BIOQUIMICA MOLECULAR, 11

Autor: RODRÍGUEZ MULERO SÍLVIA.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: El control del pH sistémico se lleva a cabo mayoritariamente en el riñón, mediante la producción y subsecuente excreción de iones amonio. La principal fuente renal de amonio es la vía enzimática que parte de la glutamina convirtiendola primero en glutamato y finalmente en alfa-cetoglutarato. La desaminación completa de la glutamina por esta vía genera dos iones amonio y está mediada por la glutaminasa renal y la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa. El flujo a través de esta vía es de gran importancia para la excreción renal de amonio y, en general, para el control del pH sistémico. Uno de los elementos clave en esta vía es el transportador de glutamato renal EAAC1 dado que regula la asequibilidad de glutamato en el interior de la célula. Sobre esta premisa, consideramos oportuno el estudio del a regulación del principal transportador de glutamato renal en situación de acidosis. El estudio se ha realizado siguiendo dos ópticas diferentes pero complementarias; mediante un modelo de acidosis conocida y controlada, como es el cultivo in vitro de células renales, y en un modelo de acidosis fisiológica, como la diabetes, estudiada en ratas tratadas con estreptozotocina. A partir de estos trabajos se ha podido concluir: 1,- El transporte renal de aminoácidos aniónicos a través de la isoforma EAAC1 del sistema de transporte X AG se encuentra estimulado durante la acidosis metabólica por un mecanismo que implica la síntesis de nuevas moléculas de proteína ya sea del mismo transportador o de algún regulador de su actividad, todavía no descrito. 2,- La regulación por pH del sistema X AG- es un mecanismo exclusivo del riñón, posiblemente implicado en la supervivencia del epitelio tubular renal en condiciones fisiológicas. Es posible que otros tejidos periféricos estén expresando isoformas distintas de EAAC1 y que éstas no tengan la capacidad para responder a este tipo de estimulo. 3,- La respuesta más temprana a la acidosis se produce en los segmentos proximales, implicados en la amoniogénesis renal. El transporte de glutamato en estos segmentos podrían formar parte de los mecanismos reguladores de la reabsorción de glutamina y la amoniogénesis renal. 4,- La angiotensina II ejerce un importante papel regulador sobre el transporte de aminoácidos del túbulo proximal, impidiendo su adaptación a situaciones patológicas como la acidosis metabólica, el ayuno de aminoácidos o la hiperosmolaridad. 5,- La línea renal PKSV-PCT ha demostrado constituir un buen modelo para el estudio del transporte de aminoácidos en el túbulo proximal contorneado ya que conserva la expresión característica del transporte de aminoácidos ácidos. PKSV-PR, por el contrario, presenta un ratón de transporte alterado y no es un modelo adecuado para este tipo de investigación. 6,- La expresión de la proteína reguladora GTRAP3-18 a lo largo de la nefrona coincide con la del transportador EAAC1, al cual modula, y es siempre superior a la de este. La expresión de ambas proteínas se encuentra modificada durante la diabetes de forma que se produce un incremento de la relación de expresiones EAAC1/GTRAP3-18. El tratamiento con insulina reduce esta relación en la mayoría de segmentos estudiados. 7,- Nuestros datos demuestran una activación de la Na+, K+ ATPasa durante la diabetes, soportada en un incremento de la cantidad de ambas proteínas principales de la bomba, las subunidades alfa y beta. 8,- El transportador de aminoácidos neutros SAT2 presenta una expresión a lo largo de la nefrona relacionada mayoritariamente con su función en la regulación del volumen celular más que con una función reabsortiva. Su expresión presenta una regulación diferente a lo largo de la nefrona durante la diabétes y el posterior tratamiento con insulina. 9,- Los transportadores de nucleósidos CNT1 y CNT2 presentan patrones de expresión a lo largo de la nefrona claramente diferenciados, muy probablemente relacionados con funciones diferentes. CNT1 estaría relacionado con la reabsorción renal de los nucleósidos pirimidínicos, mientras que CNT2 participaría en la regulación de la activación purinérgica glomerular. La expresión de ambos transportadores disminuye con la diabetes posiblemente a causa de la aparición de daño epitelial.

Autor: DÍAZ CORTÉS VÍCTOR MANUEL.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA, HOSPITAL VALL D'HEBRÓN.

