BIOQUIMICA MOLECULAR, 20

Autor: GUTIÉRREZ LÓPEZ LUIS GONZAGA.
Año: 2001.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: E.T.S.I. AGRÓNOMOS.

Resumen: El aliso (Alnus acuminata H.B.K.) es una especie forestal que gracias a su rápido crecimiento, a su asociación con fijadores de nitrógeno, y a sus ventajas ecológicas, tiene un enorme potencial entre las leñosas de los países lantinoamericanos. Y de hecho, ya ha sido introducida con mucho éxito en otros continentes. A pesar de sus virtudes como forestal, no está del todo exenta de problemas reproductivos, pues la viabilidad de su semilla decrece rápidamente con el tiempo, y al menos uno de sus ecotipos es de difícil multiplicación por vía vegetativa. Una alternativa para solventar estos problemas sería la reproducción de genotipos seleccionados mediante técnicas de micropropagación. Hasta ahora sólo se ha logrado la regneración de plantas de aliso en cultivo in vitro mediante brotación axilar. El objetivo central de la presente investigación ha sido desarrollar la embriogénesis somática como vía alternativa para la micropropagación de la especie Alnus acuminata y estudiar, mediante moleculares, la probable variación somaclonal que se genere como consecuencia del proceso. De los resultados obtenidos en este estudio se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1,- A partir de explantes de limbo foliar de plantas adultas de Alnus acuminata se ha logrado la inducción de callos embriogénicos utilizando medios de cultivo con las siguientes combinaciones de reguladores: 1 mg/l de NAA + 3 mg/l de 6-BAP y 1 mg/l de 2,4-D + 3 mg/l de 6-BAP. En estos medios no sólo se produce la inducción, sino también el desarrollo inicial de los embriones somáticos. 2,- La maduración y germinación de los embriones somáticos se consiguió en diversos medios de cultivo, aunque los mejores resultados de obtuvieron en los medios MS + 0.5 mg/l de AIA y MS + 0.5 mg/l de GA. 3,- El medio inductor con 2,4-D (DB1030) provocó mayor anormalidad en los embriones, mayor embriogénesis secundaria y una mayor frecuencia de anomalías en la germinación de los embriones somáticos que elmedio inductor con NAA (NB1030). 4,- Con el protocolo de regeneración que se ha desarrollado en Alnus acuminata se ha logrado una tasa de conversión a plántulas del 30%. La aclimatación de las plantas regeneradas se llevó a cabo sin ningún problema. 5,- Empleando marcadores AFLPs, se detectó variación somacional a nivel molecular enlos callos embriogénicos procedentes de tejido foliar de Alnus acuminata. En general la tasa de variación molecular fue mayor cuando los callos embiogénicos se habían desarrollado en medios con 2,4-D

Autor: DÍAZ PEÑATE RAQUEL GLORIA.
Año: 2001.
Universidad: LAS PALMAS DE GRAN CANARIA.
Centro de lectura: CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.

Resumen: La coexpresión de óxido nítrico NO) y prostaglandinas (PGs) permite que estos mediadores celulares regulen de forma cruzada la actividad y expresión de los enzimas implicados en su biosintesis: la NO-sintasa (NOS) y prostaglandina endoperóxido sintasa/ciclooxigenasa (COX) siendo este un mecanismo importante para la homeostasis tisular que además contribuye a exacerbar/atenuar la respuesta inflamatoria. En esta memoria demostramos que las células gramulosa del ovario expresan las isoformas inducibles NOS2 y COX2 en respuesta al tratamiento singular con interleuquina 1beta (IL1beta) y que este efecto se amplifica estimulando simultáneamente con la gonadotrofina hipofisaria FSH o los neuropéptidos estructuralmente relacionados VIP (péptido intestinal vasoactivo) y PACAP (péptido activador de adenilato ciclasa de la pituitaria). Usando diferentes pautas de estimulación y diferentes inhibidores de los dos enzimas inducibles demostramos además que la biosintesis de prostaglandinas no afecta la actividad NOS2 pero que el NO es imprescindible para la actividad catalítica COX2 que depende de efectos estabilizadores sore su mRNA y proteina. El efecto amplificador de la FSH y los neuropéptidos (VIP y PACAP) depende de su capacidad para inducir la biosíntesis de tetrahidrobiopterina (BH4) que actúa como cofactor no enzimático/estructural imprescindible para que la NOS2 mantenga una conformación homodimérica, antiparalela y catalíticamente activa. En esta memoria además de comprobar que el BH4 juega un papel inhibitorio directo sobre la actividad catalítica COX2, demostramos que los efectos estimuladores de la FSH y los neuropéptidos (VIP y PACAP) sobre la transcripción y actividad optima de los enzimas esteroidogénicos (proteína StAR y enzimas P450scc y 3BHSD) depende directamente de los niveles adecuados de biopterinas celulares.

