BIOQUIMICA MOLECULAR, 13

Autor: GARCÍA ORTIZ M.JESÚS .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UAM.

Resumen: La DNA polimerasa es una nueva proteína implicada potencialmente en la reparación del DNA por escisión de base, BER. Ante la alta similitud de la secuencia de aminoácidos con la DNA polimerasa beta, proteína implicada en la reparación del DNA, y la existencia de un ratón deficiente en ella que moría a día 18,5 post-coito, nos planteamos el estudiar la expresión de Pol en el ratón adulto, el embrión, y la obtención del ratón deficiente en Pol. Los datos conseguidos han demostrado la expresión de Pol en testículos, cerebelo, hígado y glándula vesiculares en el ratón adulto. Así mismo hemos observado una diferencia de aparición del mRNA de Pol respecto al de Pol beta en los testículos de los ratones prepúberes. El mRNA de Pol comienza a aumentar alrededor del día 16 post-natal (pn), con picos a día 18 y 22 pn manteniéndose más o menos al mismo nivel hasta el período adulto. Estos niveles son aproximadamente un 90-100% de los que exhibe Pol beta. A día 22 pn el mRNA de Pol beta aumenta hasta llegar a los mismos niveles que Pol. Los ratones deficientes son viables, a diferencia de los de Pol beta y en concidiones fisiológicas no presentan anomalías sistémicas. Este hecho es muy interesante ya que nos permitió realizar diferentes estudios en condiciones de daño o estrés. En estos ratones deficientes hemos observado una fertilidad peor cuando los progenitores utilizados eran muy jóvenes (8 semanas). Esto puede ser debido a que el patrón de maduración meiótica de estos ratones no es el mismo que en los ratones silvestres, apareciendo las células haploides en los ratones deficients bastante antes que en los silvestres. La proteína Pol también se expresa con el mismo patrón en los testículos de ratones adultos que su m RNA, aunque debe existir una fuerte regulación post-transcripcional ya que los análisis por western blotting revelaron que la cantidad de proteína total en testículos, cerebro y líneas celulares murinas (NIH-3T3) y humanas (HeLa) es muy leve y sólo se consigue observar con unas condiciones específicas. El sistema linfo-hematopoyética de estos ratones deficientes presentan una recuperación más rápida tras un tratamiento mieloablativo (5-FU). Esta droga se intercala en el DNA y puede ser eliminado por la BER, por lo que sugerimos un papel de Pol en este proceso, apoyando los datos bioquímicos obtenidos. También las células de la médula ósea presentaban una menor apoptosis. Este hecho también se observó en los túbulos seminíferos de los ratones deficientes adultos, pero no exhibían ninguna anomalía en fertilidad ya que las camadas son similares en número a las silvestres. Suponemos que es debido a que cuando Pol beta llega a los mismos niveles de expresión de Pol, la primera realiza todas las funciones esenciales para la espermiogénesis, por lo que la deficiencia de Pol no repercute en la formación de espermatozoides. Al poseer este modelo murino, pudimos también conseguir un modelo in vitro de deficiencia. Obtuvimos fibroblastos embrionarios murinos, MEF, y los tratamos con lulz ultravioleta, UV. Tras el tratamiento, los MEF deficientes exhibían una mayor resistencia a la luz UV, por lo que pensamos que Pol podría estar implicada en la BER que actúa tras el daño oxidativo ndirecto producido por la luz UV.

Autor: GARCÍA DÍAZ MIGUEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Mediante búsquedas por analogía de secuencia se ha identificado la secuencia de un nuevo gen humano que codifica una nueva ADN polimerasa de la familia X. Esta nueva proteína se ha denominado ADN polimerasa lambda (Pol). La Pol es homóloga a la Pol beta, una ADN polimerasa de reparación que participa en mamíferos en el proceso de reparación por escisión de base. La Pol se expresa en todos los tejidos analizados, con especial preponderancia en testículo. Además, su expresión es exclusivamente nuclear. Se ha llevado a cabo la sobreexpresión de la Pol en células de E.coli, así como su purificación, demostrando que la Pol posee una actividad ADN polimerasa intrínseca. La caracterización de sus características enzimáticas ha permitido comprobar que se trata de un enzima dirigido por el molde y distributivo, aunque su procesividad se incrementa en sustrato de tipo gap, lo que sugiere que estos moldes podrían ser su sustrato fisiológico. La medida de los parámetros cinéticos de la Pol ha permitido demostrar que se trata de un enzima con una elevada afinidad por nucloeótico, sugiriendo un papel de este enzima en situaciones en que los niveles de precursores nucleotídicos se encuentren disminuidos. Además de su actividad de polimerización, la Pol posee un actividad desoxirribosa fosfato liasa (dRP liasa), lo que sugiere su participación en el proceso de reparación por escisión de base. De hecho, es posible reconstruir la reacción de reparación de un uracilo in vitro empleando Pol. Se han llevado a cabo medidas de la fidelidad de síntesis de la Pol humana. En cuanto a las sustituciones de base, se trata de un enzima con una fidelidad modesta, algo inferior a la de la Pol beta. Sin embargo, la Pol comete con una frecuencia extraordinaria errores de deleción: se trata de la ADN polimerasa caracterizada hasta el momento con la mayor frecuencia de comisión de errores de deleción. El análisis de los errores de deleción cometidos por la Pol sugiere además alguna peculiaridad en el centro activo del enzima que justifique su elevada infidelidad. Por último, se han llevado a cabo pruebas de cristalización que han permitido la obtención de cristales del dominio de polimerización de la Pol acomplejado con ADN. Estos cristales se emplearán en el futuro para determinar la estructura cristalográfica de la Pol.

