BIOQUIMICA MOLECULAR, 17

Autor: ZURITA NOVARO ADA IRENE.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se han aislado tres proteínas antigénicas de Leishmania braziliensis candidatas a ser estudiadas como posibles herramientas de diagnóstico de la lieshmaniasis causada pro este parásito, denominadas pLb70, pLb87 y pLb99. Presentan un alto porcentaje de reconocimiento por los sueros de pacientes con leishmaniasis y muy baja reacción cruzada con sueros chagásicos. La identificación d epLb70 determinó que codifica la Hsp70 de L. Braziliensis, no caracterizada hasta la fecha.Se ha aislado y caracterizado el gen que la codifica, determinando que consta de una única copia, al contrario que en otros tripanosomátidos.Se ha expresado como proteína recombinantes y también se ha dividido en 5 fragmentos solpantes para estudiar su antigenicidad y realizar el correspondiente mapeo antigénico.El fragmento recombiante carboxiterminal rLb70(513-663) presenta una sensibilidad del 70% y una especificaidad del 100%. Alcanzando el objetivo principal palanteado en esta Tesis Doctoral, este fragmento podría se utilizado para el diagnóstico específico de la lesihamaniasis cutánea y mucocutánea causada por L. Braziliensis.

Autor: RODRÍGUEZ GARCÍA LETICIA.
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: En la presente tesis se describe la secuenciación y caracterización de los genes oleV, oleW, oleL, oleS, oleE y oleU, demostrándose su implicación en la biosíntesis de dTDP-L-olivosa mediante la generación de los plásmidos pOLV y pOLE. Este último plásmido incluida el gen oleY. Tras sobreexpresar dicho gen, se hicieron ensayos de actividad frente a distintos sustratos, concluyendo que la metiltransfersas OleY actúa sobre el azúcar unido al aglicón.Este enzima ha sido purificado y caracterizado, concluyendo que actúa a un rango de pH restringido, que su forma nativa es dimérica,que requiere cationes para su buen funcionamiento y que es capaz de metilar L-micarosil-eritronólido B y L-ramnosil-eritronólido B. Los plásmidos pOLV y pOLE fueron introducios en una cepa de S. Lividans que incluía el cósmido cos16F4, obteniéndose los compuestos híbridos: L-olivosil-8-demetil-tetracenomicina C, L-oleandrosil-8-demetil-etracenomicina C, 2'-demetoxi-eloramicina y eloramicina. La obtención del último compuesto nos llevó a concluír que con los genes de biosíntesis de L-olivosa se podía generar el azúcar L-ramnosa, y para confirmarlo se constryó el plásmido pRHAM. Por útlimo en el trabajo se ha construído un plásmido de cassettes pLN2 utilizando los genes de biosíntesis de L-oleandrosa. Este plásmido era capaz de generar 2,6 y 6 deoxiazúcares mediante intercambio, deleción y adición de genes pertenecientes a otros rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes pertenecientes a otras rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes codificadores de 4-cet-reductasas y la generación de un plásmido capaz de sintetizar dTDP-L-rodinosa.

Autor: QUILES ROSILLO M. DOLORES.
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: El gen crgA es un regulador negativo de la biosintesis de carotenos en el hongo Mucor circinelloides. La biosintesis de carotenos en este hongo es inducida por la luz azul, pero las estirpes mutantes en el gen crgA sobreacumulan carotenos tanto en la luz como en la oscuridad. Esta sobreacumulacion de carotenos esta relacionada con una sobreexpresion de los genes estructurales de las carotenogenesis. Con el objetivo de profundizar en la funcion del gen crgA se han aislado, mediante la tecnica de hibridacion diferencial de mensajeros ("differential display"), dos genes reprimidos por el gen crgA: los genes cigA y cigB. Para determinar la funcion de estos genes se han generado,mediante reemplazamiento genico, mutantes nulos para cada gen. La falta del gen cigB no provoca la aparicion de un fenotipo caracteristicos, mientras que la falta de gen cigA tiene como consecuencia una reduccion del tamaño de las colonias, surgiriendo la implicacion del gen cigA en el crecimiento vegetativo. El hecho de que los mutantes en el gen cigA o cigB no esten afectados en carotenogenesis, junto con la implicacion del gen cigA en el crecimiento, apunta a que el gen crgA esta implicado en la regulacion de otros procesos celulares aparte de la carotenogenesis. Analisis de secuencia que flanquean el locus crgA ha permitido identificar un gen, denominado cigC, con alta homologia al gen cigA y cuya expresion es tambien reprimido por crgA. De esta forma se ha definido una familia de genes cig, que podria estar compuesta por el menos seis miembros, tal como sugieren los experimentos de hibridacion del DNA genomico con sondas de cigA, en condiciones de baja homologia. La expresion de los genes cigA y cigC en respuesta a la luz se ha analizado a nivel de la acumulacion de mensajeros. Los niveles de mensajero de ambos genes es inducida por la luz. La aparicion de varios maximos tras el pulso sugiere la existencia de distintas velocidades de transduccion de la señal luminosa. El patron de expresion del gen cigA es muy similar cuando los micelios se someten a un tratamiento de luz continua, revelando la existencia de un mecanismo de fotoadaptacion de la expresion genica en M. Circinelloides. Asi, los resultados obtenidos en esta tesis sugieren la existencia de al menos tres mecanismos implicados en la regulacion de la expresion del gen cigA: uno que la reprime y en el que participa la proteina crgA; otro responsable del incremento de los niveles de mensajero inducido por la luz; y un tercero, implicado en la fotoadaptacion.

