BIOQUIMICA MOLECULAR, 19

Autor: BERBEL TORNERO ANA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE PLANTAS-UPV.

Resumen: En el presente trabajo se ha profundizado en el estudio de los procesos de iniciación y desarrollo floral de guisante. Para ello, hemos llevado a cabo el estudio de la función de los genes MADS de guisante PEAM1, PEAM4 y PEAM6 previamente aislados en nuestro laboratorio mediante dos tipos de abordajes experimentales: (i) analilzando el fenotipo resultante de su expresión constitutiva en plantas silvestres de Arabidopsis thaliana y de Antirrhinum majus. (ii) ensayando su capacidad de complementar mutantes de Arabidopsis. También se ha estudiado la interacción entre los genes PEAM4 y PEAM6, testando la interacción entre los polipéptidos que codifican utilizando el sistema de doble híbrido en levaduras, así como estudiando su interacción genética en plantas transgénicas de Arabidopsis. Los resultados de la expresión constitutiva de PEAM1 en plantas silvestres de Arabidopsis y de tabaco apoyan la hipótesis de que PEAM1 funciona como un gen de identidad de órgano floral de tipo B. Además. El hecho de que la construcción 35S:PEAM1 sea capaz de complementar la mutación pi-1 de Arabidopsis, pero no las mutaciónes ap3-1 o ap3-3, confirma que PEAM1 es el homólogo funcional de guisante del gen PI. Los resultados del estudio funcional de PEAM4 indican que este gen es el homólogo funcional del guisante del gen AP1 de Arabidopsis, y además que, a pesar de carecer de la secuencia del motivo de prenilación presente en AP1, comparte con éste tanto la capacidad de funcionar como un gen de identidad de meristemo floral como la de especificar la identidad de los órganos del periantio, pudiendo, por tanto, actuar como un gen de función A. Los resultados de la expresión constitutiva de PEAM6 concuerdan con la hipótesis de que PEAM6 pueda estar implicado en el proceso de la iniciación floral de guisante, sugerida previamente a partir de las evidencias genéticas que correlacionan a este gen con la mutación veg1 de guisante, y también apoyada por la expresión temprana del gen en los meristemos florales. No obstante, el fenotipo resultante de la expresión constitutiva de PEAM6 también es compatible con un papel como gen de tipo SEP, con los que comparte homología de secuencia. Los datos disponibles sugieren que tal vez PEAM6 podría llevar a cabo una doble función en guisante, como gen de iniciación floral y como gen de identidad de órgano floral de tipo SEP. El resultado positivo del ensayo de interacción entre PEMA4 y PEMA6 en el sistema del doble híbrido en levaduras así como la intensificación sinérgica del fenotipo de las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan constitutivamente, y de manera simultánea, PEAM4 y PEAM6 indica que estos dos genes interaccionan in planta durante la iniciación floral y apoya la hipótesis de la interacción entres sus productos génicos sugerida por los experimentos en levadura.

Autor: GARCÍA ARRIBAS OLGA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: Esta tesis pretende aportar nuevos datos sobre los posibles y discutidos efectos biológicos de los campos magnéticos de muy baja frecuencia (50 Hz) y de radiofrecuencia (2,45 GHz) relacionándolo a su vez con el de los metales pesados: cadmio y mercurio, siguiendo así las recomendaciones del Parlamento Europeo, que aconseja investigar fenómenos de sinergia entre los campos electromagnéticos y agentes químicos ambientales. Para el estudio de los campos magnéticos de 50 Hz, se empelan diferentes tipos de sistemas in vitro: linfocitos y sangre humanos; y sistemas in vivo: ratones Balb/c. Asimismo se utilizan los campos de radiofrecuencia (2,45 GHz) para determinar las propiedades eléctricas de diferentes tejidos de rata. Como conclusiones podemos señalar que: La exposición de linfocitos a campos de 50 Hz e intensidades hasta 9,7 mT durante 96 h no produce efectos genotóxicos (ya que no se observa un aumento del número de micronúcleos) y tampoco se detectan cambios en la proliferación celular. El tratamiento de linfocitos con Cd y Hg desde 10-3 - 10-7M durante 96 h provoca un aumento del número de micronúcleos a la concentración de Cd 10-4-10-6M y Hg 10-4M y 10-5M. También se produce una disminución de la proliferación celular a la concentración de metal > 10-5M. No exite efecto sinérgico entre el tratamiento con iones metálicos y la exposición a campos magnéticos independientemente de la concentración de metal y la intensidad de campo magnético aplicado. La exposición de ratones a campos de 50 Hz y 2,75 mT durante 7 días provoca un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica al rojo neutro. El tratamiento de los ratones con sobrecarga de Hg también produce un aumento de la permeabilidad de la barrera. Existe sinergismo entre la exposición a campos magnéticos y el tratamiento con sobrecarga de mercurio traduciéndose en un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Por otro lado, se determinanlas propiedades eléctricas de los tejidos permitividad y conductividad de diferentes tejidos de ratas con sobrecarga de Cd y de Hg aplicando un campo de radiofrecuencia (2,45 GHz). La exposición de los tejidos a una sobrecarga de Cd y Hg altera sus propiedades eléctricas.

Autor: CATALÁ RODRÍGUEZ MYRIAM.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: F. CC. QUÍMICAS.

