipídicas que incorporan esfingolípidos por ESR. Todo ello ha conducido a establecer lo siguiente: 1. Los esfingolípidos modifican la transición de fase lamelar a hexagonal invertida en fosfatidiletanolaminas, facilitando en unos caos (p. ej. ceramidas) y dificultando en otros (p. ej. esfingosina-1-fosfato) la transición, según la forma molecular de cada lípido concreto. 2. Esfingolípidos como las ceramidas o la esfingomielina, en mezclas con glicerofosfolípidos en fase lamelar, promueven la separación lateral de fases, con dominios ricos en esfingolípidos, en fase gel y dominios ricos en fosfoglicéridos en fase fluida. 3. En mezclas ternarias de esfingolípido, glicerofosfolípido y colesterol, el colesterol estabiliza de manera particularmente eficaz la existencia de dominios separados en fase gel y en fase líquido-ordenada.