BIOQUIMICA MOLECULAR, 10

Autor: GARCÍA ÁLVAREZ BEGOÑA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: THE BURNHAM INSTITUTE.

Resumen: La unión de proteínas de citoesqueleto, como la talina, a las regiones citoplasmáticas de los principales receptores de adhesión a la matrizextracelular, las integrinas, media las trasducción bidireccional de la señal en la membrana. En esta tesis se presenta las estructuras a resolución atómica obtenidas por cristalografía de rayos X de un fragmento de la cabeza de talina, sola y fusionada con varios fragmentos de la cola citoplásmatica de la integrina beta 3. La estructura resuelta de talina es homóloga alos subdominios F2 y F3 de los dominios FERM. Se demuestra que este fragmento de talina une y activa integrinas a través de una variante nueva de la interacción observada entre los dominios PTB (Dominios de unión a fosfotiroainas) y los ligandos que contienen motivos NPxY. Estudios de RMN y mutagénesis confirman los elementos críticos de la interacción entre la talina y la cola citoplasmática de beta 3, proporcionando los paradigmas estructurales en la unión de integrinas al interior celular. Esta interacción puede ser el prototipo del reconocimiento de los dominios FERM por los receptores transmembrenales. Además se demuestra la exitencia de un sitio de unión con la F-actina en el subdominio F2 de la cabeza de talina. Esta unión sugiere un modo de conexión de integrinas a F-actina independiente del sitio de unión a actima en el C-terminal de talina.

Autor: DELGADO CHAVERO CARMEN LUZ.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FAC. QUÍMICA.

Resumen: Los dominios preS aislados del virus de la hepatitis B son capaces de interaccionar con vesículas de fosfolípidos ácidos, teniendo lugar un cambio conformacional en la proteína como consecuencia de dichas interacción. El objetivo del presente trabajo es determinar la posible implicación de las diferentes zonas del dominio preS1 en las primeras etapas del ciclo infectivo del HBV. Para ello, se han obtenido cinco proteínas mutantes del dominio preS1 del HBV, en las que se han eliminado 40 aminoácidos a lo largo de la secuencia, y se han caracterizado espectroscópicamente mediante fluorescencia y dicroísmo circular, comprobando que en todos los casos mantienen la estructura poco ordenada y con alto porcentaje en estructura beta típica de la proteína completa. Todas estas proteínas son capaces de insertarse en el interior de la matriz lipídica de vesículas de DMPG. Además, se ha estudiado la interacción de las proteínas con vesículas de fosfolípidos ácidos, PG, y se ha visto que producen, en mayor o menor medida, los efectos de agregación y desestabilización de vesículas observadas con el dominio preS1. Además, se ha obtenido el dominio preS del DHBV con una extensión de 6 residuos de histidina en su extremo carboxilo-terminal. El método empleado permite la purificación de 15-20 mg de proteína/L de cultivo con un alto grado de pureza. Se ha caracterizado la proteína mediante técnicas espectroscópicas y se ha estudiado su interacción con vesículas de fosfolípidos, comprobando que tanto su estructura como un comportamiento es similar al descrito para el dominio preS del HBV, a pesar de la escasa homología de secuencia, lo que pone de manifiesto la implicación de esta región en las etapas iniciales del ciclo infectivo de los hepadnavirus. Se ha obtenido el dominio preS del DHBV miristoilado. El método de purificación empleado permite obtener 6 mg de proteína/L de cultivo con un alto grado de pureza, en condiciones desnaturalizantes, miristoilada en un 77-82%. La reconstitución de la proteína acilada se consigue en vesículas de fosfolípidos neutros. Sus propiedades espectroscópicas y de interacción con vesículas de fosfolípidos indican que tanto su estructura como su comportamiento son similares a los descritos para el dominio DpreS sin miristoilar. Por tanto, el rescto acilo no influye en el mantenimiento de la estructura ni en las propiedades desestabilizantes de la proteína. La proteína miristoilada y reconstituida en vesículas de PC penetra en hepatocitos de pato de forma totalmente específica, por lo que el dominio preS contiene todo la información necesaria para interaccionar con el receptor y penetrar en la célula vía endocitosis. La utilización de este sistema modelo puede permitir la elucidación del mecanismo de fusión y liberación del contenido viral en el hepatocito.

Autor: MILLÁN ADÁN CARMELO.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Las sinapsis glutamatérgicas constituyen el sistema de neurotransmisión exictatoria rápida más abundante en el Sistema Nervioso Central de los mamíferos. La complejidad funcional de estas sinapsis se refleja a nivel presináptico en la existencia de múltiples mecanismos de control de la exocitosis, iniciados por la activación de receptores que responden bien al propio glutamato (autorreceptores) o bien a otros neurotransmisores (heterorreceptores), y que potencian o inhiben la liberación del neurotransmisor. En esta Tesis Doctoral hemos empleado una preparación de terminales sinápticos (sinaptosomas) para estudiar algunos aspectos de la modulación de la neurotransmisión glutamatérgica a nivel presináptico, centrándosnos principalmente en el estudio del control de la liberación de glutamato por parte de autorreceptores metabotrópicos. Mediante el empleo de técnicas de fluorimetría continua de glutamato hemos observado como la activación de los receptores metabotrópicos del grupo III produce una inhibición de la liberación de glutamato a través de una reducción en la actividad de los canales de calcio dependientes de voltaje de tipo N, por un mecanismos delimitado de membrana que depende de la activación de proteínas G de tipo Gi/Go. Además, estos receptores reducen los niveles intracelulares de AMPc en aquellas situaciones en las que existe una activación previa de adenilato ciclasa, como ocurre tras la activación de receptores beta-adrenérgicos, y este efecto se traduce en la supresión de la liberación espontánea de glutamato inducida por estos receptores. Mediante el empleo de técnicas de imagen de Ca2+ hemos comprobado que la expresión de los receptores del grupo III se encuentra restringida a una subpoblación de terminales cerebrocorticales, donde inhiben la forma drástica la entrada de calcio en respuesta a un estímulo despolarizante, y hemos identificado inmunocitoquímicamente los subtipos del receptor responsable de esta respuesta, observando un cambio evolutivo en su expresión con el desarrollo. Hemos estudiado asimismo cuales son los subtipos de canales de calcio implicados en la exocitosis de glutamato en corteza cerebral, su grado de coexistencia en un mismo terminal sináptico, su grado de acoplamiento a la liberación de glutamato y la evolución de su expresión con el desarrollo, y hemos descrito una colocalización preferencial de determinados subtipos de canales de calcio con determinados subtipos de autorreceptores glutamatérgico. Por último, hemos caracterizado el efecto de la activación simultánea de proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKC) sobre la liberación de glutamato, observando una potenciación sinergística de la liberación tras la activación de ambas quinasas, lo que sugiere la existencia de una interacción funcional entre ambas vías de transducción de señales a nivel presináptico.