Resumen: El estudio de la respuesta hepática al estrés oxidativo desencadenado por la endotoxina de E.coli 0111:B4 (LPS) se ha llevado a cabo en el presente trabajo utilizando distintos modelos experimentales con el fin de caracterizar la acción del LPS in vivo sobre sistemas antioxidantes hepáticos y séricos y poder diferenciar in vitro los efectos directos del LPS de los producidos por distintos mediadores de la acción endotóxica. Los resultados obtenidos en vivo con el modelo de shock endotóxico reversible en rata e in vitro con la utilización de distintas poblaciones celulares hepáticas, demuestran la importancia de los mecanismos de defensa antioxidante del hígado (sistema glutatión, Mn-SOD o catalasa) durante el shock endotóxico e indica la posible utilidad de los niveles de glutatión plasmático como indicador de la fase aguda del proceso. Los experimentos in vivo no permiten diferenciar entre el efecto directo o debido a mediadores de la acción endotóxica, por lo que se analizó la acción del LPS in vitro con el objeto de profundizar en sus mecanismos de acción sobre el tejido hepático y el suero. Con este motivo se ha estudiado la acción directa del LPS sobre el sistema glutatión en presencia o ausencia de lipoproteínas, las actividades glutatión peroxidasa y glutatión reductasa y la unión celular del LPS en distintos tipos celulares (células parenquimatosas, endoteliales y de Kupffer) así como el efecto de mediadores de la acción endotóxica sobre células parenquimatosas. En el presente trabajo se demuestra in vitro que la relación GSSG/tGSH no se correlaciona con la existencia de estrés oxidativo producido in vivo por LPS o TNF-alfa. Este hecho sugiere un papel diferente para el índice GSSG/tGSH en células parenquimatosas, independiente del estado rédox de la célula, pudiendo estar implicado en la homeostasis de la glucosa como tercer mensajero.

Autor: SANTOS SIERRA SANDRA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD CC. QUÍMICAS.

Resumen: En este trabajo se ha realizado una caracterización funcional y estructural de la antitoxinas Kis y de la toxina Kid del sistema de muerte condicional parD del plásmido R1 y también del complejo formado por ambas proteínas. Este trabajo integra distintas aproximaciones (genéticas, bioquímicas y biofísicas) y sus resultados ponen las bases para un entendimiento molecular de las interacciones a la base de la acción de las proteínas del sistema parD y de su regulación. El trabajo ha contribuido con la preparación y caracterización de muestras de la proteína Kid a la resolución de la estructura cristalina de la toxina por nuestros colaboradores en la Universidad de Sheffield. Ello ha permitido integrar los datos obtenidos para identificar regiones funcionalmente relevantes en esta estructura. También se ha iniciado la caracterización funcional y estructural de la toxina homóloga ChpaK del sistema cromosómico homólogo chpa.

Autor: BARCO BARRIUSO VICTORÍA DEL.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: ANÁLISIS CLÍNICOS (H. CLÍNICO SAN CARLOS DE MADRI).

Resumen: El carcinoma renal constituye cerca del 3% de todos los cánceres humanos. El cáncer es el resultado de una acumulación de alteraciones genéticas que afectan a diversos genes. Una de estas alteraciones es la pérdida de material genético en el brazo corto del cromosoma 9 (9p21). Se ha demostrado que esta región contiene un gen Supresor de tumores llamado p16 que codifica la proteína p16. En este trabajo se ha estudiado una serie de 48 pacientes diagnosticados de carcinoma renal en los que se analizó la LOH en 9p21, el estado de metilación del promotor del gen p16 y la expresión de la proteína p16. Las alteraciones genéticas del gen supresor p16 son un hecho frecuente en nuestra serie de pacientes: el 50% no expresa la proteína p16. El 51% presenta al menos una de las alteraciones genéticas estudiadas. La LOH en 9p21 (25%) y la metilación del promotor del gen p16 (23%) son hechos frecuentes. La LOH y la metilación tienen tendencias a relacionarse con los estadios precoces y grados diferenciados y, la ausencia de expresión de la proteína p16 tiende a ser un evento tardío. Los pacientes que presentan al menos una de las alteraciones tienen un riesgo relativo de recidivar 1,45 veces superior a los que no tienen ninguna alteración y los pacientes que no expresan p16 tienen un riesgo de recidivar de 2,04 veces más que los que expresan proteína, aunque estas diferencias no son estadísticamente significativas. La metilación puede ser un factor pronóstico en los pacientes mayores de 60 años. Únicamente el grado de diferenciación presentó significado pronóstico indpendiente en la SLE. Eliminando el efecto que el grado de diferenciación ejerce en el riesgo de recidivar, los pacientes con tumores metilados tienen un riesgo de recidivar 16,24 veces más respecto a los que no metilan.

Autor: VALVERDE QUILEZ CONSUELO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: Los compuestos derivados del Almizcle tienen un amplio uso en la vida cotidiana (detergentes, cremas, perfumes, tabaco de mascar y en productos alimentarios como dulces y bebidas). Se han encontrado incluso en la leche materna. Tras realizar estudios en distintos organismos vivos, se ha comprobado su toxicidad, ocasionando en ratas atrofia muscular con parálisis y retraso en el crecimiento, cambios neuropatológicos e ictericia. Dada la repercusión de los almizcles, nosotros hemos seleccionado el almizcle ambrette (6-TER-BUTIL-3-METIL-2,4-DINITROANISOL) por ser uno de los más utilizados. Nuestras investigaciones se han centrado en estudios genotóxicos, seleccionando el ensayo de reversión mutagénica en S. Typhimurium y E. Coli. Siguiendo las normas que dicta el diario oficial de las comunidades europeas y citotóxicos, en células gonadales de trucha arcoiris. Los resultados obtenidos nos indican que el Musk "Ambrette" no es tóxico a ninguna de las concentraciones ensayadas excepto en la cepa TA97 de S. Typhimurium a la mayor concentración ensayada y en presencia de activación metabólica. El efecto mutagénico observado en S. Thyphimurium Cepa TA 100 a la máxima concentración empleada y con activación metabólica, no se observa en las otras concentraciones empleadas, o al utilizar otras cepas de la misma especie o de otra distinta como es D. Coli. Los valores de citotoxicidad (NR50 y KB50) del almizcle "Ambrette" han sido muy similares en los dos ensayos realizados de viabilidad celular y proteínas totales. Consecuentemente nosotros apoyamos la eliminación del Musk "Ambrette" de los productos de consumo.

Autor: PIÑEIRO REDONDO ALICIA.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTADE DE BIOLOXÍA.