Autor: MONSERRAT COLL M. ASUNCION.
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: QUIMICA .
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DE LA ARRIXACA.

Resumen: Hemos investigado los efectos del etanol sobre la fluidez de hematies y plaquetas en alcoholicos cronicos con minimo daño hepatico. Tras observar variacion en la fluidez de las plaquetas, estas se fluidifican, y no en los hematies, hemos analizado la composicion lipidica de las plaquetas y hematies, asi como las distintas fracciones fosfolipidicas y los acidos grasos de los fosfolipidos de las plaquetas para intentar relacionarlos con la variacion observada en la fluidez de las membranas. Hemos llegado a la conclusion de que: 1 El consumo de alcohol provoca variaciones significativas en la fluidez de la membrana de plaquetas, apreciandose un aumento de esta: este efecto no se aprecia en la membrana de hematies. 2 El aumento de la fluidez de la membrana de plaquetas puede explicarse tanto por el descenso en la concentracion de colesterol, como por las variaciones observadas en las distintas fracciones de fosfolipidos. 3 el contenido de los acidos grasos en la membrana de plaquetas no es responsable de los cambios observados en la fluidez, ya que no se observan diferencias en los indices de saturacion e insaturacion. 4 Podemos rebatir la teoria que postula que el consumo cronico de alcohol tiene dos efectos sobre la fluidez de la membrana: por una parte, no se ha observado el fenomeno de rigidificacion basal postulado como explicacion del fenomeno de dependencia, y por otra parte no se aprecia proteccion frente a la fluidificacion provocada por la exposicion aguda al etanol, que serviria como explicacion de la tolerancia en los alcoholicos cronicos.

Autor: MARTÍN CASANUEVA MIGUEL ÁNGEL.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA Y HOSPITAL 12 DE OCTUBRE.

Resumen: En el presente estudio se tipifican las bases moleculares de 60 pacientes con síndrome de intolerancia al ejercicio, 38 de los cuales presentaron déficit de miofosforilasa MPL, 16 déficit de carnitina-palmitil transferasa II CPT II, y 6 déficit de mioadenilato desaminasa MADA. Las mutaciones más frecuentes en el gen PYGM asociadas a déficit de MPL fueron la R49X, W797R, G204S y 753delA. Además se han encontrado 12 nuevas mutaciones en el gen PYGM que cumplieron los criterios de patogenicidad exigidos. En los pacientes con déficit de CPT II la mutación más frecuente en el gen CPT2 fue la S113L. Además se han encontrado 3 nuevas mutaciones patogénicas en el gen CPT2. Los pacientes con déficit de MADA era portadores de la mutación Q12X en el gen AMPD1. Se describen métodos por PCR-RFLP para realizar el cribado molecular de dichas mutaciones.

Autor: GOMEZ GALLEGO FELIX.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS.

Resumen: La glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza la primera reaccion de la ruta de las pentosas fosfato en la que la glucosa 6 fosfato se transforma en 6 fosfogluconolactona con la concomitante reduccion de NADP a NADPH. En eritrocitos esta reaccion constituye la principal fuente de poder reductor por lo que la funcion de la G6PD se hace esencial en procesos de proteccion de los eritrocitos frente a un daño oxidativo. La deficienca en glucosa 6 fosfato deshidrogeasa representa uno de los defectos geneticos mas frecuentes en humanos debido, probablemente, a un proceso de proteccion de los eritrocitos deficientes a la proliferacion de los parasitos responsables de la malaria. Una de las variantes deficientes que aparece con mas frecuencia en poblaciones de Africa es la G6PD A- que difiere de la variante normal (G6PD B) en dos sustituciones aminoacidicas (V68M y N126D). Por otra parte la presencia de una de esas mutaciones (N126D) en otra variante (G6PD A) no provoca deficiencia. Debido a la alta inestabilidad estructural de la molecula de G6PD A- puesta de manifiesto por sus bajos niveles de actividad en eritrocitos, el objeto de este trabajo es la determinacion de las lesiones estructurales responsables de la inestabilidad en la molecula de la variante deficiente G6PD A-. Los resultados obtenidos muestran que la inestabilidad in vivo de esta variante puede ser debida tanto a la perdida de determinantes de plegamiento que impiden que se alcance un estado plegado cataliticamente activo como a modificaciones en su estructura que se ponen de manifiesto a traves de los cambios observados en los contenidos en estructura secundaria y terciaria, la menor entalpia de desnaturalizacion y los cambios en distacias internas entre residuos dentro del dominio del coenzima.

Autor: HERMOSO CALATRAVA FRANCISCO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Se estudian los efectos cardiovasculares y renales de un modelo animal de hipertensión renovascular: Goldblatt dos riñones un clip (G2R1C), sobre la actividad aminopeptidásica relacionada con el matabolismo de la angiotensina, vasopresina y hormona liberadora de tiotropina. Las actividades enizmáticas se analizaron en plasma, rión, aurícula derecha, pulmón, ventrículo izquierdo y cayado aórtico de ratas normotensas e hipertensas (G2R1C), tratadas y no tratadas con el antagonista de los receptores AT1: valsartan. Los resultados sugieren un metabolismo reducido de la Ang II en el pulmón y la aorta de ratas G2R1C. Esta reducción podría prolongar la vida media de la Ang II y contribuir así al mentenimiento de la hipertensión. Además, el valsartan, aumentó la activiad degradativa de Ang II en el cayado aórtico de ratas normotensas pero no de las hipertensas. Por otro lado, en el riñón, las principales diferencias producidas por la hipertensión o el tratamiento con valsartan se observaron en la actividad degradativa de Ang III y en la actividad degradativa de vasopresina. Estos cambios enzimáticos podrían suferir respectivamente, modificaciones en el flujo sanguíneo del riñón no isquémico y una conesión funcional entre el receptro AT1 y la actividad degradativa de vasopresina a nivel renal. En definitiva, estos resultados sugieren un papel importante para estas actividades aminopepetidásicas en el desarrollo y mantenimiento de la hipertensión renovascular.