Autor: LÓPEZ GARCÍA M. JOSÉ.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: De la guayaba de origen brasileño como español, se han obtenido cuatro tipos de extractos: hexánico, clorofórmico, metanólico y acuoso. Ninguno de los extractos obtenidos de la guayaba Brasileña presentó efecto alguno sobre la homeostasis de las ratas diabéticas inducidas por la administración de multiples dosis subdiabetogénicas de estreptozotocina; esta actividad demostró ser de mayor potencia y durante un tiempo más prolongado que el de la glibenclamida.

Autor: PUERTA FERNÁNDEZ VÍCTOR.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Durante los últimos años se ha dedicado una gran atención al estudio de los ácidos grasos poliinsaturados como componentes de membranas biológicas, por ser precursores de diversas moléculas que intervienen en procesos de defensa e inflamación y por participar en la regulación de la expresión génica. Estos ácidos grasos juegan papeles importantes en la modulación de diversas enfermedades tan comunes en la sociedad occidental como la enfermedad coronaria, diversos tipos de cáncer, la hipertensión, la diabetes, la artritis reumatoide, desórdenes autoinmunes (lupus o nefropatía) o la enfermedad de Crohn. La *6 y *5 desaturasas son enzimas clave en la regulación de la síntesis de ácidos grasos poilinsaturados de larga cadena y se conoce que se regulan por dos mecanismos distintos, uno a través del SREBP-1c que está asociado a su inducción durante la realimentación tras un período de ayuno, y otro en el que intervienen el PPARalfa asociado al ayuno, esto último se ha puesto de manifiesto en estudios utilizando ratones que carecían de este receptor nuclear. La doble regulación que reciben estas enzimas, por dos factores de transcripción cuyas acciones son opuestas dependiendo del estado nutricional, provocan que los niveles de las enzimas sean siempre similares dependiendo del estado nutricional, provocan que los niveles de las enzimas sean siempre similares independientemente del estado nutricional que se experimente. Por otra parte, la doble regulación de estas desaturasas contribuye a una producción estable de AGPI, que son esenciales para las funciones celulares así como para controlar el estado energético celular, regulando o modificando estos factores de transcripción lipídicos. Los resultados presentados en esta Tesis Doctoral indican que: 1,- La linoleil-CoA desaturasa de rata debe de estar regulada tanto a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional. Además las diferencias observadas en los distintos tejidos en el contenido de RNA mensajero y proteína, indican que la regulación de esta enzima es tejido-dependiente. 2,- Existen al menos tres tránscritos de la linoleil-CoA desaturasa de rata que difieren en su extremo 3' no traducido. Los tránscritos incluyen una única región codificante y dan lugar a una única proteína. 3,- Los extremos 3' no traducidos podrían tener un papel importante en la regulación de la estabilidad del RNA mensajero y en la traducción de la enzima. 4,- Tanto el ayuno como la diabetes producen modificaciones muy similares en la expresión de la linoleil-CoA desaturasa en distintos tejidos. En general se indica como ambas situaciones producen un descenso en la expresión de la enzima en hígado, mientras que la expresión en yeyuno, íleon y colon se vio incrementada. Estas variaciones se producen a nivel transcripcional y probablemente postranscripcional e implicaría una regulación específica del gen en cada tejido. En definitiva el estudio de la expresión de la *6 desaturasa en distintos tejidos, así como su regulación en condiciones basales, es de una gran importancia para poder llegar a conocer su expresión en situaciones fisiológicas o fisiopatológicas y puede ser de un enorme interés. El trabajo presentado en la Memoria de Tesis Doctoral, trata de arrojar un poco de luz sobre la regulación de la *6 desturasa en estas situaciones.

