BIOQUIMICA MOLECULAR, 2

Autor: MEDINA BADENES MARÍA DEL PILAR.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.
Centro de realización: HOSPITAL "LA FE" DE VALENCIA.

Resumen: El sistema de la proteína C presenta actividades anticoagulantes, antiinflamatorias, antiapoptóicas, neuroprotectoras y profibrinolíticas para la activación de la proteína C se requiere el precio ensamblaje de, al menos, la trombina. Trombomodulina, proteína C y EPCR. Así, la APC detiene la coagulación, por ello, cambios en la expresión o en el ensamblaje de estas cuatro proteínas podrían dar lugar a una reducción de APC y un aumento del riesgo trombótico. Hemos desarrollado un ensayo para cuantificar la APC circulante, mediante el cual hemos observado que un nivel reducido de APC es un factor de riesgo prevalente e independiente de tromboembolismo venoso, el cual parece estar genéticamente determinado. Hemos idetificado humerosas mutaciones en las proteínas del sistema de activación de la proteína C. El poliformismo C1418T (Ala 455 Val) en la trombomodulina está asociado con niveles elevados de APC y un menor riesgo trombótico. El A4600E (Ser219Gly) en el EPCR, determina los niveles plasmáticos de EPCR soluble. Y, finalmente, el polimorfismo G4678C en el gen del EPCR está asociado con niveles elevados de APC y una disminución del riesgo trombótico, como ocurre en aquellos portadores de la mutación protrombótica factor V Leiden.

Autor: Tomás Cobos Lidia.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: Facultad Medicina y Odontología.
Centro de realización: Instituto de Biomedicina.

Resumen: La glucosa es la principal fuente de carbono y energía para la mayoría de las células. Además de ser nutriente se puede considerar a la glucosa como una "hormona de crecimiento", ya que regula varios aspectos del crecimiento, metabolismo y desarrollo celular. En Saccharomyces cerevisiae la presencia de glucosa tiene distintos efectos en la maquinaria metabólica, así pues, fenómenos a largo plazo suponen un control de la expresión génica mediante dos rutas diferentes denominadas: ruta de inducción y ruta de represión. Mediante la ruta de r~resiQn se inactiva la expresión génica de un gran número de genes tales como los genes responsables de la utilización de otras fuentes de carbono distintas a la glucosa, de la gluconeogénesis y la respiración; por el contrario, mediante la ruta de inducción se activan los genes responsables de la utilización de la glucosa, tales como genes que codifican para enzimas glicolíticos y transportadores de glucosa, HXTs, (1-5). En los últimos afios se han caracterizado distintos componentes del sistema de represión. Siendo el complejo protein-kinasa Snfl (1) un componente clave y esencial para la activación de los genes reprimidos por glucosa. El complejo se encuentra activo en condiciones de baja glucosa, y su actividad esta regulada negativamente por la hexoquinasa II, Hxk2 (6), y el complejo fosfatasa Regl/Glc7 (7,8). El gen del transportador de glucosa de baja afmidad, HXTl (9), se induce en altas concentraciones de glucosa, y la regulación de su expresión se utiliza como modelo en el estudio de la ruta de inducción por glucosa. En dicho sistema se han descrito varias moléculas. Los sensores de membrana de baja y alta afinidad, Rgt2 y Snf3 (10), que inician la transmisión de la señal a través de Grrl (11,12), molécula que forma parte del sistema de ubiquitinación, y regula la actividad del factor transcripcional Rgtl (9). RESULTADOS y DISCUSIÓN El trabajo realizado se ha centrado principalmente en el estudio de la regulación de la expresión del transportador de glucosa de baja afinidad, HXT 1, de S.cerevisae. Los resultados obtenidos se pueden agrupar en tres grandes bloques: 1. El complejo Snfl activo inhibe la expresión de HXT1. En este estudio se demostró la implicación de la protein kinasa Snfl en la regulación de la expresión de HXT 1; ya que, se observó que existía una correlación entre el estado de activación del complejo Snfl, y la expresión de HXT1. De modo que, si se activaba artificialmente al complejo Snfl en alta glucosa, por la eliminación de sus reguladores (Regl y Hxk2) se inhibía la expresión del transportador. Además, encontramos por el sistema del doble híbrido que Std 1 ( 13 ), molécula que regula negativamente a HXT 1, interacciona con el dominio kinasa de Snfl y también con el factor transcripcional Rgtl. Al mismo tiempo que definimos que el factor transcripcional Rgtl interacciona con el gran complejo represor Ssn6 (14). De modo que, el complejo Snfl no sólo participa en la desrepresión de los genes reprimidos por glucosa, sino que además reprime a los genes inducidos por glucosa. Estos resultados están recogidos en la publicación:Tomas-Cobos, L., and S'anz, P., Active SnfJ protein kinase inhibits expresión ofthe Saccharomyces cerevi.S'iae HXTl glucose transponer. Biochem. J. (2002) 368, 657-663. 2. La ruta HOG y la ruta de señalización por glucosa regulan la expresión de HXT1. En este trabajo observamos que la ruta MAP kinasa de respuesta a estrés osmótico, la ruta HOG (15,16), también participa en la expresión de HXT1. Demostrando que la presencia de alta glucosa (2%), condiciones de inducción del transportador de glucosa de baja afmidad HXT 1, es leída por la célula S. cerevisae como estrés osmotico. Además, también identificamos que el factor de transcripción Skol, cuya actividad está regulada por la kinasa Hogl, regula la expresión de HXT1. Este trabajo se realizó en colaboración con el Dr. Francesc Posas de la Universidad Pompeu Fabra de Barcelona, y los resultados aparecen affinity glucose transporter requires the coordinated activities of the HOG and glucose signalling pathways. The Joumal ofBiological Chemistry. Vol. 279. No.21. pp 22010-22019. 3. La participación de la ruta de la kinasa TOR y las proteínas 14-3-3 en la regulación de la expresión de HXT1. La ruta TOR es una ruta esencial de los organismos eucariotas considerada con un centro regulador del crecimiento celular; de modo que, si la ruta está activa significa que la célula se encuentra en un estado energético óptimo para continuar con el crecimiento celular (17). En esta parte de nuestro estudio encontramos que si inhibimos la ruta TOR mediante el tratamiento con rapamicina se inhibe la expresión de HXTl; de modo que, la ruta TOR participa en la inducción de la expresión de HXT 1. Además, dicha acción esta mediada a su vez por las proteínas Bmhs (homólogos de levadura de las proteínas 14-3-3 de mamíferos). También demostramos a través del sistema del doble híbrido la existencia de un complejo temario entre: las proteínas Bmhs, Regl (subunidad reguladora de la fosfatasa Glc7) y Grrl. Resultados recogidos en la siguiente publicación: Tomás-Cobos, L., Viana, R, and Sanz, P. TOR kinase pathway and 14- 3-3 proteins regulate glucose-induced expression of HXT 1, a yeast low-affinity glucose transporter. Yeast, pendiente de publicación). BIBLIOGRAFíA 1. Rolland, f., Winderickx, J., and Thevelein, J.M. 2002. Glucose-sensing mechanism in yeast. FEMS yeast research 2, p: 183-201. 2. Kruckeberg, A.L., Walsh, M.C., and Van Dam, K. 1998. How do yeast cells sense glucose? BioEssays 20: 972-976. (1998). 3. Gancedo, J.M. 1998. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol. Biol Rev.62; 334-361. 4. RoUand, f., Winderickx, J., and Thevelein, J.M. 2001. Glucose-sensing mechanism in eukaryotics cells. TRENDS in Biochemical Sciences. 26(5), 310-317 . 5. Carlson, M. 1998. Regulation offue glucose utilization in yeast. Current Opinion in Genetics & Development. 8:560-564. 6. Mayordomo, L, and Sanz, P. Hexokinase PII: structural analysis and glucose signaling in fue yeast Saccharomyces cerevísiae. Yeast 2001; 18: 923-930. 7. McCartney, R.R., and Schmidt, M. 2001. Regulation of fue Snfl, activation requires phosphorylation of fue threonina 210 by an upstream kinase as well as a distinct step mediated by the Snf4 subunit. The Journal Biological Chemistry. 276(39): 36460-36466. 8. Alms, G.R., Sanz, P., Carlson, M., Haystead, T.A. 1999. Reglp targets protein phosphatase 1 to dephosphorylate hexokinase II in Saccharomyces cerevisiae: characterizing the effects of a phosphatase subunit on the yeast proteome. EMBO Journal18 (15), pp. 4157-4168. 9. Ozcan, S., Dover, J., and Johnston, M. (1998). Glucose sensing and signalling by two glucose receptors in fue yeast Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 17:2566-2573. (15) lo. Ozcan, S., and Johnston, M. Function and Regulation ofHexose Transporters. Microbiol and Molecular Biology Revíews. 1999. 63 (3)554-569. 11. Hsiung, Y.G.m Chang, H., Pellequer, J-L., La Valle, R., Lanker, S., and Wittenberg, C. 2001. F -box Protein Grr 1 interacts wifu phosphorylated targets vía the cationic surface of its leucine-rich repeat. Molecular and Cellular Biology. 21(7), p: 2506-2520. 12. Skowyra D., K. L. Craig, M. Tyers, S. J Elledge, and J. W. Harper. (1997). F-box proteins are receptors fuat recruit phosphorylated substrates to fue SCF ubiquitin-ligase complex. Ce1191: 209-219.5324,1996. 13. Schimdt, M.C., McCartney, R., Zhang, X., Tillman, T.S., Solimeo, a, Wolf, s., Almonte, C., and Watkins, S.C. (1999). Stdl and Mth1 proteins interact wifu fue glucose sensors Snf3 and Rgt2 in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biology. Vo119. m: 4561-4571. 14. Varanasi, U.S, Klis, M., Mikesell, P.B., and Trumbly, R. 1996. The Cyc8 (Ssn6)-Tupl corepressor complex is composed ofone Cyc8 and four Tup1 subunits. Molecular and Cell Biology. 16 (12), p: 6707-6714. 15. Hohman, S. 2002. Osmotic Stress Signalling and Osmoadaptation in Yeast. Microbiol. Mol. Biology. Revíews. 62 (2) 300-372. 16. O.Rourke, S.M., Herskowitz, L, O'Shea, E.K 2002. Yeast go fue Whole HOG for fue hyperosmotic response. TRENDS in genetics. 18 (8),405-412. 17. Crespo, J.L and Michael Hall, M.N. 2002. Elucidating TOR signaling and rapamycin action: Lessons from Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular -reviews, 66 (4) p 579-591.