Autor: BERMEJO HERRERO M. MERCEDES.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CNM. INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: CXCR4 y CCR5 son los principales correceptores del VIH. A pesar de que CXCR4 está muy distribuido, los virus R5 predominan en las fases tempranas de la infección. Se ha demostrado que las células epiteliales producen la quimiocina SDF-1, la cual regula negativamente la expresión de CXCR4 en las células de alrededor. Esta es probablemente la razón por la que las células de Langerhans y las células dendríticas de la piel expresan CXCR4 a nivel intracelular. Esto explicaría la transmisión preferencial de cepas R5 a través del contacto sexual, sin embargo los mecanismos involucrados en la resistencia a la infección de los linfocitos por cepas X4 inmediatamente después de la transmisión, incluso cuando ocurre a través de la ruta intravenosa no están totalmente comprendidos. En particular hay estudios controvertidos respecto a la expresión de CXCR4 y a la activación. Para intentar comprender los mecanismos de propagación de cepas X4 en linfocitos nosotros estudiamos la expresión de CXCR4 en linfocitos recién aislados sin activar manteniéndolos en cultivo y su regulación por diferentes estímulos. Como SDF-1 regula negativamente la expresión de CXCR4, estudiamos la expresión de esta quimiocina en diferentes órganos linfoides y cultivos de células dendríticas in vitro. Viendo que CXCR4 está presente en una localización intracelular en la mayoría de los linfocitos recién aislados, y se localizan en la superficie sólo después de mantenerlos unas horas en cultivo. La activación 1 con anti-CD3 y PHA regulan negativamente la expresión de CXCR4 en la superficie celular. Las células dendríticas situadas en la zona parafolicular, células epiteliales de las criptas y subepiteliales por debajo de las criptas con morfología de células dendríticas expresan SDF-1. Las células foliculares dendríticas no expresan SDF-1. El SDF-1 que expresan las células dendríticas es funcional.

Autor: BERMEJO MORENO RODRIGO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La mayoría de las células somáticas aseguran el mantenimiento de la ploidía por alternancia de la fase S y M del diclo celular, a través de un sistema de licencia que garantiza el inicio de la replicación del ADN una única vez por ciclo. En la fase G1, los factores de licencia cdc6 y cdt1 ensamblan el complejo MCM al origen de replicación. Una vez iniciada la fase S, la fosforilación de cdc6 por CDKs y la expresión de geminina, que inhibe cdtl, mantienen silentes los orígenes de replicación hasta la compleción de la división celular. Algunos tipos celulares, como el megacariocito, escapan a dicho control durante su proceso de diferenciación. En su maduración terminal, el magacariocito alcanza contenidos poliploides de ADN estableciendo ciclos de endorreplicación por entrada repetida en fase S, sin que se produzca división celular intermedia. En este trabajo hemos estudiado el pepal de cdc6 y cdt1 en la endorreplicación megacariocítica, por comparación de dos líneas celulares, HEL y K562, que diferencian hacia megacariocito en respuesta al tratamiento con ésteres de forbol, aunque sólo las HEL establecen ciclos endorreplicativos. Nuestros resultados muestran que estos ciclos se producen con mantenimiento de los niveles nucleares de cdc6 y cdt1, y disminución concomitante de la expresión de geminina. La sobreexpresión de cdc6 es capaz de llevar a las células HEL proliferantes a ciclos de endorreplicación, mientras que la expresión ectópica de geminina impide la poliplidización de estas células tras su tratamiento con TPA. Sin embargo, sólo la expresión de cdc6 está diferencialmente regulada, a través de mecanismos transcripcionales y postraduccionales, en las células endomitóticas. Los factores de transcripción GATA-1 y E2A parecen estar implicados en la inducción de la transcripción de cdc6, a través de una región localizada a 3 Kb en 5' por encima del promotor del gen, y que actúa como amplificador específico durante la diferenciación. Por otra parte, la sobreexpresión de ciclina E en células K562, que induce su poliploidización en respuesta al estímulo diferenciador, estabiliza la proteína en un proceso dependiente de su fosforilación por CDKs. Nuestros resultados sugieren un papel central para cdc6 en la endomitosis megacariocítica, así como la existencia de mecanismos inherentes a la diferenciación que garantizan su expresión durante este proceso.

Autor: CABELLO FERNÁNDEZ GERTRUDIS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se ha estudiado el efecto de los insecticidas organofosforados (IOFs), paratión y malatión, sobre la proliferación y posible transformación de células de la glándula mamaria. Estos compuestos son de amplio uso doméstico contra parásitos, y en agricultura se utilizan para el control de plagas. Paratión y malatión actúan inhibiendo la acetilcolinesterasa (AcE) y también ocupando los receptores colinérgicos muscarínicos. Los resultados obtenidos muestran que en ratas Sprague-Dawley tratadas durante cinco días con concentraciones de paratión (250 ug/100g p.c.) y malatión (17 mg/100 g p.c.) que no alteran la viabilidad de los animales, no afectan al desarrollo de la glándula mamaria en animales de 21 días de edad. Sin embargo, estos mismos tratamientos bloquean el proceso normal de diferenciación de brotes terminales (BTs) a alveolares (BAs), en ratas de 44 días de edad. Además, se observa que en los 28 meses posteriores al tratamiento de animales de 44 días de edad aparecen lesiones tumorales en la glándula mamaria, en un porcentaje que varía entre el 8% y el 24%, no observándose alteraciones en animales controles. La naturaleza de las lesiones mamarias se ha analizado mediante observación histológica e inmunohistoquímica, encontrándose que la mayoría de las mismas son hiperplasias, adenomas y fibroadenomas. No obstante, cuatro de las tumoraciones, tres inducidas por malatión y una por paratión, mostraron un resultado diagnóstico correspondiente a carcinomas. Los resultados obtenidos con malatión y paratión con mimetizados por tratamiento con aserina, inhibidor de la AcE, pero se previenen con tratamientos combinados de pesticidas y antropina (antagonista específico de la acetilcolina en el receptor muscarínico). Los estudios in vivo, se han complementado con estudios in vitro en la línea celular MCF-7, donde se observa que tanto el paratión como el malatión, provocan un aumento de la proliferación celular y de la expresión de los marcadores PCNA y p53. Los resultados de los tratamientos in vitro con paratión y malatión, son revertidos por la antropina. Además, malatión induce modificaciones en la distribución de los microfilamentos de actina y en beta-catenina, implicados principalmente en la adhesión y migración celular. Debido a que los pesticidas organofosforados son de amplio uso tanto doméstico como en agricultura, estos estudios podrían ser de utilidad para alertar del peligro potencial del empleo indiscriminado de los organofosforados por sus posibles repercusiones en la Salud Pública.

