BIOQUIMICA MOLECULAR, 18

Autor: MERINO MARTIN JOSE JOAQUIN.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FAC. C.C. BIOLÓGICAS.

Resumen: Dado que las glicoproteínas denominadas moléculas de adhesión celular neural (NCAM, su forma polisializada, PSA-NCAM, y LI) desempeñan un papel importante en la consolidación de la memoria, se estudió su expresión en diferentes regiones cerebrales, en ratas entrenadas en el paradigma conductual del condicionamiento del miedo al contexto, bajo diferentes niveles de estrés intrínseco (ligado a la tarea de aprendizaje), y a diferentes tiempos post-entremamiento (12 y 24 horas). También se estudiaron los posibles efectos del estrés crónico sobre la expresión de dichas moléculas de adhesión celular neural en ratas sometidas a inmovilización y/o entrenadas en el condicionamiento del miedo al contexto. Los resultados obtenidos mostraron una diferencial implicación de la polisilaización de NCAM hipocampal en el almacenamiento de información relativa a experiencias que implican diferentes grados de estrés. En conjunto, los resultados mostrados en esta Tesis, apoyan la idea de una modulación de las moléculas de adhesion celular en situaciones de estrés, tanto agudo, como crónico, y sugieren la posibilidad de que los cambios producidos en los niveles de dichas moléculas como consecuencia del estrés participen en los mecanismos neurales implicados en diversas funciones cognitivas. Asimismo, los datos neuroendocrinos y conductuales refuerzan las hipoteizadas acciones de los glucocorticoides sobre los procesos de formación de la memoria, incluidas las memorias traumáticas. Por otro lado, el estrés crónico indujo un descenso de los niveles de NCAM hipocampales, que podría estar implicado en los procesos deletéreos que a nivel sináptico se han descrito en otros estudios a nivel de dicha estructura. Por el contrario, incrementó los niveles de PSA-NCAM y de Ll, moléculas implicadas en el remodelamiento estructural de tipo compensatorio ante el daño neural inducido por el estrés crónico. Además, el estrés crónico también indujo alteraciones en el contenido de dichas moléculas de adhesión en otras regiones cerebrales.

Autor: OBREGON SANCHEZ VIRGINIA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS (CSIC).

Resumen: Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano que pertenece al grupo de los estreptococos del grupo mitis, grupo que ha sido tradicionalmente dificil de clasificar. Los aislados pertenecientes a esta especie se distinguen de otras especies proximas de estreptococos como S.mitis y S.oralis, mediante tres analisis de identificacion: la lisis en por desoxicolato sódico (Doc), la sensibilidad o optoquina y la reacción inmunológica de Quellung o reacción capsular. Durante los últimos años se ha aislado un número significativo de neumococos que exhiben respuestas atipicas frente a estas pruebas diagnosticas, y que habitualmente, se ha clasificado de manera incorrecta. Basándose en la hibridación postivia con una sonda especifica de DNA, se seleccionó una serie de de cepas atipicas de neumocco que no se lisaban en presencia de Doc para estudiar la implicación de la autolisina LytA de estas estirpes en dicho fenotipo. Se han secuenciado los alelos lytA de varias de estas cepas que no se lisan en presencia de Doc y se ha caracterizado la causa de esta ausencia de lisis. Se ha llevado a cabo un estuido taxonómico que sugiere que estas cepas no pueden ser consideradas como neumococos en sentido estrict. La abundancia de bacteriofagos atemperados que se ha encontrado en cepas clinicas de S.pneumoniae llevó a algunos autores a postular una posible relación entre lisogenia y patogenicidad en aislados de esta especie. Los bacteriofagos son considerados una fuente de información genetica y pueden diseminar genes entre aislados de una misma especie e incluso entre especies diferentes, lo que da lugar a la introducción de variabilidad genetica. Este hecho cobra una especial relevancia en un patógeno humano como S.pneumoniae. Hasta el momento no se habia secuenciado completamente ningun fago atemperado en este sistema bacteriano, por lo que se decidió secuenciar el genoma de un fago integrado en una cepa clínica pertenciente a un clon del serotipo 23F de los más virulentos de esta especie. El genoma de este fago se ha caracterizado y secuenciado completamente. Consta de 40 248 pb y pertenece a la familia de los fagos cuyo genoma es redundante y se encuentra permutado circularmente.