Autor: VALLADARES LÓPEZ M. AMPARO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En esta Tesis Doctoral hemos querido profundizar en el papel de diferentes miembros de la superfamilia de las MAPKs durante el desarrollo fetal del tejido adiposo marrón, analizando in vitro la regulacion de los procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis por estas vías en respuesta a diferentes señales. Por un lado, hemos observado que el TNF-alfa inhibe la proliferación basal y la inducida por IGF-I e insulina en adipocitos marrones fetales de rata, y mientras que la p38MAPK media dicha parada del ciclo celular, las ERKs juegan un papel opuesto. Además, el TNF-alfa induce a un proceso de apoptosis en este tejido, que es rescatado de manera específica por el IGF-I. La p38MAPK media este proceso de apoptosis, mientras que las ERKs median supervivencia celular. Por otro lado, las JNKs no parecen jugar ningún papel en esta apoptosis inducida por el TNF-alfa. Respecto a la inhibición de la diferenciación adipogénica y termogénica inducida por el TNF-alfa en los adipocitos marrones, hemos comprobado que la p38MAPK regula positivamente ambos procesos de diferenciacion. Por el contrario, las ERKs son responsables de la inhbición de la diferenciación termogéncia, teniendo un efecto regulador negativo discreto sobre la diferenciación adipogéncia. Además, hemos observado que las ERKs median la proliferación inducida por la noradrenalina en los adipocitos marrones fetales de rata por un mecanismo independiente de la vía AMPc/PKA, mientras que regulan negativamente la diferenciación termogénica. Finalmente, el tratamiento crónico con insulina induce un proceso de apoptosis en los adipocitos marrones fetales de rata, probablemente mediante la indcución de la síntesis de un factor proapoptótico a través de la vía mTOR/p70 s6k.

Autor: CASTRILLO VIGUERA ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC QUIMICAS.

Resumen: La activacion del macrofago es un proceso clave en la respuesta inmune innata y constituye la primera linea de defensa del organismo frente a infecciones bacterianas, fúngicas y virales. Datos bioquímicos, farmacológicos y genéticos apuntan a que el factor NFKB constituye una diana importante en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias. Por esta razon, el conocimiento de los sucesivos pasos que conducen a la activacion de NFkB esta siendo objeto de una intensa investigacion. En ese sentido, nuestro trabajo en los últimos años ha consistido en el estudio de la señalizacion inflamatoria en macrófagos, con especial atención sobre la regulacion de la actividad de NFkB. Ademas, se han analizado moléculas que modulen la activacion de NFkB, para su uso como posibles agentes farmacológicos. De forma resumida podemos destacar: -Las prostaglandinas tipo ciclopentenona, como 15-desoxi- 12,14-PGJ2 (15dPGJ2), ejercen efectos antiinflamatorios ya que inhiben la expresion de genes como NOS-2 y COX-2, inducidos en macrófagos estimulados con lipopolisacarido y otras citoquinas proinflamatorias. -Parte de estos efectos son independientes de la union al receptor de proliferacion peroxisomal tipo-y (PPAR-y), y son debidos a la inhibicion de la actividad IkB quinasa (IKK) in vitro e in vivo. -Ademas, 15dPGJ2 contribuye a la resolucion de la inflamacion promoviendo la muerte por apoptosis de macrófagos que han participado en el proceso inflamatorio. -Los diterpenos tipo kauranos, obtenidos del genero Sideritis, inhiben la ruta de NFkB. Parte de este efecto se debe a la inibición de la actividad de la quinasa inductora de NFkB. Parte de este efecto se debe a la inhibicion de la actividad de la quinasa inductora de NFkB(NIK), uno de los responsables de la activacion del complejo IKK. -Ademas, nuestros resultados sugieren que la proteina quinasa C E(PKCE) es un mediador importante en la activacion de macrófagos ya que su ausencia compromete la respuesta inmune frente a varios tipos de patogenos.

Autor: ORTIZ CODORNIU CRISTINA M..
Año: 2001.
Universidad: GRANADA .
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Resumen: El phoR1 es un gen de Myxococcus xanthus constituido por un marco abierto de lectura de 1362 pares de bases con un uso de guaninas o citosinas en la tercera posicion de codones del 93% y precedido en 15 pares de bases por una secuencia de Shine-Darlgano. El gen phoR1 de Myxococcus xanthus codifica una proteina de 455 aminoacidos que consta de dos subdominios. El subdominio aminoerminal (aminoacidos 1 al 224) presenta dos regiones hidrofobas suficientemente largas cada una de ellas como para atravesar la membrana (aminoacidos 1 al 50). El dominio carboxiterminal guarda aquellas caracteristicas conservadas que caracterizan la familia de quinasas en histidina del sistema de transduccion de señales de dos componentes, con una alta homologia especialmente con la subfamilia PhoR de los regulones Pho. Una cepa mutante en el gen phoR1 de Myxococcus xanthus presenta una actividad fosfatada menor que la correspondiente cepa salvaje, forma cuerpos fructificantes inmaduros y produce hasta un 50% menos de esporas durante el ciclo de desarrollo, si bien estas esporas son capaces de germinar mas eficientemente que en la correspondiente cepa salvaje. Esta misma cepa mutante de Myxococcus xanthus muestra un movimiento anormal. Esta anormalidad no radica en el sistema aventurero ni en el social sino que tiene su origen en un inicio destemporalizado de la migracion del enjambre.

