BIOQUIMICA MOLECULAR, 14

Autor: PIGNATELLI MORENO MIGUEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: En este trabajo hemos analizado los mecanismos moleculares responsables del efecto de la 15-deoxi-delta-12,14 -prostaglandina J2 (15dPG-j2), un ligando natural de la isoforma gamma del receptor nuclear activado por proliferadores peroxisomales gamma (PPARgamma), sobre el crecimiento, diferenciación y muerte de células epiteliales de cáncer de mama. Nuestros datos muestran que esta prostaglandina inhibe el crecimiento de este tipo de células y produce una parada de ciclo celular en las transiciones G1/S y G2/M y que estos efectos podrían estar mediados, al menos en parte, por su regulación de la ciclina D1, el gen supresor de tumores brca1 y por su bloqueo de la ruta de señalización mitogénica inducida por receptores tirosina kinasa de la familia ErbB. Hemos demostrado también que 15dPG-J2 induce un fenotipo diferenciado asociado con un aumento en los niveles de expresión de C/EBPbeta y C/EBP*, dos genes fundamentales en el proceso de diferenciación de la glándula mamaria. Finalmente hemos demostrado que 15dPG-J2 induce muerte celular de células de cáncer de mama, por un lado a través de un mecanismo de apoptosis clásica intrínseca (externalización de la fosfatidil serina, activación de caspasas, liberación de citocromo C) y también por otros mecanismos que implican una disfunción mitocondrial asociada con liberación de radicales libres, disminución del consumo de oxígeno, regulación de la expresión génica mitocondrial y pérdida del potencial de membrana mitocondrial.

Autor: RODRÍGUEZ GONZÁLEZ AGUSTÍN.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS-CSIC.

Resumen: En la actualidad el cáncer constituye una patología que afecta a un gran y creciente porcentaje de nuestra sociedad. El arsenal disponible en la práctica clínica tiene un techo de curación del 50% de los casos diagnosticados. Esta coyuntura obliga necesariamente a buscar nuevas alternativas en todas y cada una de las modalidades clínicas que tienen por objetivo la curación del cáncer, abarcando desde el área preventiva hasta la aplicación de terapia génica experimental. La quimioterapia junto con la cirugía ha venido desarrollando tradicionalmente un papel fundamental en el tratamiento del cáncer. La creciente demanda de nuevos compuestos de menor toxicidad, mayor potencia y especificidad, han estimulado a la comunidad científica al desarrollo de un nuevo modelo para el estudio, experimentación y desarrollo de nuevos quimioterápicos. Este modelo se basa en la caracterización empírica de diferencias cualitativas y cuantitativas entre células tumorales y normales. Una vez bien caracterizada la diferencia observada, se diseñarían una estrategia para afectar específicamente el proceso desregulado, afectando preferentemente a las células tumorales. En este trabajo nos centramos en estudiar la inhibición de colino quinasa (ChoK) como una posible estrategia antitumoral. La elección de la ChoK como posible estrategia antitumoral. La elección de la ChoK como posible diana para la racionalización de la síntesis de inhibidores específicos de su actividad, subyace en la elevación de los niveles itracelulares de PCho durante el proceso de trasformación celular, hecho este ampliamente descrito en los últimos años. El presente estudio ha abordado el análisis de la especificidad del MN58b por la Chok y la inhibición de esta como causa directa del efecto celular derivado del tratamiento con MN58b. También se ha estudiado el mecanismo por el cual la inhibición de Chok tiene efectos antitumorales. Se ha puesto de relieve que el incremento de los niveles intracelulares de fosforilcolina (Pcho) es un evento común en la naturaleza tumoral o fenotipos que conlleven transformación. También se ha constatado una mayor sensibilidad al tratamiento con inhibidores de ChoK (MN58b) por parte de las líneas que presentan niveles elevados de PCho. Esta diferente sensibilidad se basa en el efecto apoptótico e irreversible causado en células tumorales por el tratamiento con MN58b, en contraposición al a quiescencia reversible que presentan las células normales. Es en base a esta especificidad en la toxicidad inducida por MN58b que se explica el efecto antitumoral de los inhibidores de ChoK. También se ha tratado de profundizar en el mecanismo molecular que infiere esta diferente reacción celular al tratamiento con MN58b. Esta es aún una cuestión abierta, pero todo parece indicar que la inhibición de ChoK afectaría a la síntesis de fosfatidilcolina (PC), principal lípido de membrana. Esta síntesis está tremendamente regulada por el ciclo celular (fases G1/S), y por ello el descenso de PCho en la fase G1 conllevaría la desfosforilación de pRb observada en células normales. Esta hipofosforilación de pRb induciría el arresto en G0 de estas células. Por el contrario en células tumorales. Esta hipofosforilación de pRb induciría el arresto en G0 de estas células. Por el contrario en células tumorales, el descenso de los niveles de PCho derivado del tratamiento con MN58b no conlleva la desfosforilación de pRb, con lo que no se genera un arresto celular, y por ello continuaría la progresión de la fase G1 a S. Esto explicaría que consecutivamente al descenso de los niveles de PCho le seguirían el descenso de los niveles de citosina difosfato-colina (CDP-Cho), PC y esfingomielina (SM), por ese orden, hecho este que no es observado en células normales. El descenso de SM podría verse afectado por partida doble, por la imposibilidad de una suficiente síntesis de PC en ausencia de PCho durante el ciclo celular, y por la potencial posibilidad de que los niveles ínfimos de PCho estimule la actividad de esfinogmielinasas S(MS) para generar PCho y ceramidas, productos de la hidrólisis de SM. Esto explicaría la observación del incremento en los niveles de ceramidas para los mismos tiempos en los que se observan el descenso de los niveles de CDP-Cho. El incremento específico de las ceramidas explicaría la apoptosis de células tumorales. Por otra parte la desfosforilación de pRb explicaría el arresto en células normales, siendo estas las bases moleculares del efecto diferencial entre células normales y tumorales al tratamiento con MN58b, explicando a su vez el efecto antitumoral demostrado por los inhibidores de ChoK in vivo.