Autor: BERTRAND ALBERTS SARA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: Las chaperonas moleculares son un grupo de proteínas que facilitan el plegamiento de otras proteínas. Dentro de esta familia de proteínas se encuentran las chaperoninas, que se caracterizan por poseer una cavidad central donde aíslan el sustrato, creando así el entorno adecuado para que la proteína adopte su conformación nativa. Todas las chaperoninas conocidas hasta la fecha han evolucionado a partir de una proteína primitiva, son oligoméricas y comparten una estructura similar, un cilindro compuesto por uno o dos anillos con una cavidad central. En el citoplasma eucariótico se encuentra la chaperonina CCT, que es la más compleja de las chaperoninas conocidas hasta la fecha. Se trata de un oligómero formado por dos anillos octaméricos dispuestos espalda contra espalda que, a diferencia del resto de las chaperoninas, posee 8 subunidades distintas, aunque homólogas dispuestas de forma precisa en dentro del anillo. Las diferencias principales las podemos encontrar en los dominios responsables de la unión con el sustrato. Estas características nos sugiere una especificidad de unión entre el sustrato y CCT, de echo, hasta ahora se han encontrado muy pocos sustratos de esta chaperonina, principalmente las proteínas citoesqueléticas, actina y tubulina. Estudios de microscopia electrónica y procesamiento de imagen revelan que CCT reconoce conformaciones cuasinativas de estas dos proteínas citoesqueléticas y que asiste en su plegamiento gracias a los grandes cambios conformacionales que sufre la chaperonina por la interacción y posterior hidrólisis de ATP a lo largo de su ciclo de plegamiento. A diferencia que lo que sucede en su homóloga procariota, GroEL, la interacción con actina y tubulina se lleva a cabo a través de dominios específicos de sustrato con subunidades específicas de CCT. En esta memoria, se quiso comprobar si los supuestos dominios de interacción de uno de los sustratos caracterizados, por ejemplo tubulina, están realmente involucrados en la interacción con CCT y si esta interacción específica se extiende también para otros sustratos relacionados con CCT. Por todo ello, nos planteamos dos objetivos: 1,- Profundizar en el estudio de la interacción entre tubulina y CCT, y mediante la creación de proteínas quiméricas, determinar las regiones de tubulina involucradas en la unión con la chaperonina. 2,- Estudiar la unión a la chaperonina citosólica de otros sustratos de distinta naturaleza y función, y determinar si la unión se produce a través de la interacción con subunidades específicas de CCT y que los sustratos relacionados con CCT estudiados interaccionan con CCT a través de dominio y subunidades específicas.

Autor: CERNUDA MOROLLÓN EVA M..
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los agentes inductores de la proliferación peroxisomal, entre los que se encuentran agentes hipolipemiantes y antidiabéticos orales, se caracterizan por su capacidad de activar a una subfamilia de receptores nucleares, los PPAR. Estos fármacos presentan efectos beneficiosos en el tratamiento de los procesos aterogénicos que se han relacionado con sus acciones anti-inflamatorias. Se ha descrito que los agonistas de PPAR inhiben la expresión de la forma inducible de la óxido nítrico sintasa (NOSi) en distintos modelos experimentales y se ha propuesto que dicha inhibición es debida, al menos en parte, a la inhibición de la actividad transcripcional de NF-kB. Nosotros hemos observado que ciertos agonistas de PPAR potencian la expresión de la NOSi en células mesangiales activadas con estímulos inflamatorios, con la participación de mecanismos de regulación transcripcional. El NO producido podría contribuir a los efectos anti-inflamatorios de estos genes. Además todos los agonistas empleados inhibieron la vía de activación de NF-kB por distintos mecanismos. En el caso de la 15-desoxi-delta12,14 -prostaglandina J2 -prostaglandina que se produce en las células tras la inducción de la ciclooxigenasa-2 (COX-2)-, hemos descrito la modificación covalente de la subunidad p50 de NF-kB, a través de una adición de Michael a cisteína en posición 62. Esta modificación tiene lugar en células intactas, como hemos podido demostrar mediante el empleo de una prostaglandina biotinilada. Por ello la modificación postraduccional de proteínas por "prostanilación" podría constituir un mecanismo de autorregulación de los procesos inflamatorios.

Autor: CLAVERÍA IZQUIERDO M. CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La identificación de los mecanismos moleculares que regulan la muerte celular es un aspecto de alto interés en Biología, tanto desde el punto de vista básico, como desde su potencial aplicación clínica. La muerte celular es esencial durante la embriogénesis para determinar la expasión de los diferentes linajes celulares, así como para esculpir órganos o determinar el correcto balance numérico entre poblaciones celulares coordinadas funcionalmente. Durante la vida adulta, la muerte celular controla el nivel de expansión de los tejidos sujetos a renovación proliferativa y elimina células alteradas que puedan resultar potencialmente peligrosas. Las alteraciones por exceso o defecto en los procesos de muerte celular durante la embriogénesis conducen a malformaciones congénitas, mientras que si ocurren durante la vida adulta pueden conducir a la formación de tumores, síndromes hiperproliferativos y cuadros degenerativos. En el presente trabajo se ha abordado el estudio de los mecanismos moleculares que regulan la muerte celular, mediante el análisis de vías proapoptóticas de insectos y su estudio comparado en mamíferos. El análisis comparado de los mencionados procesos en organismos tan dispares como C.elegans y el hombre ha sido curcial para identificar reguladores esenciales de la apoptosis, frecuentemente implicados en las alteraciones patológicas antes señaladas. Por el contrario, D.melanogaster, que ha servido como modelo excelente para el estudio de innumerables procesos biológicos conservados, ha quedado un tanto al margen en aportaciones al estudio comparado de la apoptósis. El trabajo experimental presentado profundiza en los mecanismos proapoptóticos disparados por reguladores esenciales de la muerte celular programada identificados de GH3, un nuevo dominio proapoptótico en Grim, uno de los reguladores esenciales de la apoptosis en D.melanogaster. Se ha estudiado la vía proapoptótica disparada por el dominio GH3, identificándose un nuevo mecanismo de acción que implica la vía mitocondrial de activación de caspasas y es independiente de la función previamente conocida de inhibición de IAPs. Se han identificado los residuos más importantes para la función del dominio GH3 es capaz de inducir apoptosis por la vía mitocondrial.

Autor: DUQUE MUÑOZ JAVIER.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: La ciclooxigenasa esta relacionada con procesos fisiológicos como la vasodilatación, desagregación de plaquetas, etc.. Pero también en alteraciones patológicas como inflamación y diferentes tipos de cáncer. En esta tesis se abordan los efectos de distintos estímulos como el ester de forbol y la citoquina proinflamatoria IL-1 beta sobre la expresión de Cox-2 y se analiza el papel de diferentes factores de transcripción en la regulación de la inducción de Cox-2. Se describe la presencia de NFAT en células CACO2. Asimismo, se estudia el efecto de la inhibición de calcineurina por ciclosporina A y de diferentes inhibidores de las vías de transducción de señales sobre la regulación de Cox-2 y sus implicaciones en carcinoma de colon.