Autor: Poch Jiménez Enric.
Año: 2004.
Universidad: CARDENAL HERRERA CEU.
Centro de lectura: Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salu.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y DE LA SALUD.

Resumen: Las proteínas con actividad GTPasa de la familia de Ras juegan un papel central en la regulación de una amplia gama de funciones celulares. Dentro de la superfamilia de Ras se encuentran las proteínas de la familia de Rho, cuyos 20 miembros se subdividen en 5 subgrupos: Rho, Rac, Cdc42, Rnd y RhoBTB. Como el resto de miembros de la superfamilia de Ras, las proteínas Rho funcionan como interruptores moleculares, presentando un estado inactivo cuando están unidas a GDP y un estado activo cuando se unen a GTP. Hasta hace poco tiempo, se pensaba que las proteínas Rho solo participaban en la regulación de la organización del citoesqueleto en respuesta a estímulos extracelulares. Sin embargo, en los últimos años se ha comprobado que las GTPasas Rho juegan un papel crucial en muchas funciones celulares como son el tráfico de vesículas, regulación transcripcional, proliferación, transformación, crecimiento celular, supervivencia y desarrollo. RhoE (Rnd3) es uno de los miembros de la familia de Rho con un alto grado de similitud con RhoA, pero, a diferencia de ésta, carece de actividad GTPasa lo que la convierte en una proteína constitutivamente activa. Los efectos de RhoE sobre la organización del citoesqueleto son opuestos a los de RhoA, por lo que RhoE actúa como antagonista de RhoA. Con la realización de este trabajo hemos querido estudiar el papel RhoE en la proliferación y supervivencia celular y los mecanismos moleculares que están implicados. Para destacar la relevancia de RhoE en cáncer hemos utilizado como modelo células U87, una línea celular derivada de glioblastoma humano y caracterizada por carecer de la expresión de PTEN, lo que conduce a una activación constitutiva de la ruta de Akt. Para la sobreexpresión de proteínas hemos utilizado un sistema adenoviral que nos permite una eficacia de infección mayor que 90%. También hemos estudiado el papel de RhoE en la proliferación y supervivencia celular de astrocitos primarios de rata que tienen normalmente regulada la ruta de Akt. Finalmente, hemos estudiado el posible papel antagónico de RhoE y RhoA y su importancia sobre la proliferación y supervivencia de células U87. Los resultados obtenidos demuestran que RhoE produce alteraciones del citoesqueleto similares a las descritas en otros modelos, confirmando resultados de otros autores. En cuanto a la proliferación celular, RhoE inhibe el crecimiento de células U87 a través de un bloqueo en la fase G1 del ciclo celular. Dicho bloqueo se produce por una inhibición de la expresión de ciclina D1 y p21Cip1 que resulta en una reducción del grado de fosforilación de Rb. RhoE también reduce la capacidad de las células de entrar en el ciclo celular y retrasa en el tiempo esta entrada, lo que demostramos mediante ensayos de incorporación de BrdU. A nivel molecular, observamos también un retraso en la fosforilación de Rb, como consecuencia de la ausencia de inducción de la expresión de ciclina D1. De las posibles rutas de transducción de señales implicadas en la regulación de la expresión de la ciclina D1, hemos comprobado que RhoE interfiere con la activación de ERK inducida por suero. Por otro lado, RhoE induce muerte celular tanto en células U87 como en astrocitos primarios de rata. Mediante la sobreexpresión de mutantes de Akt constitutivamente activos o dominantes negativos, demostramos que esto sucede a través de mecanismos independientes de la ruta de supervivencia PI3K/Akt. Finalmente, los estudios realizados con RhoA demuestran que la sobreexpresión de esta proteína es capaz de revertir el efecto sobre el crecimiento y supervivencia inducido por RhoE en células U87. Con todos los datos presentados en este trabajo proponemos un nuevo papel para RhoE como proteína supresora de tumores.

Autor: PAÑEDA RODRIGUEZ ASTRID.
Año: 2004.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: EDIFICIO SANTIAGO GASCON.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se presenta el desarrollo de un conjunto de herramientas moleculares que han permitido y permitirán la localización de genes de interés en la judía común (Phaseolus vulgaris L.). Se realizó la búsqueda de marcadores moleculares ligados al gen fin y bc3, encontrándose 16 marcadores que mostraron un ligamiento claro a uno de los dos genes. Se diseñaron 40 SCARs a partir de los RAPDs incluidos en un mapa genético previamente elaborado en este laboratorio, obteniéndose polimorfismo para 25 de ellos. Se llevó a cabo una caracterización molecular de treinta variedades a partir del análisis del patrón de amplificación de 81 marcadores de interés en la judía. El árbol filogenético obtenido ha permitido establecer las relaciones filogenéticas existentes entre las variedades analizadas y constituye una herramienta de gran valor para el futuro diseño de programas de mejora asistida. También se obtuvo una población de RILs a partir del cruzamiento entre las variedades Xana y Cornell 49-242, así como un completo mapa genético con numerosos marcadores moleculares (AFLPs, SCARs, RAPDs, SSRs, ISSRs y CAPs), que servirá de esqueleto base para la localización futura de caracteres de interés aplicado.

Autor: RICO MARTINEZ ARANTZA.
Año: 2003.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: ESCUELA TECNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ESCUELA TECNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: El control de las enfermedades causadas por bacterias requiere la aplicación de métodos eficaces de detección y diagnóstico de los agentes patógenos. Asímismo, el estudio de la diversidad genética de las poblaciones bacterianas es esencial para conocer su variabilidad y evolución en campo. En esta tesis se han aplicado diversas técnicas moleculares para la identificación y evaluación de la variabilidad genética de las poblaciones de dos especies de patógenos bacterianos: Erwinia Amylovora y Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. El primer objetivo de esta TEsis consistió en evaluar una serie de métodos de caracterización molecular para el estudio de las vías de dispersión de E. amylovora en España y para el desarrollo de marcadores moleculares que permitan la identificación de cepas. Diversas combinaciones de cebadores ISTR permitieron detectar variaciones genéticas dentro de un grupo de aislados españoles de E. amylovora. El análisis de 22 cepas de E. amylovora de diversos huéspedes y orígenes mediante la técnica de AFLP, permitió detectar cinco veces más bandas polimórficas que las producidas mediante amplificación por PCR con cuatro cebadores de secuencia arbitraria. La técnica de AFLP demostró ser la herramienta más sensible descrita hasta ahora para discriminar entre aislados de este patógeno. Asímismo,se estudiaron las bases moleculares del polimorfismo producido por siete cebadores de secuencia arbitraria, así como la capacidad de esta técnica de tipado para generar marcadores moleculares específicos de cepas de E. amylora. El análisis de 93 aislados de E. amylovora con estos cebadores reveló un número limitado de bandas polimórficas, en sólo once de los aislados. Un tercio de las bandas examinadas eran de origen plasmídico, lo que limita el valor filogenético de este tipo de análisis. Sin embargo, se obtuvieron marcadores moleculares específicos que podrían usarse para el tipado de cepas. El segundo objetivo de esta tesis fue la identificación y caracterización de las principales pseudomonas fluorescentes responsables de bacteriosis de judía (phaseolus vulgaris L) en Castilla y León. Se seleccionaron 152 aislados de judías enfermas obtenidos a partir de prospecciones realizadas en campos comerciales de cultivo de judía desde 1993 hasta 2001. Se identificaron 14 aislados como P. syringae pv. syringae y 138 como P. syringae pv. phaseolicola. La caracterización fenotípica y molecular de las cepas de P. syringae pv. phaseolicola mostró que la mayoría de ellas no producían faseolotoxina ni albergaban los genes necesarios para su expresión, lo que puso en evidencia que los actuales métodos moleculares de detección basados en la presencia de los genes de la biosíntesis de la faseolotoxina tienen un valor limitado en España. Una caracterización molecular más exhaustiva demostró que los aislados que carecen de los genes de biosíntesis de faseolotoxina mostraban diferencias genómicas relevantes con respecto a los aislados productores de faseolotoxina. Estas diferencias incluyeron distintos perfiles de PCR usando dos cebadores de secuencia arbitraria y distinto patrón de inserciones genómicas de IS801. Asímismo, las secuencias intergénicas (ITS) de los cinco operones ribosomales fueron idénticas en los aislados Tox+ pero no en los aislados Tox-, como se puso de manifiesto mediante una técnica de migración de heteroduplex en geles de agarosa. Por último, los aislados tox- carecen de un plásmido de alto peso molecular presente en los aislados Tox+. Este plásmido porta una isla de patogenicidad que incluye genes esenciales para la producción de enfermedad en judía y soja. Aunque estos genes están presentes en los aislados Tox-, la organización de la isla de patogenicidad no está conservada. Estos resultados permiten proponer la separación del patovar phaseolicola en al menos dos líneas genéticas y plantea nuevas cuestiones sobre la evolución de los distintos linajes que consituyen P. syringae pv. pahseolicola.