Autor: LACHAUD CHRISTIAN CLAUDE.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El presente estudio realizado en hombres normozoospérmicos o con una espermatogénesis normal, ha demostrado que los espermatozoides eyaculados humanos presentan varias de las características del proceso apoptótico. Sin embargo en el eyaculado la muerte celular predominante no es la apoptosis, sino la necrosis. Los pármaetros espermáticos, como la movilidad y la vitalidad celular indican la integridad del ADN de los espermatozoides eyaculados. El estudio de dos técnicas de selección espermática: la técnica swim-up y la centrifugación en gradiente discontinuo de densidad, demuestra que la técnica swim-up es la técnica más sencilla y efectiva para seleccionar una población espermática de buena calidad tanto a nivel de parámetros espermáticos básicos como a nivel de la integridad del ADN. Cuando se cultivan in vitro los espermatozoides humanos, mueren únicamente por necrosis. La testosterona, el 17beta estradiol y la hormona folículo estimulante no tienen en concentraciones fisiológicas y intrafisiólogicas efecto sobre la muerte celular de los espermatozoides eyaculados cultivados in vitro. Sin embargo, la testosterona y el 17beta estradiol en concentraciones suprafisiológicas tienen efectos tóxicos dosis dependiente sobre los espermatozoides eyaculados cultivados in vitro. El análisis de la integridad del ADN en células germinales inmaduras y células de Sertoli provenientes de biopsias testiculares de hombres con una espermatogénesis normal, demuestra niveles de integridad del ADN muy altos frente a los niveles que se pueden observar en hombres con patologías de la espermatogénesis. Sin embargo, cuando se cultivan in vitro las biopsias testiculares durante 24 y 48 horas, se observa una pérdida progresiva de la integridad del ADN de la células germinales y células de Sertoli. La testosterona en un rango de concentración de 1 micromolar a 100 nanomolar demuestra un potente efecto antiapoptótico en células de Sertoli humanas. El 17beta estradiol en una concentración de 10 nanomolar demuestra un leve efecto antiapoptótico en células de Sertoli humanas. Finalmente, la hormona folículo estimulante no demuestra tener efecto modulador de la apoptosis en células de Sertoli humanas.

Autor: PÉREZ ALEGRE MÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS VCO.

Resumen: Se han identificado en C.reinhardtii mediante mutagénesis insercional tres loci (Nrg1 (N1), Nrg3 (N10), Nrg4 (N24)) implicados en la ruta de señalización negativa que ejerce el amonio, y/o sus derivados, sobre la asimilación de nitrato en este alga. Los mutantes afectados en estos genes Nrg han sido seleccionados por su fenotipo de sensibilidad a clorato en presencia de amonio (CSA), condición bajo la cual la estirpe parental es resistente. El análisis genético de estos mutantes indica que las mutaciones están asociadas a la inserción plasmídica, son epistáticas sobre el alelo mutante nit2, y afectan a genes que no se encuentran ligados entre sí. Las mutaciones Nrg de las estirpes N1, N10 y N24 no afectan a la regulación de los sistemas de alta afinidad, Nrt2;1/Nar2 (Sistema I) y Nrt2;2/Nar2 (Sistema II), de C.reinhardtii. El nitrato clorato, agente inductor y tóxico respectivamente, entra al interior celular en presencia de amonio a través de sistemas de transporte de baja afinidad de nitrato. La causa princial del fenotipo CSA en los mutantes reguladores aislados es la despresión, parcial de la expresión de la nitrato reductasa en condiciones de inducción/represión (nitrato + amonio). Dicha desrepresión es mayor en el mutante N10 que en los dos mutantes N1 y N24. El estudio molecular de los mutantes Nrg se ha abordado mediante rescate plasmídico. En el mutante N24 (Nrg4) se ha aislado un fragmento de 1,4 kb adyacente a la inserción y que presenta cierta homología con factores de transcripción. En el caso del mutante N1 (Nrg1), se ha aislado mediante PCR inversa un fragmento de 2,5 kb usado para el escrutinio de una biblioteca de DNA cromosómico. Aislamos así un fragmento de aproximadamente 7Kb cuya subclonación y secuenciación nos ha permitido identificar en el locus Nrg1 un nuevo LTR-retrotransposón en C.reinhardtii de tipo gypsy que hemos denominado CrREM1. Este se encuentra en un bajo número de copias y posee una actividad transposicional elevada la cual podría inducirse mediante integración de DNA exógeno en c.reinhardtii. En CrREM1 se han identificado dos dominios funcionales adicionales a los característicos de estos elementos móviles, PHD y chromo domain, los cuales podrían conferir al retrostransposón especificidad en el sitio de integración en el Dna del huésped actuando así como un mecanismo de control de la retrotranscripción del mismo. Realizando estudios de Northern blot se ha observado que CrREM1 se sobreexpresa en los tres mutantes N1, N10 y N24 y que se halla en un mayor número de copias respecto a su estirpe parental. Según estos resultados, y dado que estos mutantes reguladores derivan de transformaciones independientes, estána fectados en genes indpendientes, y presentan el mismo fenotipo CSA, nuestra hipótesis es que eventos de integración independientes de DNA exógeno ha afectado elementos de control de la expresión de retrotransposones y de genes de la asimilación de nitrato.

Autor: MOHAMED IBRAHIM DALIA FOUAD.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CORDOBA. FAC. DE CIENCIAS.

