BIOQUIMICA MOLECULAR

Autor: DÍAZ GONZÁLEZ SUSANA .
Año: 2004.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALICANTE.

Resumen: Haloferax mediterranei es un organismo halófilo extremo perteneciente al Dominio Archaea y que presenta diferentes actividades glutamato deshidrogenasa, enzima que cataliza la interconversión entre catabolitos tan importantes como el 2-oxoglutarato y el L-glutamato. Una de ellas, la NADP-dependiente, presenta un máximo de actividad a 2 M de NaCl y 1 M de KCl, siendo ligeramente mayor en presencia de KCl que en NaCl. También se ha determinado actividad glutamato deshidrogenasa NAD-dependiente, con la que se han realizado estudios de purificación y caracterización, así como el clonaje, secuenciación y expresión de su gen. Con la finalidad de obtener enzima en concentraciones elevadas que permitiesen realizar estudios de cristalización, el gen de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, se expresó en el huésped mesófilo E. coli, obteniéndose la proteína en forma de agregados insolubles. La renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante se llevó a cabo mediante dilución rápida empleando tampones con una elevada concentración de sal, siendo ésta óptima a 4 M de NaCl. Se purificó y caracterizó la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa observando que las propiedades moleculares y cinéticas determinadas para esta enzima son prácticamente idénticas a las obtenidas para la enzima recombinante. La NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, es un homohexámero con un tamaño de subunidad de aproximadamente 48 kDa y una masa molecular de 290 kDa. La enzima presenta un comportamiento halofílico y también cierto carácter termofílico, con un máximo de actividad a 4 M de NaCl y una temperatura óptima de 60 ºC. Además el análisis peptídico realizado mediante la técnica de Nanoelectrospray LC/MS, permite la confirmación de forma inequívoca de la identidad de la enzima nativa con la enzima obtenida mediante clonaje, secuenciación y expresión.El análisis comparativo de las secuencias ha puesto de manifiesto la presencia de residuos aminoacídicos altamente conservados, clave en el mantenimiento de las propiedades catalíticas de la enzima, independientemente del carácter halofílico de la misma o del Dominio al que pertenece el organismo.La cadena polipeptídica de la subunidad de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, está formada por 441 residuos aminoacídicos distribuidos, según estudios de modelado molecular, en dos dominios. El dominio I contiene la mayoría de los residuos responsables de las interacciones entre las subunidades del hexámero. El dominio II contiene el sitio de unión del coenzima.

Autor: MONJAS SERRANO ALICIA.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: RESUMEN DE LA MEMORIA La estimulación del complejo TCR/CD3 por su ligando produce su modulación de la membrana plasmática. Este fenómeno parece ser importante para la desensibilización de la célula T. En el laboratorio se había descrito que la unión del TCR a su ligando resultaba en la modulación no sólo de los receptores contactados sino en trans de receptores no contactados. En esta memoria se han investigado los mecanismos que median la modulación de los receptores contactados y no contactados. Así hemos demostrado que los mecanismos que median la modulación directa son independientes de la actividad de proteína tirosina quinasas y no está mediada por vesículas de clatrina, sino por un mecanismo que requiere la integridad de las balsas lipídicas. Por el contrario la modulación de receptores no contactados requiere la actividad tirosina quinasa y está mediada por vesículas cubiertas de clatrina. Así, la modulación del TCR parece operar por dos mecanismos independientes de internalización que actúan de manera diferencial en los receptores contactados y no contactados. Nosotros proponemos que ambos mecanismos coexisten pero la predominancia de uno u otro dependerá de la dosis de ligando. Otra parte de la tesis está dirigida al estudio de la interacción entre el TCR y EB1 y de su significado funcional. EB1 fue descubierto en nuestro laboratorio como un posible ligando del complejo TCR/CD3. El trabajo, que ha sido plasmado en esta memoria, ha consistido primero en determinar que la interacción entre EB1 y el TCR se produce en linfocitos T. Posteriormente se ha realizado una caracterización detallada de las regiones en EB1 y en las subunidades del CD3 responsables de la interacción. Y finalmente se ha demostrado que la sobreexpresión de formas truncadas de EB1 inhiben ciertos parámetros de activación de linfocitos T. Esto implica que la interacción EB1-TCR puede tener un significado funcional que podría residir en la estabilización del TCR en membrana y/o la reorientación del Centro Organizador de Microtúbulos hacia la célula presentadora de antígeno. Esto ha sido confirmado en esta tesis mediante la utilización de ARN de interferencia de EB1. Asimismo mediante esta última técnica se ha podido determinar un papel fundamental de EB1 en el mantenimiento del complejo TCR/CD3 en la membrana plasmática.

Autor: GARCIA CAO MARTA.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLOGICAS.
Centro de realización: CNIO (CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLOGICAS) / CNB (CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA).