Resumen: INTRODUCCIÓN Las proteasas activadoras del plasminógeno (AP), de tipo tisular o t-PA y de tipo uroquinasa o u-PA, calizan la conversión del plasminógeno o plasmina, una serina proteasa de amplio espectro. Estas proteasas participan en la proteólisis de componentes de la matriz extracelular, en la activación de factores de crecimiento y de otros proenzimas., t-PA se une a anexina II en células endoteliales y u-PA interacciona con u-PAR en varios tipos celulares. ANTECEDENTES t-PA está sobreexpresado en líneas de cáncer de páncreas, pero no en cultivos primarios del páncreas normal OBJETIVOS Analizar la expresión de t-PA en los tumores pancreáticos y compararla con la de u-PA y sus receptores anexina II y u-PAR. Estudiar la contribución de t-PA y u-PA al fenotipo tumoral. Analizar si anexina II puede actuar como receptor de t-PA en cáncer de páncreas. RESULTADOS t-PA está sobreexpresado en >90% de los tumores pancreáticos y anexina II en un 40% y la expresión de ambos se asocia más específicamente al fenotipo tumoral., u-PAR se sobreexpresan en cáncer de páncreas y conjuntamente con u-PA, en áreas de pancreatitis peritumoral. La capacidad invasiva in vitro de las células tumorales pancreáticas depende de u-PA y t-PA. El uso de un inhibidor químico de t-PA Pefabloc/t-PA, oligonucleótidos antisentido que bloquean la expresión de t-PA, o la introducción estable de una construcción generadora de RNAs antisentido contra el mRNA de t-PA, inhibe la invasión in vitro y al crecimiento in vitro e in vivo. La inhibición del crecimiento tumoral in vivo correlaciona con un menor número de células en proliferación y con una disminución de la respuesta angiogénica. In vitro, la supresión de t-PA disminuye la capacidad de las células endoteliales para organizarse en estructuras tubulares y la migración in vitro. La transfección de t-PA o la adición exógena de rt-PA en células que no expresan la proteasa estimula la proliferación in vitro, independientemente de la generación de plasmina. La capacidad invasiva de las células tumorales páncreaticas es superior en aquellas líneas que sobreexpresan t-PA y anexina II., t-PA se une a la membrana celular de las células tumorales pancreáticas de manera saturable y concentración dependiente y la unión puede inhibierse con péptidos bloqueantes de la interacción con anexina II., t-PA y anexina II colocalizan en el comportamiento basolateral, coinmunoprecipitan en extractos de células tumorales pancreáticas y colocalizan in vivo en tumores pancreáticos. CONCLUSIONES La sobreexpresión de t-PA en cáncer de páncreas estimula la invasión y el crecimiento in vitro e in vivo. Anexina II participa como receptor de t-PA en las células tumorales pancreáticas.

Autor: MUÑOZ MORAN M. ENCARNACIÓN.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Se analiza la evolución con la edad de las frecuencias de los polimorfismos genéticos: M235T del Angiotensinógeno (AGT), I/D de ECA, a1166c del Receptor AT1 de la Angiotensina y A222V de la MTHFR, en la población control (55 años) y se realiza la subsiguiente comparación con el grupo de pacientes con infarto (30-55 y >55 años) en un doble estudio caso-control. Dentro del grupo control menor de 30 años se observa, en los nacidos después de 1976, un aumento de la frecuencia de los individuos VV de la MTHFR, concluyendo, tras exlcuir otras posibles causas, la existencia de una selección genética consecuencia de los tratamientos con ácido fólico. Del estudio caso-control se desprende que el genotipo cc en mujeres y el MM en hombres, constituyen un importante factor de riesgo, de padecer infarto de miocardio. Todos los apareamientos con los demás genotipos, dos a dos, tienen como resultado la persitencia del riesgo sobre todo, la asociación ccMM en mujeres y MMVV en hombres. Al valorar la relación de estos polimorfismos y los factores de riesgo: hipertensión, hipercolesterolemia y tabaco, se concluye que el alelo M es un factor de riesgo independiente de padecer infarto de miocardio y que el alelo T, considerado protector, lo modifica cuando están presentes los otros factores de riesgo mayores.

Autor: CARRERA GÓMEZ JOSE EUGENIO.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA U. DE MÁLAGA.

Resumen: En la presente tesis se ha realizado un estudio de los factores de riesgo cardio y cerebrovascular de origen lipidico en la población de sada en función de la edad y el sexo dentro de la estrategia individual de la prevención primaria y secundaria para identificar las poblaciones con riesgo de origen vascular y poder intervenir para reducir las elevadas tasas de mortalidad cardio y cerebrovascular.

Autor: PÉREZ GÓMEZ CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Se ha aislado y acracterizado el Gen de la glutaminasa L humana, con una longitud de aproximadamente 18 Kb y compuesto por 18 exones. El sitio de inicio de la transcripción se ha mapeado 240 pb cadena arriba del codón de iniciación. El análisis transcripcional del gen ha mostrado un núcleo promotor entre los nucleótidos -141 y +410. El promotor carece de caja tata y posee elementos CAAT y cajas tata no canónicas de alta funcionalidad. El promotor mínimo está entre los nucleótidos +107 y +410, donde existe un elemento Sp1. Se ha puesto a punto un método de RT-PCR competitivo con el que se han identificado y cuantificado de forma simultánea las isoformas de glutaminasa K y L humanas.

Autor: GONZÁLEZ BARBERO LAURA .
Año: 2002.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: El tumor ascítico de Ehrlich induce una respuesta inmune en la que intervienen factores secretados por el propio tumor, como la citoquina TGF-beta. Esta respuesta inmunitaria no está encuadrada en el tipo Th1, responsable del rechazo tumoral. Hemos demostrado, mediante estimulación con enterotoxina B, que el tumor induce en linfocitos T un estado resistente a la activación, caracterizado por una menor capacidad de producción de IFN-gamma, citoquina esencial para generar una respuesta Th1. En los esplenocitos del huésped, la presencia del tumor provoca cambios tempranos en la expresión génica de las proteínas gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y glutaminasa. Se ha observado un aumento en los niveles relativos de mensajero de GAPDH, no asociado con un incremento del flujo glucolítico en esas células, y una expresión diferencial de dos transcritos de glutaminasa a lo largo del desarrollo tumoral.