Autor: MUÑOZ PINEDO CRISTINA .
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El desbalance en los niveles de nucleótidos trifosfato induce apoptosis en células hematopoyéticas. En este trabajo se ha estudiado la implicación de la proteína supresora de tumores p53 y la relación con la vía de apoptosis inducida por ligandos de muerte. La timidina exógena, pero no la uridina, inhibió la muerte inducida por el inhibidor de la timidilato-sintasa 5-fluoro-2'deoxiuridina (FUdR). La acumulación de p53 no fue necesaria para este proceso de muerte. Se observó liberación de citocromo c durante este proceso, y esto se produjo en ausencia de activación de caspasas. La caspasa/8 se activó, pero esta activación no resultó esencial para el desarrollo de la apoptosis. La despolarización mitocondrial observada ocurrió como consecuencia, no como causa, de la activación de caspasas. La inhibición de la glicolisis produjo la inhibición de la muerte inducida por FUdR, inhibiéndose este proceso en un punto anterior a la liberación de citocromo c. Sin embargo, en las mismas condiciones, se potenció la apoptosis inducida por activación de receptores de muerte de la familia del receptor del Factor de Necrosis Tumoral alga (TNF-alfa). Se demostró que las células, en condiciones de bajo ATP, seguían muriendo por apoptosis, no por necrosis. En medio sin glucoso, o en presencia del inhibidor de la glicolisis 2-deoxiglucosa, se observó sensibilización de varias líneas tumorales a la apoptosis inducida por TNF-alfa, TRAIL y un anticuerpo activador de Fas. Tanto la activación de caspasas como la vía mitocondrial estaban potenciadas en estas condiciones, y se determinó que incluso la activación de la caspasa-8 apical ocurría antes en ausencia de glucosa que en medio de cultivo con glucosa. Este fenómeno se observó en varias líneas tumorales de distinto origen, lo que sugiere nuevas posibildiades terapéuticas del uso combiando de inhibidores de glicólisis y ligandos de muerte que matan selectivamente células tumorales.

Autor: IZQUIERDO RUIZ JOSE.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los lipidos de las membranas biologicas pueden influir sobre la funcion de ciertas proteinas ubicadas en ella. Esta sensibilidad puede involucrar cambios conformacionales que afecten al centro activo de las enzimas. Es razonable asumir que si el microentorno lipidico es sensible a alteraciones externas, una proteina embebida en ese dominio lipidico puede ser tambien sensible y de este modelo su funcionamiento se veria alterado. La mayor dificultad en el estudio de las interacciones lipido-proteina es poder simplificar un sistema multiparametrico complejo y ajustarlo a unos pocos parametros independientes. Uno de los caminos por los que se ha llevado a cabo esta simplificacion es la utilizacion de sondas o agentes externos que puedan introducirse dentro de la membrana y monitorizarse su comportamiento por una serie de tecnicas diferentes. En el trabajo de investigacion de la presente tesis doctoral se analizan dos actividades enzimaticas ligadas a la membrana del reticulo endoplasmatico, la reaccion de intercambio de bases, mediada por enzimas que catalizan la incorporacion, independiente de energia, de serina y etanolamina a fosfolipidos de la membrana, y por otro lado la incorporacion selectiva de acidos grasos a fosfolipidos mediante actividades acil CoA:lisofosfolipido aciltransferasas. Una propiedad particularmente interesante de la membranas biologicas es la distribucion asimetrica de sus componenetes lipidicos. En membranas subcelulares, aunque se admite la existencia de esta asimetria, la distribucion transmembrana especifica de los fosfolipidos es materia de continuos debates. La distribucion especifica de los fosfolipidos dentro de la bicapa lipidica plantea cuestiones fundamentales como: donde se origina, como se mantiene y regula, cual es su papel funcional y cuales son las consecuencias de la alteracion de los procesos reguladores de dicha distribucion. En el presente trabajo de tesis doctoral analizamos la posible influencia de agentes lipofilicos como etaol, acetonitrilo, dimetilsulfoxico y estearilamina en los procesos de remodelado y distribucion de aminofosflipidos de la membrana a traves de ciclos de desacilacion/reacilacion y de la ruta de sintesis de aminofosfolipidos mediante reaccion de intercambio de bases. Y mas especificamente: a)Estudio de la influencia de agentes lipofilicos sobre los procesos de remodelado de fosfolipidos en microsomas hepaticos. Para ello analizamos la incorporacion selectiva de acidos grasos con diferente grado de insaturacion (palmitico y oleico) a una u otra monocapa de la membrana. B)Determinacion de los principales sistemas enzimaticos implicandos en la sintesis de aminofosfolipidos mediante la reaccion de intercambio de bases y por lo tanto directamente responsables del remodelado de estos lipidos. Distribucion transbicapa de aminofosfolipidos. Conclusiones: Los agentes exogenos etanol, acetonitrilo y dimetilsulfoxido fluidifican la membrana microsomal de higado de rata e inhiben la reacciones de intercambio de bases. Al contrario, la estearilamina rigidifica la membrana y activa dichas actividades enzimaticas. Asi pues se demuestra la existencia de una estrecha correlacion entre actividad enzimatica y estado fisioquimico de la membrana. La distinta sensibilidad que muestran desde el punto de vista cinetico los procesos de sintesis de fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina a los agentes exogenos nos permiten deducir la existencia de dos proteinas diferentes, una de ellas especifica para la sintesis de fosfatidilserina y otra que puede sintetizar tanto fosfatidilserina como fosfatidiletanolamina. Las enzimas implicadas en las reacciones de intercambio de bases pueden utilizar indistintamente como sustrato endogeno fosfolipidos localizados en una u otra monocapa de la membrana. Los aminofosfolipidos sintetizados mediante reacciones de intercambio de bases son transportados eficientemente a la monocapa luminal de la membrana microsomal. El transporte de fosfatidilserina es mas efectivo que el fosfatidiletanolamina, sugirieron que esta caracteristica puede determinar la existencia de mayores proporciones de fosfatidilserina en la monocapa luminal del reticulo endoplasmatico. El proceso de reacilacion de fosfolipidos de membrana es dependiente del grado de orden de la misma, de modo que su fluidificacion disminuye la acilacion con acido oleico, mientras que la rigidificacion incrementa la incorporacion de este acido graso a los fosfolipidos mayoritarios. La fosfatidilserina recien acilada es transportada a monocapa interna mas eficientemente que la fosfatidiletanolamina, ademas, las especies moleculares de aminofosfolipidos son translocadas a velocidades distintas, siendo mas activo el transporte para especies saturadas que insaturadas. La fosfotidilserina de reticulo endoplasmatico es activamente transportada a mitocondrias, donde se descarboxila de forma eficiente para generar fosfofatidiletanolamina. Esta a su vez es, en parte, transportada a microsomas. El alcohol interfiere especificamente en el transporte del aminofosfolipido a mitocondrias, sin afectar significativamente al resto de procesos.