Resumen: INTRODUCCIÓN El tratamiento con prostaglandina E1 (PGE1) reduce la citotoxicidad in vivo e in vitro por D-galactosamina (D-GalN). Se ha demostrado que NF-kB ejerce un efecto citoprotector frente a la muerte celular inducida por diversos agentes. El óxido nítrico (NO) producido por la oxidación nírico sintasa inducible (iNOS), gen regulado, principalmente por NK-kB, es capaz de reduir o incrementar la citotoxicidad celular dependiendo de las condiciones experimentales. El objetivo del presente trabajo fue el estudio del papel de la activación de NF-kB en la protección por PGE1 frente a la muerte celular inducida pro D-GalNen el cultivo primario de hepatocitos de rata. Asimismo, se estudió la asociación existente entre la activación de NF-kB y la regulación de la expresión de iNOS en nuestras condiciones experimentales. MATERIALES Y MÉTODOS Los hepatocitos de rata se aislaron por el método clásico de perfusión hepática con colagenasa. El papel de NF-kB se estudió mediante la utilización de un inhibidor de su activación como es el inhibidor del proteosoma de tipo 1 (PSl) administrando antes que la PGE1- y/o D-GalN en los hepatocitos en cultivo. La apoptosis se evaluó mediante la fragmentación del DNA y la actividad caspasa-3 en hepatocios, y la necrosis por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo. La activación de NF-KB se determinó por la degradación de IkBalfa y la translocación de NK-kB al núcleo. Se evaluó la expresión de la iNOS en hepatocitos, así como la concentración de los productos finales del óxido nítrico (NO), nitrito+nitrato (Nox), en el medio de cultivo. RESULTADOS D-GalN incrementó la actividad caspasa-3, la fragmentación del DNA y la liberación de LDH. PGE1 estimuló la degradación de IkBalfa y la activación de NF-kB, con reducción de todos los parámetros asociados a la inducción de apoptosis por D-GaIN. PSI bloqueó la protección por PGE1 frente a la fragmentación del DNA y la actividad caspasa-3 inducida por D-GalN. Este efecto de PSI se asoció con una reducción de la activación del NF-kB y de la expresión de iNOS inducida por PGE1 en los hepatocitos tratados con D-GalN. CONCLUSIONES 1,- D-GalN indujo apoptosis y necrosis en el cultivo de hepatocios. 2,- PGE1 redujo la apoptosis inducida por D-GalN. 3,- Este efecto citorpotector de la PGE1 se asoció con un aumento de la activación de NF-kB y de la expresión de iNOS. 4,- La inhibición de la activación de NF-kB bloqueó el aumento de la expresión de iNOS y la citoprotección frente a la apoptois por D-GalN observada con el tratamiento con PGE1.

Autor: LÓPEZ RÁEZ JUAN ANTONIO.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo de tesis doctoral se ha procedido a la clonación y determinación de la estructura molecular de tres genes de fresa (Fragaria x ananassa cv. Chandler) a los que se les ha denominado FaQR, Fadfr y Famyb2, los cuales presentaron un alto nivel de identidad de secuencia con las de genes encontrados en las bases de datos y que codifican, respectivamente, quinona oxidorreductasas, dihidroflavonol 4-reductasas y factores de transcripción MYB de plantas superiores y que codifican proteínas relacionadas con el metabolismo de los fenilpropanoides. Posteriormente, se estudiaron sus modelos de expresión con el objetivo de determinar su función fisiológica en el fruto de fresa. Se determinaron las características de expresión a lo largo del proceso de desarrollo y maduración del fruto, detectándose los máximos de expresión en los estadíos maduros del mismo en los tres casos. Además, la expresión de los tres genes se encontraba regulada de forma negativa por el efecto de las auxinas sintetizadas y liberadas por los aquenios, por tanto su modelo de expresión se ajustó al descrito previamente para otros genes relacionados con la maduración del fruto. Seguidamente, se estudiaron sus perfiles de expresión en respuesta a la acción de compuestos elicitores de diversas situaciones fisiológicas y metabólicas, observándose que los genes FaQR y Famyb2 respondían a estrés oxidativo, a la adición de moléculas señal que desencadenan los mecanismos de respuesta de las plantas, a herida, así como a diferentes metabolitos relacionados con el metabolismo de los fenilpropanoides, lo que sugiere que estos genes podrían encontrarse relacionados con el proceso de lignificación del fruto. Adicionalmente, mediante estudios de actividad se ha demostrado que el gen FaQR codifica una quinona oxidorreductasa y que también es capaz de sintetizar Furaneol, uno de los componentes mayoritarios del aroma del fruto de fresa. Por otro lado, el gen Fadfr codifica una dihidroflavonol 4-reductasa que podría estar relacionada con la biosíntesis de taninos condensados en los primeros estadíos de desarrollo del fruto y con la biosíntesis de antocianinas en los estadíos de maduración.

Autor: MONJE CASAS FERNANDO.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La tiorredoxina (Trx) es una proteína con un papel fundamental en la protección frente a estrés oxidativo. Trx actúa como una disulfuro oxido-reductasa, y su forma oxidada es reducida por NADPH a través de la acción catalítica de la flavoenzima tiorredoxina reductasa (TR). Trx, TR y NADPH forman el sistema Trx, que constituye un sistema general de reducción de disulfuros en proteínas. El sistema Trx , junto con el sistema de glutatión (GSH), regula el estado tiol-disulfuro del citoplasma. En la presente tesis doctoral se han estudiado los patrones de expresión de genes de los sistemas Trx y GSH de E.coli y de S.cerevisiae. Por ello, se aplicaron las metodologías de RT-PCR múltiple y de RT-PCR en tiempo real, que permiten la cuantificación de los niveles de transcrito con gran sensibilidad y repetitividad. Los resultados obtenidos demuestran que los sistemas Trx y GSH de E.coli participan en la inactivación de OxyR, el regulador de la respuesta adaptativa a peróxido de hidrógeno en esta bacteria. Adicionalmente se comprueba que este factor de transcripción incrementa la expresión de genes de los sistemas Trx y GSH. De este modo, se propone un modelo de autorregulación del regulón OxyR. Trx y Grx se aislaron como reductores de la ribonucleótido reductasa (Rrasa). Se demuestra que la expresión del operón, nrdHIEF, que codifica la RRAsa de clase Ib de E.coli y su redoxina específica, puede ser vital bajo ciertas condiciones de crecimiento. Los niveles de transcrito de estos genes varían con la fase de crecimiento y la composición del medio. También se observa un incremento de su expresión como consecuencia de la deficiencia en componentes de los sistemas Trx y GSH y tras la exposición de estrés oxidativo. En cuánto a S. Cerevisiae, el perfil transcripcional de los genes de los sistemas Trx y GSH de la levadura a lo largo de la curva de crecimiento indica que el programa de expresión génica por el cambio diáuxico difiere del esperado para una respuesta frente a estrés oxidativo. Por último, también se observa en el cambio diáuxico una inducción de los genes mitocondriales, de acuerdo con el avance paralelo del proceso de biogénesis de las mitocondrias.