Autor: RAMIS MOREY JOANA M..
Año: 2002.
Universidad: ISLAS BALEARES.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS. FACULTAT DE CIÈNCIES.

Autor: ASTOLA GONZÁLEZ ANTONIO.
Año: 2002.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD DE CÁDIZ.

Resumen: Se ha demostrado ampliamente el papel fundamental que las hormonas de origen hipofisario juegan en distintos aspectos fisiológicos. Estos comprenden, desde la reproducción o el desarrollo, hasta la adaptación al medio o la regulación de los niveles de calcio, entre otras distintas funciones. La prolactina se identificó por primera vez en la adenohipófisis de diversos animales en 1928 y fue purificada en 1932. La PRL humana se purificó en el año 1971 y el gen se clonó y secuenció en el año 1984. La prolactina se sintetiza en las células lactotropas de la pars distalis rostralis de la adenohipófisis de los vertebrados. En peces, las acciones biológicas de la prolactina comprenden desde la osmoregulación al comportamiento, pasando por la reproducción o el metabolismo. La somatolactina es una hormona perteneciente a la familia de la GH/PRL que ha sido identificada recientemente en la pars intermedia de la adenohipófisis de los teleosteos. La función de esta hormona en peces no ha sido aun descubierta, aunque algunos estudios sugieren la participación de esta hormona en la reproducción. El objetivo fundamental de esta tesis, por tanto, el desarrollo de herramientas bioquímicas encaminadas a la determinación, tanto cualitativa, de la presencia y niveles de diversas hormonas hipofisarias (Somatolactina y Prolactina) "in vivo" en la especie Sparus aurata (Dorada). Así mismo, nos proponemos como objetivo la caracterización de las zonas promotoras de dichos genes con el fin de estudiar su regulación. Para ello se plantean una serie de objetivos a desarrollar. Screening, clonaje y secuenciación del cDNA que codifica por la hormona somatolactina. Expresión y purificación de la hormona SL recombinante. Obtención de anticuerpos AbSL mediante inmunización de conejos con la hormona recombinante. Desarrollo del RIA homólogo. Construcción de una librería genómica de dorada. Secreening, clonaje y secuenciación tanto del gen de somatolactina como de su región promotora. Caracterización del promotor de somatolactina mediante ensayos de transfección y medidas de luciferasa. Screening por PCR, clonaje y secuenciación del cDNA de la hormona prolactina. Expresión y purificación de la hormona recombinante. Obtención de anticuerpos AbPRO mediante inmunización de conejos con la hormona recombinante Desarrollo del ELISA homólogo. Screening, clonaje y secuenciación del promotor de prolactina Caracterización del promotor de somatolactina mediante ensayos de transfección y medidas de luciferasa.

Autor: RIO LAGAR BEATRIZ DEL.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Los estrógenos muestran acciones biológicas beneficiosas y perjudiciales mediadas a traves de los receptores de estrógenos Realfa, Rebeta y sus variantes. La hormona melatonina actúa como un modulador selectivo del Realfa, ya que inhibe específicamente acciones estrogénicas mediadas por el hREalfa. En este trabajo demostramos que la melatonina actúa selectivamente sobre el hREalfa a través de la inhibición de la CaM, proteína que interacciona específicamente con la isoforma hREalfa, pero no con la hREbeta. La melatonina muestra efectos antiestrogénicos en células de carcinoma de mama, inhibiendo la proliferación celular estimulada por estradiol. Además, inhibe la unión selectiva de la isoforma hREalfa al DNA al causar disminución de la afinidad del complejo E2-hREalfa al DNA y por tanto inhibe la transcripción dependiente de hREalfa e inducida por el E2. Esta desestabilización podría ser debida al cambio conformacional que la melatonina induce en el hREalfa, así como por la alteración de los niveles relativos de hREalfa y hREbeta en células de carcinoma de mama, en respuesta al tratamiento con esta hormona. La región aminoacídica (298-310) del Realfa parece ser un sitio de unión de la calmodulina en el hREalfa, siendo las lisinas 302 y 303 imprescindibles para la unión de esta proteína y para la modulación específica del hREalfa por la melatonina. Los resultados obtenidos en este trabajo resultan de gran importancia ya que demostramos una inhibición específica de la isoforma hREalfa por los antagonistas de calmodulina, la melatonina y el W7. La progresión de diferentes tipos de tumores como los de ovario, mama, endometrio y colon se ha asociado con un aumento en los niveles proteicos de esta isoforma. El tratamiento con melatonina podría reducir los niveles de Realfa así como inhibir acciones estrogénicas mediadas específicamente por esta isoforma que pueden contribuir a la progresión tumoral. Estas acciones de la melatonina ocurrirían sin afectar las acciones estrogénicas mediadas por el Rebeta, muchas de ellas consideradas beneficiosas.