Autor: LLEDO FEIJOO ELISA.
Año: 2003.
Universidad: CARDENAL HERRERA CEU.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y DE LA SALU.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y DE LA SALUD.

Resumen: La leucemia mieloide crónica (LMC) es una enfermedad hematológica que resulta de la proliferación desregulada de una célula troncal hematopoyética pluripotencial. A nivel molecular, la LMC se caracteriza por la expresión de una proteína quimérica, BCR-ABL, que presenta una actividad tirosina kinasa aumentada y desregulada. La expresión de esta oncoproteína resulta en una elevada proliferación celular y en una inhibición de la muerte celular por apoptosis. La forma BCR-ABLp210 es suficiente y necesaria para transformar células hematopoyéticas y juega un papel muy importante en la inducción de la LMC. Para la realización de este trabajo hemos empleado líneas celulares que expresan BCR-ABLp210, tanto de origen murino (BaF/3-p210) como humano (Mo7e-p210). El estudio de la actividad de BCR-ABL, y su efecto sobre la proliferación celular, lo hemos llevado a cabo mediante la inhibición específica de la actividad tirosina kinasa de esta oncoproteína con el fármaco STI571. El tratamiento de las células BCR-ABL positivas con este inhibidor resulta en una parada del ciclo celular, mientras que en ausencia de éste las células proliferan de una manera normal y su crecimiento es independiente del aporte de factores externos, como la Interleukina-3. El tratamiento de estas células con distintos inhibidores de las principales rutas de transducción de señales activadas por BCR-ABL, indica que su efecto sobre la proliferación celular está mediado principalmente por la vía de PI3K/Akt. La inhibición de BCR-ABL también está asociada a una acumulación de la proteína inhibidora del ciclo celular p27Kip1, así como a una disminución en la actividad kinasa de los complejos Ciclina E/Cdk2. Todas estas proteínas juegan un papel importante en la regulación del ciclo celular en la transición G1/S, y a través de ellas BCR-ABL controla la progresión del ciclo celular en este punto. Nuestro estudio se ha centrado en la regulación de los niveles de expresión de p27Kip1 en las células BCR-ABL positivas. Mediante la técnica de Western-blot, demostramos que el control negativo que ejerce BCR-ABL sobre la expresión de esta proteína es llevado a cabo principalmente mediante la vía de PI3K/Akt, y esta vía es la empleada en el control transcripcional sobre p27Kip1, como demuestran nuestros experimentos del análisis de los niveles de mRNA por qRT-PCR. Además, BCR-ABL está disminuyendo la vida media de p27Kip1 aumentando su degradación en el proteasoma, según demuestran los ensayos de pulso y caza que hemos llevado a cabo en las células BaF/3-p210. Puesto que la degradación de p27Kip1 depende del proceso de ubicuitilación mediado por Skp2, perteneciente a los complejos SCFSkp2, analizamos la expresión de Skp2 en las líneas celulares BCR-ABL positivas mediante Western-blot y comprobamos que la oncoproteína regula positivamente la expresión de Skp2 a través de la vía de PI3K/Akt. Mediante análisis por qRT-PCR de los niveles de mRNA de Skp2, demostramos que esta regulación es, al menos, a nivel transcripcional y también a través de la ruta de PI3K/Akt. De esta forma, el control positivo que lleva a cabo BCR-ABL sobre los niveles de expresión de Skp2 resulta en un aumento de los complejos SCFSkp2, promoviendo de esta manera la ubicuitilación y, por tanto, la degradación de p27Kip1. Finalmente, la expresión de un mutante de p27Kip1, en el que el residuo Thr187 ha sido sustituido por una Val y no puede ser reconocido por Skp2, resulta en un bloqueo de la proliferación de las células BaF/3-p210, indicando que la degradación de p27Kip1 es un proceso fundamental y necesario para la proliferación celular inducida por BCR-ABL. En conclusión, estos resultados sugieren que BCR-ABL regula el ciclo celular en las células de LMC al menos en parte mediante la inducción de la degradación de la proteína inhibidora del ciclo celular p27Kip1 en el proteasoma, lo que apoya el uso de inhibidores del proteasoma en pacientes con LMC.

Autor: NIETO CERON SUSANA.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: Las colinesterasas, acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BuChE) son enzimas que hidrolizan los ésteres de colina a mayor velocidad que otros ésteres. Además de participar en la transmisión nerviosa hidrolizando el neurotransmisor acetilcolina, desempeñan funciones relacionadas con la morfogénesis, la proliferación celular, la diferenciación, y el funcionamiento del sistema inmune, entre otras. La distrofia muscular congénita por deficiencia de merosina (subunidad a2 de laminina) es una miopatía hereditaria caracterizada por debilidad y desgaste progresivo del músculo, debido al debilitamiento de la asociación entre el citoesqueleto y la lámina basal, y se ha comprobado que las colinesterasas de músculo y otros tejidos se encuentran afectadas por esta patología. En este trabajo se ha analizado si las colinesterasas de dos órganos linfoides, bazo y timo, se ven afectadas por la deficiencia de merosina. En esta memoria se ha demostrado que: 1. El bazo de ratón tiene una actividad AChE moderada (0.65U/mg), mayor que músculo esquelético y corazón, pero menor que el cerebro. La actividad BuChE del bazo es muy baja. La falta de merosina hace que la actividad específica de AChE del bazo aumente el doble, reduciendo la disponibilidad de acetilcolina y la activación de los receptores colinérgicos. Puesto que, según varios autores, la proliferación de los esplenocitos depende de la estimulación de los receptores, los cambios en la actividad AChE afectarán a la proliferación de los esplenocitos, sin olvidar la importancia de la acetilcolina para la maduración de los propios esplenocitos y de las células del estroma del bazo. 2. Los análisis de sedimentación en gradientes de sacarosa, la conversión de los dímeros en monómeros, la cromatografía hidrofóbica en fenil-agarosa, la digestión con fosfolipasa C específica para el fosfatidilinositol (PIPLC), y las electroforesis practicadas con varios detergentes revelan que la actividad AChE del bazo se distribuye entre moléculas G1H (43%), G1A (35%), G2A (20%) y G4H (2%). Pese al acusado aumento de la actividad AChE en bazo distrófico, el defecto de merosina no afecta al patrón de formas moleculares del órgano. 3. La conversión de gran parte de los dímeros anfifílicos (G2A) de bazo en hidrofílicos (G2H), por incubación con PIPLC, demuestra que esas moléculas, al menos, están compuestas por subunidades con restos de glicosilfosfatidilinositol (GPI) y, por tanto, codificadas por transcritos H. La distrofia no afecta a la incorporación del GPI, pero sí al procesamiento de los oligoglicanos unidos a la AChE. 4. En preparaciones de bazo, el anticuerpo C-46 reconoce monómeros de AChE, desprovistos de oligoglicanos y con fuerte carácter anfifílico. Los monómeros marcados por C-46 son más abundantes en bazo normal que en el distrófico. Como al parecer carecen de actividad catalítica, podrían representar un depósito de moléculas inactivas, susceptibles de ser activadas en situaciones de estrés fisiológico, como por ejemplo en la distrofia. La propuesta anterior podría explicar el menor contenido de los monómeros detectados con C-46 en bazo distrófico. 5. Con el anticuerpo C-16 se detectan proteínas de 72 y 75kDa, dos subunidades que seguramente difieren en el número de oligoglicanos unidos. La intensidad de teñido es mayor en la preparaciones S1 que S2, sin que se aprecien diferencias entre las muestras homólogas de bazo normal y distrófico. 6. El timo normal tiene una AChE específica de 1.42U/mg, mayor que la de bazo y, además, contiene una notable actividad BuChE, rasgo que lo diferencia del bazo. La actividad AChE específica del timo cae a la mitad por la distrofia. 7. La actividad AChE del timo se reparte entre moléculas G2A (67%), G1H (10%), G1A (15%) y G4H (8%) y tal distribución es muy similar en preparaciones de timo normal y distrófico. La actividad BuChE se reparte entre componentes G1A (46%), G2A (38%) y G4H (16%); tampoco cambia el patrón de moléculas de BuChE en timo distrófico. Puesto que el timo normal y distrófico tienen la misma composición molecular de AChE y el patrón de interacción de AChE con lectinas muy parecido, se puede afirmar que la deficiencia de laminina-a2 no afecta a la oligomerización ni al procesamiento de los azúcares de AChE en timo. Lo mismo se puede decir de las moléculas de BuChE. 8. En extractos de timo se identifican con el anticuerpo C-46 monómeros de 62kDa, y el anticuerpo C-16 reconoce proteínas de 72 y 75kDa. El antisuero anti-mrAChE marca proteínas de 67, 70 y 73kDa, más intensas en muestras de timo distrófico que en las del control, para la misma cantidad de proteína. La presencia en timo de las moléculas de 62kDa, sugiere que el timo posee moléculas inactivas de AChE. 9. Sólo parte de las formas G2A de bazo pierden el resto GPI por incubación con PIPLC. Las diferencias en el resto de GPI, así como el reconocimiento por lectinas y anticuerpos de la AChE de linfocito, bazo y timo sugieren que la actividad AChE medida en bazo y timo procede de los propios órganos y no de los linfocitos sanguíneos. 10. En bazo, timo, médula ósea, músculo esquelético y médula espinal se expresan los tres transcritos principales de AChE: H, R y T. Los niveles de los tres mensajeros son elevados en médula ósea y timo. En médula de ratones distróficos, la cantidad de transcrito R cae un 40%, lo que se contrapone con las observaciones de otros autores, que afirman que el estrés estimula la síntesis del mensajero R en células de médula ósea. 11. En músculo y médula espinal predomina claramente el transcrito T, cuyo contenido no se modifica por la distrofia. Los cambios observados en la actividad AChE del músculo distrófico, en su composición de formas moleculares y en la glicosilación deben obedecer a anomalías en el procesamiento postraduccional. 12. La cantidad de los tres transcritos en bazo se reduce a la mitad por la distrofia, lo que contrasta con el aumento de actividad AChE. Puede que la traducción sea más eficiente en bazo distrófico o que la patología impulse la activación de moléculas de AChE catalíticamente inactivas. 13. Aunque la actividad AChE cae en timo distrófico, la expresión de los mensajeros H sólo disminuye ligeramente, y la de los R y T no cambia. Los datos apoyan la hipótesis de que la mayor o menor actividad AChE en los tejidos normales y patológicos depende principalmente de mecanismos postraduccionales, más que de la expresión del gen. 14. En bazo y timo hemos detectado moléculas de AChE de 62kDa, que probablemente son inactivas dado que no están glicosiladas. Este hallazgo abre el camino a la identificación de formas inactivas de AChE en órganos de otros vertebrados, incluido el hombre, y en células normales y tumorales. Además supone el principio de una nueva línea de investigación cuyos objetivos serán conocer la estructura cuaternaria de las moléculas inactivas, el porqué de su incapacidad para la catálisis, su origen, destino y sus posibles acciones fisiológicas.