Resumen: Transformación de células humanas normales en ausencia de activación de telomerasa. Durante la transformación neoplástica, las células adquieren mutaciones genéticas que les permiten escapar de los mecanismos de control de la proliferación celular. Células primaria murinas pueden ser transformadas en tumorales mediante la coexpresión de dos oncogenes cooperantes como c-myc y H-RasV12. Sin embargo, experimentos similares en células humanas no han tenido éxito en la obtención de células transformadas. Estas diferencias pueden atribuirse, al menos en parte, a las diferencias que existen entre células humanas y de ratón en cuanto a su biología telomérica. Mientras que células murinas expresan telomerasa y sus telómeros son extremadamente largos, las células humanas carecen de telomerasa y sus telómeros se acortan tras cada ciclo de división celular. Este acortamiento telomérico supone una barrera que limita la capacidad proliferativa de las células humanas. La importancia de la telomerasa en el proceso de conversión de una célula humana normal en tumoral se pone de manifiesto en que la mayoría de los tumores humanos presentan elevados niveles de actividad telomerasa. Los modelos existentes de obtención de células humanas mediante la alteración de elementos genéticos definidos incluían la activación de un mecanismo de mantenimiento telomérico como un requisito necesario para la transformación celular. En nuestro trabajo hemos descrito un modelo alternativo de transformación celular que no requiere la activación de telomerasa o de otro mecanismo alternativo de mantenimiento telomérico. Hemos demostrado que la sobreexpresión de E1A, MDM2 y H-RasV12 es suficiente para convertir fibroblastos humanos normales en células transformadas, es decir, capaces de crecer en ausencia de adhesión y de generar tumores al ser inyectadas en ratones inmunodeprimidos. No detectamos activación de un mecanismo de mantenimiento de longitud telomérica ni en las células transformadas en el momento de inyección en ratones inmumodeprimidos ni en los tumores resultantes. Cabe destacar que ni las células transformadas ni los tumores resultantes son inmortales y, tras acumular unas cuantas divisiones en cultivo, entran en una etapa de crisis de la que emergen algunas células que han activado telomerasa. Estos datos indican que la activación de un mecanismo de mantenimiento telomérico no es un requisito necesario para las etapas iniciales de formación de un tumor pero sí para un mantenimiento posterior. En etapas iniciales, la inestabilidad genómica generada por acortamiento telomérico crítico podía facilitar la progresión tumoral al favorecer el cúmulo de mutaciones. En etapas posteriores, la reactivación de telomersa permitría la estabilización de la longitud y del genoma a unos niveles tolelables para la viabilidad celular. -Regulación epigenética de la longitud telomérica en células de mamífero. La cromatina telomérica de moscas y levaduras adopta una estructura característica de heterocromatina. Defectos en actividades que modifican el estado de la cromatina conducen a la disfuncionalidad telomérica en estos organismos. En nuestro trabajo hemos caracterizado la cromatina telomérica de mamíferos y hemos encontrado que los telómeros de mamíferos presentan modificaciones caraterísticas de heterocromatina como trimetilación de H4K9 y unión de HP1. La eliminación de las histona metiltransferasas Suv39h1 y Suv39h2, que medían la metilación de H3k9 en heterocromatina pericéntrica, conduce a una reducción de los niveles de di- y trimetilación de H3K9 y en la unión de HP1 a los telómeros, lo que otorga a estas histona metiltransferasas un papel en el ensamblaje de la heterocromatina telomérica. También hemos identificado nuevos reguladores de la formación de heterocromatina, como las proteínas de la familia pRb, que modulan la actividad histona metiltransferasa de Suv4-20h1 y Suv4-20h2, responsables de la trimetilación de H4K20 en centrómeros y telómeros . Modificaciones en proteínas con actividad remodeladora de la cromatina conducen a la desestructuración de la heterocromatina y alargamiento telomérico, lo que demuestra que la longitud de lso telómeros puede ser controlada por factores epigenéticos.

Autor: Ramos Martín María del Carmen.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Facultad de Ciencias.
Centro de realización: Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid.

Resumen: Para investigar el papel de la señalización adrenérgica en la Enfermedad de Alzheimer (EA), generamos una serie de estudios genéticos y funcionales de los genes iniciadores de la cascada adrenérgica. Seleccionamos dos polimorfismos de cambio de una sola base (SNPs): en el gen del receptor beta1-adrenérgico (ADRB1) y en el de la subunidad beta3 de las proteínas G heterotriméricas (GNB3) y analizamos sus frecuencias alélicas en un estudio caso-control para la EA. Encontramos que el alelo GNB3 T produce un aumento significativo del riesgo para la EA en los individuos homocigotos para el alelo ADRB1 C, sugiriendo que el efecto combinado de ambos influye sobre la susceptibilidad a la EA. Resultó interesante encontrar además que la coexpresión de los alelos ADRB1 C y GNB3 T , comparados con los alelos ADRB1 G y GNB3 C, producían un aumento de la cantidad de cAMP, de la activación de MAPK-ERK1/2 y del factor de transcripción CREB tras estimulación adrenérgica en líneas celulares humanas transfectadas. Además, la coexpresión de los alelos de riesgo también aumentó la expresión de la proteína precursora del péptido beta-amiloide (APP). Usamos también experimentos de unión de radioligandos para descartar que existieran diferencias en la afinidad por el agonista adrenérgico isoproterenol entre las dos variantes del receptor. En segundo lugar encontramos que la isoforma 389Arg del receptor, codificada por el alelo ADRB1 C, posee una mayor afinidad por el agonista inverso betaxolol y que las células de neuroblastoma transfectadas establemente con la combinación de los alelos de riesgo alcanzan un mayor grado de desensibilización respecto a las células transfectadas con las respectivas paréjas alélicas. Realizamos además, un análisis de la expresión génica de la línea de neuroblastoma tras estimulación adrenérgica que mostró cambios en numerosos genes implicados en la señalización, la oncogénesis y el control del ciclo celular; estos resultados nos indujeron a analizar la progresión del ciclo celular del neuroblastoma tras estimulación. Encontramos que la coexpresión de los alelos de riesgo provocaba una disminución de la proliferación, una parada del ciclo celular en la fase G2/M y un aumento de la muerte celular tras estimulación adrenérgica. Los resultados encontrados indicaban que la variabilidad genética en los genes del sistema adrenérgico, ADRB1 y GNB3, daba lugar a una variabilidad en la producción de cAMP y esta originaba variaciones en la transducción de señales al interior de la célula. Puesto que esta variabilidad se asocia con la susceptibilidad a la EA, concluimos también, que la activación adrenérgica participa en la patogénesis de la enfermedad.