Autor: BANCES SOTO PATRICIA.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La organización genómica y las características estructurales del gen de la anexina A11 se determinaron mediante la clonación experimental del mismo y su posterior secuenciación. El patrón del procesamiento de intrones se mostró congruente con el de 9 de las 12 anexinas de vertebrados y la determinación del inicio de la transcripción permitió demarcar la región promotora que se sometió al estudio funcional. Estas estructuras se caracterizaron también mediante el análisis genómico comparado del gen en otras especies con el fin de inferir la significancia funcional de las características comunes conservadas. También se identificaron variaciones tales como polimorfismos en un solo nucleótido y procesamientos alternativos conducentes a isoformas de cDNAs. La expresión génica de la anexina A11 se evaluó mediante el análisis de bases de datos de secuencias expresadas (ESTs) y las de "microarrays", mostrándose el amplio rango de expresión de este gen en diversos tipos celulares. La secuencia promotora/reguladora, responsable de la transcripción, se sometió, previamente, al análisis bioinformático con el fin de identificar secuencias posibles de unión a factores de transcripción. La determinación experimental de la actividad transcripcional y los sitios de unión a factores de transcripción se llevó a cabo a través ensayos de transfección celular utilizando diversas regiones del promotor del gen y también se llevaron a cabo ensayos de unión DNA-proteína para determinar la especificidad e identidad de las proteínas implicadas. Los resultados obtenidos demuestran la importancia crítica del exón 1 y de los factores Sp1 y AP2 en la transcripción de este gen.

Autor: BORRELL PICHS YAISEL JUAN.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Resumen: Esta tesis se propone como objetivo general comprobar la utilidad de la variación microsatélite en el manejo de poblaciones de tres especies con gran interés económico: el salmón atlántico Salmo salar L., el rodaballo Scophtalmus maximus, y el camarón blanco Litopenaeus schmitti. Los resultados obtenidos obtenidos demuestran que los loci microsatélites son útiles para el manejo de reproductores en las estaciones de cultivo a través del establecimiento de pedigríes si se tienen en cuenta: un análisis previo de variabilidad en los reproductores, la posibilidad de mutaciones y alelos nulos y las relaciones genéticas existentes entre los reproductores. No se encuentra una relación alelos-caracteres de interés comercial en el cultivo, aunque si asociación entre la heterocigosidad enzimática y estos últimos, mientras parece no existir ninguna relación con la heterocigosidad microsatélite. Nuestros resultados apoyan la idea de que las enzimas, a través del control del metabolismo, juegan un papel fundamental en el incremento de la eficacia biológica de los individuos. Finalmente, los loci microsatélites muestran mayores niveles de variabilidad que las enzimas en poblaciones naturales, aunque el reparto de esa variabilidad genética es similar para ambos marcadores en camarón. No obstante, la mayor variabilidad de los microsatélites permite asignar los individuos a sus poblaciones de origen, lo cual sería de gran utilidad en el manejo poblaciones naturales y cultivadas.

Autor: CADIÑANOS BAÑALES JUAN.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Una gran variedad de proteínas celulares, incluyendo las oncoproteínas Ras, las subunidades gamma de las proteínas G heterotriméricas y las laminas nucleares, son objeto de una serie de modificaciones postraduccionales que afectan a su motivo C-terminal CaaX (C, cisteína; a, aminoácido alifático; X, cualquier aminoácido). La primera de estas modificaciones consiste en la prenilación (farnesilación o geranilgeranilación) del residuo de cisteína y sitúa a estas proteínas en la cara citoplásmica del sistema de endomembranas celulares. A continuación, en la membrana del retículo endoplásmico se produce la eliminación proteolítica del tripéptido aaX y, por último, la cisteína prenilada es carboximetilada. En la presente Tesis Doctoral se describe la identificación de los enzimas humanos responsables de la eliminación proteolítica del tripéptido aaX de las proteínas preniladas. A estas proteasas las hemos llamado FACE-1 y FACE-2 por las siglas de FARnesylated-proteins Converting Enzymes. Asimismo, hemos generado modelos murinos deficientes en estos enzimas. Los ratones deficientes en FACE-1 presentan envejecimiento acelerado, distrofia muscular, alteraciones del tejido adiposo y muerte prematura, recordando a los síndromes de los pacientes con laminopatías y a los ratones deficientes en el gen LMNA que codifica las laminas nucleares A y C. En consistencia con este fenotipo, la ausencia de FACE-1 provoca el procesamiento defectuoso de la prelamina A. De este modo, la metaloproteasa FAC-1 está directamente implicada en el procesamiento de la prelamina A, siendo esta proteína el primer sustrato identificado en mamíferos para este enzima proteolítico. La deficiencia en FACE-1 también causa modificaciones en los patrones de transcripción del hígado, conduciendo a una sobreexpresión de dianas de p53 y a la desregulación de genes implicados en el metabolismo lipídico. Estas alteraciones son muy similares a las observadas en ausencia del gen LMNA, y sugieren que pueden existir mecanismos moleculares comunes responsables del desarrollo de las laminopatías. Los ratones deficientes en FACE-2 mueren durante el desarrollo embrionario o en los primeros días después del parto. La deficiencia en FACE-2 impide el procesamiento proteolítico del tripéptido aaX de las oncoproteínas Ras, RalA, Rap2, Cdc42 y Rab8, lo que sugiere que este enzima es una potencial diana molecular para el desarrollo de terapias antioncogénicas. Por último, hemos identificado y caracterizado bioquímicamente las proteasas de proteínas CaaX, CeFACE-1 y CeFACE-2 de Caenorhabditis elegans, así como el enzima AtFACE-2 de Arabidopsis thaliana, comprobando que este sistema proteolítico está conservado a lo largo de la evolución de los organismos eucariotas.