Autor: PRIETO SÁNCHEZ CELIA.
Año: 2001.
Universidad: POLITECNICA DE CATALUÑA.
Centro de lectura: INGENIEROS INDUSTRIALES .
Centro de realización: ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS INDUSTRIALES.

Resumen: La nucleoplasmina (NP) es una proteína fosforilable, acídica y termoestable que se encuentra en el núcleo de los oocitos y huevos de Xenopus laevis, donde es la proteína más abundante. Las dos funciones principales en las que está implicada la NP son: el ensamblaje de nucleosomas y la descondensación de la cromatina espermática. A la hora de iniciar este trabajo se planteó como objetivo principal obtener información estructural de la nucleoplasmina así como de su interacción con proteínas básicas. En un principio se puso a punto la obtención de NP a partir de la disección de ovarios de rana, pero más adelante se planteó la opción de expresar la proteína en E.coli. De esta manera se obtuvieron varios mutantes diseñados estratégicamente para conseguir el máximo de información de la molécula. A partir de diferentes métodos se obtuvo un grado de pureza adecuado de las formas expresadas; salvando el obstáculo que representa la formación de unas proteínas de peso molecular inferior que han sido denominadas formas truncadas y cuya caracterización ha permitido concluir en que se dan durante la expresión de la NP y en que se originan por el extremo carboxilo terminal. Mediante ensayos de ultracentrífuga analítica y de dicroísmo circular se ha comprobado la validez de las diferentes proteínas recombinantes obtenidas en lo que a estructura secundaria y cuaternaria se refiere. A nivel funcional se han determinado diversas cuestiones relacionadas con la unión de la NP a proteínas básicas. Los resultados obtenidos apuntan que el tramo acídico más carboxilo terminal de la proteína no participa en la descondensación de la cromatina espermática; mientras que el tramo poliglutámico principal de la molécula, aunque no es imprescindible, sí que es muy importante a la hora de realizar esta actividad, ya que su eliminación reduce mucho la eficacia con que la NP desplaza las protaminas del DNA espermático. La determinación de la estequiometría de esta unión muestra que tanto la NP entera como las variantes delecionadas tienen la capacidad de unir las mismas moléculas de protamina: 2,5 moles de protamina por pentámero de NP. Estudios realizados con las histonas indican que el comportamiento de la NP con estas proteínas sigue directrices parecidas a las de su unión con protaminas.

Autor: GONZÁLEZ ALONSO BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA (CSIC-UAM).

Resumen: Todas las células estudiadas hasta la fecha, desde el mas sencillo procariota a las células de las especies mas complejas, inducen la síntesis de una serie de proteínas denominadas proteínas de choque térmico o de forma más general, proteínas de estrés en respuesta a un rango amplio de situaciones que comprometen la homeostasia celular. Los datos de esta tesis demuestran como los niveles de expresión constitutiva de proteínas de estrés en el hígado son muy variables en relación con los de músculo esquelético, miocardio y riñón, además los niveles hepáticos de HSOs son dependientes de género, mayores en hembras que en machos, siendo HSP25 y HSP72 las que presentan un dimorfismo sexual más acusado. En respuesta a un golpe agudo de ejercicio se indujo en el hígado un pico de síntesis incrementada de proteínas de estrés, al que sigue una acumulación de proteína durante las primeras horas de post-ejercicio. Las proteínas HSP72 y HSP25 son las que presentaron inducciones mayores. Para ambas, se confirmó un mecanismo de inducción transcripcional, con niveles de mensajeros que se mantuvieron altos solamente durante las 2-3 primeras horas de post-ejercicio. En el post-ejercicio tardío se observaron nuevas ondas de acumulación con máximos a los 8 y 48h post-ejercicio, que no se correspondieron con niveles incrementados de mensajeros. Sin embargo, la realización de un ejercicio crónico solo incrementó los niveles hepáticos de HSP72 y HSP25 en animales entrenados, tres días después de la última sesión de entrenamiento. La inducción transcripcional de HSP72 tras ejercicio agudo se amortiguó en los animales entrenados que expresan niveles incrementados de proteína. Las proteínas HSP72 y HSP73, así como la HSP25, presentan variantes moleculares con diferencias en sus puntos isoeléctricos, que no han podido atribuirse en su totalidad a modificaciones por fosforilación. Las proporciones de las diferentes variantes presentes en hígado se modificaron inmediatamente después de un golpe agudo de ejercicio. Su patrón en animales entrenados que expresan niveles incrementados de proteína también es diferente del de los sedentarios, lo que sugiere que la estabilización de niveles incrementados de estas proteínas implica modificaciones posttraduccionales. Se analizó también el tratamiento con dosis suprafarmacológicas de los esteroides anabólico-androgénicos decanoato nandrolona (ND) y estanozolol (ST) de animales que habían realizado un entrenamiento o que permanecieron sedentarios. La ND incrementó los niveles hepáticos de HSP25 en animales sedentarios y ambos anabolizantes los efectos del entrenamiento en los niveles de expresión de HSP25. Los niveles hepáticos de TBARS (indicadores de daño oxidativo), son menores en hígado que en el resto de tejidos analizados, lo que se correlaciona con actividades mayores de enzimas de defensa antioxidante dependientes de glutatión y niveles mayores de superóxido dismutasa. Aunque inmediatamente después del ejercicio se observan tendencias, el único aumento significativo de los índices de peroxidación lipídica se detectó a ls 48h de post-ejercicio en las TBARS conjugadas, cuyos niveles se redujeron con el entrenamiento. El análisis de correlaciones entre los niveles de expresión de proteínas de estrés (HSP25 y HSP72) y los de TBARS puso de manifiesto que un estrés oxidativo inferior al necesario para generar cambios significativos en las TBARS puede inducir la acumulación de proteínas de estrés en el hígado.