Autor: Qiu Deyi.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa.
Centro de realización: Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa.

Resumen: RESUMEN DE LA TESIS El llamado tallo ribosómico es una estructura muy conservada del la subunidad mayor del ribosoma que esta directamente implicada en el funcionamiento de los factores solubles de la traducción. El tallo ribosómico es mas complejo que el procariótico y además parece que participa en actividades reguladoras de la traducción que no se han encontrado en sistemas mas primitivos. Debido a su gran flexibilidad el tallo ribosómico es muy móvil lo que ha impedido la resolución de su estructura en los modelos del ribosomas derivados de difracción de rayos X. Debido a esta circunstancia se han de utilizar técnicas alternativas que proporcionen información sobre su estructura y función a nivel molecular. Una información relevante en este sentido es determinar que otros componentes del ribosoma o de la maquinaria de traducción están próximos a cada uno de los componentes del tallo. En esta tesis se ha llevado un estudio mediante reactivos que forman puentes covalentes entre proteínas, "cross-linkers", para estudiar el entorno estructural de cada un de los componentes del tallo en el ribosoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae. El tallo ribosómico de esta levadura esta formado por cuatro proteínas ácidas (pIs entre 3,0 y 4,0) de 12 kDa y de una proteína de mayor tamaño y pI mas alto (aprox. 5,0) que forman un pentámero el cual se une al resto del ribosomas a través del dominio amino terminal de la proteína P0. Las proteínas ácidas forman dos familias diferentes con dos miembros cada una de ellas, P1a/P1b y P2a/P2b. De esta forma en el tallo en esta especie esta formado por cuatro proteínas ácidas diferentes, aunque aquellas que son del mismo grupo parecen tener una función muy similar. Todas las proteínas, incluidas la proteína P0 tienen el mismo péptido terminal, EESDDDMGFGLFD. Dado que ninguna de las proteínas tiene en su secuencia residuos de cisteína, se opto por preparar mutantes de cada una de ellas en los que se introdujo una cisteína en la posición de la serina presente en el péptido anteriormente descrito y de esta forma poder utilizar reactivos específicos de grupos SH. Esta proteínas mutadas se introdujeron en cepas de levadura deficientes en esa misma proteína, de forma que el tallo ribosómica en esas células tenia todos sus componentes y uno solo de ellos conteniendo un residuo de cisteína. Los ribosomas de estas cepas fueron tratados con diferentes reactivos mono (o-phenantrolina/Cu2+) y bifuncionales (DPDPB, SPDP, y DSP) y posteriormente sus proteínas fueron separadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Las proteínas fueron identificadas utilizando anticuerpos monoclonales específicos. Los resultados han mostrado que las proteínas de tipo P2 presentan una mucha mayor capacidad de formar enlaces covalentes con otras proteínas que las de tipo P1, lo que indica una mayor movilidad del extremo Carboxilo en las primeras. Por otra parte aunque presentan cierta similitud los mapas de complejos covalentes con otras proteínas formados por las dos proteínas de tipo P2 no son idénticas indicando que sus respectivos entornos estructurales no son idénticos aunque sean posiblemente solapantes. El carboxilo terminal de la proteína P0 en presencia de las proteínas ácidas, parece tener también poca capacidad de formar complejos, indicando igualmente que tiene cierta restricción en su movilidad. Sin embargo, cuando alguna de las proteínas ácidas falta del tallo ribosómico, el péptido terminal de la proteína mutada es eliminado de la proteína, posiblemente por la acción de una proteasa especifica de cisteínas, quedando le proteína inactiva. El truncamiento de la proteínas P0 mutada es protegido por la presencia de las proteínas ácidas que parecen impedir el acceso de la proteasa, y esa acción protectora es más eficaz en el caso de las proteínas P2. Es interesante que la acción protectora que ejercen las proteínas ácidas sobre el extremo de P0 no se lleva a cabo cuando estas proteínas a su vez están mutadas y llevan también una cisteína en el carboxilo. Posiblemente en este caso la mutación causa un cambio en la conformación de la proteina que permite la acción del enzima degradador. Los datos parecen apoyar una estructura del tallo ribosómico en el que los extremos Carboxilos de las proteínas P2 están mas cerca que los extremos equivalentes de las proteínas P1, los cuales a su vez tienen una movilidad mas restringida. Se ha llevada a cabo la identificación de las proteínas a las que se unen covalentemente las proteínas ácidas. Se ha comprobado la unión de las proteínas P2 a RpL3, RpL15 y RpS18. Por otra parte las proteínas de tipo P1 se unen solamente a Asc1p. Aunque esta caracterización no es exhaustiva y posiblemente todas las proteínas ácidas puedan interaccionar con otras proteínas que este estudio no ha identificado, los resultados confirman la mayor movilidad de las proteínas P2. Es interesante que la proteínas RpL3 esta relativamente lejana del extremo del tallo ribosómico y se ha sugerido que puede formar parte del entorno del centro peptidil transferasa del ribosoma. Y tanto la proteína RpS18 y Asc1p son proteinas de la subunidad ribosómica menor. Estos datos indican que el tallo ribosómico puede alcanzar posiciones dentro del ribosoma inesperadamente lejanas de su punto de unión al ribosoma como se resume en el modelo que se incluye, lo que le permite actuar y posiblemente regular algunas a actividades de la partícula que hasta este momento se consideraban fuera de su alcance.