Resumen: Protimosina alfa (Pro T alfa) es una proteína altamente conservada y ampliamente distribuida cuya función fisiológica todavía no es conocida. Ha demostrado tener una gran capacidad inmunopotenciadora en estudios realizados con células procedentes de donantes sanos y especialmente en aquellos realizados con células procedentes de pacientes de cáncer o distintas enfermedades autoimunes, al igual que en modelos experimentales animales. En una búsqueda del posible mecanismo molecular responsable de los efectos de Pro T alfa sobre células linfoides, nos hemos propuesto determinar la existencia de un posible receptor/es para esta proteína en la membrana plasmática de estos tipos celulares. Mediante la obtención de un derivado biotinilado de Pro T alfa con integridad tanto estructural como funcional, hemos conseguido caracterizar la existencia de un receptor específico, saturable e inducible por estimulación mitogénica para esta proteína en la superficie de linfoblastos activados. El cross-linking de afinidad entre Pro T alfa y sus moléculas aceptoras ha revelado que éstas poseen una Mr aproximada de 61,43,31,29 y 22 kDa, siendo las dos primeras de presencia minoritaria. Del análisis de distintos tipos y líneas celulares se ha concluido que este receptor se expresa en leucocitos de forma generalizada. Su distribución en la membrana plasmática es heterogénea y se encuentra asociado a microdominios raft, especializaciones funcionales de la membrana celular estrechamente relacionadas con los procesos de señalización. Mediante experimentos de estimulación de linfoblastos con Pro T alfa hemos observado que se genera una activación de la vía de transducción de las MAP quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK 1/2), lo que conjuntamente con la descripción del receptor específico en la membrana plasmática de estas mismas células constituiría un mecanismo molecular que podría explicar la actividad biológica de Pro T alfa.

Autor: RODRÍGUEZ ANDELO JOSÉ MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Anteriormente, habíamos descrito un minisatélite humano rico en G+C, denominado MsH42, con dos alelos: largo y corto. En este trabajo hemos identificado un tercer alelo de longitud intermedia y hemos localizado el locus MsH42 en el cromosoma 15q25,1. Dentro de un intrón perteneciente a un gen de función desconocida. El potencial recombinogénico de los tres alelos se ensayó in vitro incubando plásmidos, construidos clonando en pBR322 dos copis de las variantes alélicas del minisatélite MsH42 con sus secuencias flanqueantes, en presencia de extractos nucleares de testículos de rata. Este sistema experimental fue diseñado para detectar entrecruzamientos y no conversación génica. Todos los alelos de MsH42 potencian la recombinación homóloga intramolecular, promoviendo altas tasas de entrecruzamiento igual (76%), siendo el alelo largo el que mostró una mayor actividad recombinatoria. La eliminación de las secuencias flanqueantes del alelo largo de MsH42, idénticas a las de los otros alelos, provocó un descenso en la potenciación de la recombinación y en la frecuencia de entrecruzamientos de tipo igual, sugiriendo que estas secuencias homólogas. La detección de algunos eventos recombinatorios complejos dentro del minisatélite MsH42 sugiere la existencia de procesos relacionados tanto con el slippage como con la disociación y reinvasión durante la síntesis reparadora del DNA. Nuestros resultados apuntan hacia la existencia de dos rutas bioquímicas para la iniciación y resolución de eventos recombinatorios en el minisatélite MsH42. Así mismo, hemos detectado la existencia de interacciones específicas producidas por proteínas procedentes de extractos nucleares somáticos y germinales con diferentes grupos de repeticiones del minisatélite, así como también con zonas de las secuencias no repetitivas que lo flanquean, observándose patrones de interacción distintos con ambos tipos de extractos. Además, la adicción de extractos somáticos a la reacción de recombinación con extracto proteico nuclear de testículo disminuye el potencial recombinogénico mostrado por la región MsH42 del alelo largo. Finalmente, el sistema de recombinación in vitro empleado en este estudio podría constituir una buena aproximación experimental para investigar los procesos de inestabilidad en secuencias de DNA repetitivo y la recombinación.

Autor: ESPLIGUERO GARCÍA GEMMA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS "ALBERTO SOLS".

Resumen: Las hormonas tiroideas son claves en el desarrollo y maduración del Sistema Nervioso Central (SNC). Cualquier carencia o anomalía de dichas hormonas en períodos claves del desarrollo generan alteraciones graves, como es la deficiencia en la síntesis de mielina, llevada a cabo por los oligodendrocitos (OLs). El mecanismo de acción de las hormonas tiroideas se rige por la regulación de genes diana, mediada por sus receptores TRalfa y TRbeta. En la presente tesis se ha analizado la caracterización de la generación de OLs en médula espinal de ratones con inactivación de las diferentes isoformas de los receptores para hormonas tiroidea, comparando el efecto de dicha inactivación con el fenotipo producido por el hipotiroidismo neonatal. En paralelo, se ha analizado el efecto de la falta de los receptores en otros dos tipos de Células gliales: astrocitos y microglía. En resumen se ha observado que: * La falta de ninguna de las dos isoformas del receptor para hormona tiroidea, T3, noaltera la aparición de los progenitores de OLs en el foco ventral de médula espinal, así como tampoco el patrón normal del número y migración de los progenitores durante el desarrollo embrional. * La falta del receptor beta provoca una tendencia a disminuir el número de progenitores justo antes de la diferenciación de progenitores o oligodendrocitos. Esta disminución se correlaciona con el aumento de OLs diferenciados a esta misma edad. Dicho aumento es transitorio y recupera los niveles normales tras el nacimiento y manteniéndose durante el desarrollo postnatal. Dicho aumento transitorio es similar al generador en ratas y ratones hipotiroideos. Esto parece indicar que la T3 bloquea la diferenciación del lingaje de OLs específicamente a través de la isoforma TRbeta .

Autor: SOTO MONTENEGRO M. LUISA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN.