Autor: SAMINO GARCÍA YOLANDA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CNM. INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: La respuesta inmune celular mediada por linfocitos T citotóxicos CD8+ o CTL juega un papel importante en el control de la infección por VIH. Está descrito que la glicoproteína de la envuelta de la cepa IIIB de VIH-1 induce una respuesta de CTL mediada por el alotipo Dd de MHC de clase I. Estudios empleando péptidos sintéticos describieron al decámero 318RGPGRAFVTI327 (R10I) como el péptido óptimo presentado por Dd a CTL específicos. Estos estudios llevaron a asumir, injustificadamente, que el péptido sintético óptimo era también el único péptido natural responsable de esta respuesta de CTL. Además datos previos en la literatura apuntaban la posibilidad de detectar una débil presentación a CTL por la molécula Ld de este péptido, pero nunca se observó presentación intracelular del epítopo de la glicoproteína por Ld, siendo únicamente presentado endógenamente por Dd. Todos estos trabajos se realizaron empleando péptidos sintéticos y ninguno de los múltiples epítopos de CTL descritos en la secuencia de la glicoproteína han sido identificados como ligandos naturales de MHC de clase I. Estos hechos, unidos a la relevancia de esta región del bucle V3 en la respuesta inmune frente la infección por VIH apoyan la necesidad del estudio de los péptidos naturales responsables de una respuesta eficiente de CTL frente a la infección viral. Los resultados descritos en esta memoria confirman que el epítopo estudiado del bucle V3 de la glicoproteína de la envuelta de la cepa IIIB de VIH-1 es presentado fisiológicamente por Ld. El nonámero 319GPGRAFVTI327 (G9I) constituyó el núcleo antigénico de este epítopo presentado tanto por Dd, como por Ld. Como consecuencia del procesamiento endógeno de la glicoproteína de la envuelta de generan, al menos, dos especies peptíticas diferentes unidas a Dd en la célula infectada. Una de ellas correspondió al núcleo antigénico G9I, y la otra podría corresponder al decámero R10I o a su extensión en el extremo amino Q11I, o bien a una mezcla de ambos. Este procesamiento generó también, al menos, tres especies peptídicas diferentes unidas a Ld en la célula infectada. Dos de ellas concidirían con las previamente determinadas unidas a Dd, mientras que la tercera correspodería al péptido de 15 aminoácidos K15I. Todos los complejos Dd/péptido y Ld/péptido naturales identificados mostraron una antigenicidad elevada, por lo que todos ellos podrían contribuir significativamente a la respuesta fisiológica de CTL frente a la glicoproteína. Los resultados también mostraron que los alotipos Dd y Ld fueron permisivos a la unión de péptidos derivados de este epítopo con extensiones en el extremo amino, al igual que lo fueron los TCR específicos del epítopo presentado por cada uno de los alotipos. Las extensiones en el extremo carboxilo o en ambos extremos fueron mucho pero toleradas. Además, en la unión del ligando natural G9I a Dd, se observó que no participaba la interacción del grupo NH3+ con la molécula Dd, indicando que este anclaje era dispensable. Se observó, también, una presentación diferencial por Dd y por Ld del epítopo estudiado cuando se encontraba en contextos proteicos diferentes, debido al efecto de las secuencias flanqueantes. Los péptidos generados a partir de la proteína quimérica fueron adecuados para su presentación por Dd, pero no por Ld.

Autor: RAMÍREZ DE MOLINA ANA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS-CSIC.