Autor: GALLEGO GARCÍA CLARIBEL.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Resumen: El protozzo parásito Leishmania major es el agente causal de una de las enfermedades infecciosas que afectan a mayor número de personas a nivel mundial. Actualmente existen alrededor de 350 millones de individuos expuestos a al enfermedad, de los cuales cerca de 12 millones la minifiestan, apariciendo 1,5-2 millones de casos nuevos al año. Hoy en día la asociación de lishmaniasis visceral con el SIDA se considera una enfermedad emergente. Teniendo en cuenta que no existe ninguna terapia totalmente efectiva frente a la infección, que los fármacos utilizados son muy tóxicos y la aparición de resistencias a ellos por parte del parásito, hace necesario buscar nuevas estrategias para combatir la enfermedad. En general, los protozoos parásitos son organismos altamente sensibles la estrés oxidativo. Bien porque su hábitat es pobre en oxígeno o porque en algún caso carecen de alguna de las enzimas que metabolizan su hábitat es pobre en oxígeno o porque en algún caso carecen de alguna de las enzimas que metabolizan radicales libres, por ejemplo Leishmania no posee catalasa, son susceptibles a la acción de especies reactivas del oxígeno. Durante la fase en el interior de la célula huésped, Leishmania está expuesta a la acción de diversos radicales libres como peróxido de hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2) y óxido nírico (NO), que son liberados por el macrófago durante la fagocitosis como mecanismo de defensa del huésped contra el parásito. A pesar de ello, Leishamnia es capaz de sobrevivir en el interior del macrófago, evolucionar hasta la forma mastigote, multiplicarse y seguir infectando a nuevos células. En estas situaciones de estrés oxidativo, el parásito debe desarrollar mecanismos de defensa antioxidante. Son numerosos los daños que se producen en el organismo patógeno. La oxidación de lípidos y la desnaturalización de proteínas se podrían considerar daños secundarios pues estas macromoléculas puden ser sutituidas por correctas, sin embargo las lesiones en el DNA si no son reparadas se transmitirán de generación en generción de forma prácticamente intacta, implicando una alteración de la integridad genética y por consiguiente una disminución de la viabilidad celular. Por ello probablemente el parásito posea mecanismos altamente eficientes para repararlas lesiones que se producen en su genoma. Uno de los mecanismos principales responsable de la reparación de los daños oxidativos delDNA es el mecanismo de reparación por descisión de bases. A través de este proceso son reparados los sitios básicos, siendo esta lesión una de las que con más frecuencia se origina en el DNA. Son lesiones mutagéncias y citotóxicas, por lo que su reparación es esencial para garantizar la viabilidad celular. En el proceso de reparación los sitios abásicos son reconocidos específicamente por las AP endonucleasas, enzima presente a lo largo de toda la escala filogenética y esencial para todos los organismos. Se ha aislado el gen que codifica a la AP endonucleasa de Leishamania. Se trata de un gen de copia única y se localiza en un cromosoma de aproximadamente 700 kb, que corresponde a los cromosomas 16 ó 17 que comigran en electroforesis de campos pulsados. El gen se transcribe dando lugar a un único RNA mensajero de alrededor de 2,4 kb. Para la caracterización de la proteína se utilizó el sistema de expresión pET28a, a través del cual el producto de expresión del gen APLM clonado presenta una cola de histidinas fusionado al extremo amino que permitió purificar la proteína recombinate mediante cromatografía de afindiad utilizando columnas de agarosa-Niquel. La AP endonucleasa de Lesihmania es monomérica y reconoce específicamente sitios AP en un DNA de doble hebra. Para la caracterización cinética se utilizó como sustrato un DNA dúplex de 21 nucleótidos que presentaba un sitio abásico sintético (residuo de tetrahidrofurano).Al igual que otras AP endonucleasas,la perteneciente a Lesihmania es dependiente de cationes divalentes, siendo el Magnesio el metal preferente. La máxima actividad se detecta al pH superior a 7 y el aumento de fuerza iónica tiene un efecto estimulador sobre la actividad AP endonucleasa.Por el contrario, este incremento en la concentración de sal inhibe la actividad 3'-5' exonucleasa de la proteína, actividad minoritaria responsable de la liberación de nucleótidos desde extremos 3'-OH de DNA dúplex. Los valores cinéticos obtenidos para el sustrato THF-DNA fueron semejantes a lo qeu presentó la enzima homóloga humana, lo que puso de manifiesto su elevada especificada para el sustrato.Además, la AP endonucleasa tiene actividad 3'-fosfodiestresas a través de la cual actúa sobre extremos 3' alterados que bloquean la replicación, como residuos de fosfoglicolato, y que son originados por radicales libres. La localización subcelular de la AP endonucleasa es preferentemente nuclear, aunque también aparece proteína asociada al citosol y al kinetoplasto. Además se ha observado que la expresión de la proteína protoxoaria confiere un fentoipo de resistencia a cepas de C. Coli hipersensibles a agentes alquilantes y oxidantes, sugiriendo que presenta una actividad reparadora equivalente a la de la exonucleasa III de E. Coli. De igual manera la sobreexpresión de la proteína en formas promastigotes de Lesihmania les confiere una resistencia moderada aperóxido de hidrógeno y a metotrexato, lo que apoyaría su papel en la reparación de lesiones en el DNA generados por otros compuestos. Asimismo, la framentación del DNA de forma promastigones de Lesihmania inducida por metrotexato es inhibida en células que sobreexpresan la proteína AOLm, sugiriendo que bajo estas condiciones la proteína ejerce una función protectora a nivel celular. Por útlimo, se ha detectado un mecanismo de regulación de la AP endonucleasa a nivel postraduccional mediante fosforilación. In vitro,la proteína recombinate se autofosforila en presencia de ATP. Asimismo, la proteína es fosforialda por caseina quinasa II, lo que provoca un aumento de su actividad AP endonucelasa. Este resultado sugiere que in vivo la fosforilación de la AP endonucleasa mediada por esta quinasa podría tener una función biológica.