Resumen: Los objetivos de nuestro trabajo entran dentro de otros más general, que consiste en la búsqueda de la reversión de las diabetes experimental en ratas, sin la necesidad de utilizar drogas inmunosupresoras. Para ello, partimos de diversos trabajos previos sobre la utilización de las células de Sertoli como inductoras de tolerancia al alo-trasplante de islotes (Selawry and Cameron, 1993) (Korbutt, Elliott et al., 1997). Considerando que un sitio de implantación de los islotes trasplantados suelen ser el hígado, y que este órgano posee ventajas sobre otros sitios de implantación (riñón, peritoneo entre otros), pensamos en utilizar células hepáticas como co-trasplante de islotes, en lugar de las células de Sertoli empleadas por los grupos de Selawry y Korbutt. Sí con ello lográramos la facilitación de la implantación de los islotes, podríamos disponer de un medio celular mucho más fácilmente asequible y muchísimo más numerosos que las células de Sertoli. No hemos encontrado datos bibliográficos previos, a excepción de los trabajos de Ricordi (Ricordi, Flye et al., 1988) y Legrelle (Legrelle, Chapa, et al., 1993) que se refieren beneficioso de los islotes para la supervivencia de los hepatocitos; y a los trabajos de Tafra (Tafra, Berezniak et al., 1990) y Dafoe (Dafoe, Wang et al., 1992) que se refieren al efecto beneficioso del empleo de tejido fetal hepático sobre la implantación de islotes fetales en riñón. Con estos antecedentes, en el proyecto se exponen una serie de experiencias in vitro e in vivo, acerca del objetivo general propuesto: la facilitación de la tolerancia al alo-trasplante de islotes en ratas, mediante el alo-co-trasplante de células hepáticas, sin drogas inmunosupresoras. Todas las experiencias afirman el efecto favorable de las células hepáticas sobre la tolerancia del trasplante de islotes sin drogas inmunosupresoras. Sin embargo, el mecanismo no parece ser una interacción celular entre las células hepáticas y los islotes, sino algún tipo de acción de estas células hepáticas sobre el sistema inmune del organismo receptor, bloqueándolo temporalmente, permitiendo que los islotes no sean rechazados durante períodos variables, que en determinadas condiciones llegan a superar 3 meses, sin necesidad de drogas inmunosupresoras.

Autor: CHAMIZO GARCÍA CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: La leishmaniasis visceral canina es un problema veterinario y de salud pública en áreas endémicas. Además, diferentes autores han sugerido que el perro es un buen modelo para investigar la patogénesis de la leishmaniasis visceral humana. El perro es el reservorio natural de L infantum, por lo que el estudio de su sistema inmune puede favorecer el desarrollo de nuevos programas profilácticos y terapéuticos, pues todavía hoy es bastante desconocido. Las citoquinas son importantes moléculas reguladoras del sistema inmune con capacidad efectora en el mismo. En el modelo murino de leishmaniasis se ha establecido que según las citoquinas producidas por las células T, se determina la susceptibilidad o resistencia al desarrollo de la enfermedad de forma que citoquinas de TH1 se asocian con resistencia (TNF-alfa, IL-2, INF-y, IL-12, IL-18) y las de respuestas TH2 con susceptibilidad (IL-4, IL-6 e IL-10). En el presente trabajo se describe la estandarización de una técnica de RT-PCR semicuantitativa como sistema de detección y cuantificación de la expresión de citoquinas (TNF-alfa, IL-2, INF-y, IL-18, IL-4, IL-6 e IL-10) en relación con la expresión de GAPDH, en PBMC procedentes de perros sanos, asintomáticos y enfermos. El estudio fue realizado en PBMC analizadas ex vivo, y en PBMC cultivadas sin estímulo, en presencia de un mitógeno inespecífico (ConA) y estimuladas por los antígenos solubles de Leishmania (LSA). La expresión de citoquinas en PBMC de perros sanos se corresponde con un fenotipo TH0, tanto ex vivo como in vitro. La leishmaniasis canina asintomática está caracterizada por una expresión de citoquinas que favorece el desarrollo de respuesta inmune celular protectora caracterizada por: (i) la ausencia de expresión de IL-4 en aislados de PBMC analizados ex vivo. (ii) expresión de todas las citoquinas estudiadas como consecuencia de la estimulación inespecífica (ConA), es decir, fenotipo mezcla de TH1 y TH2. (iii) expresión de todas las citoquinas en los cultivos estimulados con los antígenos parasitarios (LSA), siendo las citoquinas reguladoras de respuesta inmune celular (principalmente IL-2 e IFN-y) la que tienen favorecida su expresión en estas condiciones. En perros enfermos la expresión de citoquinas no se corresponde con respuesta TH2, sino con un estado de inmunosupresión debida al desarrollo de la enfermedad, en el que las células no responden a la estimulación inespecífica ni a la presencia de antígenos parasitarios.

Autor: MONTIEL DUARTE CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La MDMA (3,1-metilendioximetanfetamina) o "éxtasis" es un derivado de la anfetamina cuyo consumo produce hepatotoxicidad en humanos. En este estudio se demuestra que en hepatocitos primarios de rata y en una línea celular de células estelares hepáticas (CEH) de rata, la administración de MDMA produce apoptosis. Esta apoptosis cursa con condensación nuclear, acumulación de fragmentos oligonucleosomales en el citoplasma, disminución de los niveles de la proteína Bcl-xL, salida de citocromo c desdela mitocondria y activación de la caspasa-3. Además, en el caso de las CEH y no en el de los hepatocitos, la administración de la MDMA produce la proteolisis de la proteína poliADP-ribosa polimerasa. El posible papel del estrés oxidativo en la acción apoptótica de la MDMA se estudió en las CEH. La MDMA provocó estrés oxidativo en estas células, con un aumento del agua oxigenada y un descenso de los niveles de GSH intracelulares. Sin embargo, el estrés oxidativo no es un mediador de la acción apoptótica, ya que el pretratamiento con antioxidantes no inhibió la muerte celular. La MDMA indujo la activación del factor NFkB, pero la inhibición de éste aumentó la apoptosis indicando que su acción es protectora. La inhibición del citocromo P450 previno la acción proapoptótica de la MDMA, indicando que un derivado de la droga es responsable de su efecto apoptótico.