Autor: FERNÁNDEZ HERNANDO CARLOS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL RAMÓN Y CAJAL.

Resumen: El colesterol, además de ser precursor de las hormonas esteroideas y de los ácidos biliares, es una molécula esencial para las células de mamiferos al ser uno de los principales componentes de la membrana plasmática, siendo necesaria en los procesos de embriogénesis y de la proliferación celular. En este último caso, el colesterol no se limita a ser un componente estructural sino que, como recientemente se ha demostrado en nuestro laboratorio, también ejerce un papel regulador del ciclo celular, permitiendo la transición de G2 a M. Continuando esta línea experimental, en primer lugar analizamos la especificidad del colesterol en relación con otros esteroles naturales (fitosteroles), en las acciones proliferativas y reguladoras del ciclo celular en células de mamífero. Para el estudio se cultivaron diferentes líneas celulares en un medio deficiente de colesterol y se trataron con un inhibidor distal de la síntesis de colesterol, como el SKF 104976, analizándose los efectos de los diferentes esteroles sobre la biosíntesis de colesterol, la proliferación y la diferenciación celular. En último lugar se estudio el papel del colesterol y de los derivados isoprenoides en la diferenciación de células PC-12. Este modelo celular, ampliamente utilizado por otros autores, permite estudiar las conexiones entre el metabolismo del colesterol y las enfermeddades neurodegenerativas. Brevemente, hemos demostrado que los fitosteroles insaturados en la cadena lateral son potentes inhibidores competitivos de la esterol delta24 -reductasa, enzima que convierte desmosterol en colesterol. Esta acción podría justificar en aprte el efecto hipocolesterolémico de la ingesta de estos compuestos. En cuanto a la proliferación celular, en este trabajo se demuestra que la reducción de la disponibilidad de colesterol produce una inhibición de laproliferación celular, acompañada en un retraso de la progresión del ciclo celular G2/M y, en última instancia, un bloqueo de la citocinesis celular. Estos resultados fueron evitados y revertidos por la adición de colesterol al medio de cultivo, mientras que los fitosteroles fueron inactivos. Es más, los fitosteroles favorecieron la formación de células poliploides y multinucleadas. Todo ello coincide con la capacidad del colesterol para estimular la expresión de ciclina B1, a diferencia de los fitosteroles. En referencia a los intermediarios de la síntesis de colesterol, tan solo el 7-deshidrocolesterol fue capaz de reemplazar al colesterol en la proliferación celular pero con alguna limitación, puesto que la adición del mismo al medio a dosis moderadas resultó citotóxico, al contrario que el colesterol. Por último, el tratamiento con estatinas, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, estimuló la formación de neuritas de las células PC-12. Demostramos que este efecto está mediado por la inhibición de la proteína Rho A y, consecuentemente, de la proteína quinasa p160ROCK, y es dependiente de la disponibilidad de colesterol u otros esteroles.

Autor: DELGADO CAÑAVERAS M. PILAR.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBMSO.

Resumen: La expresión del receptor para el antígeno de células T en la superficie celular está regulada de tal forma que sólo tras la formación del complejo completo se permite la exportación del mismo a la membrana plasmática. Para ello las subunidades del complejo poseen señales de retención intracelular. Una parte de la subunidad CD3gama y del TCR/CD3. Se ha identificado la presencia de múltiples señales de retención localizadas en los dominios extracelular, transmembránico y citoplasmático de esta subunidad, que impiden su expresión en la superficie celular como subunidad aislada. Sin embargo el ensamblaje de CD3gama y con CD3* resulta en la anulación de todas las señales de retención intracelular de CD3gama. Esto nos lleva a proponer un modelo de ensamblaje ordenado del complejo TCR/CD3, por ocultación y anulación progresiva de las señales de retención presentes en las subunidades aisladas. Otra parte de esta tesis se dedica a analizar la especialización funcional de las subunidades del CD3 en la transducción de señales. Para ello desarrollamos dos abordajes. El primero consiste en el análisis a nivel molecular del defecto en señalización en timocitos de ratones deficientes en la subunidad CD3* del TCR/CD3, cuyo desarrollo tímico queda interrumpido a nivel de timocitos inmaduros doble positivos para CD4y CD8. Encontramos que CD3* tiene un papel específico en la señalización por el TCR para la activación de la vía de la MAPK ERK y la selección positiva en el desarrollo de células T. Esta función es independiente de su región intracitoplasmática y por tanto de su motivo ITAM. A nivel bioquímico la señalización por un TCR carente de CD3* genera un defecto específico en la fosforilación de la fracción de CD3* que se localiza en los microdominios de membrana denominados GEMs. Esto se traduce en un defecto en la fosforilación de la proteína adaptadora LAT, que a su vez genera un defecto en la activación de la vía Ras-ERK, lo que finalmente conduce a un defecto en selección positiva. La expresión de un transgén de Raf constitutivamente activo, elemento activador de la vía de Ras-ERK, no es suficiente para revertir el defecto en selección positiva producido por la ausencia de CD3*. El segundo abordaje consistió en la búsqueda de ligandos específicos para las regiones citoplasmáticas de CD3gama y CD3*. Encontramos que todas las subunidades del CD3, a través de su región citoplasmática, son capaces de asociarse a la proteína G pequeña de la familia de Ras llamada TC21. Los motivos ITAM del CD3 son suficientes para mediar esta interacción. Y, por último, la estimulación a través del TCR/CD3 induce la activación de TC21, y además incrementa la asociación de TC21 al CD3. En el futuro tratarémos de averiguar cuál puede ser la función de esta interacción directa entre el TCR y una proteían G pequeña en el proceso de activación de los linfocitos T.

Autor: CONTRERAS MARTÍN BEATRIZ.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: LABORATORIO DE MEDICINA INTERNA I DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO PUERTA DE HIERRO Y FUNDACIÓN LAIR DE MADRID.