Autor: FUNES LUQUE M. VICTORIA.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.

Resumen: Debido a la actividad del hombre, los seres acuáticos están expuestos a muchos xenobióticos (metales, bifenilos policlorados, hidrocarburos policíclicos aromáticos y pesticidas). Tanto el xenobiótico como los productos de su biotransformación son muy reactivos, originando especies reactivas de oxígeno que provocan daños a biomoléculas (ADN, proteínas, lípidos, etc). Ante esta situación los organismos presentan sistemas de defensa antioxidante (enzimáticos y no enzimáticos). Los moluscos bivalvos, por su capacidad de bioacumulación y transformación de contaminantes, se usan como indicadores del nivel de polución de las aguas que habitan. El litoral onubense es un área rica en la producción de moluscos, aunque existen zonas con altos niveles de cobre y otros metales de transición. En el presente trabajo se han utilizado el ostión (Crassostrea angulata) y el mejillón (Mytilus galloprovincialis) como indicadores de contaminación. Se han tomado muestras de dos zonas contaminadas (Punta Umbría y Mazagón) y de una zona más amplia (Isla Cristina). Se han determinado los niveles de cobre y zinc y distintos parámetros como biomarcadores de contaminación (actividades enzimáticas antioxidantes -catalasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y glutatión transferasa-, estado redox del glutation, metalotioneínas, taurina, malondialdehído y 8- oxo-desoxiguanosina). Los resultados muestran claras diferencias entre ambas especies. Los ostiones acumulan mayor concentración de metales en sus tejidos, a la vez que presentan inducidos la mayoría de sistemas de defensa antioxidante, por lo que el daño oxidativo en biomoléculas es menor. Por el contrario, los mejillones acumulan menor cantidad de metales, presentan escasa inducción en sus mecanismos de defensa y mayores niveles de metabolitos resultante del daño oxidativo. Por otro lado se ha clonado el gen que codifica la metalotioneína del ostión (C.angulata). Éste presentó una homología del 64-92% con los genes mt de otras especies de ostras, y del 43-56% con los genes mt de distintas especies de mejillón.

Autor: SÁNCHEZ PUIG JUANA M..
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD CC. BIOLÓGICAS.

Resumen: El trabajo de esta tesis está encaminado a mejorar el virus vaccinia como vector de expresión. Un paso previo es la elección del sistema de selección y aislamiento de los virus recombinantes. Con este fin se evaluó el gen pac omo marcador seleccionable en el virus vaccinia y su posible uso en el aislamiento de virus vaccinia recombinantes. A través de mutaciones en posiciones próximas al AUG se determinó el efecto de mutaciones en las posiciones -3 y +4 con respecto al AUG iniciador en la eficiencia de traducción de proteínas, en el contexto de una infección con el virus de la vacuna. Por último se hizo el diseño y construcción de virus vaccinia recombinantes que expresen un gen exógeno mediante un replicón de alfavirus insertado en el genoma de vaccinia y la construcción y asilamiento de un virus vaccinia recombinante conteniendo un replicón y los genes estructurales de SFV que produzca partículas virales de ciclo único.

Autor: PANEQUE CORRALES MANUEL GILBERTO.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA CSIC.

Resumen: La respuesta a herida se produce tanto en la zona dañada como en el resto de la planta, e incluye la inducción de genes que se supone que participan en la reparación del daño y en la defensa de la planta frente a los agentes causantes de la herida y/o posibles patógenos. Trabajos previos habían aislado varios genes inducibles por herida para ser utilizados como marcadores moleculares. No se encontraron homólogos descritos para estos marcadores utilizados, por lo que se decidió caracterizar algunos de ellos con función desconocida. Hemos aislado los ADNc y las regiones promotoras correspondientes a los genes de respuesta a heridas AtMBP3, AtTAT1, AtTAT3, IAR3, ILL5, AtCK1 y AtWR3.1. El gen AtMBP3 codifica una posible proteína de unión a mirosinasa, que contiene tres dominios jacalina y se localiza en retículo endoplasmático. La región promotora aislada induce la expresión del gen beta-GUS en respuesta a tratamientos con JA y STA. Los genes AtTAT1 y AtTAT3, codifican proteínas con similitud a tirosina aminotransferasas. Ambos genes se inducen por herida, JA y NaCl. La región promotora aislada de AtTAT1 induce la expresión del gen Beta-GUS en respuesta al tratamiento con JA. Los genes IAR3 e ILL5, codifican proteínas con similitud a auxina amino hidrolasa. Ambos genes se inducen en plantas heridas o tratadas con JA, si bien la acumulación del transcrito de IAR3 es 1500-200 veces mayor que la de ILL5. La región promotora aislada de ILL5 induce la expresión del gen beta-GUS en respuesta al tratamiento con altas concentraciones de JA y NAA en plantas jóvenes pero no en plantas adultas. La región promotora aislada de IAR3 induce la expresión del gen beta-GUS en respuesta a herida y JA. En plantas transgenicas donde la expresión de IAR3 esta cosuprimidas se altera el momento de floración. El gen AtCKl codifica una proteína con similitud a colina quinasa. La región promotora aislada indcue la expresión del gen Beta-GUS en los tejidos adyacentes a las heridas. En la región delimitada entre -2216 a -1212 se encuentra una secuencia reguladora negativa. El gen WR3.1 codifica una proteína de respuesta a herida que posiblemente esté asociada a los transportadores de nitrato de alta afinidad. La proteína WR3.1 se localiza en las membranas nuclear y plasmática. Una región promotora de 459 pb contiene todos los elementos necesarios para la regulación y expresión por herida y respuesta a la adición de nitrato. Las plantas que expresan un RNA del gen WR3.1 antisentido tienen un mayor desarrollo radicular que las plantas silvestres en medios sin nitrato, sugiriendo que WR3.1 interviene en el transporte de nitrógeno.