Autor: ALVAREZ DIAZ RUTH .
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La enfermedad coronaria es la principal causa de mortalidad en los paises desarrollados. Muchos procesos fisiopatologicos coronarios y vasculares se encuentran relacionados con la expresión diferencial de determinados genes. La presencia de variantes en la secuencia de estos genes (polimorfismos) determina una varibilidad interindividual que podria asociarse al grado de susceptibilidad al desarrollar la enfermedad. El sistema renina-anginotensina (SRA) desempeña un papel fundamental en la homeostasis salina y en el mantenimiento del tono vascular. Este sistema está formado por diversos componentes, como enzimas proteolíticos (ECA, renina) y hormonas peptídicas (angiotensinas) que ejercen su función a traves de la union a los correspondientes receptores de membrana, de los cuales se han caracterizado dos en el hombre (AT1 y AT2). Algunos estudios han demostrado la implicacion de la variación en los genes que codifican estos componentes en diversas enfermedades cardiovaculares. Otros, en cambio, no han encontrado tal asociación. El oxido nitrico (NO) desempeña importantes funciones en la pared vascular, como la inhibición de la agregación plaquetaria y la adhesión monocítica o la regulación de la proliferacion de las celulas del musculo liso. El óxido nitrico es sintetizado por las oxido nitrico sintasas (NOS) a partir del aminoacido L-arginina. El gen de la oxido nitrico sinitasa endotelial es polimorfico y se ha relacionado con el riesgo de desarrollar enfermedad coronaria e hipertensión. Tambien los genes que codifican apolipoproteinas se presentan como genes candidatos para los estudios geneticos de asociación a enfermedad coronaria. La apolipoproteina E(apoE) forma parte de los remanentes de los quilomicrones, de la VLDL y de las lipoproteinas de alta densidad (HDL), y es un ligando critico para la depuración de estas sustancias. La apoE es una proteina polimorfica. La variación genetica de este locus contribuye de forma importante a las diferencia interindividuales en los niveles de colesterol total y colesterol LDL, de manera que el alelo APOE*4 (relacionado con los niveles mas altos de colesterol ) se ha asociado a un mayor riesgo de enfermedad coronaria. Se analizó la variación genetica del SRA para los polimorfismos ECA (I/D), ECA (-93T/C), ECA (-240 A/T), AT1 (1166A/C), AT2(3123A/C), AGT(M235T), eNOS(vntr), eNOS(-786T/C) y APOE (E2,E3,E4) en nuestra población, comparando las frecuencias en pacientes con enfermedad coronaria y controles sanos (estudio casos-controles), asi como el efecto sinergico (acción combinada )de estos polimorfismos. Tambien se estudió la relación entre los genotipos de la ECA y los niveles de actividad serica del enzima, y el efecto de los polimorfismos ECA(-93T/C) y ECA (-240 A/C) en la actividad del promotor de la ECA, empleando ensayos in vitro de "sistemas reporter".

Autor: GIRALDEZ FERNANDEZ TERESA .
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El objetivo general de esta Tesis ha sido el estudio de los componentes y los mecanismos de regulación de la cascada de acoplamiento estimulo-secreción de las celulas adenohipofisarias en respuesta a la hormona liberadora de tirotropina (TRH). De un modo más concreto, el trabajo se ha centrado en dos objetivos principales: a) el estudio de la modulación de los canales de K+ erg que participan en la regulación de la actividad electrica de las celulas adenohipofisarias por la TRH, y b)la correlación en celulas individuales de la actividad electrica y variaciones de Ca2+ citosólico, asi como el estudio de los distinos mecanismos que median la producción de oscilaciones del cation en celulas GH3. Nuestros resultados demuestran que en células HEK 293 que expresan el canal humano h-erg y el receptor de TRH la regulación de este canal por la hormona incluye una reducción en la magnitud de la corriente, un desplazamiento de la dependencia de voltaje de activación hacia valores mas positivos, una ralentización de la apertura y una aceleración del cierre. Además, la activación de los receptores muscarínicos endógenos en estos celulas induce efectos similares pero de menor magnitud que los causados por la TRH sobre h-erg. En cuanto a los componentes moleculares impliados en la cascada de señalización de la TRH, nuestros resultados demuestran que, si bien h-erg puede ser regulado por la PKC, esta quinasa no parece estar implicada en los mecanismos de regulación hormonal de este canal. Asimismo, ni la PKA ni la calcio-calmodulina quinasa participan en la cascada de señalización acoplada al receptor de TRH en estas células. Por otro lado, el mecanismo de regulación de h-erg por la TRH parece ser ejercida a traves de mecanismos analogos en celulas HEK 293 y en celulas adenohipofisarias. Sin embargo, parecen existir diferencias en los mecanismos de regulacion de los canales erg por los distintos receptores hormonales y agentes farmacologicos, que dependen del tipo celular y del esimulo estudiado. En cuanto al estudio de la correlación de la actividad eléctrica y las oscilaciones de calcio intracelular en celulas GH3, nuestros resultados indican que en estas celulas las caracteristicas de la actividad electrica son un determinante crucial de los niveles de calcio intracelular y de las caracteristicas de las oscilaciones de calcio. Asi, la frecuencia de produccion de potenciales de acción determina los niveles de calcio. No obstante, la magnitud de las oscilaciones de calcio depende del tamaño y de la duración de los potenciales de acción. En estas celulas existen otros procesos que, además de los potenciales de acción, influyen en las caracteristicas de las oscilaciones de calcio. Asi, mientras que estas celulas no parece existir un mecanismo de liberación de calcio inducida por calcio que contribuya de forma importante a las oscilaciones del catión, la expulsion del calcio al medio extracelular y la captación del catión por la mitocondria juegan un papel fundamental en la recuperación de las oscilaciones de calcio citoplásmico.

Autor: MORA MARTÍNEZ M. PAZ.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: Se ha sometido a carbamil fosfato sintetasa de E. Coli a mutagénesis dirigida para esclarecer dos aspectos relacionados con la regulación alostérica de este enzima. Por un lado, se ha caracterizado el sitio de unión de los efectores nucleotídicos, UMP e IMP, del enzima. Se ha demostrado que ambos efectores se anclan a través del grupo fosforilo a un mismo sitio en el enzima. Se ha construido un modelo de sitio de unión del nucleótido efector que ha sido corroborado para el IMP tras la resolución de la estructura tridimensional de complejos de enzima e IMP. Por otro lado, se ha establecido la independencia tanto del estado de agregación del enzima con la actividad específica como de la olicomerización controlada por los efectores alsotéricos en la modulación de la actividad enzimática. Aunque ambos, oligomerización y actividad están controladas por los efectores alostéricos son independientes entre sí. Para demostrar esto hemos tenido que esclarecer cual es el mecanismo de oligomerización del enzima. CPs es un (l, b) heterodímero que puede formar (l.b)2 dimeros a través de interacciones entre dominios de regulación de monómeros adyacentes. La presencia de efectores positivos favorece la dimerización de los (l,b)2 dimeros a través de interacciones mutuas entre residuos pertenecientes a dominios de oligomerización de (l.b)2 dímeros adyacentes originando (l,.b)4 tetrámeros. El inhibidor UMP impide la dimerización de los (l.b)2 dímeros, aboliendo la agregación a formas oligoméricas superiores.