Autor: Pastor Pareja José Carlos.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Universidad Autónoma de Madrid.
Centro de realización: Centro de Biología Molecular (CSIC-UAM).

Resumen: Durante las primeras horas de la metamorfosis de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster los discos imaginales, que son los primordios de la epidermis adulta, evierten y se fusionan entre sí . En esta tesis se ha investigado el mecanismo celular que posibilita la externalización de los discos y su fusión, encontrándose que unas células, las del tallo y la membrana peripodial, están especializadas en ello. En estas células es activa la vía de transducción de señales de JNK. Por análisis genético, se concluyó que la señalización por esta vía produce en estas células una transición epitelio-mesénquima.

Autor: Villa Cuesta Mª Eugenia.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Universidad Autónoma de Madrid.
Centro de realización: C.B.M. Severo Ochoa.

Resumen: Los bordes morfogenéticos permiten que las células de una misma población celular se separen en distintos territorios. En el disco de ala de Drosophila melanogaster existe un borde que separa el primordio de notum del de axila dorsal. La especificación de este borde se desconoce, así los objetivos de esta tesis han sido ayudar a entender como se establece esta subdivisión, y para ello, analizamos la función de los genes muscle segment homeobox (msh) e iroquois. El gen msh codifica para un factor de transcripción tipo homeoproteína cuyo patrón de expresión está limitado desde temprano en el desarrollo al primordio de axila dorsal, este patrón es adyacente pero no solapante al patrón de expresión de los genes iroquios( que codifican también para factores de transcripción tipo homeoproteínas) en el primordio de notum. Nuestros estudios muestran que el mantenimiento de la frontera entre ambos dominios de expresión se produce por una represión mutua de ambas homeoproteínas. Mediante experimentos de sobreexpresión y falta de función del gen msh en la tesis se muestra que msh es además imprescindible para el correcto desarrollo de la axila alar, del notum y del patrón de órganos sensoriales del notum. Todos estos resultados permiten concluir que el borde notum-axila dorsal se establece y/o mantiene por represión mutua entre Msh e Iroquois. Esta represión parece ser directa al mentos para Iroquois puesto que análisis in vitro e in vivo muestran que las proteínas Iroquois se unen al ADN de msh. La represión mutua entre proteínas con homeodominio es un mecanismo frecuente en la subdivisión del cerebro de vertebrados, además, homólogos a iroquois en vertebrados intervienen en la formación de bordes morfogenéticos. Se enfatiza pues en la tesis, que el mecanismo mediante el cual se mantiene la separación entre el notum y la axila dorsal en el disco de ala de Drosophila melanogaster es un mecanismo conservado evolutivamente.

Autor: Serrano de las Heras Gemma.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Instituto Bilogía Molecular.
Centro de realización: Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM).

Resumen: En eucaritos, el uso de estructuras grandes que agrupan factores de replicación parece ser un mecanismo general para aumentar la eficiencia del proceso de replicación. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la sabe molecular que determina la compartimentalización del DNA procariótico. La proteína p1 aumenta la eficiencia de la replicación del DNA viral. Estudios previos indicaron que la prteína p1 está asociada a la membrana bacteriana tanto durante la replicación del DNA viral como en ausencia de componentes virales. Madiante el uso del detergente Tritón X-114 se ha estudiado la naturales de dicha asociación. Este analisis bioquímico ha revelado que la proteína p1, al igual que la proteínas integrales de membrana, tiene una naturaleza anfifílica. Además los estudioa de inmunomicroscopía elelctrónica han mostrado que la proteína p1 tiene una localización periferica, tanto durante la replicación del DNA como en ausencia de componentes virales. Por otro lado, mediante la combinación de técnicas de entrecruzamiento químico y fraccionamiento celular se ha demostrado que la proteína p1 forma estructuras multiméricas y que dichas estructuras estan asociadas a la membrana bacteriana. Estos resultados apoyan un modelo para la función de la protéína p1 en la replicación del DNA, según el cual una estructura multimérica de p1 proporciona un sitio espesífico para el anclaje de la maquinaria de replicación viral.

Autor: Martín Belinchón Mónica.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Instituto de Investigaciones Biomédicas.
Centro de realización: Instituto de Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols". CSIC-UAM.

Resumen: La presencia de glucosa en el medio provoca múltiples cambios en el metabolismo de la levadura y esto plantea la pregunta de si estas modificaciones responden a una señal única o si se deben a señales alternativas. Para abordar esta cuestión se ha estudiado cómo afecta a diferentes procesos desencadenados por la glucosa la ausencia de dos posibles elementos iniciales en la vía de señalización: los sensores de glucosa de la membrana plasmática (Snf3, Rgt2 y Gpr1) y las enzimas capaces de fosforilar la glucosa e iniciar su metabolismo (Hxk1, Hxk2 y Glk1). Nuestros resultados indican que Snf3/Rgt2 y Gpr1 tienen un efecto moderado y aditivo sobre la inducción de SUC2 por baja glucosa y sobre la inactivación irreversible de la FbPasa. Por el contrario siempre que la levadura transporte bien la glucosa, los sensores no se requieren para la represión catabólica ni para la activación de la H+-ATPasa de membrana plasmática. Mientras que Snf3/Rgt2 se requiere para la inducción del gen HXT1 por glucosa alta, la ausencia de Gpr1 no afecta al proceso. Por otro lado hemos comprobado que la fosforilación de la glucosa es absolutamente necesaria para que se produzca represión catabólica. En el caso de enzimas gluconeogénicas cualquiera de las quinasas capaces de fosforilar glucosa permite total represión, en otros casos la represión es total con Hxk2 pero sólo parcial o nula con Hxk1 o Glk1. En ausencia de enzimas que fosforilan la glucosa no se induce la piruvato descarboxilasa, pero hay cierto grado de inducción de HXT1-lacZ y una fuerte inducción de SUC2 que requiere una elevada concentración de glucosa. Por último cualquier enzima que fosforile la glucosa permite la inactivación de la FbPasa. También se ha analizado la capacidad de diferentes fuentes de carbono no fermentables para producir represión catabólica en S. cerevisiae. A corto plazo la xilosa bloquea totalmente la desrepresión de genes que codifican enzimas gluconeogénicas y disminuye la expresión de otras enzimas investigadas. La glicerina y la dihidroxiacetona tienen unos efectos menos marcados. En experimentos a largo plazo el efecto represor de la xilosa es menor. No se ha encontrado una correlación entre el grado de represión de la FbPasa y los niveles intracelulares de algunos intermediarios glicolíticos como la glucosa-6-P y la fructosa-1,6-bisfosfato.