Resumen: La leucemia linfoide crónica de células B se caracteriza por linfocitos en sangre periférica de células B monoclonales CD5+. Estas células están paradas en fase G0/G1 del ciclo celular y poseen una elevada longevidad in vivo. Además, se piensa que esta elevada vida media es el factor principal de la acumulación de las células tumorales. Sin embargo, en cultivo, las células B de la leucemia linfoide crónica (LLC) sufren una rápida apoptosis espontánea, sugiriendo que la muerte celular programada de estas células B de LLC, puede ser el resultado de las ausencia de varios factores: humorales, celulares o ambos, presentes in vivo. Además, la regulación del tamaño de la población tumoral, es posible que dependa directamente de señales externas a la células y que sean éstas las que determinen si se produce la muerte celular programada. Se sabe que los linfocitos B de esta enfermedad, son células circulantes que probablemente interaccionen con células endoteliales vasculares y por tanto, es posible que esta interacción sea crucial en el mantenimiento de la viabilidad de las células B circulantes de LLC. En este trabajo los linfocitos B tumorales y las células B de anginas purificadas se cultivaron en contacto directo con células endoteliales, o físicamente separadas de éstas usando una membrana semipermeable, que permite el paso de factores solubles pero previene del contacto directo entre las células tumorales y endoteliales. Con el fin de valorar la contribución de estas células endoteliales en la prevención de la apoptosis, vía factores solubles y/o contacto celular directo. Nosotros obteníamos que las células B de LLC pero no las células B control, eran protegidas de la apoptosis espontánea por los co-cultivos con las células endoteliales. Varias citocinas endoteliales (IL-6, IL-8 y el TGF-beta) parecen actuar de forma coordinada en la prevención de la muerte celular programada. Por otra parte, las interacciones celulares directas con el endotelio tienen una contribución en viabilidad notablemente mayor a la del componente soluble y están medidas por la inducción de la proteína anti-apoptótica Bcl-XL. Tanto las integrinas beta1 como las integrinas beta2 contribuyen a la adhesividad al endotelio y son capaces de transmitir señales anti-apoptóticas. Resulta interesante la contribución de la subunidad alfa denominada CD11c, cuyo papel en la supervivencia de linfocitos de la LLC no se había estudiado previamente. En este trabajo parece ser la más destacadas, actuando por un mecanismo similar al del contacto celular directo. Además, las señales mediadas a través de CD11c inducen activación pero no proliferación de las células leucémicas. Por otra parte se observa que, tanto el contacto con células endoteliales como las citocinas producidas por éstas pueden reducir el efecto antitumoral de alguno de los fármacos que habitualmente se emplean para el tratamiento de esta enfermedad.

Autor: SOTILLO ROMÁN ROCÍO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLÓGICAS (CNIO).

Resumen: El trabajo realizado ha estudiado en profundidad la función de dos proteínas reguladoras de la proliferación celular: las quinasas dependientes de ciclinas Cdk4 y Cdk6. Ambas proteínas habían sido caracterizadas ampliamente mediante sistemas in vitro y cultivos celulares. En esta Tesis se ha utilizado sin embargo modelos modificados genéticamente que portan mutaciones nulas (knock out) o activantes (knock in) en alguna de estas moléculas. De esta manera, el trabajo aquí expuesto muestra como ninguna de estas proteínas es necesaria para la progresión del ciclo celular o para la proliferación de fibroblastos aislados de los animales modificados genéticamente. Sin embargo, la desregulación activamente de una de estas moléculas, Cdk4 (mediante una mutación que impide que su actividad pueda ser eliminada por unos inhibidores del ciclo celular), ha mostrado de manera dramática cómo esta molécula presenta una actividad de gran importancia en el desarrollo de tumores. Así, la simple eliminación de esta inhibición provocan en las células en cultivo y en los ratones adultos una tremenda susceptibilidad al desarrollo de tumores. Es interesante, además, el hecho de que el origen de estos tumores es muy variado sugiriendo la amplitud de este fenómeno. De hecho, se ha demostrado que esta mutación es capaz de provocar la susceptibilidad a determinados tumores que no se desarrollan espontáneamente como el melanoma. Este hecho es de especial relevancia dado el desconocimiento actual en los procesos moleculares que participan en el desarrollo de esta enfermedad de tan difícil control en pacientes humanos. En general, estos resultados tienen claras implicaciones en el entendimiento de la proliferación maligna que surge en los tejidos adultos y en el diseño de nuevas terapias contra estos procesos neoplásicos.

Autor: OLAVARRIETA SCAPPINI LUZ LETICIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La topología del DNA cambia constantemente a medida que progresa la replicación. Pero la dinámica de este proceso es hasta hoy desconocida. Para abordar este problema en Escherichia coli, construimos varios plásmidos con un origen ColE1 y una barrera polar para la replicación localizada a distintas distancias del origen. El análisis de los intermediarios de replicación de estos plásmidos por electroforesis bidimensional en geles de agarosa y microscopia electrónica nos ha permitido comprobar que el superenrollado negativo disminuye a medida que avanza la horquilla. Hemos comprobado que la cloroquina y el bromuro de etidio, que inducen el superenrollamiento positivo de moléculas no replicadas, son incapaces de inducir en superenrollamiento positivo de los intermediarios de replicación. Esto se debe a que en los intermediarios el superenrollamiento positivo es inmediatamente adsorbido por una regresión de las horquillas. El anudamiento de las doble-hélices hermanas dentrás de la horquilla ocurre normalmente durante la replicación. Para estudiar la dinámica de la formación de nudos, utilizamos geles bidimensionales para identificar burbujas anudadas en moléculas con la horquilla detenida en distintos sitios a lo largo del proceso. Hemos comprabado que el número y complejidad de burbujas anudadas aumenta en función del tamaño de la burbuja, lo que sugiere que la probabilidad de anudamiento es inversamente proporcional a la densidad de pre-encadenados. Finalmente, estudiamos las consecuencias topológicas de la colisión frontal entre replicación y trascripción. Los resultados obtenidos indican que este tipo de colisión favorece la formación de burbujas anudadas y que un exceso de intermediarios anudados tendría consecuencias deletéreas para la segregación. Esta podría ser al menos una de las razones por lo que a lo largo de la evolución los genomas han evitado la colisión frontal entre transcripción y replicación.