Autor: SEGARRA MORAGUES JOSÉ GABRIEL.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE HUESCA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se ha realizado un estudio comparativo de la diversidad y divergencia genética existente en los táxones del género endémico de los Pirineos, Borderea Miégeville, mediante el empleo de marcadores moleculares de isoenzimas, RAPD y microsatélites. Este estudio ha demostrado que los niveles de divergencia genética estimados a partir del análisis de tres tipos distintos de marcadores moleculares, permiten reconocer con rango específico a los dos táxones actuales de Borderea rechazando consideraciones previas que trataban a B. Chouardii como una subespecie de B. Pyrenaica. Los valores de divergencia genética entre ambas especies apoyan un origen Terciario para este género y su diversificación en el Prepirineo. Los elevados valores de diferenciación genética entre las dos especies de Borderea están correlacionados con su diferenciación morfológica. El empleo de marcadores codominantes (isoenzimas y microsatélites) ha permitido identificar a Borderea como un táxon tetraploide. Nuestros estudios indican además que el número cromosómico básico de Borderea es x=6, el más bajo entre los detectados en las Dioscoreáceas. El análisis comparativo de los patrones de distribución de frecuencias genotípicas observadas y esperadas de distintos loci microsatélite bajo las distintas asunciones de autopoliploidía (herencia polisómica) o alopoliploidía (herencia duplicado-disómica) ha permitido demostrar la naturaleza alopoliploide del género Borderea. Los resultados de la prueba bayesiana basada en modelos probabilísticos máximo verosímiles para ambas hipótesis confiere un mayor apoyo a la hipótesis de la alopoliploidía sobre la de la autopoliploidía para ambas especies. Los tres tipos de marcadores moleculares empleados detectan niveles de diversidad genética inferiores en la especie críticamente amenazada Borderea chouardii frente a su congénere Borderea pyrenaica, y han constatado la existencia de dos núcleos genéticamente distintos los cuales se corresponden con la separación espacial existente entre los mismos. Los métodos de análisis de agrupación y clasificación de nuestras han permitido identificar la procedencia, respecto a la población natural de Borderea chouardii, de 5 lotes de semillas contenidas en el banco de germoplasma de esta especie. Tanto los marcadores RAPD como los microsatélites detectaron valores similares de diversidad genética y heterozigosidad entre las distintas poblaciones de Borderea pyrenaica indicando una reciente diversificación de las mismas. Los marcadores más polimórficos, RAPD y microsatélites, fueron capaces de detectar una expansión postglacial de estas poblaciones a partir de zonas refugio prepirenaicas, siguiendo una ruta de colonización de salto-de-piedra (step-stone) desde los Prepirineos, hacia el Sur de los Pirineos, y alcanzando su límite en el Norte de los Pirineos. De acuerdo con los marcadores microsatélites, la reciente colonización de la vertiente Norte de los Pirineos en Gavarnie siguió dos potenciales rutas paralelas. Los microsatélites han demostrado su utilidad para mejorar el plan de gestión de las poblaciones francesas de Borderea pyrenaica, constituyendo un modelo muy eficiente que permite reducir el coste asociado a la conservación de la totalidad de las poblaciones sin comprometer los niveles de variabilidad genética ni la historia evolutiva de las poblaciones.

Autor: ZARAGOZÁ COLOM ROSA .
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En la glándula mamaria, al final de la lactancia, o al separar las crías de la madre, la acumulación de leche y el descenso en los niveles de hormonas lactogénicas (glucocorticoides, insulina y prolactina) inician una cascada de señalización intracelular que conduce a la muerte de las células epiteliales secretoras por apoptosis y a la regresión de tejido mamario. Estas características tan particulares hacen de este tejido un excelente modelo dónde estudiar la función y regulación de todos aquellos genes implicados en la apoptosis. En la glándula mamaria de rata lactante, el destete produce apoptosis de las células epiteliales, un proceso caracterizado por la liberación de citocromo c mitocondrial al citosol. Esta proteína, a su vez, desencadena la activación de toda una cascada de caspasas, responsables de los cambios observados en la muerte celular programada. Uno de estos cambios, característicos de la apoptosis es la fragmentación del ADN internucleosomal, por activación de una endonucleasa dependiente de caspasas. Si realizamos una electroforesis de ADN a las 8 horas de destete ya se observa un patrón en escalera típico de la fragmentación del mismo. Además de estos cambios característicos del proceso apoptótico, también se observan una serie de cambios a nivel genético: el destete de 2 horas produce una inducción temprana de p53, mientras que otros genes como c-Jun o JNK no aumentan hasta 8 o 24 horas de destete. La expresión y los niveles de proteína de p21cip1 y p27kip1, ambos inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas y por ello favorecen la detención del ciclo celular, está significativamente aumentada tras el destete si comparamos con ratas control en el pico de la lactancia. Todos los cambios anteriormente mencionados también tienen lugar en la glándula mamaria cuando se inhibe la transulfuración hepática tras un tratamiento con PPG durante tres días. Este efecto se ve parcialmente revertido tras la administración de N-acetilcisteína (NAC). El tratamiento de ratas lactantes con butionina sulfoximina (BSO), un inhibidor irreversible de la g-glutamil cisteína sintetasa, produce un descenso en la concentración de GSH y unos cambios en los niveles de proteína y de transcritos de genes similares a los observados tras el tratamiento con PPG. Estos resultados sugieren que el flujo intertisular de GSH es un mecanismo muy importante para abastecer de L-cisteína a la glándula mamaria y resaltan la importancia de este proceso fisiológico para mantener la expresión de los genes necesaria para el mantenimiento de la lactancia. Otra de las moléculas implicada en el proceso apoptótico en la involución de la glándula mamaria de rata lactante es el óxido nítrico (NO). A altas concentraciones el NO puede formar derivados más reactivos (especies reactivas del nitrógeno, RNS) que pueden inducir la apoptosis por distintos mecanismos: producen alteración a nivel mitocondrial favoreciendo la salida de citocromo c al citosol, activación de la vía de las MAP quinasas, daño al ADN y acumulación de p53 que detiene el ciclo celular vía activación de p21 y favorece la apoptosis por activación de bax, una proteína proapoptótica, etc. En la glándula mamaria de rata lactante se expresan las tres isoformas de la enzima encargada de la síntesis de NO (NOS). No obstante, la expresión de la isoforma endotelial (eNOS) y de la inducible (iNOS) se encuentran modificadas tras el destete o tras el tratamiento con BSO. De esta forma se observa una disminución en los niveles de eNOS tras un destete de 24 horas o tras el tratamiento con BSO. Contrariamente los niveles de iNOS están aumentados con respecto a los valores control y este incremento es dependiente de las horas de destete. Como consecuencia de esto, la producción de NO en la glándula mamaria está significativamente aumentada durante la involución, siendo aproximadamente el doble a las 8 horas de destete que en una rata control. Este aumento en la producción de NO induce la apoptosis y genera especies derivadas del NO más reactivas, como puede ser el peroxinitrito, capaces de modificar postraduccionalmente a las proteínas alterando su función. Hemos podido comprobar que los niveles más elevados de iNOS se correlacionan con un incremento en la producción de nitritos y con una mayor nitración de residuos de tirosina en las proteínas. Por todo ello podemos concluir que, efectivamente, el NO juega un papel importante en la inducción de la apoptosis en la glándula mamaria de rata lactante durante el destete o tras el tratamiento con BSO. Por último, y puesto que los cambios observados en la glándula mamaria eran similares tras el destete o al inhibir la disponibilidad de GSH bien con PPG, bien con BSO, quisimos realizar un estudio comparativo de los patrones de expresión génica en células secretoras aisladas del tejido mamario de ratas lactantes control, sometidas a un destete de 8 horas o tras el tratamiento con PPG. La técnica de los Microarray chip permite comparar la expresión de unos 9000 genes diferentes; tan sólo encontramos diferencias estadísticamente significativas en un 1-2% y empleando un sistema informático que nos permitió agrupar los genes que se expresaban diferencialmente según su función biológica pudimos establecer claramente dos patrones que se reproducían tanto en el destete como tras el tratamiento con PPG. El primero de ellos incluía una serie de genes implicados en la apoptosis celular; encontramos incrementados genes como la caspasa-6, una efectora de la apoptosis, una metaloproteinasa encargada de degradar la membrana basal y la matriz extracelular, JunD o el antígeno CD14 que facilita la fagocitosis de la célula apoptótica. Otro de los patrones en el que centramos nuestro estudio inclía enzimas implicados en el metabolismo de la glucosa y de los lípidos. Durante la lactancia la glándula mamaria es uno de los tejidos más activos en la captación de nutrientes con el fin de obtener los substratos necesarios para la síntesis de leche; prácticamente el 50% de la glucosa captada será transformada en lípidos mediante la lipogénesis de novo, por lo que este proceso se encuentra muy activado. Sin embargo, en la involución de la glándula mamaria se inhibe está síntesis de lípidos, por lo que no es de extrañar que encontremos disminuidos los genes que codifican enzimas de esta vía: piruvato deshidrogenasa, piruvato carboxilasa, acetil-CoA carboxilasa, ácido graso sintasa, etc. Podemos concluir pues que la disminución de GSH en la glándula mamaria mimetiza los cambios encontrados durante el destete a nivel de la expresión génica.