Autor: MAESTRO GUTIERREZ BEGOÑA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: In vivo el tratamiento con la 1,25-(OH)2D3 a ratas no diabéticas no causó ninguna modificación de los parámetros estudiados en orina y sangre, pero sí un aumento del peso corporal de estos animales. El hígado y el riñón podrían haber sufrido una hipertrofia. La expresión del gen del IR fue inhibida en el tejido adiposo perirrenal y no se alteró en el hígado, riñón, ni en el tejido adiposo epididimal. En este último tejido, ni el número de IRs, ni el transporte de glucosa estimulado por insulina ni la oxidación de glucosa estimulada por insulina resultaron modificados por el tratamiento con la 1,25-(OH)2D3. Por otro lado, hemos observado que el tratamiento con 1,25-(OH)2D3 a ratas diabéticas por estreptozotocina revirtió la perdida de peso ocasionada por la diabetes, contrarrestando en parte la presencia de leucocitos en orina, pero acidificando aún más su pH. En el plasma no fue capaz de revertir ni la hiperglucemia ni la hipoinsulinemia producida por la diabetes, mientras que incrementó los niveles de fósforo. El tratamiento con 1,25-(OH)2D3 no revirtió ninguno de los parámetros tisulares alterados por la diabetes, con la excepción de disminuir el contenido en proteínas del tejido adiposo perirrenal. Tampoco modificó el incremento del ARNm del IR causado por la diabetes en el hígado, ni en el riñón, pero si en el tejido adiposo epididimal. En este último tejido no alteró ni el número de Irs, ni la afinidad de estos receptores. El tratamiento con 1,25-(OH)2D3 a ratas diabéticas no modificó la inhibición inducida por la diabetes del transporte ni la oxidación de glucosa basal, tampoco las modificó cuando ambas actividades fueron estimuladas por la insulina. In vitro el tratamiento con la 1,25-(OH)2D3 al concentración 10-8 M durante 24 h, a través de su receptor VDR, es capaz de incrementar la expresión del gen del IR y la proteína por él codificada, dando lugar a un incremento de ciertas actividades biológicas de la insulina como el transporte y la oxidación de glucosa. La regulación primaria tiene lugar a nivel trancripcional a través de un VDRE (5'CGTCGGGCCTGTGGGGCGCCTCCGGGGGTC3'), localizado en el promotor del gen del IR, concretamente entre -758 y -774 pb y solapado con un sitio AP-2.

Autor: RODRÍGUEZ DE ACUÑA MARTINEZ LUCRECIA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ.

Resumen: La incorporación de un aloinjerto óseo está acompañada de una cascada de eventos en la que participan factores sistémicos (PTH, 1,25(OH)2 vitamina D3) y locales (IL1, IL6, TNFalfa, M-CSF, BMP, IGF, FGF, TGFbeta, PDGF). Estos factores, ejercen su actividad a través de las acciones realizadas por los osteoblastos y osteoclastos del receptor. Recientemente se ha demostrado el papel del sistema OPG/RANKL en la regulación de la resorción osteoclástica. Por otro lado, se ha visto que la conocida citoquina resortiva, IL6, puede ejercer un efecto activador de la resorción por una vía independiente del RANKL. A pesar de la amplia utilización de los aloinjertos óseos en cirugía traumatología, no existen apenas trabajos básicos que profundicen en el mecanismos fistiopatológico de lainteracción entre los aloinjertos y las células del huesped. Por esta razón, el objetivo de este trabajo ha sido estudiar: 1,- La modulación de la resorción ósea ante la presencia del aloinjerto, mediante el análisis de la síntesis y liberación por los osteoblastos de la IL6, como factor activador de la resorción, y de la OPG como factor antiresortivo. 2,- La influencia del aloinjerto sobre la formación ósea, analizando directamente la proliferación osteoblástica, y la síntesis de colágeno óseo, principal constituyente de la matriz ósea, a trvés de la medida del PINP. Este estudio se ha realizado utilizando osteoblastos humanos cultivados durante dos semanas, con (problema) o sin (control) la adición de aloinjerto. Los aloinjertos fueron obtenidos de cabezas femorales autoclavadas y conservadas a -80ºC hasta su uso. Los resultados muestran que la presencia de los aloinjertos disminuye la proliferación de osteoblastos durante la primera semana pero, a partir de la segunda semana, la presencia de los aloinjertos incrementa significativamente la proliferación de osteoblastos, cuando se compara con su control, sin aloinjerto. Los aloinjertos incrementaron la liberación neta de IL6 por los osteoblastos tras 2 días de cultivo, pero se observa el efecto opuesto tras 13 días. Por otra parte, los aloinjertos disminuyeron la liberación neta de OPG tras 2 días. Sin embargo, se observa el efecto opuesto tras 8 días. Los injertos producen un incremento significativo en la liberación neta de PINP tras 8, 10 y 13 días. Los resultados obtenidos a través de esta tesis confirman la intervención activa del aloinjerto en la modulación de la formación de hueso (medida por la producción de osteoblastos y por la síntesis de PINP) y en la estimulación de la síntesis de factores de origen osteoblástico moduladores de la resorción y reguladores de su propia incorporación (IL6, OPG). Los resultados demuestran, que los factores resortivo y antiresortivo, IL6 y OPG respectivamente, intervienen en el mecanismo de incorporación del aloinjerto al receptor, promoviendo una resorción inicial durante la primera semana, y un efecto antiresortivo posterior, a partir de la segunda semana. Además, la acción del aloinjerto sobre la liberación de PINP y sobre la proliferación de osteoblastos, revela que la presencia del aloinjerto induce en un primer momento, una disminución de la formación ósea, efecto que se invierte a partir de la segunda semana de contacto; aumentando tanto la proliferación de osteoblastos como la cantidad de PINP neta, marcador de formaciónd e matriz ósea, liberada al espacio extracelular.