Autor: PÉREZ FERNÁNDEZ JORGE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El tallo ribosómico constituye un dominio funcional muy dinámica y aún muy poco conocida. El tallo de S.cerevisiae está constituído de cuatro proteínas de 12 kDa (P1alfa, P1beta, P2alfa and P2beta), que forma un pentámero con la proteína P0. Las proteinas ácidas unidas a ribosoma se intercambian con las presentes en un reservorio citoplásmico durante la síntesis de proteínas, y están probablemente implicadas en un proceso de regulación de la traducción. Las interacciones de las diferentes proteínas ácidas con P0, implicadas en el proceso de ensamblaje del tallo han sido exploradas empleando el sistema de doble híbrido, cromatografía de afinidad, análisis de mutantes de delección y mutantes puntuales. Los resultados indican que la proteína P0 completa interacciona debilmente con las proteínas P1. En contraste, un fragmento de 100 aminoácidos de largo une de forma muy fuerte las proteínas P1, con menor intensidad la proteína P2alfa, y no interacciona con la proteína P2beta. La delección progresiva de ambos extremos a permitido definir un fragmento de las posiciones 212 a 265 como la parte más pequeña de P0 capaz de interaccionar con las proteínas. Demás, los resultados sugieren la participación del extremos carboxilo en la interacción específica de las proteínas P2. La delección de 15 aminoácidos de P0 resulta en una reducció drástica de las proteínas ácidas unidas a ribosoma. Los análisis de mutaciones puntuales descartan la interacción por cremalleras de leucinas como el mecanismo de interacción relevante. Los resultados sostienen un modelo de ensamblaje del tallo que requiere un cambio conformacional de P0 para exponer los sitios de unión de las proteínas P1, que es seguido por la asociación de las proteínas P2 al complejo. La interacción de esta estructura con varios factores de traducción ha sido también caracterizada por diferentes métodos. Hemos aplicado el sistema de doble híbrido para estudiar la intercción del tallo ribosómico con e factor de elongación EF2, con el factor de iniciación eIF5 y eIF5B, y los factores de terminación Sup35p y Sup45p. Hemos encontrado que estas proteínas interaccionan mejor con el carboxilo terminal de las proteínas del tallo ribosómico, indicando que el sitio de unión se encuentra menos expuesto en la proteína intacta. Por último, esta interacción parece tener lugar de forma preferente con alguna de las proteínas. Para tratar de identificar nuevas proteínas relacionadas con el tallo ribosómico, se realizó un rastreo genético mediante doble híbrido utilizando la proteína P0 como anzuelo. Se identificó un nuevo gen putativo, ORF YLR287c. Esta es una ORF no esencial de función desconocida y no relacionada funcionalmente con ningún otro gen. El empleo del análisis fenotípico en diferentes condiciones de crecimiento tanto en ausencia como en sobrexpresión del gen YLR287c no ha aportado datos de su posible función. Los resultados negativos nos han llevado a desarrollar un rastreo mediante sintéticos letales empleando una cepa de levadura con todos los marcadores autotróficos disponibles para tratar de identificar proteínas relacionadas con YLR287c. De los mutantes obtenidos hemos caracterizado el gen CDC5 como capaz de producir sintéticos letales con YLR287c, sugiriendo su posible relación functional en la síntesis y ensamblaje del ribosoma.

Autor: LÓPEZ FRAGA MARTA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA (CNB) - C.S.I.C..

Resumen: El presente trabajo versa sobre la caracterización y análisis biológico de APRIL. En este trabajo se describe que APRIL es procesado intracelularmente por un furin convertasas que actúa sobre una secuencia multibásica R-K-R-R situada en los aminoácidos 101-104. El bloqueo del transporte de proteínas desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi mediante tratamiento con brefeldina A conlleva una interrupción del procesamiento post-Golgi, no interfiere en el procesamiento de APRIL; aunque si en la secreción de la forma procesada de APRIL al exterior de la célula. De éste modo, APRIL presenta un modo único de maduración entre los miembros de la familia de TNF, puesto que no es detectable en la superficie de la célula y es procesada en el aparato de Golgi, liberándose así una proteína soluble con actividad biológica. Para el estudio de la participación de APRIL en el sistema immune se generaron ratones transgénicos que expresaban APRIL como un transgen en linfocitos T. Estos ratones presentan un fenotipo aparentemente normal y no muestran signos de hiperplasia de linfocitos B. Los linfocitos T transgénicos revelan una supervivencia aumentada in vitro, así como un aumento de la supervivencia in ivo de linfocitos T CD4+ reactivos frente a la enterotoxina B de estafilococo (SEB) tras el tratatmiento con ésta. Ambos efectos están relacionados con niveles elevados de Bcl-2. Los análisis de la respuesta humoral frente a antígenos linfocito T-dependientes en estos ratones indican que ésta sólo se encuentra parcialmente alterada. Así, APRIL afecta sólo a las respuestas de IgMs y no a las respuestas de IgGs. Sin embargo, la respueta tumoral frente a antígenos linfocitos T-independientes de tipo II (TI-2) se encuentra aumentada en los ratones transgénicos. Puesto que previamente se había descrito que TACI es indispensable para la formación de anticuerpos TI-2, estos resultados sugieren un posible papel de la interacción entre TACI y APRIL en la generación de estas respuestas. En conjunto, nuestros datos sugieren que APRIL está implicado en la inducción y/o mantenimiento de las respuestas T y B. Por último, se describe una nueva proteína, denominada TWE-PRIL, resultado de la traducción de un ARNm híbrido entre los ARNms de APRIL y TWEAK. La proteína TWE-PRIL codificada por este ARNm contiene los dominios citoplasmáticos, transmembrana y tronco de TWEAK fusionados con el dominio C-terminal extracelular de APRIL. El mARN de TWE-PRIL se expresa y es traducido, detectándose la proteína endógena, en linfocitos T primarios humanos y en líneas celulares monocíticas. TWE-PRIL se encuentra unido a membrana y expone el dominio de unión al receptor de APRIL en la superficie celular. Se trata además de un ligando biológicamente activo, puesto que es capaz de estimular la entrada en ciclo de líneas celulares de linfomas tanto T como B. Las diferentes localizaciónes subcelulares de APRIL y TWW-PRIL sugieren que ambas moleculas podrían ejercer distintas funciones biológicas.