Autor: Clemente Cervera Roberto.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Centro Nacional de Biotecnología (C.N.B.-C.S.I.S..
Centro de realización: Centro Nacional de Biotecnología (C.N.B.-C.S.I.C.).

Resumen: Se ha determinado mediante la utilización de vectores virales el papel fundamental de la proteína VP3 de IBDV dentro del proceso morfogenético del virus. Para ello se ha caracterizado bioquimicamente el dominio de ioligomerización y se ha descrito la cápsida del virus está formada, exclusivamente, por la proteína VP2.

Autor: JURADO PÉREZ PAOLA.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA .
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: El objetivo de este trabajo es generar un sistmma, en bacterias gram negativas, capaz de producir anticuerpos intracelulares funcionales (intracuerpos). Pretendemos además, dirigiendo la unión de algunos de estos anticuerpos hacia proteínas concretas, ser capaces de modular un mecanismo fisiológico dentro de la célula. La producción de anticuerpos intracelulares en cepas de E. coli silvestres da lugar a anticuerpos no funcionales. Esto se debe a la imposibilidad de que se formen, en el ambiente reductor del citoplasma, los enlaces disulfuro que contienen los anticuerpos. La formación de estos enlaces es necesaria para el plegamiento y la actividad de la mayoría de los dominios inmunoglobulina (Ig). En este trabajo se investiga la formación de puentes disulfuro y la funcionalidad de los anticuerpos monocadena (scFv), en el citoplasma de estirpes de E. coli con mutaciones en genes que forman parte los dos principales sistemas intracelulares de reducción de enlaces disulfuro (la ruta de las tiorredoxinas, y la de las glutarredoxinas). Se ha examinado asimismo el efecto de la coexpresión de diferentes chaperonas de puentes disulfuro, en trans o fusionadas al scFv. Los resultados de esta tesis demuestran que la forma más eficiente de producir intracuerpos funcionales, con puentes disulfuro en sus dominios Ig, tiene lugar en cepas mutantes en los genes que codifican a la tiorredoxina reductasa (trxB) y la glutation oxidorreductasa (gor) en las cuales el scFv se produce fusionado al extremo C-terminal de la tiorredoxina 1 (Trx1). Hemos transformado una cepa trxB gor con genotecas de fragmentos de DNA, que codificin a diferentes colecciones de scFvs, con la intención de buscar anticuerpos capaces de inhibir o activar un proceso de transcripción desde un promotor concreto. En estas búsquedas hemos encontrado varios anticuerpos capaces de activar o de inhibir el mecanismo de transcripción desde un promotor dependiente del factor de transcripción alternativo sigma 54.

Autor: FERNÁNDEZ SORIANO SILVIA .
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UAM).

Resumen: En este trabajo, hemos estudiado los mecanismos implicados en la señalización de quimioquinas, demostrando que los receptores de quimioquinas existen en múltiples conformaciones que resultan estabilizadas por la disponibilidad del ligando. Este hecho condiciona la respuesta celular observada. Es posible relacionar la conformación heterodimérica con el incremento de la adhesión celular que puede producirse en condiciones limitantes de ligando como puede ocurrir por ejemplo durante los primeros estadíos de la extravasación. En esas condiciones la no internalización de los receptores asegura que la célula pueda rápidamente detectar por donde llega un gradiente quimiotáctico. La estabilización de los homodímeros, aseguraría entonces el movimiento celular completo. Sin embargo, la célula se encuentra en un microambiente complejo y allí su capacidad de respuesta puede verse modulada por la presencia de otras moléculas como citoquinas o factores de crecimiento con las que comparten algunas vías de señalización. En cualquier caso, estas evidencias hacen pensar que los fenómenos celulares no ocurren de forma aislada y que para definir y entender la respuesta inmune cada hecho debe analizarse en el contexto de todos los demás. Estas consideraciones sustentan además la inclusión de la dimerización de los receptores y la activación de JAK por quimioquinas, como puntos susceptibles de intervención si quiere modificar la función de este grupo de proteínas. Dado por otro lado la participación de estas moléculas y sus receptores en múltiples patologías relacionadas con procesos inflamatorios, autoinmunes, rechazo a transplantes e incluso metástasis tumorales, estos pasos en la cascada señalizadora se convierten en puntos a considerar en el diseño de potenciales drogas con interés terapéutico.