Autor: OLALLA MARTÍN LUCÍA.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En mamíferos, existen dos genes diferentes que codifican dos isoformas de glutaminasa denominadas tipo hígado (LGA) y tipo riñón (KGA). Siempre se había considerado que la proteína LGA estaba únicamente presente en mitocondrias de hígado, mientras que era la glutaiminasa tipo K, la expresada por el resto de los órganos con actividad glutaminasa. Sin embargo, en este trabajo describimos la presencia de dos isoformas de glutaminasa (KGA y LGA) en cerebro de diversos mamíferos. Además, se realiza un estudio de la distribución regional, celular y subcelular de ambas proteínas en cerebro de rata y mono, mediante técnicas inmunocitoquímicas, utilizando anticuerpos isoforma específicos. La proteína LGA apareció mayoritariamente en los núcleos de las células neuronales, mientras que la localización de la glutaminasa tipo K fue mitocondrial. Los estudios realizados muestran además que tanto LGA como KGA se encuentran mayoritariamente en células glutamatérgicas, aunque también son expresadas por neuronas de naturaleza GABAérgica. Existe una alta correlación entre LGA y KGA tanto a nivel del mRNA como de proteína, de hecho, existen multitud de células que coexpresan ambas isoformas de glutaminasa. Mediante el sistema del doble híbrido en levaduras, aislamos una nueva proteína, denominada GIP (Glutaminase Interacting Protein), que interacciona con LGA pero no con KGA. Se realizó un estudio de la distribución regional, celular y subcelular de esta proteína, que contiene un dominado PDZ, en cerebro de rata y mono, revelándose una localización tanto mitocondrial como no mitocondrial, expresándose mayoritariamente en astrocitos. La capacidad de LGA de interaccionar con proteínas que contengan dominios PDZ, no necesariamente la GIP, podría estar relacionada con la localización subcelular diferencial de ambas glutaminasas en cerebro.

Autor: LOBO GARCÍA CAROLINA.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los tumores consumen grandes cantidades de glutamina para satisfacer sus necesidades energéticas y de nitrógeno, y presentan una alta actividad glutaminasa. Existen numerosas evidencias experimentales de que la glutaminasa es un enzima que se correlaciona positivamente con la malignidad tumoral. En esta memoria se ha inhibido mediante técnicas de RNA antisentido la glutaminasa de células tumorales. El contjuno de resultados obtenidos pone de manifiesto que la inhibición de la glutaminasa conduce a un reversión del fenotipo transformado de las células, tanto in vitro, como in vivo. Estos cambios fenotípitcos afectan a su tasa de proliferación, actividad glutaminasa, eficiencia de clonación, morfología, capacidad de crecimiento in vivo y cambios relacionados con su inmunogenicidad.

Autor: RODRÍGUEZ AGUDO DANIEL.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La Tesis Doctoral define 5 objetivos fundamentales: 1,- El estudio del posible papel del extremo carboxilo terminal de la histidina descarboxilasa (HDC) de mamíferos en la degradación dependiente de ATP. 2,- El estudio de la posible degradación de la HDC por sistemas proteolíticos dependientes de calcio (calpaínas). 3,- El establecimiento de un protocolo de purificación de la enzima recombinante (residuos 1/512) en cantidades semi-preparativas. 4,- El estudio de los efectos inhibidores de algunos análogos de substrato, y finalmente. 5,- El estudio de la implicación de algunos residuos en la catálisis o estructura de la proteína mediante la estrategia de mutagénesis dirigida. Los dos primeros objetivos se llevan a cabo a partir de distintas versiones recombinantes expresadas in vitro; cuya degradación se realiza, igualmente in vitro en sistemas enriquecidos en distintas proteasas o reconstituidos a partir de sus componentes. Los otros tres objetivos tienen como material de trabajo preparaciones altamente purificadas de la enzima salvaje, o mutantes generados a partir de ella, que contienen 512 residuos del extremo N-terminal de la proteína deducida de su cDNA. La caracterización de la versión salvaje y los efectos de inhibidores y mutaciones se estudian mediante espectrofotometría UV-Vis, fluorescencia, electroforesis convencionales SDS/PAGE y no reductoras, transferencias Western, y medidas de actividades enzimáticas en función de la capacidad de descarboxilación de histidina marcada radiactivamente. La discusión se apoya sobre un modelo 3D de la proteína generada mediante programas bioinformáticos de predicción de estructura de proteínas. Las conclusiones de este trabajo se resumen en los siguientes puntos: 1,- El extremo carboxilo de la HDC no puede reemplazar al extremo carboxilo de la ornitina descarboxilasa en su papel en la degradación de esta proteína por el proteasoma 26S, por tanto, este extremo carboxilo tampoco debe cumplir esta función en la propia HDC. 2,- La m-calpaína degrada in vitro dos versiones distintas de la HDC (truncadas o no en su extremo carboxilo), confirmándose, pues, que la HDC se puede degradar por sistemas alternativos al proteasoma 26S. 3,- La versión truncada 1/512 sobreexpresada en un sistema heterólogo y purificada por los procedimientos cromatográficos descritos es activa y presenta propiedades similares a las descritas para la enzima purificada de mamíferos. 4,- La presencia de un análogo de substrato en el centro catalítico protege a la HDC frente a la degradación por tripsina, posiblemente debido a una compactación del dímero. Finalmente, el residuo D257 parece estar implicado en el mantenimiento de una orientación óptima del PLP en el sitio catalítico; el residuo H274 parece crítico en el mantenimiento de la superestructura beta característica de las descarboxilasas del grupo II. Tanto este residuo como el D315 parecen claves en el posicionamiento del residuo K308 y, consecuentemente, en la formación de la aldimina interna. El residuo D315 podría también influir en el mantenimiento del estado dimérico de la enzima.