Autor: REVERT ROS FRANCISCO JOSE.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FARMACIA.

Resumen: La enfermedad de Goodpasture es un proceso autoinmunitario exclusivamente humano que se caracteriza por la deposición de autoanticuerpos sobre las membranas basales glomerular y renal. Los autoanticuerpos van dirigidos exclusivamente contra el globular C terminal de la cadena a3 del colágeno de tipo IV, que es el componente principal de las membranas basales. Este dominio contiene una región altamente divergente si se compara con las demás cadenas a del colágeno IV humano o con cadenas a3 de otras especies, lo que indicaba que podía tener un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad. Utilizando un péptido que representaba esta región y un anticuerpo monoclonal desarollado contra este se clonó mediante una librería de expresión la proteína GPBP (Goodpasture antigen- binding protein), una Ser/Thr quinasa atípica que es capaz de unir y fosforilar el antígeno de Goodpasture, y que además cataliza su isomerización conformacional y su agregación supramolecular. Usando la proteína GPBP como cebo se realizó una búsqueda de mensajes interactivos con el sistema dos-híbridos en levadura, y se clonó GIP90 (GPBP- interacting protein 90 kDa), cuyos rasgos principales eran una región con alta probabilidad de formación de superhélices que incuía dos cremalleras de leucina, y dos señales bipartitas de localización nuclear. GIP90 presentaba homología con dos polipéptidos anteriormente descritos con expresión disminuida en cáncer de ovario (downregulated in ovarian cancer-1 o DOC-1). La expresión de GIP90 era especialmente elevada en músculo estriado según se evidenció con estudios con membranas Northern prefabricadas, mientras que DOC-1 tenía una expresión más amplia GIP90 recombinante interacciona in vitro con GPBP, y es fosforilaba por esta última. También pudimos comprobar interacción ex vivo con GPBP en células HEK 293 mediante experimentos de inmunoprecipitación, y colocalización en células NIH 3T3 mediante microscopía de inmunofluorescencia. GIP90 presenta en estas células diversos patrones de distribución , como citosólica difusa, granular perinuclear y granular nuclear. Por otra parte, en sistema dos-híbridos en levadura GIP90 presentaba interacción consigo mismo, así como actividad transactivacional sobre promotores heterólogos. Al hacer estudios comparativos entre GIP90 y DOC-1 comprobamos que la interacción con GPBP por dos-híbridos en levadura era exclusiva de GIP90, y que por el contrario DOC-1 interaccionaba consigo mismo más fuertemente que GIP90. Finalmente, sólo GIP90, y no DOC-1 tenía capacidad de transactivar promotores heterólogos. Obteniendo mutantes de deleción comprobamos que los 240 resíduos N terminales de GIP90, ausentes en los polipéptidos DOC-1, eran necesarios y no suficientes para interaccionar con GPBP, y necesarios y suficientes para tener actividad transactivacional. La comparación de los cDNAs de GIP90 y DOC-1 con el genoma humano nos permitió conocer la estructura exón/intrón del gen que los codificaba (COL4A3BPIP/DOC-1) , así como saber que GIP90 era resultado de la inserción de un nucleótido de adenina (A2720) en la secuencia genómica. Por procedimientos de RT-PCR descubrimos que había formas GIP que carecían de esta inserción y cuyo tamaño predicho era de 130 kDa, por lo que las llamamos GIP130, de los que conocemos cuatro (GIP130a-d). Los GIP y los DOC1 son resultado de un amplio programa de diversificación que incluye uso de sitios alternativos de inicio de transcripción, polimorfismo de DNA genómico, uso alternativo de exones 3' terminales, probablemente acoplado a uso de sitios alternativos de poliadenilación, y edición de mRNA. Por estudios de uno- y dos-híbridos en levadura averiguamos GIP130 interaccionan con GPBP más débilmente que GIP90, aunque la interacción consigo mismo es similar a la de este, y que su actividad transactivacional es menor que la de GIP90. Lo GIP130 expresados en HEK 293 tenían un tamaño aparente superior al teórico (166 kDa), y un procesamiento proteolítico C terminal que producía un polipéptido indistinguile de GIP90. Por RT-PCR upimos que en levadura se expresan los GIP130b y c, y por fraccionamiento celular y microscopía confocal que tienen una localización nuclear. La inmunohistoquímica demostró que los polipéptidos GIP/DOC1 tenían una distribución similar a la de GPBP, y que se encontraban en órganos susceptibles de ataques autoinmunitarios. En casi todos los tejidos estudiados había un proporción variable de distribución nuclear, aunque también la había citosólica. En pieles afectadas por autoinmunidad los GIP tienen localización nuclear, igual que GPBP, mientras que en pieles normales la expresión, mucho más baja, es citosólica difusa. Esto sugirió la hipótesis de que los GIP podían modular, como factores de transcripción, la expresión de GPBP, lo que se demostró en un istema recombiante. Previamente, por cromatografía de afinidad demostramos la unión específica de los GIP130 de 293 al promotor de GPBP. Por otra parte, los GIP parecen estar implicados en la muerte celular debida a daño en el DNA en células HeLa, lo que estudiamos mediante silenciadores específicos.

Autor: RUIZ DE ALMODOVAR EGEA CARMEN.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGIA Y BIOMEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGIA Y BIOMEDICINA (CSIC), GRANADA.