Autor: CEBRIÁN LIGERO CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Nuestro laboratorio se ha centrado desde hace años en el estudio del gen codifica para la kidney-androgen regulated protein (KAP) en el riñón murino, como modelo de estudio de los mecanismos moleculares que controlan la regulación de la expresión génica mediada por andrógenos en el riñón. Este gen, expresado de forma exclusiva en las células epiteliales del túbulo proximal renal, exhibe un control multihormonal específico en los distintos segmentos del mismo, en los que participan, andrógenos, estrógenos y hormona tiroidea. La comparación de las secuencias génicas y de la proteína deducida de KAP con las depositadas en las bases de datos no revela ninguna homología con otros genes o proteínas conocidas. Los análisis de predicicón de dominios funcionales tampoco sugieren una posible localización o función para la misma. Pese a ello,la relativa abundancia del mRNA de KAP, sulocalización exclusiva en el epitelio del túbulo proximal y el estricto control multihormonal de su expresión, sugieren que podrían tratarse de una proteína de relevancia en fisiología renal y por ello el objetivo de esta tesis es la identificación y la caracterización funcional de la proteína KAP. La producción de anticuerpos monoclonales contra dos péptidos sintéticos de la proteína KAP nos ha pemitido identificar endógena por inmunohistoquímica y Western blot en riñón murino. La distribución celular y control androgénico se corresponde con la del mRNA y su tamaño aparente es de 20 kDa. La proteína también ha sido expresada y caracterizada en sistemas heterólogos tales como bacterias y levadura. Ensayos de dos híbridos en levadura han permitido observar que KAP interacciona de forma específica con le receptor de CsA, CyPB, habiéndose confirmado la interacción por técnicas de pull down. Pese a los beneficios de la CsA como inmunosupresor, prviniendo el rechazo al injerot en pacientes trasplantados, su uso se ve limitado por los graves efectos tóxicos que produce en el riñón, especialmente en las células del túbulo proximal. La interacción de KAP y CyPB nos ha llevado a analizar los efectos de la CsA sobre la interacción KAP-CyPB y sobre la expresión de KAP. Observamos que la CsA nos desplaza la interacción entre KAP i CyPB. Hemos demostrado que la administración de CsA a ratones de la cepa C5BL/6, disminuye de forma significativa los niveles de la proteína KAP en extractos crudos de riñón. En líneas celulares de túbulo proximal murino, la presencia de CsA aumenta la secreción de KAP al medio de cultivo. Asimismo, la transfección estable de KAP y su sobreexpresión controlada por tetraciclina en un sistema celular de túbulo proximal, disminuye de forma significativa la toxicidad por CsA.