Autor: LILLO RODRÍGUEZ ROSA M..
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE TRANSFUSIÓN DE LA COMUNIDAD DE MADRID.

Resumen: El cáncer de mama es el tumor con mayor incidencia en las mujeres occidentales. Debido a los programas de detección precoz, la mortalidad causada por esta enfermedad se ha visto reducida dráticamente en los últimos años. Sin embargo, en algunos casos el tratamiento de las pacientes con quimioterapia convencional no logra una total erradicación de la enfermedad. Por este motivo se han desarrollado protocolos de tratamiento más agresivos. Estos protocolos incluyen la administración de elevadas dosis de quimioterapia, seguida de transplante autólogo de progenitores de sangre periférica para regenerar el tejido hematopoyético dañado por la quimioterapia. Estos protocolos de tratamiento consiguen un aumento de la respuesta a la quimioterapia, sin embargo, existe un gran número de pacientes que recaen en su enfermedad tras el transplante. Entre las posibles causas de la recaída de estas pacientes está la presencia de células tumorales contaminantes en los productos destinados al transplante. Estas células podrían contribuir a la recaída de estas pacientes tras serles reinfundidas. El trabajo desarrollado en esta tesis se ha basado en el desarrollo de un procedimiento de purga "in vivo", eficaz y seguro, para la eliminación específica de células tumorales de cáncer de mama que contaminan los productos de leucoaféresis de sangre periférica movilizada, utilizados como tratamiento de rescate hematológico, en pacientes con cáncer de mama de alto riesgo y metastático sometidos a altas dosis de quimioterapia. El sistema se basa en la transducción específica en las células tumorales del gen procariota Citosina Desaminasa (CD), mediante la utilización de un vector adenoviral recombinante. Este gen CD, sensibiliza a las células infectadasfa la pro-droga no tóxica, 5-Fluorocitosina (5-FC), transformándola en el agente activo quimioterapéutico 5-Fluorouracilo (5-FU). En una primera serie de experimento, se establecieron las condiciones óptimas para la infección y eliminación del 100% de las células tumorales "in vitro", sin que las células hematopoyéticas CD34+ humanas fueran dañadas. Posteriormente se procedió a evaluar la seguridad y eficiencia del sistema generando un modelo animal quimérico de trasplante humano/ratón, que permitiera "in vivo", evaluar simultáneamente el grado de daño generado a la hematopoyesis humanas, así como el grado de erradicación de las células tumorales de cáncer de mama. Se realizaron mezclas artificiales de células CD34+ de sangre periférica movilizada conteniendo células tumorales. Dichas mezclas fueron infectadas con el vector adenoviral conteniendo el gen terapéutico CD (grupo purgado), o no infectadas (grupo placebo control), y trasplantadas en ratones NOD/SCID subletalmente irradiados. Ambos grupos recibieron 5-FC IP durante 4 días. Los resultados muestran una diferencia estadísticamente significativa para el análisis de la supervivencia entre el grupo de ratones purgado (100%) frente al grupo control (28%); p