Resumen: En esta tesis doctoral se han estudiado distintos aspectos de la biología de TRAIL utilizando como modelo tumoral células de cáncer de mama. Por un lado se ha caracterizado la expresión de los receptores de TRAIL y su regulación mediada por p53. TRAIL es un ligando que pertenece a la familia de ligandos de TNF-a y se une a cuatro receptores de membrana específicos denominados TRAIL-R1, -R2, -R3 y -R4, los cuales a su vez, pertenecen a la familia de receptores de TNF-a. En células de cáncer de mama se expresan tanto el ligando de TRAIL como los cuatro receptores de membrana. Tras el tratamiento de estas células con doxorrubicina, un agente genotóxico utilizado corrientemente en terapia contra el cáncer, se produce una acumulación de la proteína supresora de tumores p53 en el interior de las células. Utilizando distintas líneas celulares de cáncer de mama con diferentes estados de p53 (salvaje o mutante), y además, utlizando una de estas líneas celulares (MCF-7) establemente transfectada con la proteína E6 del virus del papiloma humano (que impide la acumulación de p53 en el interior de la célula) o establemente transfectada con una proteína p53 termosensible (la cual adquiere una conformación activa a 32ºC e inactiva a 37ºC) hemos demostrado que la expresión de los receptores TRAIL-R1, -R2 y -R3 es regulada por p53 tras la acumulación de ésta debido a un estrés genotóxico como es el tratamiento con doxorrubicina (Ruiz de Almodovar, C. et al. J Biol Chem, 2004). Además, hemos identificado, aislado y caracterizado el promotor del gen del receptor de TRAIL-R3. Este promotor contiene una secuencia típica de caja TATA. Mediante experimentos de protección por nucleasa S1 y Extensión de oligos (Primer Extension) hemos determinado el sitio de inicio de transcripción de este gen el cual se localiza a 25 nucleótidos corriente debajo de la caja TATA. A pesar de haber encontrado que el gen de TRAIL-R3 era regulado en células de cáncer de mama por p53, mediante transfecciones transitorias de distintos fragmentos del promotor clonados en un vector reportero de luciferasa pudimos demostrar que en la secuencia promotor aislada no existe ningún sitio de unión para el factor de transcripción p53 (Ruiz de Almodovar, C. et al. FEBS Lett, 2002). Posteriormente, tras un análisis de la secuencia completa del gen de TRAIL-R3 y distintos experimentos de transfecciones transitorias y de retardo de movilidad en geles (EMSAs), hemos podido demostrar que el sitio de unión a p53 responsable de la regulación mediada por p53 se localiza en el primer intrón del gen (Ruiz de Almodovar, C. et al. J Biol Chem, 2004). Otro aspecto estudiado durante esta tesis doctoral ha sido el papel de la proteína antiapoptótica Bcl-2 en la apoptosis inducida por TRAIL en el modelo tumoral de mama. Utilizando distintos clones de una línea celular de cáncer de mama (MCF-7) transfectada establemente con la proteína Bcl-2 de tal manera que sobre-expresan distintos niveles de esta proteína antiapoptótica, hemos demostrado que Bcl-2 es capaz de inhibir la muerte mediada por TRAIL sólo cuando los niveles de sobre-expresión son elevados. Sin embargo, niveles menos elevados de Bcl-2 son suficientes para inhibir la apoptosis inducida por agentes quimioterapéuticos como la doxorrubicina (Ruiz de Almodovar, C. et al. Oncogene, 2001). Finalmente, en esta tesis doctoral también hemos analizado los efectos del IFN-g sobre la apoptosis inducida por TRAIL. El IFN-g sensibiliza a células tumorales a la muerte mediada por TRAIL mediante un mecanismo que implica la inducción de la expresión de caspasa-8. En esta tesis doctoral se ha profundizado más en este mecanismo. Analizando el complejo inductor de señales (DISC) que se forma tras la unión de TRAIL a sus receptores proapoptóticos, hemos demostrado que en células pretratadas con IFN-g, existen mayores niveles de procaspasa-8 en el DISC y ésta es activada más rápidamente en dicho complejo. Por otro lado, también hemos analizado la regulación del ligando TRAIL por IFN-g y, en este trabajo de tesis, se muestra que la expresión de TRAIL es regulada por IFN-g mediante un mecanismo que necesita síntesis de novo de proteínas. Analizando el promotor de este ligando mediante experimentos de transfección transitoria con distintos fragmentos del mismo clonados en el vector reportero de luciferasa, parece ser que el sitio responsable de esta regulación es un sitio ISRE localizado a -126 pb del sitio de inicio de transcripción del gen.

Autor: CARRILLO REDONDO ANA.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DE LA ARRIXACA.

Resumen: La alteración funcional de la célula endotelial es un fenómeno importante que ocurre de forma precoz en multitud de procesos patológicos como es el daño por isquemia y reperfusión, teniendo un papel crucial en condiciones inflamatorias descontroladas como son la sepsis o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Los mediadores inflamatorios que se liberan tras un estímulo, inician una serie de vías de señalización al núcleo en la célula endotelial, mediados por NF-kB y otros factores de transcripción que alteran el programa de expresión génica de la célula. El resultado final es una desregulación de la función endotelial, dando lugar a un incremento de la adhesión y permeabilidad vascular, trombosis, etc, provocando alteraciones fisiopatológicas que pueden culminar en disfunción multiorgánica y a menudo la muerte. El Factor de Necrosis Tumoral-alpha (TNF-alpha) es uno de los mediadores más importantes de los procesos inflamatorios, y se han identificado un gran número de genes sensibles a esta citoquina. La expresión de genes dependientes de TNF-alpha está mediada principalmente por el factor de transcripción NF-kB. Bajo condiciones basales, NF-kB se encuentra secuestrado en el citoplasma de la célula, unido a su inhibidor IkB de forma inactiva. Tras la señalización iniciada por TNF-alpha, IkB es modificado (fosforilado y poliubiquitinizado) lo que conduce a la liberación de NF-kB que se dirige al núcleo donde activa la transcripción de aquellos genes que contengan secuencias de unión a NF-kB en sus promotores. Recientemente, se ha demostrado que la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) está involucrada en la alteración funcional de la célula endotelial observada en varias condiciones fisiopatológicas como son la reperfusión, el shock endotóxico, la diabetes o el envejecimiento. PARP-1 es una enzima nuclear (EC 2.4.2.30) altamente conservada, con un dominio de unión al DNA que reconoce específicamente roturas en el DNA generados por diferentes agentes genotóxicos, y utilizando NAD+ como sustrato, sintetiza y transfiere polímeros de ADP-ribosa a residuos de ácido glutámico presentes en proteínas aceptoras, incluyendo a ella misma (en su dominio de automodificación), y otras proteínas nucleares. Además se ha sugerido que otras señales diferentes del daño en el DNA, como hormonas esteroides, estrés e infección, también podrían activar PARP-1. A pesar del reciente interés en las propiedades bioquímicas y de señalización de PARP-1, su función fisiopatológica todavía está bajo intenso debate. Una herramienta muy útil para poder estudiar mejor el papel de PARP-1, ha sido el desarrollo de ratones que no expresan la proteína (PARP-1-/-). Aunque estos ratones son viables, acumulan anormalidades cromosómicas en respuesta a agentes genotóxicos y son deficientes en la reparación del daño en el DNA. Además los ratones PARP-1-/- están protegidos frente a diversos desórdenes, con un claro componente inflamatorio. La alteración funcional de la célula endotelial mediada por PARP-1 podría ser atribuida a una sobreactivación de la proteína, con el consiguiente consumo de NAD+ y la depleción de ATP. Sin embargo, una vía alternativa por la que PARP-1 puede influir en la función endotelial, es a través de la regulación de la transcripción génica de la célula. En este sentido, se ha demostrado que PARP-1 es necesario para la inducción de genes dependientes de NF-kB, algunos autores han sugerido que PARP-1 es un coactivador esencial para la expresión de genes kB-dependientes. Recientemente, también se ha observado que PARP-1 se requiere para la activación de otros factores de transcripción relacionados con los procesos inflamatorios, como AP-1, SP-1, Oct-1, YY-1 y STAT-1. Por tanto, diferentes evidencias implican a PARP-1 en la regulación de la actividad transcripcional de genes eucarióticos En este trabajo, se han obtenido y caracterizado cultivos primarios de células endoteliales PARP-1+/+ y PARP-1-/-. Con estas células endoteliales primarias, se han analizado los perfiles de expresión génica, utilizando microarrays de alta densidad. En condiciones basales, se han identificado sólo algunas diferencias en los dos tipos celulares, destacando que casi la mitad de los genes diferencialmente expresados están relacionados con la respuesta inmune, y actuando PARP-1 en líneas generales como un represor de la transcripción génica en las células endoteliales. En respuesta precoz a TNF-alpha, se ha identificado un grupo de genes que están modulados por PARP-1, mientras que la expresión de otros es PARP-1 independiente. Muchos de los genes regulados por PARP-1 están relacionados con la respuesta inflamatoria, poniendo de manifiesto la importancia de PARP-1 en la regulación de los procesos inflamtorios. Además, la actividad transcripcional dependiente del factor de transcripción NF-kB está parcialmente inhibida en células PARP-1-/- respecto a las células PARP-1+/+. Sin embargo, PARP-1 tiene un efecto dual sobre la transcripción de genes NF-kB dependientes en la célula endotelial, actuando tanto como un coactivador o como un represor de la expresión de genes bajo el control del factor de transcripción. Nuevos estudios sobre cada uno de los distintos genes regulados por PARP-1 son necesarios para intentar clarificar los mecanismos intrínsecos por los que PARP-1 puede controlar la transcripción de los mismos. Por último se ha desarrollado una línea inmortal derivada de células endoteliales primarias PARP-1-/-, denominada HYKO6, así como transfectantes estables derivados de ella que expresan la proteína PARP-1 humana, representando herramientas muy útiles para futuros estudios de la función de PARP-1 en la célula endotelial.