Autor: LOPEZ CARBALLO GRACIA M..
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE VALENCIA (CSIC).

Resumen: El tratamiento con ácido retinoico (RA) induce la diferenciación morfológica de las células de neuroblastoma SH-Sy5Y. Para caracterizar los mecanismos moleculares a través de los cuales RA induce la diferenciación en las células SH-SY5Y, se analziaron los genes expresados diferencialmente mediante Display diferencial ordenado (DDO). Hemos obtenido 43 secuencias reguladas diferencialmente por RA que corresponden a genes implicados en múltiples procesos celulares. Entre todos los genes obtenidos, nuestro interés se centró en un factor de transcripción denominado ID3. La familia de los IDs está constituida por cuatro genes relacionados en estructura y función, son factores de transcripción HLH que actúan como reguladores positivos de la proliferación celular y reguladores negativos de la diferenciación. El RA produce una regulación negativa coordinada de los Ids a través de un mecanismo complejo que requieres síntesis de nuevas protínas y actividad de ruta de señalización intracelular de P13K/AKT. La activación de esta vía es necesaria para la diferenciación celular, y probablemente tiene una gran relevancia a nivel fisiológico, puesto que acopla procesos vitales como son la diferenciación y la supervivencia celular. Aunque el mecanismo molecular por el cual el RA activa la vía P13K/AKT no está todavía definido, los resultados obtenidos indican que, probablemente, podría tratarse de una acción extragenómica del RAR, entre otras razones por la rapidez con la que se produce.

Autor: FERNANDEZ-CAPETILLO RUIZ OSCAR .
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los genes de la familia E2F codifican para proteinas que forman parte de la maquinaria de control de diversos procesos celulares tales como la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. El presente trabajo de tesis ha abordado cuestiones concretas de los diferentes aspectos de los genes E2F. En concreto, y dando continuidad a la linea de investigación seguida por nuestro laboratorio en los últimos años, el trabajo se ha centrado en el análisis de los genes E2F1 y E2F2: -Por un lado se ha analizado la regulación de la actividad de los propios genes E2F. En concreto, se ha analizado la existencia de un nuevo mecanismos de control de dicha actividad a nivel de mRNA. Se ha encontrado que el mRNA del gen E2F1 porta secuencias en su región 3´no traducida (3´UTR) que median la ràpida degradación del mRNA. -Por otro lado, se ha profundizado en el análisis de las funciones del gen E2F2 in vivo mediante la utilización de ratones carentes de E2F2(E2F2-1-). El trabajo se ha centrado en el analisis de la función de E2F2 en el control de la apoptosis, diferenciación y proliferación. -Por último, y con ayuda de la tecnología de DNA microarrays,se han identificado una gran cantidad de genes que parecen ser regulados por E2F1 y E2F2 y cuya desregulación en los ratones E2F1-/- y E2F2-/- podria ser la causa de las alteraciones presentes en estos animales.

Autor: BILOTTI OSUNA LUIS GUSTAVO .
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: El objeto de este trabajo fue la obtención de variedades mejoradas de pimiento (Capsicum anuum L) con resistencia al ataque del patógeno fúngico Phytophthora capsici Leonian. Estas variedades deberán tener las caracteristicas agronomicas adecuadas para poder ser cultivadas en regiones de clima calido y con deficiencias hidricas, similares a las condiciones ambientales de la Region de Murcia. El otro objetivo de este trabajo fue analizar las bases de la resistencia, tratando de encontrar marcadores moleculares relacionados con la misma. Se han analizado dos variedades de pimiento con distinta sensibilidad al hongo, una sensible "Americano" con valor agronomico y la otra salvaje, "Serrano Criollo de Morelos" pero con resistencia, junto con tres generaciones segregantes. Al mismo tiempo se utilizó la interacción pimiento-patógeno para profundizar los conocimientos acerca de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de la resistencia. La genética de este binomio y sus descendientes fue complicada ya que en ella intervienen factores ambientales, tipo y concentracion del aislado fungico utilizado y la propia naturaleza genetica de las variedades resistentes y susceptibles utilizadas en el ensayo. El metodo de evaluacion de la resistencia, midiendo la longitud de la necrosis, producida tras la inoculación con micelio del hongo en vástagos decapitados, resulto ser rápido y reproducible. La mortandad de plantas infectadas resulto ser mayor cuando se las inoculó con micelio creciendo en vermiculita que cuanto se las inoculo con zoosporas. La medida de la resistencia medida como longitud de la necrosis del tallo resultó ser linealmente dependiente de la anchura de la hoja, del diametro ecuatorial del fruto y estar afectado por la presencia de pelos en hojas y tallos. Las variables largo de hoja, ancho de hoja, ancho de fruto, peso de fruto y longitud de la necrosis presentan una heredabilidad en el sentido amplio muy alta en las condiciones de trabajo de la experiencia. En lo que respecta a genes de resistencia se puso a punto una tecnica de busqueda de marcadores de tipo AFLP modificada para pimiento, la cual resultó ser limpia, rapida y eficaz. Con esta tecnica se consiguieron detectar bandas polimorficas en el parental resistente y en la F2 resistente que demostraron tener gran homologia con otros genes de resistencia descritos. Con las combinaciones de cebadores utilizados y con la tecnica de AFLP modificada se podria predecir si una planta va a ser o no resistente al hongo, si se amplifican bandas del mismo tamaño que las detectadas en el parental Serrano y en la F2 resistentes y que ademas sus secuencias presenten homologias con las de otros genes de resistencia.