Autor: MARTÍN RUÍZ-JARABO CARMEN.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM "SEVERO OCHOA", DPTO. BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: El trabajo se enmarca dentro de los estudios de variabilidad genética de virus RNA. Se ha abordado el estudio de las características antigénicas, capacidad de unión a distintos receptores y alteraciones de tropismo de variantes del virus de la fiebre aftosa (VFA) de serotipo C adaptados a células BHK-21, desvelando mecanismos de coevolución de antigenicidad y tropismo celular del virus. Se ha estudiado el comportamiento antigénico, estabilidad genética e infectividad para ratones lactantes de variantes de VFA con sustituciones de aminoácido en el triplete RGD del bucle G-H de la proteína VP1. El estudio de uno de los variantes antigénicos ha permitido describir por primera vez la existencia de memoria genética en forma de genomas minoritarios del espectro de mutantes en cuasiespecies víricas. Se ha establecido que la memoria de las cuasiespecies puede ser duradera y que depende de la eficacia biológica del virus que se va a quedar en memoria, respecto de la eficacia biológica de revertientes o competidores. La presencia de memoria en cuasiespecies víricas puede permitir el desarrollo de métodos de diagnóstico de secuencias minoritarias para el diseño de pautas de tratamientos de infecciones crónicas que contemplen la estructura poblacional de los virus.

Autor: PERALES VIEJO CELIA BELÉN.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: Para profundizar en la regulación de la traducción de ARNm de env mediada por la proteína Rev del VIH-1 hemos puesto a punto un sistema de expresión en células humanas empleando plásmidos con el promotor de citomegalovirus. La transactivación medida por Rev del ARNm de env indica que la proteína es funcional y que el elementos de respuesta a Rev (RRE) responde o es dependiente de esta proteína. En este sistema hemos obtenido un incremento del transporte núcleo-citoplásmico del ARNm de env acoplado a una transactivación del traducción del ARNm en el citoplasma por lo que podemos concluir que la proteína Rev lleva a cabo un efecto biomodal en el transporte y en la traducción de los ARNm que poseen el RRE. Además, empleando plásmidos que poseen el promotor de T7 podemos deducir que Rev activa la traducción de este ARNm en células humanas independientemente de que el ARNm se sintetice en el núcleo o en el citoplasma. Además hemos analizado la regulación de la traducción que ejerce la proteasa del VIH-1 sobre la traducción del ARNm de gag. En este sentido hemos observado que la proteasa del VIH-1 hidroliza muy eficientemente el factor eIF4GI en extractos de células HeLa así como en células de mamífero. La hidrólisis del factor eIF4GI por la VIH-1 PR inhibe in vivo e in vitro la traducción tanto de ARNm marcadores con el gen de la luciferasa con estructura 5' cap como de ARNm bajo la secuencia líder del VIH-1. Por el contrario, la hidrólesis del factor eIF4GI no afecta a la traducción de un ARNm bajo el control de un elemento IRES e incluso estimula la traducción del ARNm de gag del VIH-1 que posee la secuencia 5' líder. Podemos concluir que la iniciación de la traducción del ARNm de gag se llevaría a cabo por un mecanismo de iniciación interna promovido por un elemento IRES localizado en la ORF de gag.

Autor: PUIG KRÖGER AMAYA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOLÓGICAS.

Resumen: Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno profesionales que generan y condicionan el tipo de respuesta inmune en situaciones inflamatorias o de invasión patogénica y en situaciones de homeostasis. En la presente Tesis se estudia el proceso de maduración de células dendríticas humanas derivadas de monocito in vitro identificándose: 1,- Un aumento en la expresión de integrinas CD49d (alfa4/beta1 y alfa4/beta7) durante la maduración, que permite considerar a CD49d como un nuevo marcador de la maduración de células dendríticas humanas derivadas de monocito in vitro. 2,- Un efecto regulador negativo de la vía señalización de MEK-ERK sobre la maduración fenotípica y funcional, y regulador positivo de p38MAPK en la misma. En consecuencia, las rutas de MEK-ERK y p38MAPK tienen efectos opuestos en la maduración de células dendríticas derivadas de monocito. También se estudió la regulación transcripcional de la integrina leucocitaria CD11a, que se expresa exclusivamente en leucocitos y su nivel de expresión varían según el estado de diferenciación celular. En la región reguladora proximal del gen de CD11a se identificaron dos secuencias solapantes de reconocimiento de los factores de transcripción AML/CBFbeta (AML-110) y C/EBP (C/EBP-100). En células de origen linfoide el promotor se encuentra regulado por la familia de factores de transcripción AML, mientras que en células de origen mieloide la regulación depende de los factores de transcripción C/EBP. Es decir, la regulación es linaje dependiente. Por último, la molécula pre-leucémica AML-1/ETO generada por la traslocación cromosomal t(8;21) en células de leucemia mieloide aguda reprime la transcripción de CD11a a través del reconocimiento de AML-110, lo que permite explicar la baja/nula expresión de CD11a en células de leucemia mieloide aguda AML M2.