Resumen: Las proteínas Ras están implicadas en procesos esenciales para el mantenimiento de las funciones celulares básicas como la regulación del crecimiento celular. En las últimas décadas se ha demostrado que estas proteínas inducen la liberación de segundos mensajeros fosfolipídicos involucrados en proliferación y transformación celular. Sin embargo, estos estudios han sido realizados prácticamente en su totalidad con Harvey-ras como miembro representativo de la familia, cuando los genes ras que aparecen mutados con mayor frecuencia en tumores humanos son Kirsten- y N-ras. En este trabajo hemos realizado, en primer lugar, un estudio comparativo de la alteración que producen los tres miembros de la familia de proteínas Ras sobre la ruta fosfolipasa D (PLD)/colino quinasa (ChoK)/fosforilcolina (PCho). Hemos observado que la activación de los enzimas PLD o ChoK, así como un aumento en la generación de PCho, son procesos comunes en células transformadas por estos oncogenes, sugiriendo que la activación de la ruta PLD/ChoK/PCho puede ser uno de los mecanismos utilizados por los oncogenes ras para inducir un crecimiento celular incontrolado. Por otro lado, pequeñas variaciones en la actividad PLD tras la expresión de estas tres oncoproteínas, así como diferencias en el transporte de colina desde el medio extracelular sin variaciones en la permeabilización de la membrana plasmática, no tienen efecto sobre la actividad ChoK ni sobre la producción de PCho, sugiriendo una regulación de ChoK independiente de colina, o lo que es lo mismo, de la cantidad de substrato disponible. En este sentido, demostramos que la regulación que Ras ejerce sobre ChoK es específica, indpendiente de la activación que Ras produce sobre PLD, confirmando una regulación de ChoK alternativa. Por último, mostramos evidencias de que la regulación de ChoK por Ras está mediada por sus efectores Ral GDS y PI3K. Por otra parte, el descubrimiento de ChoK como molécula clave en cascadas de señalización mitogénicas, ha resultado en el diseño de una nueva estrategia antitumoral basada en la inhibición específica de este enzima, habiéndose demostrado una actividad antitumoral de los inhibidores de ChoK tanto in vitro como in vivo en el sistema de ratones desnudos. En ese contexto, hemos estudiado el efecto de los inhibidores de ChoK en células transformadas por Ras, demostrando que la transformación celular por cualquier miembro de la familia de oncogenes ras confiere a las células mayor sensibilidad a la actividad antiproliferativa de la inhibición de ChoK. Estos resultados corroboran la impliacción de ChoK en la transformación celular inducida por ras, sugiriendo que su inhibición podría constituir una estrategia eficaz frente a tumores dependientes del oncogén ras. La generación de PCho por el enzima ChoK es un proceso relevante en rutas mitogénicas, pero no sólo en aquellas en las que el oncogén ras está implicado, sino que también se produce la activación de ChoK por distintos factores de crecimiento y por la expresión de otros oncogenes. Esto nos ha llevado a analizar la importancia de la alteración de este enzima en el proceso de tumorigénesis humana. En primer lugar, hemos analizado los niveles de expresión de ChoK en distintas líneas celulares derivadas de tumores humanos comparándolos a los niveles de ChoK de sus correspondientes líneas primarias, observando que 11 de las 13 líneas tumorales analizadas (84,6%) tienen niveles elevados de Chok. Además, hemos analizado la expresión de ChoK en tejido normal y tumoral de distintos pacientes con cáncer de pulmón, colon, próstata y mama, observando que ChoK se sobre-expresa en tejido tumoral con alta incidencia en todos los casos. Estos resultados indican que la activación de ChoK es un proceso relevante en tumorigénesis humana, sugiriendo el potencial uso de esta proteína como nuevo marcador tumoral. Más concretamente, en cáncer de mama, hemos observado que un 38,5% de los tejidos tumorales analizados tienen actividad basal de ChoK elevada, y que esta activación está asociada al grado de la enfermedad y a tumores ER-negativos. Adicionalmente, en el sistema modelo de cáncer de mama se muestran evidencias de que ChoK se regula positivamente mediante dos mecanismos complementarios, reforzando la importancia de la activación de ChoK en el proceso de carcinogénesis. Por otro lado, para corroborar la implicación de ChoK en el desarrollo del cáncer de mama, hemos estudiado la implicación de este enzima en la señalización que promueve la proliferación de células normales del epitelio mamario. En este sentido, hemos demostrado que la proliferación de células primarias humanas del epitelio mamario inducida por factores de crecimiento es dependiente de ChoK. Y lo que es más importante, que un simple incremento de la expresión de ChoK es suficiente para inducir síntesis de DNA en células primarias epiteliales humanas, promoviendo la progresión del ciclo celular a través de la inducción de fosforilación de pRb y sobrexpresión de cilcina D3. Estos resultados indican que ChoK es una molécula esencial en la proliferación de células epiteliales normales humanas de mama. Por otro lado, demostramos que ChoK juega un papel importante en las cascadas de trasmisión de señales mitogénicas de células tumorales inducidas por herregulina (HRG), factor de crecimiento ampliamente implicado en el desarrollo de tumores de mama. Adicionalmente, en este trabajo demostramos que en la progresión tumoral del cáncer de mama se requiere la activación de ChoK. Por último, hemos comprobado que las células tumorales derivadas de tumores de mama son mucho más sensibles al efecto antiproliferativo de la inhibición de ChoK que sus correspondientes células primarias, sugiriendo que una estrategia antitumoral basada en la inhibición específica de ChoK, bien sola o asociada a otros tratamientos convencionales, podría constituir un nuevo tratamiento eficaz para pacientes con cáncer de mama.

Autor: RAMOS ÁLVAREZ-BUYLLA MANUEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: El objetivo general de esta tesis fue estudiar el posible papel que tiene la presentación del péptido por HLA-B27 en la patogénsis de las espondiloartropatías. Más concretamente, se estudio como se modifica el repertorio de péptidos unidos a HLA-B27 en una célula linfoide tras la infección por una bacteria artritogénica, Salmonella Typhimurium. Así mismo, se analizaron las diferencias que hay entre los repertorios peptídicos de dos subtipos de HLA-B27 que se asocian diferencialmente a la enfermedad, B*2705 y B*2709. Y se analizó con más detalle uno de los ligandos diferenciales encontrados, que reunían características potencialmente relevantes en el papel patogenético de HLA-B27; unión selectiva a los subtipos de HLA-B27 asociados a enfermedad y alta homología con proteínas de bacterias artritogénicas. Finalmente, se identificó un nuevo alelo de HLA-B39 originario de una población nativa de Sudamérica que carece de HLA-B27. Este nuevo alotipo presenta un cambio que lo aproxima a HLA-B27 en sus características de unión de péptidos. De los resultados obtenidos se concluye: La infección por S.typhimurium produce cambios mínimos en el repertorio de péptidos unidos a HLA-B27 en la célula linfoide HMy2.C1R. Los Subtipos B*2705 y B*2709 que se asocian diferencialmente a espondilitis anquilosante comparten el 79% y el 88% respectivamente de su repertorio peptídico. Así, los péptidos diferencialmente unidos a B*2705 constituyen el 21% de su repertorio peptídico y presentan como motivo diferencial un residuo C-terminal básico o Tyr. Los péptidos diferencialmente unidos a B*2709 constituyen el 12% de su repertorio peptídico. B*2709 une in vivo solamente una pequeña proporción de péptidos con residuos no apolares en el C-terminal. En esta tesis se han identificado dos péptidos con Tyr y Arg en posición C-terminal de un total de 41 péptidos secuenciados. La expresión de cadena pesada libre en la superficie celular es equivalente en B*2705 y B*2709. Por tanto, ambos subtipos poseen una estabilidad igual en superficie, a pesar de sus diferencias en la unión de péptidos. HLA-B27 presenta in vivo un péptido derivado de su propia región intracitoplásmica, B27 (309-320), cuya presencia como ligando natural de los distintos subtipos se correlaciona con la asociación de éstos a enfermedad. Este péptido muestra alta homología con proteínas de bacterias artritogénicas. Un péptido homólogo al B27 (309-320) derivado de la DNA primasa (211-222) de C. Trachomatis se une in vitro a HLA-B27, y se produce directamente por el proteasoma 20S. Además la modelización molecular de este péptido y del B27 (309-320) sugiere estructuras similares en unión a B*2705. Se ha caracterizado un nuevo alotipo del locus B (B*3909) en poblaciones indígenas de Sudamérica, que carecen de HLA-B27. El nuevo alotipo posee la especificidad peptídica más próxima a la HLA-B27 entre todos los alotipos de clase I conocidos.