Autor: ACEVEDO AROZENA ABRAHAM.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA.

Resumen: En el presente trabajo se tiene como objetivo la localización genética de regiones modificadoras en el genoma de Mus spretus a la aparición de tumores en ratones deficientes en el gen p53 (-/-). Los ratones p53 -/- están fuertemente predispuestos a la aparición de tumores, muriendo a consecuencia de ellos alrededor de los cinco meses de edad. Para la localización de regiones modificadoras se hace uso de una nueva herramienta genética, ratones consómicos para el cromosoma 19 de Mus spretus. Así, mediante el cruce de los ratones consómicos con ratones defientes en el gen p53, se obtienen ratones p53 -/-, que portan regiones del cromosoma 19 de Mus spretus en homocigosis y/o heterocigosis, a los que se estudia el parámetro supervivencia. En el presente trabajo se encontró una región de resistencia a la aparición de linfomas tímicos, acotada por los marcadores D19Mit60 y D19Mit20, de unos 10 cM, en la que los ratones p53 deficientes de genotipo heterocigoto para estos dos marcadores se comportan de manera resistente respecto a los ratones con genotipo homocigoto. En la región de resistencia delimitada se localizan diversos genes previamente implicados en cáncer. Para este trabajo de clonaron y secuenciaron los alelos Mus spretus de dos de esos genes, para posteriormente centrarse en la posible implicación de uno de ellos, Fas, en la patología del linfoma timico inducido por la deficiencia en el gen p53.

Autor: PACHECO VENERO ROSA LUZ.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA, FAC. FARMACIA.

Resumen: El Distrito de Echarati esta ubicado en la selva de la Provincia de la Convención del Departamento de Cusco. Cuenta con una población de 59-900 habitantes. Los colonos son pobladores emigrantes altoandinos que ingresan a la selva en busca de mejoras económicas y los nativos que pertenecen a diferentes etnias. Se trabajaron 432 pacientes de los cuales 419 presentaban lesiones activas y 13 nativos que presentaron lesiones cicatrizadas. El grupo etario que presentaron leishmaniasis estaba comprendido entre 14 a 44 años de edad es decir la edad económicamente activa. En el diagnóstico clínico se encontró 278 pacientes con lesión cutánea y 141 con lesión cutáneo-mucosa. En el diagnóstico de laboratorio fue positivo en lesiones cutáneas: frotis 16%, cultivo 57%, PCR 68%, Southern 74%. En lesiones cutáneo-mucosas: frotis 31%. Cultivo 18%, PCR 45%, Southern 81%. La prevalencia de leishmaniasis entre los años 1999-2001, fue mayor en el año 2000. Las especies Leishmania b. Braziliensis y Leishmania b. Guyanensis son las causantes de la enfermedad. De muestra que Luztzomyia chagasi y Lutzomyia yuilli yuilli son vectores de Leishmania. Las especies Orizomys perenensis y Orizomys nitidus son reservorios de Leishmania.

Autor: GARRIDO RODRÍGUEZ ROSARIO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: UNIVESIDAD DE KENTUCKY.

Resumen: La lesión de la médula espinal es una de las principales causas de mortalidad entre los menores de 45 años. El estudio de las consecuencias del daño inicial ha llevado a la identificación de procesos de muerte celular y tisular que se producen tras el trauma físico. Entre estos procesos secundarios, la hidrólisis de fosfolípidos de la membranas celular contribuye en gran medida a la extensión del trauma. Debido a la composición de la membrana, el ácido arquidónico está relacionada con multitud de procesos de transducción de señales en neuronas. Para llevar a cabo el estudio del efecto de la liberación del ácido araquidónico, se estableció un modelo in vitro usando cultivos primarios de neuronas de médula espinal, a los que se sometió a tratamiento con ácido araquidónico. Por otro lado, debido a la existencia de investigaciones previas que indican la posibilidad de un efecto neuroprotector relacionado con la activación de dichos receptores puede tener un efecto protector en el modelo indicado. La investigación de los mecanismos que dan lugar al efecto tóxico del ácido araquidónico, así como el estudio de las rutas celulares responsables del potencial efecto protector inducido por la activación de receptores inocotínicos son el objeto de la presente investigación.