Autor: RUIZ VELASCO NATIVIDAD.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El receptor scavenger CD36 participa en procesos celulares tan importantes como aterosclerosis, inflamación, trombosis, angiogénesis y metabolismo lipídico a través de su interacción con múltiples ligandos: lipoproteínas, células apoptóticas, trombospondina-1, ácidos grasos, algunos fosfolípidos y AGEs. Nosotros hemos investigado el efecto de las drogas antiaterogénicas estatinas sobre la expresión de CD36 en monocitos humanos, así como el mecanismo molecular responsable de su acción reguladora. Además, hemos evaluado el efecto que tanto las estatinas como diferentes ligandos del receptor nuclear PPAR-gamma tienen sobre la susceptibilidad para formar células espumosas. Nuestros resultados demuestran que las estatinas incrementan la expresión de CD36 en la superficie celular así como sus niveles de RNA mensajero a través de la potenciación de la transcripción del gen de CD36. Los efectos de las estatinas sobre la expresión de CD36 son prevenidos por mevalonato y geranilgeraniol, lo cual indica el requerimiento de proteínas geranilgeraniladas en la regulación de CD36. El inhibidor de las Rho-GTPasas, la exoenzima C3, reproduce el efecto de las estatinas mientras que el activador de Rho, el ácido lisofosfatídico, disminuye la expresión de CD36. Lo que es más, la expresión transitoria de mutantes dominantes negativos de RhoA y RhoB inducen un aumento significativo de la actividad promotora de CD36 con respecto a sus correspondientes formas nativas. En conjunto, estos datos indican que las estatinas incrementan la expresión de CD36 mediante la inactivación de las proteínas Rho-GTPasas. Además, un disruptor del citoesqueleto de actina, la citocalasina D, incrementa la expresión de CD36, sugiriendo que las proteínas de la familia de Rho afectan la expresión de CD36 a través de sus efectos sobre la organización del citoesqueleto de actina. Por otro lado, los ligandos de PPAR-gamma, las tiazolidinedionas, incrementan la expresión de CD36 a través del aumento de la transcripción del gen de CD36. Sin embargo, nuestros resultados indican, que a pesar del aumento de la expresión de CD36 tanto por estatinas como por ligandos de PPAR-gamma, las estatinas no incrementan ni la unión ni la internalización de LDL oxidadas, por lo que no aumentan la formación de células espumosas, mientras que los ligandos de PPAR-gamma dimsinuyen la captación de LDL oxidadas, diminuyendo la susceptibilidad para formar células espumosas.

Autor: ROMERO RAMÍREZ LORENZO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La neurostatina se ha descrito como un inhibidor de la división de astroblastos y células tumorales de origen astroglial presente en extractos de cerebro normal de diferentes mamíferos. Mediante diferentes técnicas de resonancia y bioquímicas se caracterizó como el gangliósido GD1b con una O-acetilación en su siálico terminal. En este estudio, se ha caracterizado la O-acetilación de la neurostatina en la posición 9 de su siálico terminal, así como las regiones moleculares de la neurostatina importantes en la inhibición de la proliferación inducida por los mitógenos EGF y PDGF-B en líneas celulares de astrocitoma humano. La O-acetilación en la posición 9 del ácido siálico juega un papel esencial en la actividad de la neurostatina y de otros gangliósidos O-acetilados, convertiendo gangliósidos con capacidad mitogénica en sustancias inhibidoras. La pérdida de la estructura galactosil-N-acetil-galactosaminil en la neurostatina reduce 8 y 16 veces su actividad inhibidora dependiendo del polipéptido mitogénico ensayado. Además, la pérdida de un siálico de la neurostatina aunque el siálico restante esté O-acetilado, reduce su actividad más de 20 veces. La actividad inhibidora de la estructura galactosil-N-acetil-glactosaminil requiere la participación de los dos siálicos unidos consecutivamente, estando el siálico terminal O-acetilado. La estructura galactosil-N-acetil-galactosaminil interaccionaría con los siálicos, dejando expuesta el siálico O-acetilado terminal y la galactosa terminal, por donde probablemente la neurostatina interaccione con su receptor. La neurostatina reduce la expresión de la ciclina D1 y de pRb1 y aumenta la expresión de los inhibidores de ciclo p21 Waf1/Cip1 y p27 Kip1, provocando la parada del ciclo celular probablemente en la fase G1. Además, la neurostatina induce en la línea de astrocitoma humano U-373 cierto grado de diferenciación celular, porque aumenta la expresión de GFAP relacionada con diferenciación glial, y también apoptosis. La reducción en la expresión de pRb1 y los aumentos en la expresión de p21 Cip1 y p27Kip1 podrían estar implicados en la apoptosis inducida por ésta. Estos resultados podrían dar lugar al diseño de drogas sintéticas que mimetizasen la estructura de la neurostatina con una actividad inhibidora de la división y apoptótica de gliomas humanos.