Autor: DÍEZ MORENO BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Los picoeucariontes que, junto con los procariontes heterotróficos y fototróficos, forman el picoplancton, puede constituir una parte importante de la biomasa del mismo e incluso de todo el sistema. Su contribución a la producción primaria del ecosistema es también muy significativa. Pero hasta el momento la diversidad de la fracción eucariótica que forma la comunidad picoplanctónica marina era muy desconocida. La identificación de la fracción eucariótica del picoplancton en comunidades naturales es a menudo una tarea difícil, debido a su similar morofología y pequeño tamaño (< 5um). Algunos de ellos pueden ser discriminados a nivel de Clase mediante microscopía electrónica o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero en la mayoría de los casos no es posible hacer una identificación a más bajos niveles taxonómicos. Por otro lado, solo un pequeño porcentaje de estas especies picoplanctónicas puede crecer en cultivo, y además no hay garantía de que estos organismos aislados en cultivo sean los dominantes en la comunidad natural. La aproximación por técnicas moleculares basadas en análisis filogenéticos de secuencias de rRNA tales como la clonación y secuenciación, y técnicas de fingerprinting como la Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) o la Terminal Restriction Fragemnt Length Polymorphism (T-RFLP), han sido una alternativa que nos ha permitido caracterizar con más detalle la diversidad del picoplancton eucariótico en muestras naturales de diferentes sistemas marinos. Se ha muestreado una gran variedad de sistemas, desde mar abierto a zonas costeras, gracias a diferentes campañas oceanográficas: Mar de Weddel-Scotia (campaña DOVETAIL; Paso Drake (campaña DHARMA); Atlántico Norte (Campaña ACSOE-NAE); Mar de Alborán (campaña MATER'97, 98 y 99). En ellas se obtuvieron muestras que abarcaban tanto la variabilidad espacial como la variabilidad temporal de las comunidades del picoplancton eucariótico marino. Gracias a la realización de bibliotecas genéticas de algunas de estas muestras (pertenecientes a la Antártida, al Mar de Alborán y al Atlántico Norte), mediante secuenciación y comparación con el banco de datos, se obtuvo información acerca de la diversidad de los grupos filogenéticos presentes en estos diferentes ambientes. Los resultados mostraron una elevada diversidad filogenética incluyendo muchos grupos taxónomicos diferentes y miembros de grupos filogenéticos distantes. La mayoría de estos grupos taxónomicos se afiliaban a organismos conocidos del picoplancton eucariótico fototróficos como las prasionofíceas, que fueron las más representadas, así como también las primnesiofíceas. Otra fracción, menos frecuente, pudo afiliarse a grupos claramente heterotróficos tales como ciliados, algunas crosofíceas, cercomondales y hongos.P ero también apareció otro elevado número de secuencias distintas a cualquier secuencia conocida y que correspondían a nuevos linajes tales como los nuevos estramenópilos y los nuevos alveolados. Estos nuevos linajes aparecieron ampliamente distribuidos tanto filogenética como geográficamente. Algunos de ellos pueden constituir una fracción importante de los microorganismos heterotróficos y jugar un papel crucial en la red trófica microbina. Técnicas de fingerprinting como la DGGE y la T-RFLP, fueron usadas para el estudio en paralelo de la diversidad de picoeucariontes en estas muestras marinas. Gracias a la optimización de la DGGE usando cebadores específicos para amplificar un fragmento del gen rRNA 18S de ecuariontes, se pudo estudiar la diversidad y variabilidad a gran escala, de una manera detallada, de las comundiades del picoplancton eucriótico mariono presentes en muestras de la Antártida y del Mar de Alborán. Esto nos permitió observar cambios en su distribución y composición no sólo a lo largo de grandientes verticales, sino en relación con escalas espaciales y temporales.

Autor: MORA CORRAL ALFONSO.
Año: 2001.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La apoptosis en los cultivos de neuronas granulares de cerebelo de rata inducida por en medio con bajas concentraciones de potasio se acompaña con una inactivación por desfosforilación de las vias de transduccion proapoptósticas p38 y JNK. De hecho, en condiciones basales ambas vías se encuentran activas. Ademas, estudiando las vías de supervivencia PI3K/PKB y ERK observamos tambien su inactivación, por desfosforilación de las quinasas de dichas vias. A su vez se ha observado que el medio proapoptótico induce la activación de la actividad serina/treonina fosfatasa de tipo 2A, 2B y 2C. El Litio protege frente a la apoptosis inducida por el medio con bajas concentraciones de potasio, impidiendo la inactivación de la PKB y la activación de la GSK3. Como, además, el litio reduce la activación de las fosfatasas estudiadas planteamos la hipótesis de que el efecto neuroprotector del litio sea debido a que mantiene activa la vía antiapoptótica PI3K/PKB. Apoyando a la anterior hipótesis, hemos descrito que la protección del Litio frente a la ceramida se debe a que impide la desfosforilación de PKB y GSK3 a traves de su bloqueo de la activación de la PP2A. Por otro lado, el Valproato protege frente a la apoptosis inducida por el medio bajo en potasio siempre y cuando la via PI3K/PKB se encuentra activa. Su mecanismo protector parece estar relacionado con las reservas de calcio intracelulares, las cuales son necesarias para que el valproato ejerza su efecto neuroprotector.