Autor: SÁNCHEZ ELSNER TILMAN.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOLÓGICAS.

Resumen: El trabajo presentado estudia la cooperación funcional de dos vías de señalización, hipoxia y TGF-beta en la regulación transcripcional de dos genes implicados en anigogénesis, el del factor endotelial de crecimiento vascular (VEGF), y el de la endoglina, receptor auxiliar del sistema de TGF-beta. En el promotor de VEGF se ha identificado un elemento de respuesta a TGF-beta en la proximidad de la secuencia reconocida por el factor de Hipoxia (HIF-1). La tesis demuestra como el estímulo de TGF-beta sobre la transcripción de VEGF es mediado por la vía de las proteínas Smads. En condiciones de aumento de TGF-beta y de hipoxia, HIF-1 contacta su secuencia consenso en la vecindad de las Smads, estableciéndose una interacción física que da como resultado neto una estimulación sinérgica de la actividad transcripcional del gen VEGF. Es de destacar que la cooperación a nivel transcripcional de estas dos vías, hipoxia y TGF-beta, se ha descrito por vez primera en este trabajo. Por otra parte se ha validado el modelo de la cooperación HIF/Smads, en otro promotor, el del gen de la endoglina, donde se forma un complejo transcripcional multiproteico incluyendo a Sp1, para poner en contacto dos factores de transcripción cuyos sitios de reconocimiento están aquí, físicamente alejados. La cooperación hipoxia/TGF-beta, en VEGF y en endoglina, se traduce fisiológicamente en un aumento de la angiogénesis.

Autor: LARRARTE LÁZARO EIDER.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNVIERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El potencial electroquímico transmembrana generado en la membrana interna mitocondrial durante la fosforilación oxidativa proporciona la energía para la síntesis de ATP a través de la ATP-sintasa. Sin embargo, no todo el consumo de oxígeno está acoplado a la síntesis de ATP. Parte de la energía conservada en forma de gradiente electroquímico se pierde en forma de calor debido a que existen otras vías por las que puede disiparse el gradiente de protones. Esta "fuga alternativa" de protones podría constituir un componente de gran importancia en la termogénesis, y por tanto en el metabolismo basal. La proteína desacoplante (UCP1) expresada principalmente en tejido adiposo pardo, desacopla la cadena respiratoria mitocondrial y es la principal responsable de la termogénesis en este tejido. Existen otras proteínas que presentan una alta homología con dicha proteína, como la UCP2, expresada en muchos tejidos. En el presente trabajo se intentó lograr la expresión ectópica de estas proteínas en músculo esquelético mediante la inyección intramuscular de DNA "desnudo", método eficaz para la transferencia génica con una baja respuesta inmunitaria. El estudio se realizó con ratas a las que se les inyectó en el músculo tibialis un plásmido con el cDNA de las proteínas desacoplantes (UCP1 o UCP2). Al cabo de diez días, se realizaron diferentes determinaciones en mitocondrias aisladas para evaluar así la eficacia de transferencia génica. En primer lugar, se verificó que los músculos inyectados expresaban la proteína correspondiente, UCP1 o UCP2. Por otra parte, se pudo comprobar una disminución del potencial de membrana mitocondrial en ambos casos, y un aumento del consumo de oxígeno en las mitocondrias que expresaban UCP1. El presente estudio pone de manifiesto que la expresión ectopica de proteínas desacoplantes en el músculo esquelético, aumenta el flujo de protones a través de la membrana interna de la mitocondria. Este hecho podría afectar a la termogénesis y por lo tanto, contribuir a la búsqueda de nuevas estrategias para la regulación del peso corporal y tratamiento de la obesidad.

Autor: MIRPURI MERINO EDUARDO.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: En la cirrosis hepática las concentraciones plasmáticas de IGF-1 están disminuidas. La administración de dosis bajas de IGF-1 mejora el estado nutricional, osteopenia, hipogonadismo, absorción intestinal y función hepática en la cirrosis experimental. Los mecanismos moleculares del efecto del tratamiento están aún sin esclarecer. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la expresión diferencial de genes en tejido hepático normal y cirrótico; e identificar aquellos genes cuya expresión pudiera ser afectada por el tratamiento con IGF-1. La cirrosis se indujo en ratas Wistar macho por inhalación de CCL4 y fenobarbital en el agua de bebida durante 30 semanas. Las tres últimas semanas los animales fueron tratados con salino (CI) o con rhIGF-1 (2ug/100g/DIA, sc)(CI+IGF-1). Controles sanos se estudiaron paralelamente (CO). Se aislo ARN total de tejido hepático en los tres grupos. Para el análisis se aplicó la técnica de "diferential display" mediante PCR, que permite la identificación y clonaje de genes diferencialmente expresados en muestras a comparar, proporcionando un análisis completo de las poblaciones ARNm. Se encontró una disminución en la expresión del ARNm de IGF-1 en el grupo CI, que mejoro significativamente con el tratamiento. La expresión de quince genes resultó afectada en el grupo CI y nueve de ellos fueron sensibles al tratamiento con IGF-1. La administración exógena de IGF-1 en ratas con cirrosis descompensada, contribuye a normalizar la expresión de genes que se ven afectados en la hepatopatia crónica. Además, el tratamiento con IGF-1 normalizó los niveles de metilación global del ADN, que se encontraban alterados en los animales con cirrosis. También mejoro la expresión del receptor para la GH, mecanismo por el que podría explicarse la mayor sensibilidad del parenquima hepático de los animales enfermos tratados con IGF-1, a la acción de esta hormona. Esta modulación inducida por el tratamiento con IGF-1, de la expresión de genes aproximandose a los controles sanos, contribuye a explicar la recuperación de la función hepática observada en estos animales y los efectos hepatoprotectores descritos previamente por nuestro grupo.