Autor: SÁNCHEZ LARA CLAUDIA VERÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Resumen: La mayoría de las cepas de lactococos albergan entre 4 y 7 plásmidos de tamaños diversos. Algunos de éstos codifican funciones esenciales para su utilización industrial, mientras que otros sólo parecen codificar su propia maquinaria replicativa. El estudio de ambos tipos de plásmidos es importante para analizar y estabilizar las funciones que portan de forma que podamos reproducir las fermentaciones de manera más eficiente; también para la construcción de herramientas biotecnológicas que posibiliten su manipulación genética. Este trabajo se ha centrado en el estudio de dos plásmidos muy distintos presentes en cepas no relacionadas de L.lactis. El plásmido pBL1, encontrado en la cepa L.lactis subsp.lactis IPLA 972, tiene un tamaño de 11 kpb y codifica la producción y resistencia a la lactococina 972. El replicón básico de pBL1 consta de diversas secuencias no traducidas y una ORF que codifica una proteína esencial de replicación. Todos los elementos que encontramos presentaron elevada homología, incluso a nivel nucleotídico, con los presentes en otros plásmidos de lactococos que utilizan el modo de replicación Theta. El replicón de pBL1 es de estrecho rango de huésped, y replica únicamente en cepas de L.lactis. Cerca de la zona de replicación encontramos un sitio operativo oriT, que pudiera participar o haber participado en la movilización del plásmido. La zona codificadora de la lactococina está flanqueada por copias completas e incompletas de varias secuencias de inserción. Éstas podrían haber participado en la incorporación de este bloque fenotípico desde su ubicación original a pBL1 y, mediante reorganizaciones génicas, a generar la conformación actual del plásmido. Por su parte, el plásmido pBM02, presente en la cepa L.lactis subsp.cremoris P8-2-47, es de un tamaño menor, tan sólo 3,85 kpb, y no presenta más fenotipo que su replicación. Comprobamos experimentalmente que pBM02 utiliza el modo de replicación RC. La homología deducida de su proteína de replicación encuadrada a pBM02 en el grupo pLS1/pE194, aunque las secuencias nucleotídicas no aparecen conservadas respecto a las de los demás plásmidos del grupo. Sin embargo, se encontró que un pequeño segmento de unas 200 pb, que podría funcionar de sso, era idéntico al sso de los plásmidos RC más frecuentes en lactococos (el de los plásmidos casí idénticos de pSH71, pWV01 y pID25). El replicón de pBM02 es funcional en diversos grupos bacterianos, incluyendo bacterias Gram-negativas como E.coli. El plásmido no es frecuente en cepas de lactococos y sus parientes más próximos son dos plásmidos presentes en especies del género lactobacillus. De alguna de estas fuentes podría haberse transferido a una cepa de Lactococcus, sustituyendo con posterioridad su sso original por otro más eficiente en este género y presente con anterioridad en la célula huésped. En las últimas fases del trabajo, iniciamos la construcción de diversos vectores basados principalmente en el replicón de pBM02.

Autor: FERREIRA REDONDO LAURA.
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .

Resumen: El virus de la enfermedad de Newcastle o NDV es un Paramixovirus que consta de dos glicoproteínas de membrana: HN y F, ambas involucradas en los mecanismos de entrada en la célula hospedadora. Se ha examinado el efecto de algunas mutaciones en aminoácidos asignados en el sitio catalítico de la HN del NDV sobre las tres actividades biológicas de la proteína, encontrándose que las actividades sialidásica y hemaglutinante poseen un sitio único o dos muy próximos que interacciona. Los resultados también sugieren que la cabeza globular de la HN participa en la promoción de fusión. Por otro lado, está establecido que en los pasos iniciales del ciclo vírico tanto la HN como la F sufren una serie de cambios conformacionales, que en el caso concreto del NDV se desconoce su naturaleza exacta. El primero de estos cambios ocurre cuando la proteína HN se une al receptor. Tras un análisis con la técnica del bis-ANS, se ha visto que gangliósidos de cerebro bovino y el GD1a determinan un cambio conformacional en la proteína HN que conlleva a la exposición de regiones hidrofóbicas de la proteína. Este cambio es máximo a 37ºC y a pH 5, no detectándose a 4ºC. Al igual que ocurre con otros paramixovirus, los ácidos siálicos son indispensables para la fusión del NDV con la célula hospedadora. Estos monosacáridos ácidos pueden encontrarse tanto en glicoproteínas N-glicosiladas como en glicolípidos de la membrana de la células hospedadora. El NDV reconoce gangliósidos como el GM3, GM2, GM1, GD1a, GD1b y GT1b, por lo que esta unión no es altamente específica. Además de la fusión directa con la membrana, el NDV utiliza la endocitosis como vía secundaria de entrada en la célula hospedadora. Esta endocitosis se encuentra mediada por vesículas rodeadas de clatrina. Por el contrario, la entrada es independiente de las caveolas.