Autor: MAYORAL ORTEGA TOMAS.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La enzima ferredoxina NADP+ reductasa (FNR) cataliza la transformación de la coenzima NADP+ en NADPH en la última etapa de la fotosíntesis. En la presente tesis doctoral se recoge el estudio estructural del mecanismo catalítico de la FNR desde tres aspectos diferentes: * La unión de la FNR a sus donadores electrónicos. * El estudio del centro activo de la FNR. * Estudio de la especificidad y modo de unión de la coenzima NADP+. Para ello se han resuelto las estructuras tridimensionales de un total de 13 mutantes de FNR y un complejo entre FNR y NADP+, por cristalografía de Rayos X. Las estructuras han aportado información del modo de unión de los donadores de electrones, ferredoxina y flavodoxina, a la FNR, y del papel que ejercen las interacciones electrostáticas e hidrofóbicas en la unión de los complejos entre FNR: Ferredoxina y FRN: Flavodoxina. Se ha descrito un modelo de unión entre las proteinas FNR y flavodoxina en base a los diferentes estudios, bioquímicos, estructurales, biofísicos y teóricos existentes sobre la enzima FNR o proteínas relacionadas. Este modelo explica numerosos resultados reportados previamente. Se ha estudiado el centro activo de la enzima FNR y el papel de determinados residuos que se encuentran en la zona de estabilización del cofactor FAD. En el estudio de la especificidad por la coenzima, se ha logrado conocer las bases de la especificidad por el NADP+ o NAD+ en la familia estructural de la FNR. Se ha logrado conocer el modo de unión de la coenzima a la FNR, por un mecanismo en tres pasos basados en la estructura del complejo FNR:NADP+. Además, se ha propuesto un mecanismo para el movimiento del residuo tirosina 303 en la enzima, que hasta ahora no había sido descrito en ningún trabajo.

Autor: MATILLA FUENTES JOAQUÍN.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las estatinas son potentes fármacos hipolipemiantes, que ejercen numerosos efectos pleiotrópicos en múltiples procesos celulares. En la presente tesis se estudia el efecto que fluvastatina ejerce sobre la producción de las citocinas mayoritarias de la placa de ateroma (IL-1beta, IFNgama, IL-18, IL-10, IL-4 y TNFalfa): en un modelo de PBMC (células linfocitarias y monocíticas) activadas con el estímulo inmunológico Mycobacterium tuberculosis, cuyo proceso inmunológico presenta múltiples analogías al observado en las lesiones ateroscleróticas. La incubación de estas células en presencia del citado fármaco favorece la liberación de IL-1beta, IL-18 e IFN-gama, incrementando su liberación de forma sinérgica cuando se estimulan estas células con la bacteria. En cambio, la producción de las citocinas IL-10 y TNFalfa disminuye por la presencia del fármaco. La potente liberación de IL-1beta, IL-18 e IFN-gama es indiferente del estimulo usado, pues la activación inmunológica de las PBMC con lipopolisacárido bacteriano y Staphillococcus aureus genera el mismo efecto sinérgico. Este efecto potenciador de las estatinas es específico, ya que la adición de mevalonato exógeno, revierte el incremento inducido por fluvastatina sobre la secreción de estas citocinas. El efecto inductor de fluvastatina en la liberación de IL-1beta e IL-18 se debe a un incremento en el procesamiento de las proformas de estas citocinas y la secreción de las formas maduras, ambos mediados por la enzima caspasa-1, la cual se comprueba que su actividad enzimática se favorece por la presencia en el medio del fármaco. Este aumento de la actividad enzimática de caspasa-1 es debido a la disminución de la síntesis endógena del isoprenilo geranilgeraniol, derivado del producto de la enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A Reductasa, diana de las estatinas; la adición del isoprenoide geranilgeranil evita el efecto potenciador de fluvastatina, de forma dosis dependiente, sobre la liberación de IL-1beta, IL-18 e INFgama. El hecho de que geranilgeranil regule caspasa-1 induce a pensar que dicha regulación esté mediada por alguna proteína prenilada por geranilgeraniol. El análisis de bandas proteicas radiactivas procedente de extractos citoplasmáticos de PBMC incubados con fluvastatina y geranilgeraniol, activados o no con la bacteria, presenta tres bandas radiactivas mayoritarias, cuyos pesos moleculares de 12, 34 y 42 kDa, son muy similares a los de la proforma de caspasa-1 y a los primeros fragmentos del procesamiento de dicha enzima, de 35 y 12 kDa, lo que induce a pensar que la misma enzima caspasa-1 puede ser prenilada. El análisis de la secuencia aminoacídica de caspasa-1 revela dos posibles secuencias dianas de prenilación específica de geranilgeranil, una en la subunidad p20 y otra en la subunidad p10, aunque ninguna de las dos secuencias son terminales. Este hecho, junto con que la incorporación de radiactividad de estas bandas no se ve favorecida por la presencia de reactivos básicos para otras reacciones de prenilación como son el dithiotreitol, el ZnCl2 y detergentes del tipo NP-40, hacen hipotetizar que si caspasa-1 se prenila, dicha reacción será catalizada por alguna prenil-transferasa diferente a las descritas hasta la fecha. La inmunoprecipitación de caspasa-1 con un anticuerpo específico frente al prodominio de la enzima, en extractos citoplásmicos procedentes de PMBC incubadas con geranilgeraniol radiactivo, pone de manifiesto la presencia de una banda radiactiva coincidente con caspasa-1. El análisis por MALDI-TOF de esta banda indica la coprecipitación de beta-actina y keratina citoplasmática con caspasa-1, enmascarando e impidiendo la identificación de caspasa-1, puesto que los péptidos generados en la digestión de la enzima susceptibles de ser identificados por la técnica con muy escasos. El efecto inductor de fluvastatina en la producción de IFNgama es dependiente los niveles secretados al medio de IL-1beta e IL-18, y de la presencia, aunque en cantidades muy pequeñas, de IL-12. Dicha citocina es fundamental para la inducción de la síntesis del receptor de IL-18, el cual tras la unión a su ligando, la IL-18, presente en el medio en grandes cantidades, inducirá la síntesis de IFNgama.