Autor: PORTILLO BARRIO ARÁNZAZU.
Año: 2001.
Universidad: LA RIOJA.
Centro de lectura: ENSEÑANZAS CIENTÍFICAS Y TÉCNICAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LA RIOJA.

Resumen: La investigación objeto de esta tesis doctoral se centró en la caracterización de los mecanismos de resistencia a antibióticos macrólidos, liconsomidas y estreptograminas (MLS) en dos géneros bacterianos: Streptococcus y Enterococcus. OBJETIVOS 1,- Caracterizar los mecanismos de resistencia a antibióticos MLS en aislamientos de Streptococcus de diferentes especies (S.pyogenes, S.agalactiae, Streptococcus beta-hemolíticos del grupo C y grupo G y S.pneumoniae) en La Rioja (Hospital San Milán, periodo 1996-2001). Para ello se estudió la distribución de fenotipos de resistencia, así como los mecanismos de resistencia asociados a dichos fenotipos y su evolución temporal, y se analizó así la distribución clonal de aislamientos resistentes a eritromicina. 2,- Caracterizar los mecanismos de resistencia a antibióticos MLS en aislamientos de Enterococcus de diferentes especies (E.faecalis, C.faecium, E.durans, E.avium, E.hirae, E.gallinarum y E.casselifavus). En este caso, se investigaron los fenotipos de resistencia, así como los mecanismos de resistencia asociados a dichos fenotipos y se caracterizó un nuevo gen que fue denominado msrC. CONCLUSIONES Se detectaron altas tasas de resistencia e eritromicina en aislamientos de Streptococcus Beta-hemolíticos de los grupos A, B, C y G obtenidos en la Rioja (13-25%). Un porcentaje superior fue detectado en aislamientos de S.pneumoniae (54%). Se observó una disminución en el porcentaje de aislamientos resistentes a eritromicina en las especies S.pyogenes y S.pneumoniae a lo largo del periodo analizado (1996-2001), desde un 35 a un 20% en el caso de S.pyogenes, y desde un 64 a un 47% en S.pneumoniae. Entre los aislamientos resistentes a eritromicina, el fenotipo M de resistencia fue el más frecuente en S.pyogenes (80%). El fenotipo MLSb fue exclusivo en aislamientos de Streptococcus beta-hemolíticos de los grupos C y G y mayoritario entre los aislamientos de S.agalactiae y S.pneumoniae (>79%). El gen mef(A) o el gen mef(E), asociados al fenotipo M, y el gen erm(B) o el gen erm(TR), ambos asociados al fenotipo MLSb, fueron los predominios en Streptococcus según las especies. Se evidenció la presencia de aislamientos de Streptococcus beta-hemolíticos resistentes a eritromicina de un mismo clon en diferentes años del estudio. El gen erm(B) fue encontrado en todas las cepas de Enterococcus con alto nivel de resistencia a eritromicina (CMI > 128 ug/ml), con la excepción de una cepa de E.faecium en la que se detectó el gen erm(A). En todas las cepas de E.faecium, con independencia de su fenotipo de resistencia a eritromicina, se detectó un nuevo gen que fue denominado msrC. El resto de especies de Enterococcus analizadas no presentaron dicho gen. El gen msrC, descrito en E.faeciu, contiene 1479 pb y posee una identidad de un 53% con el gen msr(A), descrito en E.faecium, contiene 1479 pb y posee una identidad de un 53% con el gen msr(A), descrito en Staphylococcus y relacionado en dicho género bacteriano con la resistencia a macrólidos y estreptograminas de tipo B. El gen msrC codifica una proteína de 492 aminoácidos y pertenece a una familia de genes de bombas de eflujo. Se evidenció un sistema de bombeo de eritromicina, dependiente de energía, en cepas de E.faecium con diferentes niveles de resistencia a dicho macrólido. La bomba de eflujo MsrC podría estar relacionada con este bombeo de eritromicina.

Autor: PÉREZ LUZ SARA.
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR.