Autor: DÍAZ HERNÁNDEZ MIGUEL.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEP. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El conocimiento y entendimiento de las sustancias implicadas en la neurotransmisión es el pilar para comprender el funcionamiento del sistema nervioso central y así poder combatir las disfunciones del mismo. En este sentido, el principal objetivo de esta tesis fue conocer y entender el papel que los diadenosina polifosfatos (ApnA) realizan en señalización celular y la neurotransmisión no solo es necesario conocer cuales son los receptores sensibles a estas sustancias, sino también, su localización en las diferentes regiones del cerebro y las influencias recíprocas entre estos y otros neurotransmisores. En este sentido, hemos podido demostrar en primer lugar la existencia de terminales nerviosas que presentan receptores específicos sensibles a diadenosina polifosfatos, siendo estas el 12% de las terminales nerviosas presentes en el cerebro medio de rata. Además también hemos podido comprobar como la actividad del receptor específico a diadenosina polifosfatos se encuentra modulada por los productos obtenidos de la hidrólisis de los ApnA, el ATP y la adenosina. Gracias a la puesta a punto de nuevas técnias, como es la microfluorimetría, hemos demostrado como en la misma terminal nerviosa están presentes receptores sensibles exclusivamente a diadenosina polifosfatos y receptores nicotinicos. Por otro lado, combinando técnicas de einmunohistoquimica y microfluorimetría hemos demostrado tanto la presencia de receptores específicos a ApnA, así como de receptores nicotinicos sensibles a epibatidina funcionales en la misma terminal colinérgica, cuya activación produce un incremento de los niveles de Ach extrainaptosomal dosis-dependiente. En último lugar pudimos comprobar como la liberación de Ach inducida por Ap5A se ve inhibida hasta un 50% por la estimulación de los receptores nicotinicos sensibles a epibatidina. Inhibición que se ve revertida cuando bloqueamos los receptores nicotínicos con antagonistas específicos no la mecamilamina y el hexametonio. Estos resultados no hacen más que indicarnos el estrecho y complicado diálogo que existe entre el sistema colinérgico y purinérgico, ya que no debemos olvidar que el carácter inhibitorio que presenta dicha interacción es recíproco. La posibilidad de modular la actividad presináptica nicotínica por medio de la actuación sobre el sistema purinérgico, abre una nueva visión sobre la concepción terapéutica de enfermedades que transcurren con alteraciones en el sistema colinérgico, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer.

Autor: GARCÍA CASADO M. ZAIDA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: Durante el desarrollo embrionario mbl es necesario para la formación de un patrón muscular correcto, en concreto para la formación de las bandas Z de los sarcómeros y las uniones indirectas del músculo a la epidermis. Además, el gen mbl también es requerido para la diferenciación tardía de los fotocorrectores. Por otro lado, se han identificado hasta tres genes homólogos a mbl en humanos (MBNL, MBLL y MBXL), todos ellos relacionados con el desarrollo de la Distrofía Miotónica (DM), la distrofía muscular más común en adultos. Los principales objetivos de esta tesis doctoral son profundizar en la caracterización funcional del gen mbl, analizando su papel durante el desarrollo de Drosophila, y valorar la utilidad de Drosophila como modelo de estudio de la Distrofia Miotónica. En concreto, se pretende, por un lado, el estudio del efecto de la expresión ectópica de mbl en diferentes tejidos y estadios del desarrollo, y por otro, evaluar la homología funcional con su homólogo humano MBNL. Para ello se va a utilizar el Sistema UAS-Gal4 empleando moscas transgénicas para las construcciones UAS-mbl y UAS-MBNL obtenidas mediante microinyección. Otro objetivo del trabajo es el estudio de relaciones epistáticas de mbl con una serie de genes candidatos seleccionados en función de sus fenotipos y patrones de expresión. También se pretende completar el estudio del patrón de expresión del gen en los diferentes discos imaginables de Drosophila así como su posible función en estos tejidos, recurriendo a la obtención de clones mutantes para nuestro gen por recombinación miótica. Con todo esto se espera conseguir una información completa y detallada del papel de mbl en el desarrollo de Drosophila, y por extensión en otros organismos que conserven los mismos patrones de desarrollo.

Autor: VILLARROYA PÉREZ ADORACIÓN.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE VALENCIA.

Resumen: El objetivo general de este trabajo ha sido avanzar en el conocimiento de las bases moleculares de las lipofuscinosis ceroideas neuronales (LCN). Las LCN constituyen el grupo de enfermedades neurodegenerativas más frecuentes en niños de países desarrollados. En este estudio concluimos que el mecanismo más probable por el que la subunidad c de la ATP sintasa mitocondrial se acumula en los lisosomas de pacientes en la mayoría de las LCN es la vía macroautofágica. Además, estudiando la funcionalidad de los sistemas degradativos intracelulares, observamos que las vías macroautofágicas lisosomales están afectadas en las células procedentes de pacientes con las formas infantil tardía y juvenil de las LCN. Sin embargo, otras vías degradativas lisosomales nomacroatofágicas parecen funcionar más eficientemente, mientras que otras vías de degradación intracelular de proteínas (como las que implican a los diferentes proteasomas) no parecen estar alteradas en esta patología. Una segunda parte de nuestro trabajo ha consistido en el estudio de la localización y la función de la proteína CLN3p, implicada en la forma juvenil de las LCN. Por estudios de inmunofluorescencia y subfraccionamiento celular concluimos que CLN3p es una proteína integral de la membrana lisosomal. Además, realizando un estudio comparativo entre células procedentes de individuos control y células procedentes de la forma juvenil de las LCN con "microarrays" de ADN de 1,176 genes, establecimos una expresión elevada de 12 de ellos. De entre todos estos genes, nos parece destacable la elevada expresión del que codifica la subundiad reguladora de las calpaínas, lo que podría indicar que esta familia de cisteín-proteasas citosólicas está activada en la enfermedad. Por útlimo, estudiamos las LCN en población española, encontrando que la frecuencia de las principales formas clínicas de esta patología es similar a la de poblaciones parecidas a la nuestra. Además, analizando la frecuencia de portadores de la principal nutación en el gen CLN3, contramos dos portadores de la misma en una muestra 1.177 individuos, lo que corresponde a una frecuencia de portadores de esta mutación de 0,17%.