Autor: LÓPEZ FRANCO ÓSCAR.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA. UAM.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La contribución de los inmunocomplejos (IC) en la patogenia de diversas enfermedades inmunes, como la glomerulonefritis, se conoce desde hace tiempo, pero el papel de los receptores Fc de inmunoglobulinas (FcR) en estos procesos está menos estudiado. En la última década estudios experimentales, particularmente con animales "knock out", han puesto de manifiesto que los FcR constituyen un nexo muy importante entre los diferentes ligandos y las células efectoras de la cascada inflamatoria mediada por IC. Por otra parte, se ha visto que los factores de transcripción juegan un papel clave en el desarrollo del daño en los tejidos. Entre ellos destaca el factor nuclear- B (NF- B), capaz de controlar la activación y expresión de diversos genes, cuyos productos (citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y enzimas) están implicados en las respuestas inflamatorias. Otra ruta de señalización del proceso inflamatorio es la vía JAK/STAT. Aunque se sabe que las tirosinas fosfatasas juegan un papel crítico, la regulación negativa de esta cascada no esta bien caracterizada. Recientemente se ha identificado la familia de proteínas SOCS (supresores de la señal de citoquinas) que inhibe las señales de diversas citoquinas, aunque se ha visto que pueden regular también las señales de otros receptores. En esta tesis, en primer lugar, intentamos demostrar que los FcR son moléculas esenciales en la fase aguda del daño por IC, con un papel importante en el reclutamiento de neutrófilos. También estudiamos la implicación de los FcR de las células residentes e infiltrantes en las fases más avanzadas de daño renal, centrándonos en dos moléculas: a) el óxido nítrico, generado por iNOS, cuyo gen está regulado por NF- B y b) las proteínas SOCS, reguladas por el factor STAT. En segundo lugar, analizamos el papel del NF- B y los genes que regula (MCP-1 e iNOS) en las enfermedades renales inmunes. Usamos dos nuevos compuestos naturales (gliotoxina y partenolide) con posibles propiedades antiinflamatorias, tanto en células en cultivo como en modelos experimentales de glomerulonefritis. Por último, extendemos estos estudios a otras enfermedades en las que se ha visto la importancia del proceso inflamatorio, como la aterosclerosis. Estos resultados amplían el conocimiento de las bases moleculares de los FcR y las nefritis inmunes. Además, apoyan la idea de que nuevos agentes moduladores del NF- B podrían representar un novedoso abordaje terapéutico en las enfermedades renales y cardiovasculares.

Autor: Temes Zafrilla Elisa.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: Hospital Universitario de la Princesa..

Resumen: Los factores de transcripción HIF (Hypoxia inducible factors) dirigen la expresión de genes críticos para la adaptación celular a la disminución en la tensión parcial de oxígeno o hipoxia. En condiciones de normoxia, estos factores de transcripción son muy inestables debido a su hidroxilación por una familia de proteínas de reciente descripción, las prolina hidroxilasas (PHDs). Tras su hidroxilación son reconocidos por la ubiquitín ligasa VHL que las dirige a su degradación por el proteosoma. Además de la regulación de la estabilización del factor, su activación transcripcional se regula en un segundo momento por su hidroxilación en asparagina por la enzima asparaginil hidroxilasa FIH. En nuestro grupo hemos descrito previamente que los niveles intracelulares de ácido fosfatídico aumentan en condiciones de hipoxia a través de una actividad diacilglicerol quinasa y que este aumento parece regular la estabilización y la actividad del HIF. En este trabajo de tesis caracterizamos, a través del uso de inhibidores específicos de esta actividad enzimática los mecanismos moleculares a través de los cuáles el ácido fosfatídico regula HIF. Analizamos el efecto de estos inhibidores sobre los distintos elementos de la ruta canónica de la regulación en hipoxia de HIF y encontramos que el tratamiento con estos agentes farmacológicos activa la actividad prolina hidroxilasa y por tanto la unión del factor a VHL. Encontramos también una activación de la asparaginil hidroxilasa FIH por estos agentes. Dado el papel crucial de HIF en fenómenos patológicos como el desarrollo tumoral, proponemos el uso de estos inhibidores como posibles agentes terapéuticos.

Autor: Salama Cohén Patricia.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Departamento de Biología Molecular.
Centro de realización: Instituto Cajal, CSIC.

Resumen: En este trabajo mostramos que los niveles de expresión de los genes Hes1 y Hes5 están elevados en los cultivos de neuronas de hipocampo de alta densidad y tras la adición de un ligando Delta insoluble, pero también cuando se tratan los cultivos con NGF, BDNF, NT-3 o NT-4/5. Además, en el caso del NGF, el aumento que provoca en la expresión de Hes1 y Hes5 desaparece si se bloquea su unión al receptor p75NTR, y requiere la entrada del NF-kappaB en el núcleo. Las condiciones de cultivo con baja expresión de Hes1 y Hes5, como son la baja densidad, cultivos tratados con el ligando soluble Delta-Fc o transfectados con Hes6, presentan una morfología que se caracteriza por árboles dendríticos más complejos, con un mayor número de dendritas primarias y de puntos de ramificación. Al contrario, las células que expresan altos niveles de Hes1 y Hes5 presentan un menor número de dendritas primarias y de ramificaciones, como es el caso de los cultivos de alta densidad, o de las neuronas transfectadas con Hes1 y Hes5. La adición de NGF a los cultivos de densidad media sólo afecta a la elongación dendrítica, aumentándola, mientras que en los cultivos de baja densidad afecta al número de dendritas primarias, reduciéndolo. El efecto sobre la elongación dendrítica que se observa tras la adición de NGF y en los cultivos de alta densidad parece mediado por algo más que por p75NTR, probablemente TrkA. Además, ligandos no neurotróficos de p75NTR, como son el beta amiloide y la MAG, que impiden el incremento en la expresión de los genes Hes inducido por el NGF alteran la morfología de las neuronas aumentando el número de dendritas primarias y de ramificaciones. Mostramos también que la Neurogenina3 y Mash1 están regulados negativamente por la vía de Notch en los cultivos de neuronas de hipocampo, ya que su expresión es siempre inversa a la de los genes Hes1 y Hes5. Estos dos genes proneurales controlan el número de dendritas primarias y lo incrementan cuando son transfectados en las neuronas en cultivo.