Resumen: La región espaciadora entre los genes ribosómicos 16S y 23S (ITS) se está utilizando últimamente para establecer relaciones filogenéticas entre microorganismos muy próximos. Hasta hace relativamente poco tiempo, el marcador filogenético más utilizado había sido el gen ribosómico 16S y RNA. Sin embargo, cuando se trata de establecer relaciones por debajo del nivel de especie, la variabilidad que se encuentra en este gen no es suficiente. La región espaciadora presenta la ventaja de encontrarse entre genes altamente conservados y por lo tanto es posible amplificarla en practicamente cualquier microorganismo utilizando cebadores universales. El número de operones ribosómicos, y por lo tanto de ITS, presentes en un microorganismos varía entre 1 y 14, dependiendo de la especie. Estudios realizados en distintas especies han puesto de manifiesto la gran variabilidad existente, tanto en secuencia como en longitud, entre los diferentes operones de una misma célula. La variabilidad a la que está sometida en esta región parece no ser la misma que actúa sobre los propios genes ribosómicos, a pesar de tratarse de una familia multigénica, pudiendo ser su falta de funcionalidad la causa de esta mayor variabilidad. Estudios recientes han aprovechado la varibilidad de longitud de esta zona para estudiar y comparar la composición de microorganismos en diferentes habitats. En el presente trabajo se han analizado las regiones espaciadoras entre los genes ribosómicos 16S y 23S RNA en distintas especies con diferente número de operones ribosómicos, con el fin de estudiar la variabilidad que aparece en estas regiones. Las especies estudiadas han sido Legionella pneumophila, con un número desconocido de operones ribosómicos que será determinado antes de procedes a la secuenciación de las regiones espaciadoras, Salmonella enterica, con 7 operones ribosómicos, y distintas especies del género Mycobacterium, con uno o dos operones ribosómicos según se trate de especies de crecimiento lento o especies de crecimiento rápido. En la última parte del trabajo se ha aplicado la técnica de análisis de fragmentos a diferentes especies patógenas importantes desde el punto de vista de su transmisión hídrica, para comprobar su posible aplicación como marcador molecular en la detección de dichos patógenos. Para el estudio de las regiones espaciadoras se procedio a la secuenciación de las mismas, bien a partir de la amplificación específica de los diferentes operones, en el caso de que exista información completa de su genoma, o bien a partir de clones obtenidos tras la amplificación con cebadores universales. Para la aplicación de la técnica de análisis de fragmentos se seleccionaron distintas especies patógenas de transmisión hídrica y de cada una de ellas se estudió un conjunto de 15 cepas intentando que fuern lo más representativas posibles de la variabilidad genética de cada una de ellas. En esta técnica se amplificó mediante cebadores universales la región espaciadora entre los genes 16S y 23S y el producto de PCR fue resuelto en un secuenciador automático. Para la especie Legionella pneumophila se determinó que eran tres los operones ribosómicos presentes en esta bacteria, presentando dos tipos de regiones espaciadoras atendiendo al tipo de gen de RNA de transferencia que contenían. Con la técnica de análisis de fragmentos se obtuvo para todas las cepas estudiadas un mismo patrón elctroforético con dos fragmentos de 496 y 510 pares de bases. Las cepas de la especie Salmonella enterica presentaron una gran variabilidad no solo de secuencia sino también de organización y distribución de las regiones espaciadoras en los distintos operones. La mayoría de las cepas presentaron la organización de 4 espaciadores con un tRNA para el aminoácido glutámico en su secuencia y 3 con los tRNA para isoleucina y alanina. Sin embargo tres cepas presentaron unicamente dos espaciadores con el tandem de tRNAs. La distribución de las regiones espaciadoras también es distinta según se trate de cepas monofásicas o difásicas, presentando las primeras como ITS con dos tRNAs las de los operones B, D y H, y las segundas las de los operones A, B y H. El grado de diversidad de secuencias encontradas en la región espaciadora varía de unas especies a otras dependiendo entre motivos del número de operones ribosómicos que contenga dichas especie. Así, en las especies con un mayor número de operones la transferencia horizontal puede romper la homogeneidad que produce el fenómeno de la evolución concertada. En el caso de las especies de Mycobacteriu, además de poseer una única copia de operón ribosómico, el hecho de que presenten un ITS tan corto también puede influir en la escasa variabilidad encontrada. Por último, la técnica de análisis de fragmentos muestra que las especies con un número bajo de operones ribosómicos presentan una gran conservación en el perfiel de sus ITS, mientras que en aquellas especies con un número elevado de operones los perfiles que se obtienen son más hterogéneos en las distintas cepas.

Autor: CASTRO GALACHE M. DOLORES.
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALICANTE.

Resumen: Uno de los principales motivos del fracaso de la quimioterapia del cáncer es el desarrollo de resistencia al fármaco o a los fármacos empleados en el tratamiento. A menudo las células tumorales presentan resistencia cruzada a un gran número de fármacos de estructura química y actividad diferentes, tales como antraciclimas, alcaloides derivados de Vinca, etc., fenómeno que se denomina resistencia a múltiples fármacos o MDR. Se han descrito distintos mecanismos de resistencia asociados a este fenómeno pleiotrópico como alteraciones de las dianas farmacológicas, fallos en el control de la proliferación celular y de la apoptosis, aumento en los mecanismos de detoxificación. Entre estos, uno de los más estudiados por su importancia en clínica es la sobre-expresión en la membrana al exterior de la célula disminuyendo su concentración intracelular y por tanto su acción farmacológica, esta disminuida acumulación de fármacos es características del fenotipo MDR. Se han descrito distintas proteínas transportadoras como la glicoproteína-P (Pgp), MRP y BCRP. La gran repercusión clínica de MDR ha dado relevancia al estudio de la reversión de este fenómeno así como a la prevención de su desarrollo. Para afrontarlo se han planteado distintas estrategias terapéuticas. En primer lugar, al igual que se conocen un gran número de fármacos transportados por Pgp, también se han descrito muchos de sustancias capaces de bloquear la actividad de la bomba o bien de reducir su eficacia, son los llamados reversores de resistencia o quimiosensibilizadores (VRP, ciclosporina A, estaurosporina, etc). En segundo lugar, la reversión del fenotipio MDR se puede conseguir mediante la regulación de la expresión de los genes que codifican proteínas transportadoras como Pgp u otros genes implicados en la adquisición del fenotipo resistente, lo cual constituye otra de las alternativas en estudio. Por último, la incontrolada proliferación celular inherente al cáncer pude ser considerada como un bloqueo del proceso de maduración en tumores hematopoyéticos. La indución a maduración de las células leucémicas con agentes químicos o farmacológicos, el control de su crecimiento desmedido y la inducción de apoptosis ofrece por tanto otra alternativa terapéutica. No obstante, existe una gran controversia sobre la relación que existe entre el grado de maduración y la expresión del fenotipo MDR de las células tumorales, esto junto con la utilización en clínica de alguno de estos agentes de diferenciación justifica este estudio sobre la relación entre resistencia a fármacos e inducción de maduración células. Para ello se contó con dos líneas celulares de leucemia murina P388 y L1210 con distinto grado de diferenciación celular. Además de estas líneas parentales sensibles a fármacos contamos con dos líneas resistentes generadas a partir de las anteriores mediante selección en presencia continua de la antraciclina DNM que se caracterizan por poseer un fenotipo MDR con sobre-expresión de Pgp. Se denominan P388R y L1210R respectivamente. En este trabajo se planteó inducir la diferenciación celular con distintos agentes de conocida capacidad para promover la maduración celular como el éster de forbol TPA u otros, con objeto de estudiar su relación con el fenómeno de resistencia a fármacos. Nos planteamos un doble objetivo, por un lado estudiar si la expresión del fenotipo MDR facilita o impide la maduración celular y por otro lado si los agentes de diferenciación empleados y la maduración inducida por los mismos pueden modular la expresión y/o actividad de Pgp como pieza clave en la resistencia a fármacos. Tras el tratamiento de las células P388 y L1210 con TPA se observó que este induce una diferenciación moderada en células sensibles. En las células resistentes la inducción de maduración es inferior que en las parentales por tanto su fenotipo MDR está impidiendo la maduración que se da en sensibles, pero la actividad de Pgp no es responsable directa del poco efecto de TPA en resistentes. En un ensayo de acumulación de daunomicina en las células P388 y P388R tratadas con Tpa se observó que TPA no afecta a la actividad de Pgp como bomba transportadora de fármacos. Mediante amplificación del mismo por técnicas de RT-PCR con los cebadores adecuados detectamos el mensajero de Pgp que no se modificó en células tratadas con Tpa respecto al control. TPA no modifica la expresión de Pgp a nivel de mensajero. El tratamiento de estas líneas celulares con TPA no supone ninguna ventaja sobre los tratamientos citotóxicos ya que no consigue sensibilizar ni inducir muerte en las células resistentes a fármacos, con otro agente, la Tricostatina A (TSA), metabolito fúngico capaz de bloquear el ciclo celular e inducir diferenciación debido a su actividad como inhibidor de las desacetilasas de histonas, con los mismos objetivos. El tratamiento con TSA indujo la muerte celular diferencialmente de la línea tumoral resistente a fármacos, esta disminuida viabilidad celular se debe a la inducción de apoptosis en L1210R con activación de caspasa-3, que además resultó ser independiente de p53. En células sensibles TSA bloqueó el ciclo celular en el punto de control G1-S y produce un paso tardío por G2 pero no se indujo apoptosis. En cuanto a su efecto sobre el fenotipo MDR, TSA revirtió el fenotipo MDR de L1210R disminuyendo la expresión de Pgp, ensayos en células transfectadas con Pgp exógena revelaron que el efecto de modulación de la expresión de Pgp por TSA es a nivle transcripcional. Ambos efectos de TSA, sobre la apoptosis y expresión de Pgp en L1210R requieren la síntesis de novo de proteínas. Ensayos para dilucidar por vías de transducción de señales pueden estar implicadas en la regulación de los factores pro o anti-apoptóticos que controlan el efecto de TSA sobre L1210R demostraron la participación de la vía de las PKCs y en concreto de las isoformas clásicas de esta familia de enzimas. La activación de las mismas no sólo supone una protección de las células resistentes a la apoptosis inducida por TSA sino que da lugar a una quimiosensibilización de las mismas, indicando que el equilibrio que existe en la expresión de las distintas isoformas de PKC está directamente implicado en el desarrollo del fenotipo MDR.