Autor: MARCOS GÓMEZ FERNANDO .
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIAº.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Resumen: El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un paramixovirus que afecta al sistema respiratorio y/o nervioso de aves de corral. Posee una envoltura membranosa que rodea a una nucleocápsida helicoidal. La nucleocápsida está formada por una molécula de RNA de polaridad negativa y tres tipos de proteínas: la NP, P y L. Esta molécula de RNA esta flanqueada por los extremos 3' y 5' y entre dichos extremos se encuentran los genes que codifican a la proteínas estructurales del virus. Estos extremos 3' y 5' contienen secuencias esenciales para la replicación y la transcripción. Los extremos 3' y 5' del genoma del NDV de la cepa California ha sido objeto de estudio. Mediante técnicas de ingeniería genética se construyó un plásmidos de cDNA que son capaces de expresar en presencia de la RNA polimerasa del bacteriófago T7, un sistema genético conocido como minigenoma que consiste en una molécula de RNA que contiene la región codificante del gen CAT en polaridad negativa, flanqueada por los extremos 3' y 5' del NDV, los cuales serian replicados y transcriptos en cultivos celulares, en presencia de las proteínas víricas NP, P y L. De forma que los niveles de actividad CAT y la medida de la síntesis de RNA minigenómico como de RNAm del gen CAT por northern blot serian indicativos de la actividad replicativa y transcriptásica del minigenoma expresado. De forma que mediante construcción de minigenomas que contenían mutaciones y/o deleciones en las regiones de los extremos 5' y 3' se pudo determinar las secuencias importantes implicadas en la transcripción y replicación. Las secuencias promotoras de ambos procesos resultaron localizarse en los 18 primeros nucleótidos y la región comprendida entre los nucleótidos 73 al 90 de ambos extremos 3' y 5'. Por lo tanto el NDV al igual que otros paramixovirus presenta un promotor bipartito para la replicación y transcripción.

Autor: FERNÁNDEZ SOTO PEDRO .
Año: 2002.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MEDICINA. FACULTAD DE MEDICINA. UNIV. DE SALAMANCA.

Resumen: Desde 1996 a 2002 se llevó a cabo un estudio sobre las garrapatas que picas a las personas en la comunidad de Castillla y León a fin de conocer: 1,- Las especies implicadas. 2,- Los patógenos presentes en dichas garrapatas. 3,- La capacidad de la serología para averiguar si las personas han sido picadas por garrapatas. A partir de 2717 personas recogieron e identificaron 3059 garrapatas de 14 especies de ixódidos y de un argásido. La especie más frecuente fue Ixodes ricinus, seguida por Rhipicephalus bursa, Dermacentor marginatus, R.turanicus e Hyalomma marginatum. Las 9 especies restantes fueron más escasas. Todas las garrapatas fueron analizadas por PCR para la detección molecular de Borrelia burgodorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophil ay rickettsias del grupo de las fiebres botonosas. También se buscó por PCR el ADN de Francisella tularensis en 2186 de las 3059 garrapatas retiradas de personas y en 439 garrapatas recogidas sobre animales silvestres. Se detectó Borrelia burgdorferi sensu lato en 25 ejemplares de I.ricinus: B.lusitaniae (70%), B.valaisiana (10%) y B.garinii (20%); A.phagocytophila en 82 garrapatas (2,68%) de 9 especies y rickettsias en 219 garrapatas (7,16%) de 10 especies. Las especies/genotipos de rickettsias identificados fueron Rickettsia Bar29/R., massiliae, R.slovaca, R.aeschlimannii, genotipos IRS3/IRS4, genotipos RpA4/DnS14, R.helvetica y R.conorii. F.tularensis no fue detectada en ninguna garrapata. Se evidencia por primera vez que Neotrombicula autumnalis puede actuar como vector de A.phagocytophila, así como la presencia de R.aeschlimannii en España, tanto en Hyalomma marginatum como en otras especies de garrapatas. La serología permitió detectar personas picadas por garrapatas con una fiabilidad del 96,8%, aunque no permitió identificar a la especie responsable de la picadura por la fuerte reactividad cruzada entre ixódidos.

Autor: DIAZ GARCÍA JOSE LUIS.
Año: 2002.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA (FACULTAD DE MEDICINA).