Autor: RESINO DE CASTRO JAIME.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: El estudio del desarrollo de Drosophila melanogaster, históricamente se ha centrado en los procesos que dirigen la formación del patrón espacial y temporal estereotipado de los apéndices, y se ha prestado escasa atención a la consecución de las dimensiones finales. La obtención del tamaño final depende de un complejo proceso de crecimiento definido por una proliferación celular activa dirigida por la aparición secuencial de heterogeneidades genéticas. Así mismo la proliferación celular posibilita el incremento del territorio y la aparición de nuevas heterogeneidades. Por tanto, las condiciones genéticas que afectan a la definición del patrón del ala, producen modificaciones de la forma y el tamaño final. También las condiciones genéticas que afectan a los parámetros de proliferación, al ciclo celular y al tamaño de las células. Sin embargo, ninguna de esas modificaciones muestra evidencias claras de ejercer un control instructivo en la definición de las dimensiones de ala. Para definir los parámetros silvestres que controlan las dimensiones finales del ala, se ha realizado un análisis comparativo de condiciones genéticas con modificaciones de distinto signo en el tamaño celular, los parámetros de proliferación y el patrón de elementos del disco imaginal de ala. El análisis de basa en el estudio de mosaicos morfogenéticos de faltas de función de los loci l(3)Me10, gigas, Dmcdc2, fat y la línea de exceso de expresión EP(3)3622. En cada mosaico, las modificaciones de las características de la región mutante son dependientes de cada condición genética. Sin embargo, en la región no mutante, indpendientemente de la posición del clon, del tamaño de sus células o de su régimen de proliferación, se produce una reducción del tamaño debido a una reducción de la proliferación de las células no mutantes. Además, se observa que nunca se produce una compensación del tamaño de la región no mutante para compensar la variación producida por el territorio mutante para obtener un ala de tamaño similar al silvestre. De alguna manera las células silvestres perciben la presencia de células mutantes y reducen su régimen de proliferación. Para entender ese comportamiento es necesario argumentar que el estado de todas las células, independientemente de su posición relativa, de su relación con bordes de restricción, de su tamaño celular o de su régimen de proliferación, puede ser analizado y permite regular la proliferación en todo el ala, incluídas las regiones más alejadas de la perturbación, para definir la dimensiones finales del ala. Además la computación de la información debe realizarse por cada célula a nivel local, integrando la información propia y la de las células vecinas. Así la información de cualquier perturbación en una región, se transmite por interacciones célula a célula a todo el ala. Se define así un sistema de crecimiento dependiente de todas y cada una de las células del órgano, e independiente de regiones organizadoras o señalización externa.

Autor: RICO DAZA MIGUEL ÁNGEL.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, EDIFICIO DE BIOLOGIA.