Autor: BARBERÁ JUAN VÍCTOR MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El adenocarcinoma de páncreas exocrino es una de las neoplasias humanas más agresivas y en las que menos avances se han producido, con respecto a la prevención diagnóstico y tratamiento, en los últimos 30 años. La supervivencia global, a los 5 años es inferior al 5%. Este tumor presenta algunas limitaciones que son las responsables de que los conocimientos de alteraciones moleculares implicadas en su desarrollo sean menores que en otros tumores. La presentación en estadios avanzados y el escaso beneficio quirúrgico limitan la disponibilidad de material biológico para su estudio. Por otro lado, la gran reacción inflamatoria inducida por el tumor dificulta su estudio molecular. Estas limitaciones han condicionado que los datos de alteraciones genéticas actuales en adenocarcinomas de páncreas procedan del análisis de series pequeñas y generalmente, no del estudio directo de tumores humanos. La reciente tecnología de la microdisección láser, que permite el aislamiento de poblaciones celulares puras o casi puras, nos ha permitido el estudio de las alteraciones genéticas directamente del tumor humano sin ninguna estrategia de enriquecimiento celular intermedia. Este estudio a parte de ser la serie de tumores humanos de páncreas más grande analizada (n=52), es la primera que se analiza mediante microdisección láser. Con este planteamiento el estudio aporta resultados novedosos en el conocimiento molecular de este tumor. Las principales conclusiones de este estudios son, la identificación de la inactivación de los genes INK4a y Tp53 como un requisito esencialmente obligatorio para el desarrollo de los adenocarcinomas de páncreas en humanos. La caracterización de la inmunohistoquímica de p53 como un mal marcador de mutaciones en el gen Tp53 en este tumor y la identificación de las pérdidas del alelo normal de oncogén K-ras como un evento relativamente frecuente en los cánceres de páncreas con mutaciones activadoras del otro alelo.

Autor: FRANCES GUARINOS RUBEN.
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR - UMH .

Resumen: Las infecciones bacterianas son complicaciones frecuentes que se desarrollan en pacientes con cirrosis. La práctica de DIS en pacientes de alto riesgo, ya sea primaria o secundaria, es un instrumento útil para la prevención de estos episodios, si bien la mortalidad hospitalaria continúa siendo elevada, incluso tras la curación del proceso. En nuestro estudio, planteamos la posibilidad de identificación de pacientes en los que exista una llegada de bacterias o de sus productos al líquido ascítico (LA), incluso sin el desarrollo de episodios infecciosos, resultando de gran utilidad por cuanto permitirá detectar aquellos pacientes con un mayor riesgo de desarrollar PBE y en los que la práctica de una profilaxis primaria posibilitaría la reducción del número de dichos episodios. Previamente, el estudio requiere un análisis exhaustivo de todas las condiciones descritas hasta el momento como conflictivas y que se lleven a cabo estudios preeliminares que permitan la obtención de resultados de sensibilidad, especificidad y ausencia de contaminación de la técnica adecuados.