Resumen: Es de resaltar la originalidad del estudio, pues hasta ahora no existe en la literatura medica un análisis de estos marcadores como factor pronóstico en los pacientes que presentan un cáncer de vejiga. La puesta al día sobre el tema por el autor se ha realizado de un modo completo, coherente y ordenado. La metodología ha resultado impecable en cuanto a su planificación y realización. Los resultados han sido inmejorables, puesto que no sólo se ha asociado la presencia de alteraciones en un grupo de microsatélites a la existencia de un fenotipo tumoral más agresivo y a la presencia de un tamaño tumoral mayor a 2 centimetros, sino que también se ha detectado la relación estadísticamente significativa entre la alteración del microsatélite D9S1793 y la existencia de un estadio tumoral infiltrante y con la alteración del microsatélite D9S66 y la existencia de un hábito tabaquico; ninguno de estas asociaciones se había podido conseguir con una relación estadísticamente significativa hasta ahora en los estudios publicados. Todo ello abre grandes espectativas, ya no sólo en el diagnóstico precoz de este grupo de pacientes sino también en la elección del tratamiento más adecuado en función de la existencia de una alteración en este grupo de microsatélites o no.

Autor: REYES LEAL GILBERTO.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad del metabolismo de las lipoproteínas plasmáticas, con herencia autosómica dominante, que se caracteriza por elevadas concentraciones de colesterol total (CT) y colesterol en lipoproteínas de baja densidad (cLDL), presentación de xantomas y enfermedad coronaria prematura. La HF es causada por mutaciones en dos genes, en el gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (rLDL), que resulta en la HF clásica con una frecuencia de 1:500 en su forma heterocigota y de 1:1.000.000 en su forma homocigota, se piensa que en España existen de 80.000-100.000 personas afectas, y en el gen de la apolipoproteína B-100(apoB-100) que es el único ligando para el rLDL responsable de la apoB-100 defectuosa familiar (FDB), con una frecuencia similar a la HF clásica. El diagnóstico de la HF generalmente se realiza en base a las características clínicas de la enfermedad, sin embargo, existen muchos otros factores como la dieta, obesidad y variaciones en otros loci como la apolipoproteína E (apoE) que pueden modificar la magnitud en la elevación del perfil lipídico (fenotipo) y afectar el diagnóstico. En este trabajo se analizan las mutaciones en el gen del rLDL, la mutación apoB-3500 y los genotipos de apoE en 171 pacientes diagnosticados clínicamente de HF. El escrutinio de las mutaciones se realizó por técnicas de biología molecular, por amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de cada exón y promotor del rLDL, posteriormente se analizó cada producto amplificado por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP), y aquellas muestras que presentaron un patrón anómalo fueron secuenciados, directamente y las variaciones de las secuencias se comprobaron por análisis de restricción. El estudio de la mutación apoB-3500 en el gen de apoB y los genotipos de apoE se realizaron por un análisis de restricción. De esta manera, se han identificado 118 pacientes con mutaciones en el gen del rLDL, de las cuales se obtuvieron 72 mutaciones diferentes, una mutación en la región promotora (-42)C>G, 9 mutaciones del codón de parada W(-18)X, Q133X, Y421X, E10X, R329X, Q427X, Q371X, G516X; 12 mutaciones que modifican la pauta de lectura 7delC, 518delG, 1045delC, 1502insC, 108delC, 818del8, 1204insT, 1820de111, 231delC, 920ins4, 1243delGC/insA, 2085de119; 5 mutaciones en pauta 421de13, 2393de19, 681ins21, 675de15, 1197de19; 10 mutaciones que afectan al proceso de ayuste 313+1G>C, 313+1insT, 941-39C>T, 1061-8T>C, 1186+5G>A, 1358+1G>A, 1845+1G>C, 2140+5G>A, 2389+4A>G, 2390-1G>C; 33 mutaciones de cambio de aminoácido T41M, N59K, C68W, Q71E, E80K, C113W, C127R, S156L, D157N, S205P, E264A, G248D, C255G, E256K, C297F, C317S, C347Y, C356Y, C358R, R395Q, V408M, V502M, A519T, G528D, L534P, N543H, E594D, R612C, L621S, D630N, L633F, T740M, N804K; una mutación en el péptido señal (-23)A>C; una mutación saliente N619N. Dos pacientes presentaron la mutación por apoB-3500 como responsable de la FDB. Respecto a los genotipos de apoE, se observó que tiene poco efecto sobre el perfil lipídico de estos pacientes hiperoclesterolémicos, posiblemente debido a que la mutación en el rLDL o en apoB enmascara el efecto de apoE.