Autor: ROMERO PRADO MARINA M. DE JESÚS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA .

Resumen: La regulación de la expresión génica se explica desde varios abordajes: participación de elementos cis y trans-actuantes, de complejos multiproteicos y de una combinación de interacciones DNA:proteina, y de ácidos nucleicos entre sí que regulan y compartamentalizan regiones para ser activadas o suprimidas. Los genes del locus hGH/PL obedecen a mecanismos generales de regulación: participación de LCRs, con el correspondiente reclutamiento de acetilasas de histonas (actividad HACs) y factores de transcripción tejido-específicos como es el caso de Pit-1 que es capaz de unirse al promotor mínimo y al LCR específico del gen hGH-N, localizado a 15 Kb del sitio de iniciación transcripcional de este gen. Por otro lado, los genes placentarios tienen su propio mecanismo de regulación, también dependientes de este LCR, específicamente de los HS III-V, y de la presencia de enhancers hacia 3' de los PLs- pero no del hGH-V-. En el presente trabajo analizamos la participación de un genoma desmetilado y su efecto sobre la expresión de los genes del locus hGH-PL -provenientes de un PAC- tanto en líneas celulares hipofisarias de rata y placentarias humanas. Asimismo, analizamos diferentes promotores proximales de los genes de este locus que incluyen regiones no analizadas anteriormente. Los resultados obtenidos indican la presencia de un posible elemento regulador negativo dentro del promotor proximal hGH-N de 1,45 Kb. Por otro lado, analizamos la expresión, tanto la endógena como aquella proveniente de PACs transfectados, del gen hGH-V en líneas de coriocarcinoma placentario humano. Encontramos que este gen es regulado transcripcionalmente por glucosa la cual suprime su expresión. Asimismo, en condiciones de desmetilación, el gen suprimido por glucosa es capaz de expresarse por lo que se plantean dos mecanismos de regulación transitoria en cultivo, capaces de ejercer efectos tal vez complementarios en la regulación de la expresión de este gen. Finalmente, dentro del promotor proximal del gen hGH-V, existe una región rica en CACCC y con varios dinucleótidos CpG, susceptibles de ser reconocidos por factores de la familia Sp1/Krüppel like y por DNAmetilTransferasas (DnMTs) respectivamente. Ignoramos cuáles de los 16 miembros de la familia Krüppel-like pudieran interaccionar con esta región aunque su capacidad de formar interacciones DNA: proteina con esta región también se ve modificada por glucosa desconociéndose el mecanismo regulador de este gen bajo diferentes condiciones metabólicas.

Autor: RODRÍGUEZ CARRASCO YOLANDA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: En la Tesis Doctoral presentada se ha estudiado la regulación de la expresión y función del complejo pre-TCR en humanos. En estudios realizados ex vivo y con ayuda de cultivos organotípicos, hemos observado que el complejo pre-TCR se expresa de forma transitoria, en un estadio madurativo concreto, dentro del proceso de diferenciación pre-T en el timo postnatal humana. Además alcanza niveles muy bajos de expresión en la membrana. Ambas características responden a una estricta y compleja regulación de su función. Hemos encontrado dos etapas de regulación para el pre-TCR, una a nivel de su ensamblaje en el Retículo Endoplásmico de los timocitos pre-T mediante un mecanismo de retención en el mismo. La segunda etapa de regulación se produce en la dinámica del complejo en la membrana plasmática, mediante un proceso de modulación negativa constitutiva que ocurre en ausencia de estimulación del pre-TCR y conlleva su pérdida de la membrana y degradación en lisosomas y en el proteasoma. La información necesaria para que ambas etapas de regulación tengan lugar se encuentra en la proteína pre-T -alpha, más en concreto en su región intracitoplásmica. El tallo de pre-T -alpha incluye un motivo FF de interacción con los coatómeros en su extremo de 16 aas c-terminales, responsable de sus propiedades de retención en el Retículo Endoplásmico y capaz de regular la expresión de receptores de membrana (CD25, CD24) y complejos multiméricos (pre-TCR, TCRalfa beta). También se encuentra en el tallo de pre-T -alpha humana un motivo consenso de endocitosis y degradación lisosomal basado en Tirosina (YxxZ, donde Z es un aminoácido hidrofóbico) que pudiera estar implicado en la modulación negativa constitutiva del complejo pre-TCR.

Autor: PÉREZ CAPILLA TATIANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOQUÍMICAS.