Autor: Cortes Canteli Marta.
Año: 2004.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Facultad de Medicina.
Centro de realización: Biomédicas.

Resumen: C/EBPbeta es una proteína que pertenece a la familia de factores de transcripción bZIP. Se expresa en multitud de tejidos y desempeña una importante función en muchos procesos celulares, ya que regula la transcripción de numerosos genes implicados en la diferenciación de adipocitos y macrófagos, en distintos procesos metabólicos, en la regeneración hepática y en la respuesta a fase aguda, inflamatoria e inmune, entre otros procesos. Sin embargo, tanto la expresión como la función que esta proteína desempeña en el cerebro no han sido estudiados en profundidad. En los últimos años, sin embargo, se está implicando a este factor de transcripción en diversos procesos que tienen lugar en el sistema nervioso, como es en la consolidación de la memoria a largo plazo, la señalización por neurotrofinas y muy recientemente se han detectado cambios de expresión de esta proteína en distintas enfermedades neurodegenerativas. En este trabajo demostramos que C/EBPbeta se expresa ampliamente en distintas zonas del cerebro y que está implicada en la diferenciación y apoptosis neuronales, así como en procesos de inflamación y de daño cerebral. Hemos establecido que C/EBPbeta está implicada en la diferenciación neuronal ya que promueve la extensión de neuritas y la expresión de marcadores neuronales cuando se sobreexpresa en la línea de neuroblastoma N2A, diferenciación neuronal que parece depender de la ruta de la fosfatidilinositol-3-quinasa. Asimismo, hemos puesto de manifiesto que, como ocurre en la diferenciación de adipocitos, C/EBPbeta induce la expresión de C/EBPalpha y que la propia C/EBPalpha es capaz de inducir ella sola la diferenciación neuronal. También hemos mostrado que C/EBPbeta promueve la apoptosis en estas células, la cual podría estar mediada por las proteínas p53 y p21. Por otro lado, utilizando microarrays de ADN, hemos identificado 48 genes inducidos por C/EBPbeta en una línea celular de neuroblastoma, entre los que había varios genes implicados en procesos de inflamación y daño cerebral. Confirmamos que C/EBPbeta inducía la expresión de ornitina descarboxilasa, 24p3/LCN2, GRO1/KC, espermidina/espermina N1-acetiltransferasa, xantina deshidrogenasa, histidina descarboxilasa, decorina y TM4SF1/Antígeno L6, regulando además el promotor de dos de ellos, ornitina descarboxilasa y 24p3. Por último, utilizando modelos tanto in vitro como in vivo, hemos demostrado que los niveles de proteína C/EBPbeta aumentan de manera significativa después de un daño neural. Como modelos in vitro hemos utilizado un modelo de herida en placa, y hemos tratado cultivos primarios de astrocitos, microglía y neuronas con lipopolisacárido y estaurosporina, estímulos que provocan una respuesta inflamatoria y apoptótica, respectivamente. En todos los casos hemos detectado un aumento en los niveles de proteína C/EBPbeta, acompañado de un incremento en los niveles de la enzima inflamatoria ciclooxigenasa-2 y/o de un aumento en la liberación de óxido nítrico. Asimismo, hemos confirmado este aumento en C/EBPbeta utilizando dos modelos in vivo de daño cerebral, un modelo de daño mecánico y otro de respuesta inflamatoria, por inyección estereotáxica de suero salino y lipopolisacárido, respectivamente. Todos estos datos sugieren que C/EBPbeta puede jugar un papel muy importante en el sistema nervioso central tanto en situaciones fisiológicas normales como es el desarrollo y diferenciación así como en procesos patológicos como daño cerebral o enfermedades crónicas neurodegenerativas, donde el proceso inflamatorio desempeña un importante papel.

Autor: SÁENZ DOMÍNGUEZ YOLANDA.
Año: 2004.
Universidad: LA RIOJA.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE LA RIOJA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LA RIOJA.

Resumen: Se han analizado las tasas y los mecanismos de resistencia a antibióticos en 474 cepas de Escherichia coli aisladas de alimentos y muestras fecales de animales y humanos sanos. Asimismo se han caracterizado los mecanismos de resistencia a quinolonas en las 89 cepas resistentes a ácido nalidíxico y se ha analizado la presencia y la organización de genes cassettes incluidos en integrones en las cepas del estudio que presentan un fenotipo de multirresistencia. Destacan los altos porcentajes de resistencia a diferentes antibióticos detectados en las cepas de E. coli de los distintos orígenes, principalmente en las cepas aisladas de muestras fecales de pollos y alimentos de origen animal. El análisis de PFGE refleja una alta diversidad clonal entre las 89 cepas de E. coli resistentes a ácido nalidíxico de origen intestinal y alimentario. En estas cepas existe una asociación entre los niveles de resistencia a ciprofloxacina y el número y tipo de sustituciones en GyrA y ParC. Se detecta una gran diversidad de genes de resistencia en las cepas multirresistentes, en muchas ocasiones estos genes se incluyen como genes cassettes en integrones. La asociación de varios genes de resistencia en un mismo elemento genético móvil en muchas de estas cepas, facilita la posibilidad de co-selección por el uso de antibióticos diferentes. Se demuestra en esta tesis que la especie E. coli, como representante de la microflora intestinal de animales y de humanos, constituye un importante reservorio de genes de resistencia a antibióticos, pudiendo dichos genes de resistencia ser transferidos a otros microorganismos de la microflora intestinal y a microorganismos patógenos. El seguimiento de los niveles de resistencia a antibióticos y de los mecanismos de resistencia en bacterias tanto patógenas como no patógenas de diferentes ecosistemas debería ser considerado como una prioridad por las autoridades sanitarias para poder dirigir adecuadamente las políticas de uso de antibióticos tanto en medicina humana como en veterinaria.