Autor: GAÑAN JIMENEZ ALBERTO.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La apolipoproteína E (apo E) humana sintetizada en macrófago presenta un claro papel antiaterogénico. En el presente trabajo se ha analizado la asociación entre los polimorfismos del promotor y región codificante del gen de apolipoproteína E con la enfermedad aterosclerosa. Se han analizado tres grupos de sujetos: enfermos coronarios, personas mayores de 65 años sin enfermedad coronaria descrita y un grupo de recién nacidos consecutivos y anónimos. No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias alélicas de los polimorfismos -491A/T, -427T/C y -219G/T entre el grupo de enfermos coronarios y los otros grupos estudiados. Las frecuencias en las isoformas del gen de apo E resultaron similares a las descritas en otros estudios en población general española y de países mediterráneos, nos observándose frecuencias alélicas elevadas asociadas a enfermedad coronaria. En el grupo de personas mayores de 65 años se identificaron dos portadores de la mutación E2(R136S), la cual se asocia a hipertrigliceridemia y un portador de la mutación EDL149, relacionada con hipercolesterolemia. En todos los grupos se encontró un fuerte desequilibrio de unión entre el polimorfismo -427 y los polimorfismos que codifican las isoformas de apo E. Sin embargo, los polimorfismos del promotor del gen de apo E no presentaron asociación con los niveles de colesterol total, colesterol en LDL, colesterol en HDL y triglicéridos en los grupos analizados. Al analizar los índices que describen las coronariografías en pacientes coronarios, se encontró una asociación entre el polimorfismo -491 y el índice de vasos mayores afectados con lesiones superiores al 50%. El gen de apolipoproteían E se expresa principalmente en hígado, aunque también existe expresión en numerosos tejidos extrahepáticos como cerebro, macrófago, piel, bazo, tejido adiposo, testículos … Se ha descrito un elemento de unión al factor nuclear PPARg (PPRE) que participa en la regulación del gen de la apo E y una la región responsable de la expresión del gen de apo E en macrófagos y tejido adiposo denominada Multienhancer-1 (ME-1), situada en la región intergénica apo E-apo CI. Se ha realizado una búsqueda de mutaciones en la región PPRE, observando que este elemento está ampliamente conservado en el genoma humano. Se han identificado cuatro polimorfismos no identificados previamente: 23706C/A, 23737G/T, 23758C/T y 23788G/A (GenBank AF050154) próximos al elemento PPRE. Por otra parte se han identificado cuatro nuevos polimorfismos en la región ME-1:25407G/A, 24586G/T, 25599C/T y 25786G/A (GenBank AF050154). El fragmento ME-1 y el fragmento PPRE cotransfectado con el factor nuclear PPARg presentaron aumentos de 2,5 y 3 veces respectivamente en la actividad transcripcional del promotor del gen de la apo E. En el presente trabajo se ha identificado un elemento que regula la expresión de apo E en queratinocitos de la línea celular HACAT, el cual se encuentra situado entre las secuencias de reconocimiento para la eznima HindIII en la región intergénica apo E-apo CI, produciendo aumentos de 4,2 veces en la actividad transcripcional del promotor del gen de apo E. Se encontraron diferencias significativas en la actividad transcripcional del promotor del gen de apo E según el haplotipo de los polimorfismos -491, -427 y -219 del promotor del gen de apo E. Así los haplotipos (-491, -427, -219) ATG y ACT presentaron un 60% y un 70% respectivamente de actividad transcripcional del promotor del gen de apo E respecto al haplotipo ATT. También se analizó la expresión del gen de apoE en macrófagos derivados de monocitos humanos tras cultivo con LDLox. Para ello, se aislaron monocitos de dos grupos de pacientes: un grupo de pacientes con lesiones coronarias severas intervenidas quirúrgicamente por by-pass coronario y un grupo de pacientes sin lesiones coronarias intervenidos por valvulopatías. Se encontraron diferencias significativas en la expresión de apo E entre ambos grupos, observándose que los macrófagos de pacientes coronarios presentaron 5 veces mas expresión del gen de apo E que los pacientes sin lesiones coronarias, confirmándose el efecto ateroprotector de la apolipoproteína E producida por macrófago.

Autor: SOLANO PALACIOS ABELARDO.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El DNA mitocondrial humano (DNAmt) codifica 13 proteínas que forman parte de 4 de los 5 complejos de la cadena respiratoria (sistema OXPHOS) de la mitocondria, así como 2 rRNAs y 22 tRNAs necesarios para la traducción y síntesis de tales proteínas. Por lo tanto, las enfermedades genéticas mitocondriales tendrán su origen en la alteración de los 37 genes que contienen el DNA mitocondrial humano, o bien en cualquier gen nuclear que codifique proteínas constitutivas de la cadena respiratoria así como los elementos necesarios para su transcripción, traducción e importe y modificación de las proteínas resultantes dentro del organelo. El trabajo de esta Tesis se circunscribe solamente a las enfermedades (genéticas) mitocondriales asociadas a defectos propios del DNAmt. Durante el desarrollo del trabajo de Tesis, fueron analizadas en forma rutinaria muestras biológicas de aproximadamente 400 individuos (entre pacientes y familiares relacionados por vía materna), para la búsqueda de mutaciones puntuales conocidas y delecciones. También se realizó de forma específica, el análisis de determinados genes mitocondriales mediante secuenciación y/o análisis de tamizaje (por la técnica de CSGE), en muestras de DNA de más de 200 pacientes del banco de DNA de nuestro laboratorio, que han sido negativas para mutaciones puntuales conocidas o delecciones. La búsqueda de nuevas mutaciones permitió identificar 21 cambios en relación a la secuenciación de referencia de Cambridge. Pensamos que la mayoría de estas nuevas mutaciones se hallan relacionadas directamente con la aparición de la enfermedad en los pacientes.