Autor: CAMPOS SANDOVAL JOSE ANGEL.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: La sobreexpresión de glutaminasa es una característica fenotípica exhibida por una amplia variedad de tumores humanos y experimentales. La obtención de proteína pura y catalíticamente activa en cantidades apreciables supone un tremendo desafío, no superado aún para ninguna glutaminasa de mamíferos, pese a que resulta fundamental para averiguar sus propiedades cinéticas y reguladoras y determinar su estructura tridimensional. Los resultados obtenidos en la presente Memoria permiten concluir que las proteínas recombinantes de glutaminasa humana, isoenzimas K y L, se expresan con actividad catalítica en células de insecto infectadas con baculovirus. La actividad específica en las células de insecto al menos 30 veces superior a la que poseen las respectivas enzimas nativas. Por consiguiente, este sistema de expresión heteróloga se presenta muy útil como fuente de ambas enzimas para los estudios de estructura/función. Se han generado anticuerpos policlonales isoenzima-específicos frente a las proteínas recombinantes y péptidos sintéticos. La evidencia experimental obtenida empleando estos anticuerpos, tamibén permite concluir que la coexpresión de ambas isoformas en células y tejidos de mamíferos es mucho más frecuente de lo que se pensaba hasta ahora. Las dos proteínas se expresan en cerebro de mamíferos como rata y mono, así como en varias líneas celulares de cáncer de mama humano. Elucidar el papel fisiológico que cada proteína desempeña debe ser una prioridad futura, acrecentada por el hecho de la nueva localización nuclear encontrada para la isoenzima L. La cromatografía de afinidad de la glutaminasa humana tipo L, basada en su interacción con una proteína de la familia PDZ, permite su purificación en un solo paso a partir de un extracto celular. La afinidad y especificidad de la interacción,junto con la facilidad y simplicidad en la elución, permiten plantear su potencial aplicación en la purificación masiva de proteínas recombinantes.

Autor: ABELLA MARTÍ ANNA.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: La Aminoxidasa Sensible a Semicarbazida (SSAO) pertenece a la familia de las aminoxidasas que contienen cobre y cataliza la reacción en la que una amina primaria se oxida al aldehído correspondiente en presencia de oxígeno, produciendo peróxido de hidrógeno y amonio. SSAO es una proteína de membrana bifuncional que, a parte de la actividad aminoxidasa, presenta propiedades de adhesión vascular. La Proteína de Adhesión Vascular-1 (VAP-1), perteneciente a la familia de proteínas de adhesión implicadas en procesos inflamatorios y en la interacción célula-célula, es idéntica a la proteína SSAO de placenta humana. SSAO está altamente expresada en tejido adiposo. La función de SSAO en los adipocitos no ha sido establecida; sin embargo, el perósido de hidrógeno, uno de los productos de la reacción que cataliza, presenta propiedades isulinomiméticas en estas células. En este sentido, se ha descrito que sustratos de SSAO en adipocitos estimulan el transporte de glucosa y el reclutamiento del transportador de glucosa GLUT4 a la membrana plasmática de la célula en presencia de bajas concentraciones de vanadato. El mecanismos de acción requiere la generación de peroxovanadato, la inhibicón de proteínas tirosina fosfatasa, la fosorilación en tirosinas de los sustratos del receptor de la insulina IRS-1 y IRS-3 y la activación de la proteína fosfatidilinositol-3-quinasa. De acuerdo con los efectos insulinomiméticos in vitro, hemos demostrado in vivo propiedades insulinomiméticas de la benzilamina, un sustrato de SSAO, en combinación con bajas e inefectivas dosis de vanadato. La administración aguda de esta combinación en ratas no diabéticas, en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ), un modelo de diabetes de tipo 1, y en ratas diabéticas Goto-Kakizaki (GK), un modelo de diabetes tipo 2, aumentó la tolerancia a la glucosa y estimuló el transporte de glucosa en músculo. Además, la administración crónica de benzilamina y vanadato normalizó la glicemia en la ratas diabéticas inducidas por STZ en las ratas diabéticas GK. En las ratas diabéticas inducidas por STZ, este efecto iba acompañado de un aumento en el transporte basal de glucosa y del estimulado por insulina, así como en la cantidad total de GLUT4 en los adipocitos. En las ratas diabéticas GK, el tratamiento crónico aumentó el transporte de glucosa y la cantidad de GLUT4 en la membrana plasmática de los adipocitos en condiciones no estimuladas, y el transporte de glucosa estimulado por insulina en músculo soleus. Además, en este modelo animal la combinación de benzilamina y vanadato estimuló la secreción insulínica en islotes pancreáticos y su administración aguda llevó a la recuperación de la primera fase de secreción insulínica. Todos estos resultados nos llevan a proponer que la producción local de peroxovanadato por la actividad SSAO puede representar una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la diabetes mellitus.