Resumen: A pesar de los avances realizados desde el descubrimiento del virus C de la hepatitis (VCH) aún no se conocen los mecanismos patogénicos causantes del daño hepático asociado a la infección por VCH, aunque puede estar mediado por la acción que el sistema inmune desarrolla frente al virus. Por este motivo, en esta Tesis se han comparado las características virológicas, histológicas e inmunológicas de sujetos con infección crónica por virus C con diferentes perfiles bioquímicos de la enfermedad. Además, la respuesta de células T se comparó en el hígado y en sangre periférica para conocer qué relación existe entre la respuesta inmunológica y el curso asintomático o más agresivo de la enfermedad. Este análisis demostró que pacientes con niveles elevado de ALT y mayor grado de daño hepático tenían, en hígado, un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos T cooperadores (Th)-CD4+. Además, se encontró un incremento en paralelo entre el porcentaje de estos linfocitos Th-CD4+ y los valores de ALT o la actividad necroinflamatoria hepática de estos pacientes. La caracterización fenotípica de maduración, diferenciación y activación demostró que la población de linfocitos Th-CD4+ intrahepáticos de pacientes C crónicos era mayoritariamente de memoria central (CD45RO+CD27+) o efectora (CD45RO+CD27), encontrándose un aumento significativo en el porcentaje de células Th-CD4+ de memoria efectora activados (HLA-DR+) en aquellos pacientes con hipertransaminasemia y un mayor grado de lesión hepática. Estos resultados sugieren que el daño hepático puede estar relacionado con la proporción de células Th-CD4+ efectoras del infiltrado inflamatorio intrahepático. El análisis de la respuesta proliferativa en CMSP y LIH demostró una baja frecuencia en la respuesta de linfocitos Th-CD4+ VCH-específicos. Aunque en esta tesis se encontró una mayor frecuencia de respuestas frente a la proteína NS3 en ambos compartimentos también se encontraron respuestas frente a otras proteínas, confirmando la idea de la existencia de una respuesta multiespecífica. Por otro lado, el estudio de la producción de citoquinas en LIH se mostró una umento significativo en la frecuencia de secreción de Interferón (IFN)-gamma tanto VCH-específica como NS3-específica, en pacientes con niveles elevado de ALT. Estos resultados sugieren que el grado de lesión hepática de pacientes crónicamente infectados por VCH se relaciona con una respuesta de linfocitos Th1-CD4+ VHC-específicos. Paralelamente se estudió el perfil de expresión de ARNm de citoquinas y quimioquinas en CMSP y tejido hepático de pacientes con infección crónica por virus C. Mientras que en CMSP no se observaron diferencias significativas entre los pacientes, en tejido hepático se encontró la expresión simultánea de IFN-gamma y de la proteína inducida por interferón (IP)-10 sólo en pacientes con hepatitis C crónica. Además, se observó en estos pacientes una tendencia paralela entre la expresión de IP-10 y el grado de lesión hepática así como una correlación entre IP-10 y el porcentaje de linfocitos Th-CD4+ intrahepáticos. Simultáneamente, se encontró en estos pacientes la co-expresión del ARNm de la proteína quimiotáctica de monocitos/macrófagos (MCP)-1 e interleuquina (IL)-10. Estos resultados sugieren que la expresión en el hígado de IP-10/IFN-gamma contribuye al daño hepático a través del mantenimiento de una respuesta Th1. Además, la co-expresión de MCP-1/IL-10 podría contribuir a la persistencia del virus. En conjunto, los resultados de esta tesis muestran la implicación de la respuesta inmunológica antivírica del enfermo en el daño hepático asociado a la infección crónica por el virus C de la hepatitis.

Autor: LANZAROT ZÚÑIGA DIEGO.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Obtención de una batería de anticuerpos policlonales monoespecíficos que reconocen epítopos de secuencia de la helicas replicativa DnaB y de su proteína auxiliar DnaC. Estos anticuerpos son de gran utilidad en un variado espectro de estudios funcionales y estructurales. Para la identificación y purificación de estos anticuerpos el doctorando introdujo en nuestro laboratorio la técnica conocida como de Pep Sport Synthesys. * Identificación, validación e interpretación estructural de zonas de secuencia de la helicasa DnaB implicadas en la interpretación con su proteína auxiliar. Para ello, empleó una combinación de técnicas y bioquímicas y de análisis de la estructura de proteínas (secundaria, terciaria y cuaternaria). * Caracterización estructural del polimorfismo cuaternario de la helicasa replicativa G40P e identificación de los fenómenos que gofiernan este fenómeno in vitro, para lo que empleó técnicas de microscopía electrónica de especímenes teñidos negativamente y procesamiento digital de imágenes, con especial hincapié en el capítulo de detección de heterogeneidades en la simetría rotacional de las partículas. En paralelo, realizó estudios bioquímicos que permitieron encontrar una correlación muy buena a la vez que sugerente entre el estado cuaternario de una helicasa replicativa y su actividad bioquímica. * Formación y visualización por vez primera de los complejos entre la helicasa G40P y su proteína auxiliar G39P. Los estudios de microscopía electrónica de estos complejos han descrito por vez primera la existencia de polimorfismo cuaternario en un complejo helicasa-proteína auxiliar. * Visualización de complejos entre una proteína organizadora del replisoma (DnaA) y una helicasa (DnaB) ensamblados sobre el origen de replicación bacteriana (oriC de E.Coli), lo que ha permitido definir estrategias para el estudio de estos complejos nucleoproteícos clave mediante técnicas de procesamiento y promediado de partículas individuales. * Visualización por vez primera de los complejos que forma una helicasa replicativa (G40P) con una proteína primasa de las de la familia bacteriana (DnaG de B.subtilis). El doctorado ha observado la existencia de dost ipos de complejos G40P-DnaG, ambos de carácter heteroheptamérico, cuya relevancia se desconoce por el momento, pero que podrían tener importantes aplicaciones mecanísticas en la síntesis diferencial de las hebras de DNA adelantada y retardada.