Autor: PARK SANG-KYU.
Año: 2004.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: E.T.S DE INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA.

Resumen: Pleurotus ostreatus es una importante seta comestible, conocida como seta ostra, ésta es una de las setas comestibles más extensamente cultivadas. Esta seta es producida industrialmente como alimento humano, también tiene otras aplicaciones industriales como en el blanqueamiento de la pulpa del papel, cosméticos y la industria farmacéutica. El Grupos de Investigación de Genética y Microbiología de la Universidad Pública de Navarra ha construido un mapa de ligamiento genético basado en marcadores RAPD (random amplification of polymorphic DNA) y RFLP (restriction fragment length polymorphism), caracteres fenotípicos y genes clonados. El mapa contiene 11 grupos de ligamiento que se corresponden con los 11 cromosomas de P. ostreatus, el mapa tiene una longitud aproximada de 1000 centimorgans (cM) con un promedio de 35.1 kbp/cM. La segregación de los genes marcadores se estudió en un grupo de 80 monocariontes derivados la cepa dicariótica N001 de P. ostreatus. Para realiazar una posterior saturación del mapa de ligamiento, se construyó una genoteca de DNA complementario (cDNA) derivada de las laminillas del basidiomicete comestible P. ostreatus y se aislaron y estudiaron varios clones de cDNA que fueron usados como secuencias de expresión (EST), para el estudio de su expresión y para el mapeo de ligamiento. Las sondas de EST mapearon en todos los grupos de ligamiento. Los análisis de Northern blot usando estos clones de cDNA como sondas mostraron tres modelos de expresión diferentes: genes con expresión general, específicos de cuerpo fructífero, y específicos de laminillas. El análisis de la expresión analiza, sin embargo, hace pensar en la presencia de una red de la regulación compleja para estos genes. El mapa de ligamiento y nivel de la expresión de los genes estudiados representan nueva información que produce datos sobre el desarrollo de las laminillas, promotores específicos de tejido y la organización del genoma en P. ostreatus

Autor: EIZMENDI GOIKOETXEA MARÍA ARANTZAZU.
Año: 2004.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: E.T.S DE INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA.

Resumen: La celulosa es el polímero biológico más abundante en la Tierra. Su composición química consiste en unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces B-1,4-glicosídicos formando largas cadenas poliméricas. Estas cadenas se unen entre sí a lo largo de toda su longitud por enlaces de hidrógeno y fuerzas de van der Waals, se orientan paralelamente y poseen un extremo reductor y otro no reductor. La estructura de la celulosa no es uniforme de manera que posee regiones altamente cristalinas y otras amorfas o menos ordenadas. La degradación de la celulosa por los organismos vivos tiene lugar mediante la acción de tres tipos de enzimas: endoglucanasas (E.C.3.2.1.4), celobiohidrolasas (E.C.3.2.1.91) y B-glucosidasas (E.C.3.2.1.21). Todas ellas hidrolizan enlaces B-1,4-glicosídicos; pero varían en la especificidad de sustrato. Las endoglucanasas atacan los enlaces B-1,4-glicosídicos dentro de la molécula de celulosa, las celobiohidrolasas actúan liberando unidades de celobiosa a partir de los extremos de las cadenas de celulosa y las B-glucosidasas hidrolizan las moléculas de celobiosa dando glucosa como producto final. Dentro de las celobiohidrolasas, se distinguen dos tipos: celobiohidrolasas de tipo I (CBH I) y celobiohidrolasas de tipo II (CBH II), que se diferencian en su especificidad por el extremo de la molécula de celulosa que atacan. Mientras las CBH I actúan sobre los extremos reductores, las CBH II liberan unidades de celobiosa a partir de los extremos no reductores. Mediante la búsqueda en una genoteca genómica del basidiomiceto Pleurotus ostreatus var. florida, se han podido aislar cinco genes cbhI, que se han denominado cbhI1, cbhI2, cbhI3, cbhI4, cbhI5, cuya expresión daría lugar a diferentes celobiohidrolasas I, lo que demuestra la existencia de una familia multigénica responsable de dicha actividad enzimática. Por otro lado, utilizando dichas secuencias genómicas como sonda, se ha podido detectar cuáles son las condiciones en las cuales se produce la expresión de cada uno de dichos genes. Esto ha permitido sintetizar el cDNA de cada gen y, mediante comparación con la secuencia genómica correspondiente, caracterizar la estructura de los mismos. Asímismo, mediante la técnica de RFLP y utilizando una población de 80 monocariontes descendientes del dicarionte N001 (P. ostreatus var. florida) se han mapeado los cinco genes comprobando que cbhI1 se localiza en el cromosoma IV y el resto en el cromosoma VI.

Autor: GONZÁLEZ GUZMÁN MIGUEL.
Año: 2004.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Universidad Politécnica de Valencia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 ("salt resistant"). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1-2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+. Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que éste es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehido abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre-2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente al mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos caracterísiticos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas.