BIOQUIMICA MOLECULAR, 12

Autor: CALVO ROYO ANA CRISTINA .
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La línea de investigación que se ha llevado a cabo en este laboratorio ha sido el estudio de los efectos de los campos magnéticos alternos (CMA) de 50 Hz en la actividad bioeléctrica de las neuronas de Helix aspersa. Consideramos las neuronas como modelo experimental idóneo en nuestras condiciones de experimentación puesto que son células altamente especializadas en los intercambios iónicos transmembrana. El 67% de las neuronas estudiadas en los ganglios cerebroideos de Helix aspersa son magnetosensibles mientras que el 33% no responde al CMA de 50 Hz e intensidades variables desde 5-10 G, en nuestras condiciones experimentales de exposición. Del total de neuronas estudiadas el porcentaje de neuronas magnetosensibles es superior al de neuronas que no responden al CMA aplicado. La magnetosensibilidad de las neuronas se pone de manifiesto por variaciones en los parámetros frecuencia y amplitud de los potenciales bioeléctricos. Con respecto a las modificaciones en la frecuencia de la actividad bioeléctrica el 34% muestran disminución de la frecuencia y eventual inhibición, el 18% son estimuladas y el 15% presentan respuestas complejas. En relación con las modificaciones de la amplitud de la actividad bioléctrica se observa una disminución de la amplitud de los potenciales con mayor frecuencia bajo CMA (42%) que bajo CME (30%). El umbral para producir un efecto en la actividad bioeléctrica de las neuronas bajo exposición a un CMA de 50 Hz coincide con el observado bajo aplicación de CME. Se han observado respuestas bioeléctricas con intensidades del orden de 5-10G. Inicialmente, caracterizamos las bases iónicas de las respuestas inducidas bajo CMA de 50Hz prediciendo el tiempo de ión implicado en una respuesta neuronal determinada y poniendo de manifiesto posteriormente, mediante la aplicación de cafeína y glutamato la posible conexión existente entre los efectos inducidos por el CM aplicado y los iones de calcio. El paralelismo observado en las respuestas obtenidas bajo CMA de 50 Hz, cafeína y soluciones Ringer enriquecidas en potasio y calcio sugiere que los iones de calcio pueden ser los efectore citosólicos de la interacción del CMA con la membrana plasmática neuronal. El CMA de 50 Hz mimetiza el efecto de la cafeína y del glutamato. De estas observaciones se puede deducir que el efecto inducido por el CMA en neuronas de Helix aspersa, se ade estimulación o de inhibición, se debe al incremento del calcio libre en el citosol. Todo este trabajo experimental nos ha servido de base para estudiar la actividad de sincronización desde pares de neuronas, obteniendo registros electrofisiológicos simultáneos de sus actividades bioeléctricas. El estudio de la sincronización de la actividad bioléctrica neuronal bajo exposición a un CMA de 50 Hz muestra que en un 27% de las neuronas estudiadas se genera un ritmo de disparo de tipo oscilatorio similar a la actividad oscilatoriqa de sincronización en neuronas de mamífero. Esta actividad parece ser condición previa para el establecimiento de una actividad de sincronización entre pares de neuronas. La actividad de sincronización inducida en pares de neuronas, bajo exposición a un CMA de 50 Hz, se caracteriza por la coincidencia temporal de la actividad bioeléctrica. La posibilidad de que un CMA de 50Hz pueda generar una actividad de sincronización en neuronas de los ganglios cerebroideos de Helix aspersa, sugiere que dichas neuronas se comportan como osciladores naturales intrínsecos. Las modificaciones de la actividad bioeléctrica tienen lugar durante el tiempo de aplicación del CMA de 50 Hz, pudiéndo observar un efecto reversible. La reversibilidad del efecto inducido observada sugiere que las modificaciones de la actividad bioeléctrica producidas por el CMA de 50 Hz son funcionales y no estructurales. Los efectos inducidos por el CMA de 50 Hz dependen de las propiedades intrínsecas de las neuronas en estudio (composición y distribución en la membrana plasmática de tipos y densidad de bombas y canales iónicos, dependencia funcional con los iones de calcio). El modelo físico utilizado basado en el fuerte diamagnetismo anisotrópico de los lípidos y proteínas de las membranas, en la liberación de iones de calcio unidos a los fosfolípidos activos mediante explosión coulombiana y en la apertura de canales de potasio operados por calcio, explica una dependencia de la sincronización con el CMA de 50 Hz aplicado. La dependencia de la frecuencia de disparo con el valor cuadrático medio del CMA aplicado se verifica notablemente bien para todas las neuronas estudiadas. Se ha calculado el número de fosfolípidos activos en la membrana (es decier, los pares que liberan calcio) y por tanto el número de neuronas sincronizadas, en buen acuerdo con las distancias medidas entre los pares de neuronas estudiados. En los pares de neuronas estudiados en la sincronización de la actividad bioeléctrica, hemos encontrado que la frecuencia de la actividad neuronal oscila entre 0,3 y 5 Hz, frecuencia que se aproxima a la correspondiente a las ondas delta del encefalograma humano, con lo que los resultados que hemos obtenido pueden ser muy significativos.

Autor: LEIVA BADOSA ELISABET.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA).

Resumen: INTRODUCCIÓN La enfermedad de Parkinson (EP) es una patología multifactorial en la que intervienen factores ambientales y genéticos. La hipótesis ecogenética es la más aceptada y defiende una susceptibilidad interindividual frente a toxinas ambientales, traduciéndose en una reducción de la detoxificación enzimática. La familia de enzimas Glutation S-transferasa (GST) participa en procesos metabólicos de detoxificación de xenobióticos y endobióticos. La Glicoproteína-P, proteína codificada por el gen MDR1, actúa como una bomba expulsora de múltiples sustancias al exterior celula confiriendo una protección específica. Ambas proteínas estan sujetas a diferencias polimórficas individuales, determinando diferentes niveles de expresión y funcionalidad. OBJETIVO Determinar la influencia de los polimorfismos GSTM1, GSTT1, GSTP1 Ile105Val y MDR1 C3435T sobre la enfermedad de Parkinson, comparando una población sana con una formada por enfermos de Parkinson, teniendo en cuenta la edad de aparición de la enfermedad. Además se evaluó la influencia de la exposición a pesticidas sobre la susceptibilidad genética, mediada por dichos polimorfismos. MATERIAL Y METODOS Estudio caso-control en el que se incluyeron 106 controles sanos y 106 casos enfermos de EP, obtenidos mediante un emparejamiento 1:1 de modo que cada control era el cónyuge de un caso. La determinación de los genotipos GSTM1 y GSTT1 se llevó a cabo mediante una PCR multiplex, mientras que los genotipos GSTP1 y MDR1 se analizaron por RFLP-PCR. Tanto los casos como los controles fueron sometidos a una entrevista estructurada en la que se incluyan factores de riesgo para la EP. CONCLUSIONES 1,- El polimorfismo GSTM1 con constituyen un factor de riesgo de padecer EP respecto a la población sana, así como entre aquella población expuesta a pesticidas. 2,- El polimorfismo GSTT1 no constituye un factor de riesgo de padecer EP respecto a la población sana. Por lo contrario, se encuentran sobrerrepresentados los individuos menores de 65 años portadores del gen GSTT1, que tienen más riesgo de padecer EP que el resto de la población. 3,- El polimorfismo GSTP1 no contribuye a aumentar el riesgo de padecer EP respecto a la población sana. Sin embargo, la exposición a pesticidas potencia dicho riesgo de Parkinson de los sujetos heterozigotos respecto a los homozigotos Ile105. 4,- El polimorfismo MDR1 C3434T no está asociado a EP. No obstante, la exposición a pesticidas potencia el reisgo de padecerlo entre los sujetos heterozigotos respecto los homozigotos C3434. 5,- La asociación de los genotipos GSTM1*(+), GSTT1*(+) y GSTP1 Va1105Val no implica mayor susceptibilidad a la aparición de la EP. 6,- Los polimorfismos considerados de riesgo GSTM1, GSTT1, GSTP1 y MDR1, influyen moderadamente en algunos aspectos de la evolución de la EP y en algunas complicaciones del tratamiento antiparkinsoniano.

Autor: ROMA CASTAÑÉ JOSEP.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X más comunes siendo su causa primaria el déficit de distrofina, proteína localizada en la cara interna del sarcolema. La cepa de ratón mdx también carece de distrofina y es el modelo animal más ampliamente utilizado para esta enfermedad. A pesar de carecer de distrofina, el ratón mdx no presenta un fenotipo distrófico tan servero como el observado en la DMD humana. Se han apuntado dos hipótesis para tratar de explicar estas diferencias entre la enfermedad humana y el modelo murino. La primera atribuiría al ratón una mayor capacidad regenerativa mientras que la segunda le atribuiría un descenso del ritmo de necrosis a partir de cierto momento de su vida. En este trabajo intentamos clarificar este aspecto mediante diferentes aproximaciones: 1,- Caracterización morfológica de la patología muscular a lo largo de toda la vida del ratón mdx y estudio de marcadores de necrosis-regeneración. 2,- Estudio de la expresión de utrofina (proteína que presenta elevada homología con la distrofina) y beta-distroglicano (el ligando natural de la distrofina). 3,- Caracterización del papel de la proteasa uPA en la regeneración muscular. 4,- El doble mutante mdx/uPA-/- como modelo de necrosis espontánea y capacidad regenerativa disminuída. 5,- Identificación y caracterización de nuevas proteínas implicadas en el proceso de regeneración muscular y/o protección frente a la necrosis. Los resultados derivados de la caracterización morfológica apunta a que el ratón mdx no presenta necrosis durante sus dos primeras semanas de vida, momento a partir del cual empieza un incremento de este fenómeno llegando a un máximo entorno a los dos meses para posteriormente experimentar un descenso paulatino pero importante de la actividad necrótica. El análisis evolutivo de marcadores de necrosis-regeneración también confirman esta aparición y posterior decremento de la necrosis muscular. El estudio evolutivo de la expresión de utrofina, nos ha permitido observar como ésta desaparece a las dos semanas de vida coincidiendo con el inicio de la necrosis muscular en los ratones mdx, mientras que su posterior incremento en estos ratones coincide con el inicio de la fase en la que la necrosis se muestra mucho más leve. Además, los niveles de utrofina presentan una buena correlación con los niveles de beta-distroglicano, confirmando la capacidad de la utrofina para unirse con el que es el ligando natural de la distrofina. Estos resultados atribuyen a la ultrofina un papel como sustituta de la distrofina en el ratón carente de distrofina. Por otro lado, el ratón carente de uPA (uPA-/-) presenta una importante reducción de la capacidad regenerativa muscular, presentando un retraso temporal importante en el proceso regenerativo, una acumulación de fibrina en el tejido necrótico y una disminución del reclutamiento de macrófagos en la zona lesionada respecto a los ratones controles. El tratamiento con Ancrod (una toxina fibrinolítica) restaura sensiblemente su capacidad de regeneración. Por su parte, el músculo del ratón doble mutante mdx/uPA-/- presenta un aspecto más distrófico, destacando importantes acumulaciones de fibras nicróticas calcificadas, un aumento de grupos necróticos debidos a una disminución de su capacidad regenerativa, un peso corporal menor que las cepas mdx y uPA-/- y una mortalidad cercana al 80% aunque ésta se concentra exclusivamente en el momento de máxima necrosis. Estos resultados confirman la importancia de la proteasa uPA para el proceso de la regeneración muscular y nos muestran como la capacidad regenerativa solo es limitante en el ratón mdx durante el período de máxima necrosis. Finalmente, mediante un estudio de expresión diferencial de genes entre ratones controles y mdx hemos podido identificar 9 secuencias claramente sobreexpresadas en ratones mdx, las más interesantes de ellas, la tetraspanina CD63 y B2. Experimentos destinados a analizar la expresión de estas dos secuencias nos indican que CD63 también es expresada por ratones normales aunque a niveles algo menores que los mdx y que su expresión es elevada pero constante durante la diferenciación de la línea mioblastica murina C2C12 in vitro. La B2 es claramente diferencial, siendo expresada por ratones mdx no expresada o a niveles muy bajos por los ratones controles, mientras que presenta un pico de expresión a los 3 y 6 días de diferenciación de la línea mioblástica murina C2C12 in vitro.

Autor: SALAMANCA SEGUÍ SILVIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUT DE BIOTECNOLOGIA I BIOMEDICINA (IBB).

Resumen: En el primer tabajo de esta tesis se dilucida el camino de plegamiento oxidaivo del LCI. El LCI reducido y desnaturalizado se repliega a través de un flujo secuencial y rápido de intermdiarios de uno y dos puentes disulfuro, y llega a una etapa limitante en la cual la mezcla de tres especies mayoritarias que contienen 3 puentes disulfuro y una población heterogénea de isómeros de cuatro puentes disulfuro no nativos (scrambled) coexisten. Los intermediarios de tres puentes disulfuro se han identificado como trampas cinéticas que se hallan a lo largo del camino de plegamiento del LCI, y se han caracterizado sus estructuras; dos de ellos contienen sólo puentes disulfuro nativos. El camino de plegamiento del LCI comprende propiedades exhibidas tanto por el BPTI como por la hidrudina, dos modelos divergentes con características de plegamiento opuestas. Los resultados obtenidos en el estudio de las vías de plegamiento del LCI confirman el enorme esepectro de diversidad de los caminos de plegamiento de las proteínas. En el segundo trabajo de esta tesis se dilucidan las curvas de desplegamiento y desnaturalización del LCI. En presencia de un agente iniciador de la formación de tioles y un agente desnaturalizante se despliega el LCI nativo por el intercambio de sus puentes disulfuro, y la molécula se transforma en una mezcla de especies scrambled. Podemos distinguir claramente y aislar, entre los 104 posibles isómeros scrambled del LCI, a nueve de ellos que respresentan el 90% del total del LCI desplegado. La concentración de tiocianato de guanidino e hidrocloruro de guanidino para alcanzar el 50% de la desnaturalización son de 2,4 y 3,6 M, respectivamente. El LCI nativo es resistente a la desnaturalización por urea, incluso a concentraciones elevadas (8M). El camino de desplegamiento del LCI se ha podido definir en base a la evolución de la concentración relativa de los isómeros scrambled de la molécula a lo largo de su desnaturalización. Existen dos poblaciones de especies scrambled que sufren variaciones a lo largo del camino de desplegamiento. Una población se acumula como intermediarios bajo condiciones desnaturalizantes fuentes (incluye al isómero denominado beads-form). La otra población muestra una correlación inversa entre sus abundacia relativa y las condiciones desnaturalizantes y debería poseer otro tipo de estructuras no nativas. Los resultados que se presentan en el segundo trabajo muestran que el LCI, una molécula con potenciales aplicaciones biotecnológicas, tiene cinéticas bajas de desplegamiento y es altamente estable. En el tercer trabajo de esta tesis se estudia el efecto del LCI en la fibrinólisis in vitro. Se ha descrito, tanto por estudios in vitro como in vivo, que el PCI (potato carboxypeptidase inhibitor) incrementa la tasa de lisis de los coágulos de fibrina. Con este mismo propósito, hemos evaluado y comparado la capacidad profibrinolítica del LCI con la del PCI. Todos los resultados han sido obtenidos en ensayos con plasma humano, en un sistema in vitro. Hemos demostrado que ambos inhibidores, el LCI y el PCI, aceleran de forma substancial la lisis de los coágulos tratados con t-PA, esta aceleración es dependiente de la concentración de inhibidor. El LCI se ha mostrados unas 10 veces más potente que el PCI como acelerador de la fibrinólisis, y también muestra una mayor capacidad inhibidora de TAFI al realizar ensayos de actividad enzimática en plasma. Se ha estudiado el posible efecto de estos dos inhibidores sobre la estructura del coágulo de fibrina mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Se ha observado un incremento significativo en el grosor de las fibras y una disminución simultánea en la densidad de su entrecruzamiento: el LCI puede tener una aplicación en las terapias trombolíticas basadas en t-PA.

Autor: MEDRANO MUÑOZ ANDRÉS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Actinobacillus pleuropneumoniae es una bacteria gramnegativa que provoca la pleuroneumonía porcina. En este trabajo se ha procedido a la producción y purificación, mediante técnicas de biología molecular, de antígenos proteicos de esta bacteria y a su uso en la formulación de una vacuna por subunidades y de un ELISA para diagnóstico. Los cuatro antígenos escogidos fueron dos proteínas de membrana externa (Tbp1 y Tbp2) y dos exotoxinas (ApxI y APxIII). Para la detección de tbp1 se utilizó como sonda el gen tbp2. Tras su identificación, el gen tbp1 fue clonado en el vector pUC119 obteniéndose su secuencia completa que se depositó en el Genbank Z49708, habiéndose obtenido su patente europea EP0733708 y americana 08/624655. Finalmente, el resultado fue publicado (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2). Para la clonación de apxIa y apxIIIa, al conocerse sus secuencias, se diseñaron cebadores de PCR con mutaciones que creaban dianas de restricción, permitiendo así la amplificación sobre el genoma y posterior clonación en vectores de expresión. Una vez clonados los genes codificantes para las cuatro proteínas se pasó a la producción heteróloga en Escherichia coli. Para ello se utilizaron diversos vectores: pMAL, que generan como producto de expresión una proteína de fusión con la MBP (maltose binding protein) y vectores de la gama pET, con los cuales se ha desarrollado la mayor parte del trabajo. A partir de los extractos obtenidos se procedió a la purificación de los antígenos por cromatografía de afinidad aprovechando fusiones con colas de histidinas. Tras producir y purificar los cuatro antígenos, se procedió a la elaboración de una vacuna experimental. Se desarrollaron tres protocolos de vacunación, estudiándose la inocuidad y efectividad de esa vacuna. Se determinó la respuesta humoral a partir de las muestras de suero obtenidas en los ensayos de vacunación mediante técnicas de transferencia Western-blot y de ELISA indirecto. Utilizando estas muestras y otras bacterías de sueros de campo se ha desarrollado un kit de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos frente a A.pleuropneumoniae. Este kit se comercializa actualmente bajo el nombre de CIVTEST TM SUISAPP.

Autor: PAGANS LISTA SARA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Los factores de transcripción de Drosophila GAGA y Tramtrack (TTK) tienen en común la presencia de un dominio N-terminal de tipo POZ/BTB, un motivo estructural muy conservado que media interacciones proteína-proteína específicas. En este trabajo se ha demostrado que las isoformas GAGA519 y TTK69 interaciconan tanto in vitro como in vivo, en levaduras y en células de Drosophila Schneider SL2, y que sus dominios POZ/BTB son necesarios y suficientes para que esta interacción tenga lugar. Como muchos promotores de Drosophila, la región reguladora even-skipped (eve) stripe 2 contiene algunos sitios de unión para GAGA y TTK relativamente cercanos. Mediante experimentos de transfección transitoria en células SL2 se ha observado que GAGA activa la transcripción del promotor eve stripe 2 y que TTK inhibe esta activación mediada por GAG. La represión por TTK del promotor eve requiere de la activación por GAGA y depende de la presencia de ambos dominios POZ de TTK y GAGA, sugiriendo que esta represión es una consecuencia de la interacción GAGA-TTK. Interesantemente, el dominio POZ de TTK es capaz de reprimir por sí solo la activación mediada por GAGA, mientras que la región C-terminal de TTK, que contiene la secuencia consenso P-DLS de unión al corepresor dCtBP, no es necesaria para una represión eficiente. Consistente con esas observaciones, la substitución del dominio POZ de GAGA por el POZ de TTK suprime por completo la capacidad transactivadora de GAGA y convierte la proteína de fusión POZ TTK POZGAGA en un represor de la activación de GAGA. Por otro lado, la represión de TTK no parece involucrar un reclutamiento de desacetilasas, ya que la presencia de TSA no tiene ningún efecto sobre la actividad de TTK. Utilizando deleciones del promotor eve stripe 2, se ha observado que la represión por TTK pueden tener lugar en ausencia de lugares TTK al promotor, indicando que esta represión no requiere unión directa de TTK al DNA. En este sentido, los ensayos in vitro EMSA y de footprinting con Dnasa I han mostrado que TTK no interfiere en la unión de GAGA al DNA; contrariamente, los complejos GAGA-TTK parecen tener una mayor afinidad de unión al DNA. En resumen, estas observaciones sugieren un modelo en el que la represión por TTK de la activación mediada por GAGA implica una interacción directa GAGA-TTK la cuál facilita el reclutamiento de TTK al promotor. Sin embargo, nuestros resultados no permiten diferenciar si esta represión es consecuencia de una interferencia en la activación mediada por GAGA o a un reclutamiento activo de corepresores.

Autor: REBOLLO CASAS MONTSERRAT.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Se han estudiado las mutaciones relacionadas con la resistencia a quinolonas en aislados de escherichia coli, tanto de origen animal como humano, y de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium de origen animal, a través del desarrollo y la aplicación de diferentes metodologías. Asimismo, se ha determinado la susceptibilidad de las cepas frente a las quinolonas y a otros antimicrobianos y se ha determinado su grado de similitud relativa. Par estudiar las mutaciones presentes en los genes gyrA y parC de E.coli se ha puesto a punto un método de hibridación de colonias con sondas específicas, marcadas con 33P. Previamente, se ha secuenciado la región donde se han descrito las principales mutaciones relacionadas con la resistencia a quinolonas de los dos genes (QRDR) de algunas de las cepas estudiadas, para conocer las diferentes mutaciones que pueden tener lugar y diseñar las sondas específicas. Estos experimetnos de secuenciación han servido para determinar, tal y como está descrito, que los princiaples codones del gen gyrA donde se localizan las mutaciones son la Ser83 y el Asp87. En los dos codones se han detectado diversas de las mutaciones ya conocidas, a excepción del cambio Asp87 - Ala, no descrito hasta el momento. Por lo que se refiere al gen parC, se ha determinado también que los principales codones se localizan las mutaciones son la Ser80 y el Glu84. En las dos posiciones se han encontrado mutaciones ya conocidas, así como los dos codones codificantes de la Ser80 (AGC y AGT). Mediante el método puesto a punto y secuenciación, se han podido clasificar las cepas de E.coli en ocho grupos mutaciones. Se ha observado que el porcentaje de mutaciones simples en la Ser 83 del gen gyrA es muy similar en las cepas de los dos origenes, animal y humano, mientras que se encuentra un porcentaje más alta de dobles mutantes entre los aislados de animales que entre los de humanos. En cambio, la acumulación de tres o cuatro mutaciones en una cepa es significativamente más elevada entre los aislados de humanos que en los de animales. También se ha visto que las cepas con un número más elevado de mutaciones y, por tanto, altamente resistentes a las quinolonas también son, en porcentajes, más resistenes a otros antimicrobianos diferentes. Este fenómeno parece tener mucha más incidencia en los aislados de humanos que en los de animales. Así, el 55% de los aislados de animales presentan unos valores de CMOs frente a las quinolonas que se pueden asociar a las mutaciones detectadas en los gens gyrA y parC, mientras que el 71% de los aislados de humanos, a más a más de las mutaciones identificadas en estos genes, deben tener otros mecanismos de resistencia a quinolonas. Para estudiar las mutaciones presentes en el gen gyrA de S.typhimurium se ha puesto también a punto un método de hibridación de colonias con una sonda específica, marcada con 33P, a más de un método de PCR a tiempo real con sondas FRET. Las cepas de S.typhimurium Nal R de origen animal estudiadas son mayoritariamente sensibles a las fluoroquinolonas y presentan una única mutación en la región QRDR del gen gyrA, no habiéndose encontrado dobles mutantes. Esta mutación puede localizarse en la Ser83 o en el Asp87, tal y como está descrito , y las cuatro mutaciones detectadas por secuenciación corresponden a cambios ya conocidos. El nivel de susceptibilidad a las fluoroquinolonas que presentan las cepas de S.typhimurium estudiadas se corresponde con el hecho que presenten una única mutación en el gen gyrA, ya que se ha descrito que una mutación en ese gen, tanto en la Ser83 como en el Asp87, confiere un fenotipo de resistencia al ácido nalidíxico y de susceptibilidad reducida a las quinolonas fluoradas. Aunque las cepas de E.coli aisladas de humanos parecen estar menos relacionadas entre ellas que las de animales, se ha observado un elevado grado de relación entre las diferentes cepas estudiadas. Tanto las de E.coli como las de S.typhimurium altamente relacionadas no tan sólo suelen tner en cómun la procedencia y el año de aislamiento, si no también muestran las mismas características por lo que hace referencia a la presencia de mutaciones, susceptibilidad a quinolonas y patrón de resistencia a diferentes antimicrobianos. Según los datos obtenidos, la acumulación de mutaciones en los genes gyrA y parC de E.coli o la presencia de otros mecanismos de resistencia a quinolonas no parece tener una elevada incidencia entre los aislados de animales, sobretodo si se compara con la de los aislados clínicos estudiados. Igualmente, las cepas de S.typhimurium NalR de animales no presentan una acumulación de mutaciones y son mayoritariamente sensibles a las fluoroquinolonas.

Autor: PIEDRA BUENO JOSE ANTONIO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La E-Cadherina y sus proteínas citosólicas asociadas (* y beta-Cateninas) forman parte de las uniones adherentes. También la *-caterina. La alferación de la adhesión celular mediada por cadherina, se ha asociado con la fosforilación en trosilias de beta- *-cateninas. La quinasa Src fosforila la trosina 654 de beta-catenina. Otras quinasas como EGFR y su homólogo erbB2 también lo hacen. La modificación de la tirosila 654 comporta la pérdida de interacción entre E-cadherina y beta-catenina. Las quinasas Fc y Fyn fosforilan la tirosina 142 de beta-catenina. La modificación de esta tirosina comporta la pérdida de interacción entre beta-catenina y *-catenina. Fc y Fyn interacciona con pl20-catenina en un complejo multiproteico que implica también otras quinasas. Este papel de la p120 como acopladora de quinasas en las uniones adherentes se da también in vivo.

Autor: MIRAVET DELGADO SUSANA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA BARCELONA - EDFC.

Resumen: Beta-catenina y plakoglobina son proteínas homólogas pertenecientes a la familia de proteínas con repeticiones armadillo. Participan en dos actividades celulares alteradas durante el proceso de tumorigenesis de colon: por un lado forman parte de los complejos de adhesión celular y por otro, pueden actuar como activadores transcripcionales. El objetivo principal de esta tesis ha consistido en caracterizar las analogías y diferencias en la regulación de la interacción de beta-catenina y plakoglobina tanto con el factor de transcripción Tcf-4 como con proteínas constituyentes de las uniones adherentes (E-cadherina, alfa-catenina) y de los desmosomas (Desmogleína, desmoplakina). Se ha determinado que el factor de transcripción Tcf-4 presenta dos zonas de interacción diferentes para beta-catenina y plakoglobina y que la unión de esta última proteína al Tcf-4 impide la activación transcripcional del complejo. Asimismo, se ha caracterizado la fosforilación del Tcf-4 por la caseína quinasa CKII y la regulación de la interacción del Tcf-4 con beta-catenina y plakoglobina por esta modificación. Por otra parte se ha identificado los residuos tirosina de beta-catenina fosforilados por las quinasas Src, EGFR y Fer/Flyn y el efecto negativo que producen estas modificaciones en la asociación de beta-catenina con componentes de los complejos de adhesión (E-cadherina y alfa-catenina). Se ha estudiado la fosforilación de plakoglobina por las mismas tirosinas quinasas que fosforilan a beta-catenina y se ha determinado que no fosforilan los residuos homólogos ni producen los mismos efectos sobre la interacción con los componentes de las uniones adherentes y los desmosomas. Se han identificado los residuos tirosina de plakoglobina modificados por Src, Fer y Fyn y se ha caracterizado que su fosforilación por Src o Fer modula la localización de plakoglobina en las uniones adherentes o los desmosomas.

Autor: VALLMITJANA SOLER MIGUEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Resumen: Las beta-glucosidasas son enzimas que hidrolizan enlaces beta-glicosídicos de disacáridos o oligosacáridos, con una baja regioespecificidad de forma que reconocen específicamente el extremo glucídico no reductor i a su vez tienen baja especificidad por el extremo reductor o aglicón. El mecanismo catalítico es un doble desplazamiento con catálisis ácido/base i formación de un intermediario glicosil-enzima; la hidrólisis se produce con retención de la configuración del carbono anomérico. En este trabajo se ha estudiado la beta-glucosidasa Bgl3 de Streptomyces sp. (ATCC 11238) clonada anteriormente en el grupo, se ha mejorado la producción del enzima poniéndolo bajo control del promotor de la T7-RNA polimerasa, i se ha mejorado el proceso de purificación con la fusión a una cola de histidinas a su extremo N-terminal que permite la obtención de proteína pura mediante un solo paso de purificación (columna de afinidad). La proteína obtenida ha permitido la obtención de la estructura tridimensional del enzima por cristalografía de rayos X. Se ha caracterizado la actividad catalítica de la Bgl3 con dos baterías de substratos, una que variaba el extremo no reductor para determinar la especificidad del subseti -1, i el otro que variaba las características del aglicón con el objetivo de establecer una relación lineal de energía libre (análisis de Hammett). El estudio de la dependencia de la actividad respecto a la temperatura i al pH, ha permitido dilucidar aspectos del mecanismo catalítico como la energía de activación i la variación de los pKa de los residuos catalíticos esenciales. Por mutagénesis dirigida se han obtenido enzimas sin alguno de los dos residuos catalíticos esenciales, i se ha comprobado la reducción de la actividad catalítica. Se ha comprobado el papel de cada uno de estos residuos en la catálisis por rescate químico de la actividad de los mutantes con la adición de un nucleófilo externo, i posterior identificación por Resonancia Magnética Nuclear de los productos formados. Finalmente se ha avanzado en el estudio de la especificidad de substrato respecto al aglicón mediante mutagénesis dirigida i caracterización cinética de los mutantes sobre una posición conservada del centro activo: la cisteina 181 de la Bgl3.

Autor: PARADA RICART ESTHER.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON.

Autor: MALAGELADA GRAU CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La isquemia cerebral se caracteriza por una interrupción del flujo sanguíneo, que lleva a una muerte neuronal de la zona afectada. Los mecanismos celulares y moleculares de la muerte neuronal inducida por isquemia se desconocen pero se ha propuesto que la depleción de energía y la pérdida de los gradientes iónicos provocarían una liberación de glutamato, qu es el neurotransmisor excitatorio mayoritario en el sistema nervioso central de los mamíferos, por revisión de la función de sus recaptadores de membrana. La acumulación de glutamato comporta una sobreexcitación de sus receptores sinápticos y desencadena una muerte neuronal fulminante. Tradicionalmente, esta muerte celular se ha descrito como una muerte por necrosis, pero en los últimos años, se ha descrito la existencia de otro componente de muerte, más retardado, llamado apoptosis. En el presente trabajo se ha establecido un modelo de isquemia in vitro por deprivación de oxígeno y glucosa (OGC), en cultivos primarios de neuronas corticales de rata. El modelo ha permitido estudiar los mecanismos que se activan en una isquemia cerebral y que llevan a una muerte neuronal la cual va mediada, principalmente, por el glutamato vía receptor NMDA. Se ha podido caracterizar y cuantificar la necrosis y la apoptosis inducida por exposición a I'OGD. Además, la aparición de la apoptosis correlaciona con la activación de la caspasa 3, uno de los marcadores más relevantes de la muerte celular programada, y también de las caspasas 7 y 9. La exposición ala OGD también induce la liberación de TNFalfa, la síntesis de ceramida de novo y la translocación a núcleo del factor de trascripción NFkB, los cuales median parte de la activación de la caspasa 3 y por lo tanto parte de la apoptosis isquémica. Por otra parte, el modelo ofrece la posibilidad de controlar la ventana temporal de intervención farmacológica, y permite determinar la efectividad de los fármacos antes, durante y después de la OGD. Cuando se estudió el sistema histaminérgico en la OGD se concluyó que los antagonistas de los receptores H2 de la histamina, y principalmente la ranitidina, disminuyen la muerte celular inducida por OGD mayoritariamente reduciendo la activación de la caspasa 3. Su efecto neuroprotector podía observarse administrando el antagonista H2 hasta tres y seis horas después de la exposición al a OGD y sin pretratamiento. Todos estos resultados sirvieron para validar el modelo de isquemia in vitro para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la isquemia cerebral.

Autor: ISERN MARIN JOAN.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Esta tesis se centra básicamente en el estudio y caracterización de tres genes murinos que comparten la característica de expresarse y estar regulados por los andrógenos en el riñón, los cuales estimulan su expresión renal a nivel de mRNA. El primero de ellos corresponde al gen Cyp4b1 -representante de los citocromos P450, enzimas implicadas en el metabolismo oxidativo tanto de sustancias endógenas como en la detoxificación de fármacos y xenobióticos. Se ha estudiado su expresión en varios tejidos murinos y, mediante hibridación in situ, localizado la distribución de sus transcritos en el riñón. En este último tejido, también se ha investigado el efecto sobre su expresión de las hormonas andrógenas, utilizando ratones castrados y control de diferentes cepas. A nivel genómico, ha sido clonado el gen del Cyp4b 1 así como las dos primeras kb de promotor, determinándose su secuencia, su organización genómica y las intersecciones exón/intrón correspondientes. Con el fragmento de promotor aislado han sido preparadas diversas construcciones reporteras, con las cuales se han realizado ensayos de transfección transitoria para evaluar los posibles elementos reguladores en el promotor, tanto a nivel de expresión basal en líneas renales, como a nivel de inducción y capacidad de respuesta androgénica. Los dos genes restantes descritos -Oatp1 y Oatp-d/MJAM- eran previamente desconocidos, por lo cual se ha clonado y secuenciado su cDNA entero a partir de riñón. Uno vez identificados los correspondientes cDNAs, se ha visto que ambos correspondían a miembros de la familia murina de los transportadores de aniones orgánicos, OATPs, proteínas poliespecíficas de transporte con un amplio abanico de sustratos que pueden incluir desde sales biliares, esteroides conjudos y eicosanoides, hasta drogas y xenobióticos orgánicos. Al igual que para el Cyp4b1, se ha estudiado su distribución tisular de ambos genes a nivel de mensajero, y también la dependencia androgénica de su expresión renal en diferentes cepas murinas. Para Oatp1 en particular, se ha caracterizado a nivel funcional de manera preliminar, determinando su afinidad por algunos sustratos mediante ensayos de transporte en oocitos de Xenopus laevis. A nivel genómico, ha sido identificada tentativamente la secuencia de la región 5' adyacente de su gen. Finalmente, por Oatp-d (previamente denominado MJAM), se han realizado varios estudios computacionales comparativos entre roedores y humanos, que incluyen el mapage cromosómico del gen en ratones y de su correspondiente ortólogo en ratas. El posicionamiento de los genes Oatp-d de rata y OATP-D -su ortólogo humano- en sendas regiones genómicas donde se han descritos posibles loci genéticos con posible influencia sobre la hipertensión, han hecho que exploráramos a nivel preliminar una posible implicación de este gen en los procesos mencionados. Dichos estudios se han abordado a través de la comparación de la secuencias de los cDNA correspondientes (y también su expresión renal) entre Oatp-de en ratas de las cepas WKY (normotensas) y SHR (hipertensas genéticas). El presente trabajo debería englobarse dentro del marco general de una aproximación a los mecanismos moleculares específicos reguladores de la expresión génica renal, por parte de los andrógenos.

Autor: ALCALÁ MORALES PILAR LUCÍA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Una de las aplicaciones de la ingeniería de proteínas es el desarrollo de biosensores moleculares como herramientas para la detección de sustancias mediante la interacción de una macromolécula y su ligando. De acuerdo a este principio se han generado una serie de prototipos de biosensores enzimáticos que ha surgido a partir de la ingeniería de proteínas tales como la fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, beta-lactamasa y la proteína TSP del bacteriófago P22. En todas estas enzimas modificadas se han insertado péptidos inmunoreactivos que actúan como sondas, en aquellos sitios permisivos de las superficies expuestas al solvente de cada enzima. La unión con anticuerpos anti-péptido da como resultado un aumento o una disminución en la actividad enzimática en una forma dependiente del título, lo que a su vez constituye un método simple para la detección y cuantificación de especies moleculares dentro de una mezcal compleja. Hasta el momento los únicos activadores descritos de los biosensores basados en enzimas son los anticuerpos y aún se desconoce el mecanismo por el cual que se produce esta regulación enzimática. El principal objetivo de este trabajo ha sido determinar el tipo de interacciones moleculares que son necesarias para que se lleve a cabo la modulación de la actividad beta-galactosidasa. Especialmente, se pretendía evaluar la necesidad de una unión bivalente para la reactivación y explorar la adaptación de los biosensores beta-galactosidasa a la detección de ligandos monovalente, como antígenos. Se evaluó la interacción molecular entre un péptido RGD recombinante del virus de la fiebre aftosa, expuesto en la superficie de una proteína portadora y sus receptores en la superficie celular. Como ligandos se utilizaron las integrinas alfavbeta3 y alfa5beta1 solubles, así como células BHK21. Los resultados indicaron que ni las integrinas solubles ni aquellas expuestas en las células son capaces de modificar la actividad de sensores enzimáticos que por el contrario son activados por la unión de anticuerpos dirigidos contra el motivo RGD. Adicionalmente, se realizaron otros ensayos para determinar el impacto que podría tener la presentación múltiple de péptidos sobre la eficiencia de la unión a células. En este caso se observó que aumentando el número de segmentos virales mejoraba la unión de las proteínas recombinantes a las células. Se llevó a cabo el clonaje y producción en Escherichia coli de un fragmento scFv recombinante del anticuerpo monoclonal SD6, dirigido contra un péptido vírico antigénico, expuesto en un modelo de biosensore basado en la enzima beta-galactosidasa. Los resultados indicaron que la unión del scFv no causaba ninguna respuesta enzimática mientras que la presencia simultánea del scFv y del fragmento del SD6 daba como resultados una respuesta eficiente pero no aditiva del sensor, cuya actividad enzimática aumentaba hasta en un 200%. Este efecto cooperativo que también se pudo observar cuando se combinaban el scFv y el fragmento Fab de un anticuerpo no homólogo denominado 4C4, nos permitió postular que la reactivación enzimática requiere contactos múltiples y probablemente heterogéneos entre el sensor molecular y los analitos, y que no es necesaria la interacción con ligandos moleculares bivalentes para que se produzca dicha modulación de actividad. Por último, se evaluaron diferentes sitios tolerantes de la enzima beta-galactosidasa para generar enzimas híbridas funcionales que presentaran el fragmento recombinante scFv del anticuerpo monoclonal SD6. La caracterización de las proteínas híbridas obtenidas indicó que al fusionar dicho fragmento al extermo amino-terminal de la enzima, la proteína era estable, mantenía su actividad específica e interactuaba con el antígeno hacia el cual estaba dirigido el fragmento de anticuerpo fusionado. Además la quimera scFv-enzima era activa aún cuando se encontraba unida al antígeno y por lo tanto, se demostró su utilidad como reactivo en ELISA.

Autor: ROMERO PEREZ AMARILIS NATALIA.
Año: 2002.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El objetivo general de la Tesis se enmarca en la búsqueda de secuencias génicas implicadas en la producción de xilanasas por el actinomiceto Streptomyces lividans. De esta forma se pretende disponer en el futuro de cepas sobreproductoras de dichas enzimas, o que sean capaces de producir diferentes combinaciones de las mismas, de acuerdo con la aplicación a la que se destinen. Para la consecución del objetivo propuesto, se ha construido una colección de mutantes mediante mutagénesis por transposición en S. lividans, detectándose las posibles alteraciones en la producción de xilanasas al crecer las cepas en medios sólidos que contenían xilano o xilano más glucosa como fuentes de carbono. Una vez seleccionados cinco mutantes, se cuantificó la producción de la actividad xilanasa en medios líquidos, y se analizó la composición del complejo xilanolítico mediante zimogramas. Por último, se ha pretendido caracterizar, mediante su clonaje, secuenciación y análisis en las bases de datos, las secuencias ADN genómico que flanquean a las inserciones del transposón en las cepas mutantes. Para el clonaje de las secuencias flanqueantes se han utilizado técnicas basadas en restricciones del ADN genómicos, que al incluir dichas secuencias y parte del transposón que codifica para resistencias a antibióticos, permitiera su clonaje mediante una selección adecuada. Otra de las técnicas empleadas ha sido la PCR mediada por ligación. De esta última forma, se ha caracterizado en uno de los mutantes la zona de ADN genómico donde se ha insertado el transposón, alterando la producción de xilanasas. Esta zona incluye una proteína integral de membrana y una proteína reguladora. Este tipo de proteínas son similares a otras descritas en diferentes microorganismos, y pueden actuar regulando la secreción de enzimas extracelulares. Es la primera vez que se describen dichas proteínas en Streptomyces.

Autor: ALVAREZ PÉREZ BEATRIZ.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La progresión del ciclo celular es un proceso finamente controlado por señales intra y extracelulares. Las condiciones del entorno de la célula, tales como la presencia de factores de crecimiento, activan vías de señalización temprana que promueven la entrada en ciclo celular. Una vez que las células progresan a través del punto de restricción, se hacen independientes de factores de crecimiento y controlan la progresión del ciclo celular de manera endógena. La PI 3 quinasa de clase I (PI3K) es un heterodímero compuesto por una subunidad reguladora, p85,y una subunidad catalítica, p110, que regula varias respuestas celulares, tales como división celular y supervivencia. La vía de señalización mediada por PI3K y su efector, la quinasa PKB, debe activarse en la fase G1 del ciclo celular, para inactivar los factores de transcripción de la familia de Forkhead, FOXO, y permitir la entrada en ciclo. A lo largo de este trabajo mostramos que es necesaria la subsecuente atenuación de la vía PI3K/PKB para permitir la activación de FOXO durante la fase G2 del ciclo celular. La actividad de estos factores de transcripción en G2 controla la terminación del ciclo celular, de manera que la interferencia de la actividad FOXO mediante activación de PI3K/PKB o mediante la expresión de un mutante dominante negativo, incude un acúmulo de células en las fases G2 y M, una citoquinesis defectiva y una transición lenta de las células de fase M a G1 en el ciclo celular. Nosotros demostramos que los factores FOXO regulan la expresión de genes mitóticos, como la ciclina B y la quinasa Plk Nuestros resultados apoyan el importante papel de los factores de transcripción de la familia Forkhead en el control de la progresión del ciclo celular en mamíferos, y sugieren que la correcta ejecución del programa mitótico depende de la inactivación de PI3K/PKB y la consecuente inducción de la actividad transcripcional de los factores Forkhead. Además de la expresión de ciclinas, la división celular requiere que las células incrementen su masa de madera coordinada con la progresión del ciclo celular. Esto asegura que el tamaño y la composición macromolecular de la célula permanece constante, independientemente de cual se la tasa de proliferación celular. Con este fin, los factores de crecimiento también activan cascadas de señalización que promueven el incremento de la masa celular. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el mecanismo que controla la regulación coordinada de crecimiento celular y progresión del ciclo celular. Nosotros investigamos la contribución de PI3K al crecimiento celular durante el ciclo celular. Las señales derivadas de la vía de señalización de PI3K/PKB afectan a la activación de la quinasa p70S6K y del sustrato de rapamicina en mamíferos, mTOR, enzimas implicados en el control del crecimiento celular. Así, mutaciones que inducen un incremento de la actividad de PI3K aumentan la tasa de síntesis proteica, mientras que mutaciones que la reducen atenúan el crecimiento celular. Estas modificaciones en la tasa de crecimiento parecen estar coordinadas en cambios en la cinética de progresión del ciclo celular, de manera que variaciones transitorias en la activación de PI3K modifican el tiempo de duplicación de los cultivos, sin alterar el tamaño celular. Además, la expresión de un mutante de PI3K con actividad constitutiva induce un incremento en el tamaño celular. Además, la expresión de un mutante de PI3K con actividad constitutiva induce un incremento en el tamaño celular, sugiriendo que la correcta coordinación entre tasa de síntesis proteica y progresión del ciclo celular requiere que la actividad de PI3K sea transitoria. Estas observaciones apoyan la función de PI3K en la regulación coordinada de la tasa de crecimiento celular y la progresión del ciclo celular. Finalmente, nuestro trabajo se ha centrado en la caracterización del mecanismo molecular por el que el complejo TSC inhibe el crecimiento celular y su posible relación con el complejo multiproteico en el que participa la subunidad reguladora de PI3K, p85, implicado en la actividad de la quinasa mTOR.

Autor: GRAU SIMÓN RAQUEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La angiogénesis es un proceso esencial para el crecimiento y la expansión de un tumor. Esta, a su vez depende de diversos factores proangiogénicos secretados por las células tumorales. Entre ellos cabe destacar al factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), ya que es un potente agente mitógeno específico de células endoteliales, y a la ciclooxigenasa-2 (COX-2) cuya contribución a la angiogénesis tumoral es la inducción de la síntesis de prostanoides, que a su vez estimulan la expresión de factores proangiogénicos. La COX-2 también puede generar precursores de un grupo particular de prostaglandinas, denominadas ciclopentenonas, caracterizadas por sus actividades antitiinflamatorias y antitumorales. Una de ellas, la 15-desoxi-delta12,14 -prostaglandina J2 (15d-PGJ2) es capaz de reprimir la expresión de genes proinflamatorios como el de la COX-2. Nuestros resultados indican que, en líneas celulares de carcinoma de colon, la ciclopentenona 15d-PGJ2 inhibió la expresión de COX-2 y VEGF a nivel transcripcional. Los factores de transcripción AP-1 y NFAT están implicados en la regulación transcripcional de ambos genes, de manera que los efectos inhibidores sobre COX-2 y VEGF podrían deberse a las alteraciones observadas sobre las rutas de activación de AP-1 y NFAT, por parte de 15d-PGJ2. Además esta inhibición transcripcional fue independiente del receptor nuclear PPARgamma. Algunas de las acciones de 15d-PGJ2 se deben a la presencia de un grupo carbonilo reactivo, presente en el anillo ciclopenteno. Se ha descrito que a través de él, 15d-PGJ2 se une covalentemente a grupos tiol presentes en la forma reducida del glutation celular (GSH) o en residuos de cisteína de proteínas celulares, modificando así su función. También se ha sugerido que las prostaglandinas ciclopentenonas pueden inducir una respuesta estrés celular. Nuestros resultados indican que 15d-PGJ2 indujo un estrés oxidativo intracelular que fue prevenido en presencia de N-acetilcisteína (NAC). De manera similar NAC revirtió los efectos inhibidores de 15d-PGJ2 sobre AP-1, así como sobre los promotores de COX-2 y VEGF. El conjunto de estos resultados sugiere la implicación de un mecanismo sensible al estado redox intracelular en las acciones de 15d-PGJ2. Así, dada la importancia de COX-2 y VEGF en la progresión del tumor, el efecto inhibidor observado por parte de 15d-PGJ2, sobre la inducción transcripcional de ambos genes, podría contribuir a los efectos antitumorales de esta ciclopentenona.

Autor: GOYA AYERRA IÑIGO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: El trabajo experimental que se presenta en esta memoria versa acerca del mundo de las quimioquinas y sus receptores, y sobre la importancia que éstos tienen en la actividad leucocitaria. Nace, concretamente, de la caracterización que Zaballos et al., hicieron del receptor de quimioquinas inicialmente denominado CKR-L1 y que posteriormente se ha dado en llamar hCCR8. En primer lugar, y habiendo establecido que la quimioquina hCCL1 interacciona con este receptor de forma específica, se clonó su homólogo en ratón, mCCR8, señalando a mCCL1 como su ligando, y situando la producción de su RNA mensajero en células de timo, nódulos linfáticos y bazo. Se obtuvo, asimismo, un anticuerpo monoclonal anti-mCCR8 con el que se advirtió, mediante citometría de flujo, la presencia del receptor en la superficie de timocitos CD4- CD8- (DN), así como en la de aquellos con fenotipo CD4+ (SP) que aún no han alcanzado su madurez. También pudo concluirse que las células CD4- CD8- (DN) CCR8+ de timo son mayoritariamente TCRgama*+ y en menor medida TCRgama*+. Fue a través de experimentos de RT-PCR cuantitativa llevados a cabo sobre ratones Wild-Type y de diversos análisis de citometría efectuados con animales RAG2(KO) como se clarificó la expresión de CCR8 dentro de dicho comportamiento CD4- CD8- (DN) TCRgama*-, localizándose éta tanto en la subpoblación CD44+ CD25- (DN1) como en la CD44- CD25- (DN4). Por RT-PCR se percibió además la prsencia de CCR8 en células Lin- Sca-1+ de médula ósea. Del mismo modo, se corroboró, en términos de proteína, el dato ya defenido previamente en la literatura que habla del incremento transitotorio que, en linfocitos Th2, experimentan los niveles de mRNA de CCR8 en respuesta a activación, viéndose que se produce el mismo efecto en timocitos CD4- CD8- (DN) y CD4+ (SP) tras la estimulación del pre-TCR y el TCR respectivamente. Por otra parte, y con el ánimo de desentrañar la actividad biológica atribuible a este receptor de quimioquinas, se generaron ratones Knock-Out para CCR8. Estos animales, que en un análisis general no presentaron alteraciones significativas en timo, nódulos linfáticos, bazo y sangre periférica, mostraron, no obstante, una leve desorganización en la región subcapsular tímica, lo que parece poner de manifiesto la participación de CCR8 en el descubrimiento de los timocitos más inmaduros. Por último, queriendo caracterizar el posible papel que este receptor juega en linfocitos Th2, se estudió el comportamiento de ratones CCR8(KO) y CCR8(WT) ante diferentes modelos de una patología que cursa con la participación de este tipo de leucocitos como es el asma, llegando a concluirse que en ningúnn caso la falta de CCR8 afecta un modo alguno a su desarrollo.

Autor: GARCÍA SILVA SUSANA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Tanto la hormona tiroidea (T3) como el oncogén ras juegan un importante papel en procesos de crecimiento, desarrollo y diferenciación. En esta tesis hemos demostrado la existencia de un "cross-talk" transcripcional entre las hormonas tiroideas y el oncogén ras. En células de neuroblastoma N2a-beta que expresan de forma estable la isoforma beta del receptor de T3 (TR), T3 bloquea la proliferación inducida por Ras oncogénico. Una de las dianas principales de los efectos proliferativos y transformantes de Ras es la ciclina D1. T3 reduce fuertemente la expresión de esta ciclina inducida por Ras, al mismo tiempo que incrementa los niveles de los inhibidores de complejos ciclina-CDK p21 y p27. Ras activa la transcripción de la ciclina D1 a través de la activación de los factores CREB y ATF-2 que se unen a un elemento de respuesta a AMPc (CRE) localizado en el promtor proximal. Esta activación ocurre vía Raf/MEK/ERKs. T3 bloquea la estimulación del promotor de la ciclina D1 inducida por Ras, Raf o ERK, pero no por PI3K o Rsk2, una diana de las ERKs. La represión por T3 no está mediada la unión del receptor a un elemento de respuesta negativo (TRE) sino a través del antagonismo transcripcional con el sitio CRE por represión de la actividad transcripcional de CREB y ATF-2. T3 también bloque la actividad quinasa de Rsk2 inducida por Ras, sugiriendo que la inhibición de esta quinasa podría estar implicada en la represión que la hormona ejerce sobre la respuesta del promotor a Ras oncogénico. El antagonismo transcripcional entre Ras y TR se observa también en otras células tumorales de rata, ratón y humano y no es un fenómeno mutuo puesto que el oncogén no inhibe sino que potencia la transcripción mediada por T3. En fibroblastos NIH3T3, la hormona bloquea la transformación inducida por Ras oncogénico cuando se coexpresa con TR. T3 también inhibe la transformación mediada por v-Src, un activador de la vía Ras/MAPKs. Asimismo, TR bloquea la formación de tumores en ratones inmunodeprimidos inoculados con fibroblastos que coexpresan el receptor y el oncogén ras, siendo los efectos anti-tumorales de la isoforma beta del receptor son más potentes que los de la isoforma alfa. En conjunto, nuestros resultados muestran la existencia de un antagonismo entre la hormona tiroidea y la señalización mediada por el oncogén ras que parece tener un papel relevante en procesos de crecimiento, transformación celular y tumorogénesis.

Autor: GARCÍA DOMINGO DAVID.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La apoptosis o muerte celular programada es un fenómeno fisiológico de crucial importancia para el normal desarrollo y homeostasis de los organismos multicelulares. El gen DIO-1 (death inducer-obliterator 1) fue identificado por nosotros en la línea celular pre-BI WOL-1, mediante la técnica de clonaje diferencial de genes conocida como "Differential Display PCR", tras el estímulo apoptótico de deprivación de IL-7. Su secuencia proteica presenta homologías con dominios de activación transcripcional, una secuencia de localización nuclear de localización nuclear bipartita, un dedo de zinc tipo PHD y una región rica en lisinas en el extremo carboxilo terminal. Tras ciertos estímulos apoptóticos apropiados, sus niveles de ARNm y proteína aumentan muy poco tiempo después de la presencia del estímulo, observándose que para ello precisa de su translocación nuclear. Su sobreexpresión en diferentes líneas celulares, así como en primordios de extremidades de pollo, indujo apoptosis, inhibible por Bcl-2 o z-VAD-fmk. La generación de un mutante carente de las señas de localización nuclear permitió descubrir su incapacidad para migrar al núcleo tras el estímulo apoptótico, incluso en condiciones que provocaron la translocación y aumento de los niveles de DIO-1. Puesto que la muerte inducida por DIO-1 era inhibible por inhibidores de caspasas, quisimos averiguar la relación entre DIO-1 y las caspasas. Para ello, analizamos los niveles de las procaspasas 3 y 9 y de sus actividades tras la expresión de DIO-1 y del mutante sin NLS en células FL5.12. Encontramos que DIO-1 aumenta los niveles de dichas procaspasas y las actividades de sus formas activas, mientras que el mutante fue incapaz de producir este efecto, lo que sugiere que DIO-1 precisa de su translocación al núcleo para aumentar los niveles de caspasas. Además, células FL5.12 que expresaban establemente el mutante se vieron protegidas frente a la apoptosis inducida por ausencia de IL-3, actuando de este modo como un dominante negativo que bloquea la señal de muerte transmitida por el gen DIO-1 endógeno. Estos resultados indican que DIO-1 ostenta un papel muy relevante en la regulación de los estadios más tempranos de la muerte celular.