Autor: SÁNCHEZ DÍAZ PATRICIA C..
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El informe de la OMS del año 2000 puso de manifiesto que las enfermedades infectocontagiosas constituyen el mayor problema sanitario de nuestro tiempo. En este contexto, las infecciones causadas por microorganismos resistentes a los antibióticos, entre los que destacan los patógenos oportunistas, adquieren especial importancia. Se denominan patógenos oportunistas a una serie de microorganismos que producen enfermedad únicamente en individuos inmunodeprimidos o con patologías base que generalmente se encuentran sometidos a terapias antimicrobianas severas. Entre los patógenos oportunistas más importantes en el desarrollo de infecciones hospitalarias se encuentra Pseudomonas aeruginosa. Recientemente, Stenotrophomonas maltophilia, otro patógeno oportunista, está adquiriendo cierta relevancia. Ambos microorganismos se caracterizan por poseer una elevada resistencia intrínseca a los antibióticos y por ser capaces de adquirir niveles de resistencia aún mayores tras la terapia antiinfecciosa. Entre los mecanismos de resistencia a los antibióticos identificados en ambas especies bacterianas se encuentra la expresión de sistemas de expulsión múltiple de drogas (MDR). Se denominan sistemas MDR a una serie de transportadores que de forma relativamente inespecífica expulsan una serie de compuestos no relacionados entre sí estructuralmente. Algunas de las características de este tipo de sistemas son: Ubicuidad: pues se han encontrado en todas las estirpes de todas las especies analizadas. Multiplicidad: pues en un mismo organismo se han encontrado hasta 20 genes que codifican distintos sistemas MDR. Función, generalmente, desconocida: se ha especulado que estén implicados en detoxificación, o incluso en señalización intercelular. En P.aeruginosa se ha caracterizado 5 sistemas MDR: MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF, OprN, MexXY-OprM y MexJK-OprM; y en S.maltophilia dos: SmeDEF y SmeABC. La relevancia clínica de algunos de estos sistemas MDR (p.e. MexAB-OprM, MexCD-OprJ o SmeDEF) están demostrada. En este trabajo se han abordado dos problemas: el coste biológico de la sobreexpresión de sistemas MDR en dos mutantes multirresistentes de P.aeruginosa y SmeDEF de Stenotrophomonas matophilia. Se ha demostrado que la sobreexpresión de los sistemas MDR MExAB-OprM y MexCD-OprJ en mutantes multirresistentes de P.aeruginosa, conlleva un coste biológico para la bacteria que podrían dificultar sus transmisibilidad y supervivencia en el medio ambiente. Por otra parte, al estudiar los mecanismos que regulan la expresión de los sistemas MexAB-OprM y SmeDEF, aunque se ha visto que existen aspectos comunes, (transcripción a partir de un único promotor, regulación por fase de crecimiento, inducción de su expresión en respuesta a una serie de señales, etc.), se han encontrado indicios que sugieren que la función natural para la que se han seleccionado ambos sistemas de bombeo ha de ser distinta.

Autor: SEGURA VITUTIA INMACULADA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La angiogénesis (formación de los vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes) es un proceso que está altamente regulado. Dicho proceso se divide en varias etapas: activación de las células endoteliales, degradación de la membrana basal, proliferación y migración de las células y posteriores diferenciación de éstas en un nuevo vaso. En el trabajo que se presenta en esta tesis, se muestra que durante este proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos, también ocurre un proceso de muerte celular programada o apoptosis, que regula la angiogénesis, tanto en ensayos in vitro e in vivo. Se han caracterizado los componentes moleculares implicados en este proceso, estableciéndose una secuencia de activación de las caspasas: la caspasa 8 procesas a las caspasas tipo 3 como 3 y, probablemente, 7, para posteriormente activa a la caspasa 6. Durante dicho proceso también se ha detectado la liberación de citocromo c de la mitocondria, indicando que este orgánulo está implicado en el proceso apoptótico. Se ha estudiado el papel de los inhibidores de caspasas en un proceso patológico dependiente de la formación de vasos sanguíneos, como es la tumorogénesis, comprobando que la presencia de dicho inhibidores reduce la formación de los tumores debido a una reducción en las estructuras capilares que se forman.

Autor: MORENO DALTON ROSA M..
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Autor: LARRETA LÓPEZ RUTH.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA", FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Leishmania es un protozzo parásito perteneciente al orden de los kinetoplástidos. Su ciclo de vida incluye la alternancia entre dos hospedadores: un hospedador mamífero y un insecto vector. Las enfermedades producidas por Leishmania se denominan lishmaniosis, término que engloba a un conjunto de síndromes de diferente gravedad y manifestaciones clínicas. Leishmania tiene un origen evolutivo muy antiguo, por lo que presenta una serie de características moleculares de organización y expresión génicas propias. En esta Tesis Doctoral se han caracterizado los genes grp94 y hsp83 de Leishmania infantum, ambos pertenecientes a la familia de proteínas de choque térmico hsp83/90. La proteína grp94 de L.infantum ha resultado ser un antígeno prominente en la infección por el parásito, mostrándose como un antígeno temprano. El mapeo de epítopos inmunodominantes demostró que se localizan en las regiones menos conservadas de la proteína. Estas características pueden ser potencialmente utilziadas para el desarrollo de un sistema de diagnóstico serológico para la detección precoz de la infección. La regulación de la expresión del gen hsp83 durante el choque térmico provoca una acumulación del RNAm del mismo, por un mecanismo que opera a nivel post-transcripcional, en el cual a temperaturas de choque térmico existe un factor proteico de nueva síntesis que protege a los mensajeros de ser degradados. Además, esos mensajeros se traducen de manera preferencial. En el proceso de diferenciación de la forma promastigote a la amastigote el gen hsp 83 está fuertemente regulado. Tanto a nivel de RNAm como de proteína de nueva síntesis de observa una fuerte inducción en los primeros momentos del proceso seguida de una pérdida de esa inducción.

Autor: NAGORE CASAS DANIEL.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO.

Resumen: El nitrato y en mucha menor medida el nitrito constituyen las principales fuentes de nitrógeno inorgánico en cianobacterias. En Phormidium laminosum el transporte de estos aniones al interior celular está mediado por un sistema multicomponente denominado transportador ABC de nitrato/nitrito, codificado por el operón de genes NRT. En este trabajo, se ha estudiado separadamente cada uno de los componentes proteicos que conforman esta permeasa periplásmica, prestando especial atención en la caracterización bioquímica de las subunidades NrtA y NrtC. Los datos experimentales demuestran que NrtA es la subunidad del transportador que une nitrato y nitrito en el espacio periplásmico. NrtA es un monómero periférico de membrana de 45 kDa capaz de unir ambos aniones con alta afinidad. Por su parte, NrtB es la subunidad encargada de la translocación del nitrato y el nitrito al interior celular. Se ha demostrado que NrtC es la subunidad citoplásmica del transportador NRT que une y posiblemente cataliza la hidrólisis de ATP, y que es el dominio N-terminal de la proteína el que está directamente involucrado en la unión de ATP. La unidad funcional de NrtC, es un dímero, siendo dependiente la unión de nucleótido a la proteína del estado de agregación de ésta. Los resultados obtenidos han revelado importantes aspectos funcionales y estructurales de los componentes del transportador que pueden contribuir al mejor entendimiento de cómo funciona el transportador ABC de nitrato/nitrito en P.laminosum.