Autor: MORAN GARCÍA JOSE M..
Año: 2003.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Autor: BESUMBES CALVO OSCAR.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La ruta biosintética del Taxol (o Taxol®) ha sido objeto de estudio durante los últimos años debido a la gran importancia del citado compuesto por su potente actividad antitumoral y por la dificultad de su suministro a partir de las fuentes naturales. Así recientemente se han clonado diversos enzimas pertenecientes a la vía de síntesis de Taxol a partir de diferentes especies de Taxus, en una carrera científica para la total comprensión de esta ruta. El primer enzima específico de la ruta de síntesis de Taxol es la TXS, presente en diferentes especies de Taxus y en algunos hongos simbiontes. En este trabajo se ha llevado a cabo la clonación de un cDNA codificante para la TXS de Taxus baccata a partir de células en cultivo. Ensayos de actividad "in vitro" realizados con una versión recombinante TXS-His purificada a partir de células de E.coli, han demostrado que este enzima es activo en transformar GGPP en taxadieno pese a la deleción del posible péptido de tránsito a plastos del extremo amino terminal y a presentar un epítopo RGS-6His en el extremo carboxiterminal. Plantas transgénicas 35S:TXS de Arabidopsis portadoras de una construcción para la producción constitutiva de la proteína recombinante TXS-His procesan la proteína y la localizan correctamente ne plastos. Dichas plantas son capaces de acumular taxadieno, el primer intermediario específico de la ruta de síntesis de Taxol. La expresión de TXS-His y la consecuente acumulación de taxadieno afectan varios aspectos del desarrollo de las plantas relacionadas con la prudcción de isoprenoides, tales como la germinación, elongación, floración y acumulación de pigmentos fotosintéticos (clorifilas y carotenoides). El análisis de plantas transgénicas dobles que además de TXS-His sobreexpresan constitutivamente enzimas limitantes de la síntesis de precursores isoprenoides plastídicos muestra que los niveles de GGPP plastídico son limitantes para la producción de taxadieno en Arabidopsis.El efecto activador de la activación de mevalonato (MVA) para la producción de taxadieno en plantas 35S:TXS sugiere que precursores citoplasmáticos del GGPP pueden ser incorporados a los plastos y servir de sustratos a la TXS recombinante. La inducción puntual de la producción de TXS-His en hojas de Arabidopsis transformada con una construcción inducible permite un mayor acúmulo de proteína, un secuestro del GGPP plastídico más eficiente y una mayor acumulación de taxadieno. El análisis del proteoma transgénicas que expresan TXS-His de forma constitutiva o inducible sugiere varios mecanismos de respuesta de Arabidopsis ante la acumulación de taxadieno, incluyendo la activación de la producción de precursores y modulando la actividad de los enzimas de la ruta de síntesis de GGPP plastídico. Por último se ha puesto a punto un método para analizar por electroforesis bidimensional muestras provenientes de cultivo celular de tejo.

Autor: CASANOVA RIGAT ISOLDA.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: LAB. INVESTIG. GASTROINT. (INSTITUT DE RECERCA, H. SAN PAU).

Resumen: Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) son fármacos que actúan inhibiendo la actividad de las dos isoformas del enzima cilooxigenasa (COX-1 y COX-2) y se usan mayoritariamente en clínica para el tratamiento del dolor y la inflamación, pero también se ha descrito su acción como antitumorales. Su principal inconveniente es la aparición de efectos secundarios, principalmente como consecuencia de la inhibición de COX-1. Por este motivo, se han desarrollado nuevos compuestos que inhiben selectivamente COX-2 de manera que mantienen el efecto terapéutico, consecuencia de la inhibición de COX-2, y reducen los efectos secundarios. El mecanismo de acción de estos compuestos como antitumorales es actualmente objeto de mucha controversia y no está claro si actúan a través de la inhibición de COX-2 o bien por un mecanismo indpendiente. En esta tesis doctoral, se ha estudiado el mecanismo de accion antitumoral de diversos compuestos inhibidores selectivos de COX-2, en células de carcinoma de colon humano, determinando que la capacidad inhibidora del COX-2 de los compuestos es independiente de su efecto antitumoral. Por otro lado, se han analizado las vías de transducción de señal implicadas en el efecto antitumoral in vitro e in vivo del Celecoxib, un inhibidor selectivo de COX-2 usado actualmente en clínica. El Celecoxib induce apoptosis por la vía mitocondrial en células de carinoma de colon. Además, altera las proteínas que forman las adhesiones focales induciendo la pérdida de anclaje de las células y, en consecuencia, la muerte de las células por anoikis. El Celecoxib es también efectivo in vivo, en un modelo de xenotrasplante en ratones atímicos. El lugar de implantación tumoral no influye en el efecto antitumoral del fármaco pero sí en su mecanismo de acción. Cuando se implantan los tumores, derivados de un carcinoma de colon humano, en el subcutis del animal, el Celecoxib induce necrosis. En cambio, si los tumores se implantan ortotópicamente, es decir, en el mismo órgano de origen del tumor, el fármaco induce apoptosis. Finalmente, se han desarrollado nuevos compuestos de estructura química relacionada con el Celecoxib que son más efectivos in vitro y que comparten el mismo mecanismo de acción antitumoral.

Autor: RIUS CAPALVO JORDI.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: UNIVERSITAT DE BARCELONA.

Resumen: Dado que las células musculares lisas vasculares (CMLV) juegan un papel clave en el desarrollo de la aterosclerosis, conocer los genes que regulan la proliferación y migración de estas células pude conducir a econtrar nuevas dianas farmacológicas para tratar esta patología. Nosotros descubrimos, que el receptor nuclear huérfano NOR-1/NR4A3 se encuentra expresado en CMLV estimuladas con suero y distintos mitogenos. Entre los componentes del suero cabe destacar como principal inductor de NOR-1 las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y en menor medida las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por otra parte, distintos factores de crecimiento, en especial la trombina, y el PDGF, ambos generados en eventos tromboticos, también inducen la expresión de este gen. Los mecanismos moleculares que regulan este proceso son complejos, participan proteínas G sensibles a toxina pertusis, incrementos en la concentración citosolica de calcio y activación de distintas proteínas quinasas como la PKC, la PKA y MAPKs como la ERK y la p38 MAPK. Esta quinasa pueden directa o indirectamente activar, dependiendo del tipo y contexto celular, al factor de transcripción CREB. Nosotros observamos por primera vez que las LDL son capaces de inducir la activación de CREB y que este mecanismo es dependiente tanto del calcio como de la PLKC. CREB se une al promotor de NOR-1 mediante su interacción con tres cajas CRE; además CREB es esencial en la activación de este promotor, tal como analizamos mediante la contransfección de un dominante negativo de CREB así como eliminando las cajas CRE por mutagénesis dirigida. Para evaluar el papel de NOR-1 en la proliferación celular, usamos oligodeoxinucleótidos (ODN) antisentido para inhibir la expresión de este gen. Analizamos de manera independiente dos ODN, los cuales disminuyen de forma específica a la expresión de NOR-1. En estas conduciones, estos ODN inhiben la síntesis de Dna inducia tanto por suero como por las LDL. Además mediante citometría de flujo observamos que este efecto se refleja en una menor tasa de proliferación celular. Por último en un modelo in vitro de reparación tisular, el bloqueo de la expresión de NOR-1 produce una inhibición en la capacidad de las células para preocupar el área dañada. DE todos estos resultados se pude concluir que NNOR-1 regula la proliferación de las CMLV y que por tanto podría ser una nueva diana terapéutica en las patologías en que este involucra una excesiva proliferación de estas células.