Autor: MORENO MERCER JANE M..
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: OBJETIVOS La evaluación de la utilidad de un conjunto de parámetros bioquímicos relacionados con la remodelación ósea en el estudio del estado óseo y su evolución en la postmenopausia reciente, mediante el estudio, en mujeres con menopausia, natural (MN) o quirúrgica (MQ), de sus niveles, y de su relación con los valores de DMO de cuello femoral (CF) y columna lumbar (CL) y su variación, así como su capacidad predictiva de los mismos. Otro objetivo fue definir el umbral de respuesta de estos marcadores a la THS, al comparar mujeres sin tratamiento (ST) y con terapia hormonal sustitutiva (THS) vía transdérmica a dosis baja (E25, 25 ug/día de E2) y estándar (E50, 50 ug/día de E2). MÉTODO Se obtuvieron 3 muestras de sangre y orina, separadas 3 a 5 meses, determinando los parámetros bioquímicos seleccionados (NTx, OC, FA Ca/Cr, Ca, P, Mg, Cai, E2, T, PTH). Se midió su DMO de CD y CL por densitometría. RESULTADOS En el grupo MN se observó una correlación positiva entre edad e IMC y PTH, y negativa con DMO CF. La correlación entre DMO CF y DMO CL fue muy alta. En cuanto a la asociación entre parámetros bioquímicos y DMO, sólo fue clara su relación negativa con el marcador de resorción NTx. Por análisis de regresión lineal multivariante, sólo la edad, PTH y NTx entraron en el modelo de rpedicción de DMO CF. Para DMO CL, el E2 fue el único predictor. Para un subgrupo de mujeres, se cálculo su porcentaje de cambio anual de DMO (%DMO), que correlacionó altamente entre CF y CL. También se obtuvo una ecuación de predicción, siendo el único predictor la PTH, para CF y CL, son signo negativo. Se estudió el efecto de la menopausia quirúrgica (MQ) sobre el estado óseo, comparando MN y MQ. El análisis se ajustó por edad y ADM. La edad afectó de forma distita a la DMO CF según el tipo de menopausia, observándose una relación lineal y negativa sólo en MN. Cai, fosfato, OC y de PTH mostraron diferencias significativas entre MN y MQ, pudiéndose apreciar que todos los parámetros bioquímicos analizados tienden a presentar valores medios más altos en MQ, a excepción de Cai y PTH, que fueron más bajos. Por último, se estudió la respuesta de los parámetros bioquímicos a la THS, comparando tres grupos por tipo de tratamiento (ST, E25, E50). Los marcadores de remodelado óseo (NTx, OC y FA) presentan sus valores más altos en ST, sin mostrar diferencias significativas entre los grupos con THS. Los niveles de E2 aumentaron significativamente con la THS, sin diferencias significativas entre distintas dosis. La edad correlacionó con el IMC, aunque la significación se pierde para E50. La edad correlacionó negativamente con DMO CF y CL, y positiva con la PTH, al igual que ADM, aunque la asociación sólo fue significativa para ST. Existe una relación negativa significativa entre DMO y NTx sólo en el grupo ST. El % DMO CF y de DMO CL muestra el efecto positivo del tratamiento, con un claro freno, e incluso ganancia, de DMO CF, significativa frente a ST. Para DMO CL, entre ST y E50 (P < 0.01), se observa una ganancia de DMO, mientras que en el grupo E25 no, aunque la pérdida se frena muy significativamente frente a ST. El % DMO CL se asoció significativamente con el de CF en todos los grupos. CONCLUSIONES La DMO CF y DMO CL se comportaron de forma distinta, DMO CF se asoció más estrechamente con la edad, y DMO CL se mostró más influida por el estado menopáusico. Las mujeres con MQ muestran un recambio óseo mayor que MN durante los ADM estudiados, aunque con los ADM tienden a igualarse. Estas mujeres presentan unos niveles más bajos de PTH y calcio irónico. La THS ejerce un claro efecto positivo sobre la prevención de la pérdida de DMO de CF y CL, no observándose diferencias significativas entre la respuesta de CF y CL. El descenso de los niveles de NTx con la THS, apoyan la utilidad clínica de los valores de este marcador en la monitorización del efecto antiresortivo de la THS en mujeres postmenopáusicas.

Autor: CARBONELL CASTELLÓ TERESA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: Utilizando la química combinatoria, se han sintetizado dos quimiotecas de moléculas discretas, 2,5-piperazindionas (DKPs) (105 moléculas) y dos quimiotecas combinatorias en formato de rastreo posicional, una de pseudopéptidos (10,648 moléculas) y otras de haxapéptidos de D-aminoácidos con el extremo terminal acetilado (47,045,881 moléculas). Esta diversidad química es la que se ha utilizado en la identificación de moduladores de tres actividades enzimáticas, relacionadas con distintas patologías, y en la identificación de moduladores del crecimiento bacteriano. Para ello, se desarrollaron los ensayos biológicos adecuados para cada una de las dianas, y a continuación se exponen brevemente los resultados: - En el caso de las acetilcolinesterasa (AChE), enzima importante por su implicación en la enfermedad de Alzeimer, se han identificado distintas DKPs con una potencia y selectividad en la inhibición de la misma elevada. Concretamente, destacar el compuesto DKP-II 17, que pude considerarse para el estudio de optimización de sus propiedades. - Para la proteasa del virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (HIV-1-PR), cuya función es esencial en el ciclo vital de este virus que ocasiona el SIDA, se han identificado distintos hexapéptidosque la inhiben (constantes de inhibición en el intervalo micromolar). De entre ellos, destacar los hexapéptidos hxAH10, hxAH13 y hxAH14, que presentan constantes de inhibición entre 1-2 micromolar e interaccionan de forma espontánea con la proteasa, según indican estudios de calorimetría de titulación isotérmica. - También se han identificado inhibidores potentes de la plasmepsina II(plmII), enzima esencial para el ciclo vital de parásitos del género Plasmodium, agentes causantes de la malara. Concretamente, todos los pseudopéptidos y hexapéptidos identificados, presentan una inhibición en el intervalo micromolar, destacando como el inhibidor más potente y selectivo el hexapéptido hxAP2. Con éste se llevaron a cabo estudios de optimización y se están llevando a cabo estudios de determinación estructural del complejo hxAP2-plmII. - Finalmente se identificaron distintos pseudopéptidos que presentan actividad antibacteriana, destacando como más activos los compuestos psAB10 y psAB13.