Autor: ACEBES FERNÁNDEZ IGNACIO.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Este trabajo estudia la posible implicación del receptor opioide mu en el mecanismo de acción cerebral de diversos fármacos antidepresivos. Para ello se realizó una administración crónica de fluoxetina, sertralina, nefazodona, imipramina y carbonato de litio en ratas, seguida de un extenso estudio inmunocitoquímico regional a nivel prosencefálico. El tratamiento antidepresivo produjo variaciones significativas en la expresión inmunocitoquímica del receptor opioide mu en diversas regiones prosencefálicas, sugiriendo una posible alteración en la actividad del sistema opioide por efecto del tratamiento antidepresivo. Los resultados obtenidos sugieren la implicación del sistema opioide en el mecanismo antidepresivo de estos fármacos. Cabe reseñar especialmente el efecto de la nefazodona sobre la expresión del receptor opioide mu a nivel de la corteza cingulada y la substancia gris periacueductal, que podría estar implicado en su acción analgésica.

Autor: AGIRRE RUIZ DE ARKAUTE AITZIBER.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIDAD DE BIOFÍSICA Y DPTO. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR FAC. CIENCIAS.

Resumen: Durante el ciclo viral existen varios procesos que requieren la perturbación de la barrera de la membrana celular, tales como la fusión, promovida por las proteínas de fusión, y la permeabilización, provocada por las viroporinas. En este trabajo se ha analizado, por un lado, la posible implicación de varias regiones de la proteína de fusión gp41 de VIH-1 en la actividad fusogénica, así como el efecto de la sustitución V2E en la actividad del péptido de fusión. Por otro lado, se ha estudiado la capacidad de la viroporina 2B del virus de la poliomelitis para permeabilizar membranas, así como el mecanismo molecular subyacente. Para ello, se ha realizado una análisis multidisciplinar basado en sistemas modelos de membrana y técnica de biología molecular, bioquímicas y biofisicas.

Autor: ALONSO OLASO IBON.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La obesidad se caracteriza por un aumento excesivo en el número y tamaño de las células del tejido adiposo y constituye uno de los principales problemas de Salud Pública en los países industrializados. Asociados a la obesidad se encuentran numerosos trastornos patológicos entre los que destacan la diabetes no dependiente de insulina, la hipertensión, el cáncer y la arterioesclerosis. En los últimos años se han producido notables avances en la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la progresión a través del ciclo celular y la detención que conlleva el proceso de diferenciación. La interacción entre las moléculas reguladoras principales, ciclinas, CDKs y CKLs juegan un papel biológico muy importante en el control del ciclo celular y en la diferenciación en los distintos tipos celulares. En el presente trabajo de investigación, hemos estudiado la expresión de determinadas moléculas reguladoras del ciclo celular durante el proceso de diferenciación de células precursoras hacia dipocitos. Para ello hemos utilizado la línea celular 3T3-L1.

Autor: MARTINEZ BOUZAS CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La lengua vasco o Euskera, ha logrado sobrevivir a miles de años de contínuos cambios en las regiones vecinas. Por ello, algunos autores han considerado que esta población podría pertenecer a la primera oleada de migración fuera de Africa en el Paleolítico, y por tanto, ser geneticamente diferente a las poblaciones vecinas. Por otro lado, el Kartvelia, también lengua no indoeuropea, es considerada una lengua ancentral del sur de Cáucaso, por lo que algunos autores han querido encontrar un ancestro común entre la población de Georgia y la población autóctona vasca. También se han encontrado ciertas similitudes entre la lengua vasca y la bereber que algunos autores parecen haber confirmado en estudios genéticos en marcadores de ADN nuclear. Estas teorias en las que se ha intentado determinar la existencia de un posible parentesco lingüístico, podrían collevar la hipótesis de un parentesco genético entre estas poblaciones. Para comprobar estas hipótesis, se ha realizado el estudio genético de las tres poblaciones, mediante el análisis de marcadores de ADN mitocondrial (HVI y HVII) y de AND nuclear en el cromosoma Y (7 SNPs y una inserción Alu). En este trabajo se concluye, que tanto los linajes matrilineales del análisis de los segmentos hipervariables HVI y HVII del ADN mitocondrial, como los linajes patrilineales de los SNPs del cromosoma Y, han demostrado en primer lugar que los resultados obtenidos del análisis del ADN mitocondrial en dos muestras de población autóctona vasca, dialécticamente diferenciadas, permite confirmar la ausencia de subestructura o diferenciación genética entre sus linajes matrilineales. Por lo que se puede asumir que las diferencias lingüísticas de la población autóctona vasca, no se corresponden con diferencias genéticas. Por otra parte, se concluye que no hay indicios que demuestren que exista o haya existido una relación genética estrecha entre las poblaciones analizadas, autóctonos vascos, georgianos y bereberes. Además, de este estudio se desprende, que no puede asumirse una clara diferencia entre la población autóctona vasca y sus poblaciones vecinas europeas que permitiera determinar que pertenecen a dos poblaciones fundadoras diferentes.

Autor: SANTANA RODRÍGUEZ ALFREDO.
Año: 2002.
Universidad: LAS PALMAS DE GRAN CANARIA.
Centro de lectura: CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.