Autor: GARCIA MARTINEZ DE LECEA MARTA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las neuronas de Purkinje han sido y son centro de gran interés debido a sus exclusivas características electrofisiologicas y a su importante papel como la única vía de salida de información de la corteza cerebelosa. Considerando que la mayoria de los datos sobre la expresión de mRNA de las subunidades P2X en cerebelo proceden de ratas adultas, decidimos establecer la edad del cultivo en una semana despues del nacimiento del animal (P7), momento en que las neuronas se encuentran en una etapa más avanzada del desarrollo y de ese modo trabajar con neuronas que presenten, en la medida de lo posible, un comportamiento y unas propiedades más proximas a las de las neuronas de Purkinje adultas. Gracias al empleo de tecnicas de electrofisiologia, fluorimetria y biologia molecular, hemos puesto de manifiesto la presencia de receptores nucleotídicos P2X, en cerebelo. En cultivos primarios de cerebelo de P7 se expresan mRNAs para todas las subunidades P2X, salvo la subunidad P2X5. Las subunidades P2X1,P2X2, P2X3, P2X4 y P2X6 se localizan especificamente en las neuronas de Purkinje y forman canales funcionales de estequiometria aun no caracterizada molecularmente. Dichos receptores ionotrópicos P2X son muy permeables a Ca2+ y pueden inducir un aumento significativo de [Ca2+]i incluso sin el concurso de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje, por entrada de Ca2+ a través del propio canal P2X. En el estadio P7 existe una población mayoritaria y dominante de receptores P2X2/6, sensibles al antagonista PPADS y potenciados por Zn2+ y acidificación extracelular que corresponde a la formación de receptores heteroméricos por las subunidades P2X6 y las P2X2 y P2X2b, distinguibles por su diferente cinética de desensibilización. La expresión de las subunidades P2X cambia a lo largo del desarrollo el cerebelo. Se producen una sustitución durante la maduración de subunidades P2X2 por P2X4, cuya expresión relativa cambia 90 veces de P1 al estado adulto, mientras la expresión de P2X6 aumenta 2-3 veces y la expresión de mRNA P2X1 y P2X3 apenas varia. La presencia de receptores P2X en las células de Purkinje dota a estas celulas de un mecanismo de control de la [Ca2+]i alternativo a los ejercidos por receptores de glutamato, bien ionotropicos (via CCDVs) o metabotrópicos y operativo independientemente de la activación de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje. Este mecanismo puede ser importante para las propiedades computacionales e integradoras de las neuronas de Purkinje en el cerebelo.

Autor: TUTOR DE URETA OLGA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLOGICAS.

Resumen: En la Leucemia Linfoblastica Aguda de Celulas B precursoras infantiles de riesgo estandar existen diferentes variables morfologicas y clinicas en el momento del diagnóstico que no permiten discriminar al 20% del los pacientes que presentaran una peor respuesta frente a la quimioterapia. El estudio de la enfermedad minima residual (EMR) a lo largo del tratamiento, determinada tras el analisis del reordenamiento de los genes para los receptores de antígenos (IgH y TcRdelta) permite identificar al subgrupo de pacientes con alto riesgo de reaída. Por otro lado, la presencia de perdida alelica en la región cromosómica 9p21-22, en las muestras obtenidas en el momento del diagnóstico, es un nuevo e independiente factor pronostico del riesgo de recaidas. La coincidencia de ambos eventos (EMR y perdida alelica) permite identificar muy fiablemente al subgrupo de pacientes con un riesgo de recaída tal que podría estar indicado un abordaje terapéutico mas agresivo.

Autor: MATEO GUERRERO M. SOL.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIDAD DE GENETICA, HOSPITAL VIRGEN DE LA SALUD.

Resumen: Esta tesis contribuye de forma significativa en la comprensión, el diagnostico y el tratamiento de linfomas B esplenicos de la zona marginal. Las aportaciones originales de esta tesis han sido: -La identificación de marcadores moleculares que permiten diferenciar al linfoma esplénico de la zona marginal de otros linfoproliferativos B. La inestabilidad de microsatélites no es una caracteristica molecualar de los LEZM frente a un 25% de casos de linfomas MALT con inestavilidad de microsatelites. Se observa pérdida alélica en la región cromosómica 7q31-32 en el 40% de los LEZM frente a un 7.7% en otros linfomas B de celula pequeña. -El reconocimiento de la existencia de una heterogeneidad molecular clinicamente significativa dentro de esta enfermedad. El análisis de mutaciones somáticas en los genes bcl-6 e IgVH demuestra una heterogeneidadmolecular en este tumor, con un 49% de LEZM sin mutaciones somáticas del gen IgV H frente a un 51% de casos mutados. Los casos que presentan mutaciones para el gen IgV H tienen mejor pronostico y además un menor frecuencia de deleción cromosómica en 7q.

Autor: MARTINEZ COSO M. VICTORIA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS.

Resumen: Diferentes estudios experimentales demuestran que el factor de crecimiento para fibroblastos (FGF) tiene un efecto protector en el daño producido por la isquemia y la reperfusión en el miocardio. En este trabajo se estudia el efecto protector del FGF acido (FGFa) en un modelo experimental de isquemia miocardica en ratas, produciendo una oclusión de la arteria coronaria izquierda durante 20 minutos, seguida de reperfusión de 24 horas. El tratamiento consiste en la administración intravenos de 2,6 ug de FGFa o vehículo al inicio de la reperfusión. En estudios histológicos, de medición de la actividad de la enzimacreatina quinasa (CK), de medición de la actividad de la enzima creatina quinasa (CK), de medición de la actividad de la enzima mieloperoxidasa (MPO), de determinación de apoptosis y de determinación de la fuerza de contracción, se observa una mejora significativa en el miocardio de los animales tratados con FGFa. Para conocer el mecanismo de accion del FGF en el tejido, medimos la cantidad de GMPc como segundo mensajero de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), y observamos un aumento significativo en los animales tratados con FGFa. Ademas hicimos un pretratamiento a algunos animales con dexametasona(3 mg/kg, intraperitoneal, antes de la isquemia), inhibidor de la enzima oxido nitrico sintasa inducible (iNOS), y observamos quen o existe aumento de GMPc en el miocardio de estos animales. Por otra parte, en la detección inmunohistoquímica de la enzima iNOS, y observamos un aumento de la inmuno-reactividad de esta enzima en el area de riesgo de miocardio de los animales tratados con FGFa, mientras que este aumento no existía de los anmales pretratados con dexametasonoa y tratados con FGFa. Estos datos sugieren que el FGF tienen un efecto protector en miocardio isquemico y reperfundido, y que esta protección se produce a través de la inducción de la enzima iNOS.