Autor: IGLESIAS GONZALEZ JUAN MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Se han obtenido y caracterizado los cDNAs de la anexina A13 de ratón y los correspondientes a la isoformas a y b de la anexina A13 humana. También se identificaron otros cDNAs de los genes ortólogos en otras especies incluyendo las de rata, vaca y peces teleósteos. Estos cDNAs fueron utilizados en la caracterización de los genes, tanto por procedimientos clásicos como por los del análisis bioinformático de secuencias genómicas depositadas en las bases de datos de dominio público. El análisis comparativo de la estructrua de los genes caracterizados nos ha permitido comprobar que en peces teleósteos existen dos copias del gen y qe el tamaño del mismo es mucho menor en los genomas de telósteos analizados que en los de mamíferos. Además las copias del gen en teleósteos parecen haber seguido un proceso de evolución divergente más acusado en las regiones reguladoras que en las codificantes. Es sorprendente no haber encontrado un exón equivalente al exón alternativo humano en ninguna de las especies analizadas aunque hemos encontrado una secuencia vagamente similar en los genes de ratón y rata que nos hace sospechar que en roedores se ha perdido el mencionado exón y actualmente se encuentra en proceso de desaparación en el genoma. La subfamilia de la anexina A13 presenta un patrón de "splicing" único dentro de la familia A de las anexinas. El refinamiento de los análisis de evolución molecular mediante la inclusión de secuencias de anexina A13 procedentes de especies tempranamente divergentes nos ha permitido confirmar que la anexina A13 es la anexina de vertebrados filogenéticamente más antigua. Estos análisis avalan la hipotesis de una evolución secuencial y progresiva de todas las anexinias de vertebrados a partir de un progenitor ancestral común y se sugiere a la anexina A13 como fundador dela familia seguido de las anexinas A7 y A11. El análisis comparativo de las secuencias nucleotídicas correspondientes al gen de la anexina A13 en mamíferos ha permitido la identificación de regiones altamente conservadas en la porción 5´flanqueante y en el intrón 6 del gen humano y sus equivalentes en raton, rata y vaca. Mediante análisis informatico se han localizado en la región 5´flanqueante probables sitios de unión para factores de transcripción relacionados con la regulación de genes con expresión especifica de intestino. Tambien, a partir del análisis comparativo de las secuencias de aminoácidos que se deducen de las de nucleótidos se ha posido establecer la presencia tanto de residuos conservados dentro de la subfamilia como los divergentes con respecto al resto de las subfamilias de las anexinas. Estudios de expresión de la anexina A13 en tejidos de ratón han detectado al mRNA, además de en intestino delgado, en próstata y epidídimo. La purificación de las dos isoformas de la anexina A13 humana recombinante expresada en bacterias ha permitido poner de manifiesto su diferentes afinidad por fosfolípidos en presencia de calcio, lo que demuestra la influencia del extremo amino de la proteina sobre sus propiedades de unión a fosfolípidos en presencia de calcio. La disponibilidad de las proteinas recombinantes purificadas nos ha permitido obtener anticuerpos policlonales desarrollados en conejos, de gran utilidad en estudios de expresión génica, localización celular y otros estudios funcionales.

Autor: MAYORDOMO GINER M. ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La hexoquinasa PII de la levadura Saccharomyces cerevisiae es una enzima fosforiladora de glucosa que además de su papel en la glicólisis tiene un papel adicional en la señalización por glucosa. Para estudiar los dominios que pueden participar en este último proceso construimos para estudiar los dominios que participan en este último proceso construimos once alelos mutantes de hexoquinasa PII. En la mayoría de ellos la actividad catalítica estaba directamente correlacionada con la señalización por glucosa. Sin embargo encontramos dos mutantes (A1-15 y A476-486) que teniendo baja actividad catalítica, eran totalmente funcionales en la señalización por glucosa. Por lo que ambas funciones, enzimática y señalizadora, no están directamente correlacionadas. La glucoquinasa pancreática humana (GlkB) también tiene función señalizadora de glucosa. Su actividad es importante para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa en mamíferos. Hemos observado que la glucoquinasa pancreática complementa los defectos de inducción como de represión en mutantes de levadura carentes de hexoquinasa PII. Lo que permite utilizar la levadura S.cerevisiae como modelo celular para el estudio de la glucoquinasa pancreática humana. Hemos observado que el complejo fosfatasa Reg1/Glc7 interacciona físicamente con Bmh2, miembro de la familia de proteínas 14-3-3. Bmh2 es una proteína que ha sido involucrada en la regulación de la localización subcelular de Msn2, un activador trasncripcional de genes regulados por estrés. Nosotros hemos visto que la proteina quinasa Snf1 participa en la regulación de la localización intracelular del factor transcripcional Msn2 convergiendo con la vía TOR. Finalmente, para identificar proteínas que interaccionan con Bmh2, realizamos un escrutinio de doble híbrido utilizando como cebo LexA-Bmh2. De este modo identificamos Fin1, una proteína del filamento intermedio, como la proteína que mostró el mayor grado de interacción con Bmh2. Al estudiar la interacción entre Bmh2 y Fin1 observamos que es la fracción fosforilada de Fin1 la que interacciona con Bmh2, y que es necesaria la presencia de Bmh2 para que Fin1 pueda defosforilarse y por lo tanto polimerizarse. También hemos demostrado que Glc7, la subunidad catalítica del complejo fosfatasa PP1 también interacciona con la fracción fosforilada de Fin1.