Resumen: La Hiperoxaluria Primaria tipo I (HOP1) es una enfermedad de claro componente genético con carácter autosómico y rasgo recesivo cuya causa principal es la deficiencia funcional de la enzima hepática Alanina-Glioxilato Aminotransferasa (AGT). Como consecuencia, los pacientes generan grandes cantidades de oxalato sufriendo, desde las primeras etapas de la vida, litasis renal y nefrocalcinosis progresando más o menos rápidamente a un cuadro de insuficiencia renal; el posterior depósito sistémico del compuesto tóxico provoca la aparición de patología secundaria (cardiomiopatía, livedo reticularis, …). A través del uso de técnicas de rastreo genético como son la SSCP y secuenciación, tanto mensual como automática, hemos logrado localizar las mutaciones en el gen AGXT responsables de la aparición del fenotipo patológico en nuestros pacientes. El desarrollo de este primer acercamiento a la enfermedad nos ha permitido concluir que la mayoría de los pacientes diagnósticados de HOP1 en nuestro Hospital portan en homocigosis la mutación lle244Thr en el Exón 7 del gen AGXT. La experimentación en diferentes sistemas, especialmente en células en cultivo, nos ha permitido descubrir la etipatogenia de la mutación pudiendo incluir la variante canaria de la enfermedad en el novedoso grupo de Enfermedades Conformacionales. Asimismo, los positivos resultados obtenidos con varias moléculas pequeñas y fármacos abren una esperanzadora vía de futuro tratamiento farmacológico de la patología.

Autor: DELGADO ARELLANO M. LUISA.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE VALENCIA.

Resumen: En la tesis se aborda la caracterización de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como proteína de la pared celular de las especies fúngicas Candida albicans y Saccharomyces serevisiae. La presencia de la GAPDH en la pared celular de C.albicans ya había sido descrita anteriormente por nuestro grupo. En primer lugar, se ha demostrado que la GAPDH de C.albicans, proteína mayoritariamente citosólica y que carece de péptido señal responsable de su posible secreción, es capaz de dirigir su incorporación a la pared celular, y se ha identificado la región de la proteína que contiene los dominios responsables de dicha incorporación. Mediante una aproximación genética, usando la invertasa interna como proteína "reporter" para la expresión heteróloga de proteinas de fusión GAPDH-invertasa en una cepa Suc de S.cerevisiae, se ha demostrado que primera mitad (N-terminal) de la estructura primaria de la proteína contiene las señales responsables de la secreción de la GAPDH a la pared celular. Por otra lado, se ha descrito por primera vez la presencia de la GAPDH en la pared celular de S.cerevisiae. El estudio de la GAPDH de S.cerevisiae en esta nueva localización ha permitido demostrar que los productos de los tres genes TDH (TDH1-3) que codifican para la GAPDH, están asociados a la pared celular. Por último, se ha realizado un estudio de la expresión de la GAPDH en la superficie celular de C.albicans y S.cerevisiae en respuesta a diferentes condiciones ambientales, tales como estrés térmico y nutricional. Ambos factores producen un aumento de la actividad GAPDH asociado a la parede celular: dicho aumento se debe a un aumento en la cantidad de proteína presente en la pared celular, y es independiente de la síntesis proteica de la ubiquitina de respuesta a estrés.

Autor: GALÁN ALBIÑANA M. AMPARO.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Candida albicans es un hongo patógeno oportunista capaz de provocar infecciones a nivel superficial y sistémico, provocando cifras de mortalidad de hasta el 35% en pacientes inmunodeprimidos. Entre los factores de virulencia de este hongo destaca el dimorfismo que es la capacidad que tiene el hongo de crecer tanto en forma levaduriforme como micelial. En los últimos años, nuestro grupo ha desarrollado una línea de investigación encaminada a la caracterización de componentes celulares con el fenómeno del dimorfismo y de interacción del hongo con el hospedador. En este contexto, el principal objetivo de este trabajo consistió en el aislamiento y caracterización de un nuevo gen mediante elinmunorrastreo de una genoteca de expresión con un anticuerpo policlonal de la forma micelial del hongo (Pab anti-gt). Dicho gen está contenido en el contig 4-3030 (ahora 6-2517) del proyecto de secuenciación del genoma de C.albicans, carece de homología significativa con ninguna secuencia conocida, y contiene un marco abierto de lectura que codifica para una proteína de 1197 aminoácidos, con un peso molecular aproximado de 134 kDa, y con un elevado porcentaje molar de lisina (14,5%) y ácido glutámico )16,7%), por lo que se le ha denominado Ker1p. Ensayos de inmunotransferencia de fracciones celulares con el anticuerpo PAb anti-gt y con un anticuerpo policlonal inmunoespecífico frente a Ker1p (PAb anti-Ker1p), revelaron que Ker1p se localiza en la membrana plasmática de C.albicans. Además, el análisis de la expresión de KER1 reveló que éste se induce en células crecidas en los medios de Lee y M199 a pH alcalino, queda reprimida a pH ácido y está regulado por RIM101, el factor de transcripción que controla el dimorfismo y la expresión de genes dependientes de pH en este hongo. El análisis fenotípico del mutante nulo ker1/ker1, reveló que KER1 debe estar implicado en la biogénesis o composición de la pared celular de C.albicans, así como en su virulencia, como se deriva de los resultados obtenidos en un modelo experimental de infección sistémica en ratones. Finalmente, la utilización de KER1 como sonda en ensayos de PCR, ha permitido la caracterización inequívoca de 150 aislados clínicos de C.albicans, así como la discriminación con otras especies del género Candida que presentan menor sensibilidad a terapias antifúngicas.