Autor: SOTO RÍOS MIRIAM KARINA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Resumen: La HTA induce, a lo largo de los años, una alteración de la estructura renal con el consiguiente deterioro de la función, llegando a la nefroesclerosis hipertensiva (NH), donde es evidente la pérdida progresiva de células. La importancia de esta rarefacción tisular en el desarrollo de la NH se aborda en este trabajo, con el estudio de la apoptosis en un modelo in vivo de animales hipertensos con reducción de la masa renal. Mediante estudios in vitro investigamos posibles mecanismos implicados en este fenómeno. En este trabajo, hemos demostrado que en el establecimiento y desarrollo de la NH un aumento de la tasa de apoptosis que participa activamente en la pérdida celular y fibrosis, existiendo una correlación con el grado de disfunción renal. Estos cambios se asocian con alteraciones en la expresión de algunos genes relacionados con este proceso, concretamente la familia Bcl-2. La administración de un inhibidor de la ECA o de un antagonista de los receptores AT1 de la angiotensina II disminuyó la lesión renal y la tasa de apoptosis, sugiriendo, al menos parcialmente, la participación del sistema renina-angiotensina en este proceso. Mediante estudios in vitro hemos demostrado que las células mensagiales procedentes de animales hipertensos adquieren con el desarrollo de la HTA y la edad, una mayor susceptibilidad a la apoptosis. Este fenómeno parece estar relacionado con alteraciones en la expresión de los genes de la familia Bcl-2 y de la actividad del factor de transcripción NF-kB. En resumen, la HTA provoca a nivel celular una predisposición a la muerte celular programada o apoptosis. La normalización de los niveles tensión arterial es no es suficientemente para controlar la apoptosis tras una reducción marcada de masa renal asociada a hipertensión. Además, nuestros datos sugieren la existencia de diferencias en los mecanismos moleculares del control de la apoptosis entre células mesangiales de animales hipertensos y normotensos.

Autor: MOYANO IDOETA JOSÉ VICENTE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOLÓGICAS - CSIC.

Resumen: La fibronectina (FN) es una glicoproteína de la matriz extracelular (MEC) capaz de mediar adhesión celular, destacando el dominio central de unión a células con la secuencia RGD, ligando de las integrinas alfa5beta1 y alfavbeta3. La FN contiene además tres dominios de unión a heparina denominados I, II y III. En esta Tesis Doctoral se han estudiado con detalle las propiedades bioquímicas y biológicas del dominio de unión a heparina III (Hep III) de la FN. Se han identificado dos nuevas secuencias mediadoras de adhesión dentro de este dominio (concretamente en la repetición III5 de la FN), denominadas H2 y HBP/III5. El sitio H2 es capaz de mediar adhesión de diferentes células linfoides B y T, así como de melanoma, a través de las integrinas alfa4beta1 y alfa4beta7 en estado activado (con Mn2+ o con el anticuerpo monoclonal anti-beta1 TS2/16), pero no en el basal. El sitio HBP/III5 media también adhesión celular, pero a través de proteoglicanos de tipo condroitín-sulfato (PGS). Ambos sitios son activos en el contexto del fragmento recombinante FN-III4-5, correspondiente al dominio Hep III de la FN. La adhesión al framgento FN-III4-5 implica la cooperación de ambos receptores (integrina alfa4 y PGCS) aunque la contribución de cada uno de ellos depende del método de activación de la integrina alfa4 empleado (Mn2+, o TS2/19). Además, este fragmento une heparina con alta avidez, equiparable a la del dominio de alta afinidad Hep II. También se ha estudiado la posible implicación del dominio Hep III de la FN en la reorganización de citoesqueleto y regulación de adhesiones focales inducidas por adhesión a través de alfa5beta1, ya que podría jugar un papel similar al descrito para el dominio Hep II. Para ello, se utilizaron células de melanoma SKMEL-178 que expresan las integrinas alfa4beta1, alfa5beta1, así como PGCS, y porque los linfocitos no son capaces de reorganizar el citoesqueleto. La presencia del fragmento FN-III4-5, tanto coinmovilizado con el fragmento recombinante FN-III7-10 (que contiene la secuencia RGD) como soluble, inhibió la extensión celular, fibras de estrés y adhesiones focales inducidas por la ligación de la integrina alfa5beta1 a FN-III7-10. El efecto producido por el fragmento FN-III4-5 es críptico en la molécular de la FN, puesto que la adhesión de estas células a FN indujo una mayor contracción, gruesa fibras de estrés y adhesiones focales. Para estudiar si el efecto de FN-III4-5 se expone después de la degradación proteolígica de FN, hecho que ocurre en situaciones patológicas como heridas, inflamación, metástasis o invasión, se utilizó como modelo digestiones trípticas de FN. La adhesión de células SKMEL-178 a los fragmentos de FN producidos inhibió por completo la formación de fibras de estrés, adhesiones focales y extensión celular mediadas por la integrina alfa5beta1, resultando en un patrón morfológico muy similar al producido por el fragmento FN-III4-5 (dominio Hep III de FN). Esta inhibición mediada por FN-III4-5 se debe a la ligación de la integrina alfa4beta1, porque: 1) mutaciones en el sitio H2 abolen por completo la ausencia de estas estructuras inducidas por el FN-III4-5 original (wild-type) 2) otros ligandos bien conocidos de la integrian alfa4beta1 como son VCAM-1 y FN-H89 también inducen esta inhibición. 3) porque células HeLa transfectadas con la integrina alfa 4 (ya que normalmente no la expresan) también muestran una ausencia de extensión y fibras de estrés en presencia del ligando FN-III4-5. También se ha determinado en esta Tesis Doctoral que la ligación de la integrina alfa4beta1 a FN-III4-5 conlleva a la fosforilación (activación) de p190RhoGAP y la concomitante inhibición de la pequeña GTPasa RhoA, implicada en la formación de fibras de estrés, adhesiones focales y extensión celular. Además, esta inhibición de RhoA mediada por alfa4 unida a FN-III4-5 conlleva específicamente un aumento en la capacidad migratoria de células de melanoma. Por tanto, la integrina alfa4beta1 regula de forma antagónica la función de alfa5beta1 en cuanto a respuesta biológica en estas células, siendo estos datos cruciales para futuros estudios en procesos de invasión y metástasis de células tumorales como las de melanoma. Por último, se estudió la reorganización inducida por la otra secuencia mediadora de adhesión (HBP/III5) dentro del dominio Hep III. En este caso, la coinmovilización de FN-III7-10 (ligando de alfa5beta1) con el péptido sintético HBP/III5 (ligando de PGCS) indujo un aumento de la extensión celular, fibras de estrés y cambio en la composición de adhesiones focales (reclutando nuevas proteínas como talina y paxilina, además de vinculina). Esta reorganización del citoesqueleto inducida por HBP/III5 es dependiente de RhoA y en ella están implicados proteoglicanos condroitín-sulfato y heparán-sulfato. Por tanto el dominio Hep III puede inducir señales que regulan el citoesqueleto en formas opuestas y el predominio de una u otra dependerá del contexto celular y del microambiente.