Autor: IGLESIAS IGLESIAS ANA-AURELIA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La transcripción es una de las etapas más importantes de la expresión génica. El objetivo de esta Tesis ha sido el estudio de los mecanismos implicados en la regulación de la transcripción del promotor I del gen de la gamma-glutamil-transpeptidasa (GGT) de rata. Se ha observado la unión de un complejo multiproteico, presente en extractos hepáticos de rata y en dos líneas celulares derivadas de rata, a la secuencia de -586 a -566pb en la región 5' no traducida del promotor I, constituído por cuatro proteínas con pesos moleculares de 100, 70, 41 y 38 kDa. Se ha descartado que el factor Sp1 forme parte de este complejo multiproteico, a pesar de que existe una caja CG degenerada en la secuencia de unión. Estas proteínas se unen al ADN envolviendo a la doble hélica y no parecen ser capaces de modificar estructuras de cromatina. De las cuatro proteínas, sólo una (70 kDa) parece que se fosforila con PK-A y que presenta restos glucídicos de N-acetilglucosamina. Por otro lado, en ensayos de transcripción in vitro se ha observado que la transcripción de un promotor deleccionado (fragmento de -765 a -514pb adyacente al fragmento de -143 a +144 pb) se debe específicamente a la acción de los factores presentes en los extractos nucleares hepáticos de rata. En este promotor deleccionado el acercamiento de la secuencia de unión de los factores en estudio al lugar de inicio de la transcripción, aumenta la especificidad y la eficacia de la transcripción. La metilación del ADN provoca la represión de la transcripción mediada por estos factores nucleares. Mediante ensayos de transfección a líneas celulares derivadas de rata se ha observado que diversas zonas de la secuencia que se extiende desde -765 a +144 pb, presentan actividad positiva o negativa sobre la expresión de este promotor I. Diversas sustancias (dexametasona y SAM) son capaces de interferir la expresión del gen de la GGT en estas líneas celulares derivadas de rata a nivel de la transcripción. Finalmente, análisis informáticos han mostrado la posible relación entre las proteínas en estudio y factores transcripcionales de la familia Egr/Krox. En resumen, la regulación de la transcripción del promotor I del gen de la GGT de rata se debe a la interacción de elementos cis y trans, que actúan de manera coordinada regulando la tasa de expresión final del promotor en la célula.

Autor: ROCHERA MECHÓ M. LOURDES.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: Las carbamil fosfato sintetasas (CPSs) constituyen una familia de enzimas que catalizan el primer paso de las rutas biosintéticas de pirimidinas y de arginina y/o urea. Al ser el paso que catalizan limitante en ambas vías, representa un excelente punto de control estando sometidas a una fuerte regulación genética, alostérica y por fosforilación. En Escherichia coli una sola CPS sintetiza el carbamil fosfato utilizado en ambas rutas, siendo este enzima bacteriano inhibido por retroalimentación por UMP y activado por ornitina, IMP y amonio. En mamíferos la CPS encargada de la biosíntesis de primidinas (CPSII) forma parte de un polipéptido multienzimático de 243 kDa llamado proteína CAS, que alberga las tres primeras actividades enzimáticas de la ruta (CPSII-aspartato transcarbamilasa y dihidroorotasa). La CPSII de CAD se activa por fosforribosilpirofosfato y se inhibe por UTP estando, además, la regulación alostérica controlada por fosforilación por la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (PKA) y por la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Mientras se conoce la estructura tridimensional del enzima bacteriano, no se dispone de información estructural sobre la CPSII de la proteína CAD. Sobre la base de resultados de nuestro laboratorio y de otros grupos proponemos para el sitio de nucleótido efector una similar organización estructural en todas las CPSs involucradas en la biosíntesis de pirimidinas. Aquí ponemos a prueba esta propuesta mediante mutagénesis dirigida al sitio de fosforilación por PKA que controla la unión de nucleótido efector en CPSII. El sitio de fosforilación para PKA en la proteína CAD no está presente en la CPS bacteriana, por lo que lo hemos introducido en la enzima de E.coli, debido a la imposibilidad de disponer de proteína CAD recombinante funcional con la que realizar el estudio de mutagénesis. El comportamiento alostérico tras la fosforilación de estos mutantes quiméricos apoya la propuesta de que todas las CPSs específicas de pirimidinas presentan una región topológicamente similar para el sitio de regulación por nucleótido, que sería equivalente al de UMP en la CPS de E.coli. El análisis que hemos realizado mediante mutagénesis dirigida al sitio de unión del activador ornitina nos ha permitido profundizar en el mecanismo alostérico de la actividad de la CPS de E.coli confirmando funcionalmente las predicciones estructurales de: 1,- El sitio de unión de la ornitina. 2,- La existencia de una red de puentes de hidrógeno que conecta entre si los sitios de unión de los efectores alostéricos y el centro activo de fosforilación del carbamato. Los resultados nos han permitido proponer: 1,- Cuatro elementos estructurales (3 lazos y el túnel intramolecular), interaccionando entre si, como posibles candidatos en la mediación de la regulación alostérica de la actividad. 2,- Identificar el sitio del ion potasio próximo al centro activo de fosforilación del carbamato como sitio para el efector amonio.