Resumen: En la mayoría de las células somáticas, la alternancia de las fases S y M del ciclo celular está sometida a un control estricto que asegura el mantenimiento de la ploidía en la progenie. Algunos tipos celulares son capaces de escapar a dicho control durante su programa de diferenciación terminal. Este es el caso del megacariocito, la célula precursora de las plaquetas sanguíneas. En las últimas etapas de su maduración, el megacariocito adquiere el fenotipo poliploide por establecimiento de ciclos de endorreplicación, o endomitosis, consistentes en repetidas fases S sin división celular concomitante. Duante la endorreplicación megacariocítica, los complejos CiclinaE/Cdk2, responsables de la transición G1/S, se mantienen activos. Nos preguntamos si los inhibidores de estos complejos, p21cip1 y p27kip1 estaban implicados en la regulación de la endorreplicación. El sistema experimental que utilizamos ha consistido en comparar dos líneas celulares megacarioblásticas, HEL y K562, ya que ambas diferencian hacia megacariocito en respuesta al tratamiento con ésteres de frobol (TPA), pero sólo en las HEL se produce endorreplicación. La expresión de p21cip1 se indujo a tiempos tempranos de la diferenciación de ambas células, decayendo posteriormente de manera independiente a la capacidad de establecer o no endorreplicación. Consecutivamente, los niveles de expresión de p27kip1 aumentaron en ambas líneas celulares. No obstante, los niveles de p27kip1 y del correspondiente complejo p27kip1/CiclinaE fueron en todo momento superiores en las células K562 que no endorreplican. Estos datos sugieren que el equilibrio entre inhibidor y Ciclina, más que la ausencia/presencia de p27kip1, puede ser determinante para el establecimiento de la endorreplicación. De hecho, cuando los niveles relativos de estos factores se alteraron por expresión constitutiva de Ciclina E en las células K562, o expresión inducida de p27kip1 en las células HEL, se restableció e inhibió, respectivamente, la capacidad de endorreplicar. Nuestros resultados sugieren que mientras p21cip1 parece estar implicada en estadios tempranos de la diferenciación, pero no en el establecimiento de la endomitosis, la capacidad endorreplicativa reside en la modulación conjunta de los niveles de expresión del p27kip1 y de Ciclina E.

Autor: LÁZARO MANERO JOSÉ ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL GENERAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN.

Resumen: Uno de los efectos adversos del uso de la ciclosporina en su nefrotoxicidad. En este trabajo se describen los efectos de la ciclosporina a nivel del túbulo proximal. Se presentan los cambios inducidos a nivel del recambio de ATP, y se describe la acción de la ciclosporina sobre la mitocondria que acabará condicionando la depolarización de la misma. Mostramos como a pesar de dichos efectos la concentración intracelular de ATP se mantiene constante, lo que permite a la célula entrar en un proceso de apoptosis. Estudiamos la situación de la Na, K-ATPasa como principal determinante del recambio de ATP y mostramos tanto los efectos in vitro de la ciclosporina sobre la bomba de sodio como sus efectos in vivo sobre el transporte activo de sodio. Describimos por primera vez la desinserción de la bomba de sodio de su habitual sitio de acción bajo el efecto de la ciclosporina, y presentamos las repercusiones celulares, tubulares y renales de dicho fenómeno. Finalmente discutimos las bases que subyacen al uso empírico de antagonistas del Ca++ y angiotensina II en pacientes sometidos a tratamiento con ciclosporina.

Autor: LÓPEZ BUENO ALBERTO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La familia Parvoviridae presenta numerosas ventajas a la hora de abordar el estudio de los determinantes moleculares de virulencia en virus icosaédricos. Se han localizado los residuos de las proteínas estructurales que rigen el tropismo de estos virus, se dispone de la estructura tridimensional de la cápsida a alta resolución para alguna de sus miembros, y se han descrito características importantes de la patología asociada a su infección. El parvovirus MVMp no produce síntomas conocidos ni se multiplica de forma evidente en ratones adultos o recién nacidos. Sin embargo, en nuestro laboratorio pudimos constatar un proceso reproducible de adaptación a ratones inmunodeficientes (SCID) cuando se inyectaba directamente en sangre. Los nuevos virus emergentes se caracterizan por tener un fenotipo alterado en cultivos celulares y por haber adquirido un alto grado de virulencia. La secuenciación de estos virus reveló la existencia varias mutaciones puntuales concentradas en una región del genoma que codifica por las proteínas estructurales de la cápsida. Los cambios de aminoácidos a los que daban lugar estaban situados en una zona accesible y cercana al eje de simetría de orden 2 de la cápsida de MVMp. La construcción de virus mutantes puntuales en dos de estas posiciones nos permitió demostrar su implicación en el tamaño de placa de lisis, en la afinidad por el receptor celular, y en la virulencia en ratones SCID. A tiempo tardíos de infección de ratones SCID con estos mutantes puntuales, observamos la aparición de un segundo grupo de mutaciones que coincide temporalmente con la afectación de órganos hematopoyéticos y con una leucopenia aguda y letal, sugiriendo un cambio de tropismo in vivo. Por último, el parvovirus MVMi es capaz de escapar a la acción neutralizante de un anticuerpo monoclonal administrado en un protocolo de inmunoterapia pasiva de ratones SCID, evidenciando nuevamente la capacidad de adaptación de los parvovirus.