Autor: GARCIA GIRALT NATÀLIA.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: La osteoporosis es la enfermedad metabólica ósea más frecuente en los países desarrollados. En condiciones normales, existe un equilibrio entre los procesos de formación y reabsorción óseas, pero cuando la reabsorción es mayor que la formación se pierde masa ósea, originándose un hueso frágil y poroso con una mayor susceptibilidad a las fracturas, el hueso osteoporótico. La masa ósea es la cantidad de hueso (protéinas y minerales, fundamentalmente calcio) que presenta una persona en un momento determinado y depende de su edad, sexo, y raza. Normalmente se utiliza el valor de la densidad mineral ósea (DMO), que es la masa ósea dividida por el área rastreada (g/cm2). La matriz ósea comprende una matriz orgánica y una fase mineral. La mayor parte de la matriz orgánica está formada por fibras de colágeno tipo I, que dan cuenta del 90% del peso esquelético en el adulto. El colágeno tipo I es una molécula de triple hélice que contiene dos cadenas alfa1 (I) y una cadena alfa2(I). Los genes del colágeno de tipo I son unos buenos candidatos para determinar parte de la variabilidad genética de la osteoporosis. Cambios sutiles en la regulación de la expresión de alguna de las dos cadenas que forman la triple-hélice podrían determinar diferencias de la DMO. La hipótesis que se planteó fue la siguiente: dado un polimorfismo en un elemento en cis de la región reguladora del gen de la cadena alfa1 del colágeno de tipo I (COL1A1), una determinada proteína nuclear reconocería mejor o peor o se unirá con mejor o peor afinidad según el alelo presente y esto se traduciría en una diferencia en los niveles de transcripción del gen. El primer objetivo de este trabajo fue buscar nuevos polimorfismos en el promotor del gen COL1A1 que pudieran estar asociados a la DMO. Se escogió una región del promotor que esta descrita como la región que controla la expresión específica del tejido óseo. Se encontraron dos nuevos SPNs en esta región en las posiciones -1997 y -1663. El polimorfismo -1997 G/T mostraba asociación con la DMO en una muestra de 395 mujeres postmenopáusicas del entorno de Barcelona mientras que el otro polimorfismo, -1663indelT, se encontraba en fuerte desequilibrio de ligamiento con el polimorfismo intrónico descrito por Grant y col. (1996) el cual se había asociado con fractura. La interacción entre los dos polimorfismo del promotor también mostraba una asociación significativa con la DMO. Los ensayos de reatardamiento en gel (EMSA) mostraron que los dos polimorfismos unían específicamente con diferente afinidad en función del alelo presente. En los dos casos, el alelo más frecuente unian con mayor afinidad que el menos frecuente. El oligonucleótido de cadena sencilla reverse que contenia el SNP -1997 G/T unia con mayor afinidad que la cadena doble. El olilgonucleótido de cadena sencilla forward que contenia el SNP -1663indelT era el que unia las proteínas nucleares mientras que la doble cadena y la cadena sencilla complementaria no eran capaces de unir (publicado en JBMR "Two New Single-Nucleotide Polymorphisms in the COL1A1 Upstream Regulatory Region and Their Relationship to Bone Mineral Density" [García-Giralt i col., 2002]). Se hizo un estudio funcional de estos polimorfismos transfectando transitoriamente células de osteosarcoma humano (MG-63) con diferentes construcciones del promotor del gen del colágeno delante de un gen reportero. Estas construcciones consistían en las diferentes combinaciones haplotípicas y alélicas (cuando solo se ensayaba un polimorfismo sin la presencia del otro). También se ensayaron diferentes regiones del promotor para caracterizarlo en la linia MG-63. Los resultados mostraron que las diferencias obtenidas entre los diferentes clones eran producidas principalmente por el polimorfismo -1997 G/T. Las construcciones con el alelo G transcribían mejor que las que llevaban el alelo T independientemente del alelo presente en el polimorfismo -1663indelT. También se vió que el alelo 7T transcribía mas que el alelo 8T del polimorfismo -1663indelT. También se vió que el alelo 7T transcribía mas que el alelo 8T del polimorfismo -1663indelT. Se describió una región inhibidora situada entre la región donde se situan los polimorfismos y el promotor proximal. Se hicieron tratamientos con diferentes hormonas y citoquinas relacionadas con el metabolismo óse en las células transfectadas con las diferentes deleciones del promotor. Los resultados fueron los siguientes: Aumento leve de la transcripción por parte de la Vitamina D en aquellas construcciones que no contenían la región inhibidora y un aumento importante por parte de la dexametasona en todas las construcciones. Las hormonas sexuales no afectaban a la transcripción del gen reportero. Las citoquinas (interleuquina 1 y TNFa) desiminuían a la mitad la expresión a nivel de todas las construcciones y finalmente, la hormona paratiroidea inhibía ligeramente la expresión. El último objetivo propuesto fue identificar a las proteínas nucleares que reconocían y se unían a los oligonucleótidos que conteníen los SNPs. Mediante EMSAs y ensayos de supershift se comprobó que una de las proteínas que se unían a -1663indelT era un factor de transcripción arquitectónico de la familia CIZ/NMPA4. También se vió que los dos polimorfismos del promotor compartían la unión de al menos una proteína nuclear. Se hizo una cromatografía de afinidad de DNA para aislar e identificar a las demás proteínas que se unían tanto a -1663indelT como a -1997 G/T. El resultado que se obtuvo fue la identificación del factor de elongación de la traducción-1 como una proteína que se uniá específicamente a los dos polimorfismos.

Autor: CAÑAVATE SOLANO CONSUELO.
Año: 2003.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (CADIZ).

Autor: DELGADO NIEBLA ELENA.
Año: 2003.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.

Resumen: La somatostatina (SRIF) es un tetradecapéptido (SRIF-14) ampliamente distribuido en el sistema nervioso central y periférico, que actúa principalmente como inhibidor de la secreción de la hormona del crecimiento (GH). No obstante en la especie porcina, este factor puede además estimular la secreción de GH cuando se administra en cultivos de células hipofisarias. SRIF ejerce sus acciones mediante su unión a una familia de receptores acoplados a proteínas G con site dominios transmembrana, que se denomina sst1, sst2A, sst2B, sst3, sst4 y sst5. En el cerdo hasta la fecha sólo se había clonado el sst2A, aunque sus características funcionales no han sido estudiadas. El objetivo del presente trabajo ha sido clonar e identificar los receptores de somatostatina en la especie porcina, estudiar su expresión en diferentes tejidos, así como su distribución en las dos subpobalciones de células somatotropas existentes en la hipótesis porcina. El conjunto de nuestros resultados indica que, pese a la elevada homología existente entre los distintos subtipos de ssts, esta familia presenta un elevado grado de complejidad, de manera que, en cada tipo, e incluso subtipo celular, cada receptor expresado puede ejercer funciones específicas que, a su vez están condicionadas por la presencia en la célula de los otros tipos de receptores y es probablemente el balance que se establece entre todos ellos lo que determina en último término la respuesta celular precisa. En concreto en la especie porcina, las características particulares de algunos de los sst y/o las rutas intracelulares asocaidas, así como el tipo de interacciones que se establecen al menos entre algunos de ellos permiten que, en esta especie, SRIF pueda ejercer un efecto estimulador sobre la secrección de GH.

Autor: SIENDONES CASTILLO EMILIO.
Año: 2003.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, HOSPITAL UNIV. REINA SOFÍA.

Resumen: INTRODUCCIÓN La administración de D-galactosamina (D-galN) es un modelo experimental de toxicidad hepática adecuado debdio a su especificidad y a que reproduce el daño hepático observado en hepatitis, fallo hepático fulminante y fallo hepático subfulminante. D-galactosamina bloquea la síntesis de RNA y proteínas y por tanto altera las funciones hepatocelulares. Prostaglandina E (PGE) ejerce un efecto protector frente a la toxicidad y muerte celular inducida en el hígado por D-galN y otros modelos de toxicidad hepática. Además, está demostrado que el tratamiento de PGE1 tiene efectos beneficiosos sobre el fallo hepático fulminante de origen viral en humanos, reduciendo los niveles de transaminasas y mejorando las condiciones de endefalopatía y tasa de protrombina. OBJETIVOS Esta tesis forma parte de una serie de proyectos de investigación que tienen como objetivo estudiar los efectos hepatoprotectores de PGE1, así como la fisiopatolgoía experimental del fallo hepático fulminante. El presente proyecto de tesis tuvo como objetivos estudiar la inducción de muerte celular por D-galN en cultivo primario en hepatocitos de rata y así como los mecanismos de resistencia que la preadministración de PGE1 genera en los hepatocios frente a dicha muerte celular. MATERIAL Y MÉTODOS Los hepatocitos se aislaron de ratas macho tipo Wistar mediante el método clásico de perfusión con colagenasa. Las células se cultivaron en medio Williams E. PGE1 (1uM) se administró 2 horas antes que D-galN (0,3, 5, 40mM). La necrosis celular se e valuó mediante cuantificación de actividad lactato deshirogenasas al medio de cultivo. La apoptosis mediante determinación del grado de framentación de DNA y activación de caspasas. La producción de óxido nítrico (ON) se determinó por cuantificación de nitrato+nitrito, mediante el reactivo de Griess. Los niveles de mRNA y proteína de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) mediante RT-PCR y western-blot, respectivamente. Los Hepatocitos se transfectaron, usando el reactivo FUGENE (boeringer, alemania), con una construcción promotora conteniendo un fragmento del promotor de iNOS con dos elementos kB o un fragmento constituido por tres elementos kB dispuestas en serie. RESULTADOS La muerte celular por necrosis fue inducida por D-galN mayoritariamente a dosis altas (40 nM) y durante periodos de estimulación largos (24 h), sin embargo dosis bajas (5 mM) de D-galN generaron un mayor grado de apoptosis durante las primeras horas de estimulación (1-2 h). La preadministración de PGE1 únicamente fue capaz de reducir los parámetros asociados con la apoptosis, probablemente debido a la incapacidad de regular los niveles de radicales libres y estrés oxidativo observados durante la necrosis. La apoptosis inducida por D-galN estuvo mediada por el procesamiento y actividad de caspasa-3, sin participación de otras caspasas reguladores como caspasa-1, -8 ó -9 o liberación al citosol de citocromo c mitocondrial, por tanto la apoptosis es inducida a través de una vía no mitocondrial. PGE1 bloqueó el procesamiento y actividad de caspasa-3. Se ha descrito que el ON puede ejercer un efecto tanto protector como nocivo en diferentes modelos de daño hepático. En este modelo experimental, tanto la citotoxicidad por D-galN como la protecicón por PGE1 estuvieron asociadas a un incremento de la síntesis de ON, dada su capacidad de inducir la expresión de mRNA y proteína de iNOS. Sin embargo, la preadministración de PGE1, disminuyó la expresión de iNOS inducida por D-galN y por tanto la síntesis de ON. Además, hepatocitos transfectados incrementaron la expresión de los dos promotores utilizados, tras la estimulación con PGE1 o D-galN. CONCLUSIONES D-galN induce apoptosis y necrosis en cultivo primario de hepatocitos de rata aislados. La preadministración de PGE1 únicamente es capaz de generar resistencia frente a la apoptosis inducida por el hepatotóxico. La apoptosis inducida por D-galN es a través de una ruta independiente de la mitocondria y se asocia a un incremento de la expresión de iNOS y producción de ON. La citoprotección generada por PGE1 está asociada a una reducción de la producción endógena de ON inducida por D-galN a través de la inhibición de la expresión del den de la iNOS. Los niveles bajos de ON producidos por PGE1 son relacionados con la inhibición de la expresión de iNOS mediante un mecanismo negativa por retroalimentación.