Autor: GIRALDO CARBAJO PATRICIA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: El objetivo principal de esta tesis es el estudio funcional y estructural de la región controladora de locus (LCR) del gen de la tirosina de ratón. Como primer objetivo parcial, se realizó un análisis de la actividad transactivadora transcripcional de la LCR. Se realizó un estudio in vivo, mediante la generación de ratones transgénicos con YACs portadores del locus completo de la tirosinasa con distintas mutaciones en la región LCR e in vitro mediante transfecciones transitorias de células en cultivo. Con ambos estudios se ha concluido que la actividad transactivadora transcripcional de la LCR reside en una región en la que se habían descrito dos posibles sitios de unión a factores nucleares, siendo necesaria la presencia de ambos sitios para la actividad. La capacidad transactivadora es independiente del promotor utilizado, pero es específica de tipo celular. Dentro de las LCRs coexisten distintas actividades, el siguiente objetivo del trabajo fue analizar la posible actividad aisladora frente a efectos de posición de la LCR en transgenes heterólogos. Este estudio se realizó tanto en el sistema homólogo mediante ratones transgénicos, como en un sistema heterólogo mediante moscas transgénicas. Ambos estudios apuntan a la existencia de actividad aisladora genómica dentro de la LCR. Como análisis preliminar del papel estructural de la LCR se analizó el posicionamiento de los nucleosomas alrededor de esa región y la posible existencia de regiones S/MAR. Los datos preliminares obtenidos parecen indicar un reordenamiento de los nucleosomas alrededor de la zona de las ventanas A y B. No se ha posido determinar la existencia de regiones S/MAR dentro de la LCR ni mediante experimentos in vitro ni mediante programas informáticos. Por último se ha analizado el contexto genómico en que se encuentra la LCR. Se ha determinado la existencia de una elevada densidad de elementos repetitivos de tipo LINE1 en el locus de la tirosinasa. Un elemento completo localizado adyacente a la LCR en 5', no parece ser funcional ya que se encuentra metilado in vivo en ADN genómico de células de melanoma B16 (que expresan tirosinasa). La existencia de esta zona metilada adyacente a la LCR apoya la existencia de algún elemento aislador que protega los elementos transactivadores de su influencia.

Autor: GIRALDEZ ARELLANO ANTONIO JESÚS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Durante el desarrollo de los organismos pluricelulares, grupos de células se especializan para llevar a cabo diversas funciones. Una de las preguntas más interesantes en Biología es cómo las células de un tejido en desarrollo reciben la información necesaria para diferenciarse en tipos celulares particulares. En los últimos díez años ha habido grandes avances en este tema con la identificación de varias moléculas secretadas responsables de organizar el crecimiento y la diferenciación en distintos tejidos durante el desarrollo. Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por contestar. El mecanismo por el cual estas moléculas se desplazan es aún motivo de controversia, y no se entiende cómo estas señales externas se traducen en cambios en la expresión génica que dan lugar a la formación de diversos tipos celulares. En esta Tesis he usado el desarrollo del ala de Drosophila melanogaster como modelo para estudiar las diversas señales que controlan el crecimiento y la diferenciación. He usado el método EP de sobre-expresión aleatoria de genes, para identificar nuevos genes con una función relevante en la regulación e interpretación de los gradientes morfogenéticos que tienen lugar durante la formación del ala. He identificado un nuevo gene llamado Torero, cuya expresión se activa en respuesta a Wingless. Torero desempeña un importante papel en el embrión y en el disco imaginal limitando el rango de acción de Wingless. Torero pertenece a la familia de enzimas a/b hydrolasas y actúa durante el desarrollo en la matriz extracelular para modificar los Proteoglicanos con Heparan Sulfato. Torero reduce la capacidad morfogenético de Wingless en varios contextos durante el desarrollo.

Autor: VIDAL GARCÍA FELIPE.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA U.A.M..

Resumen: El endotelio vascular constituye la interfase entre la sangre y los tejidos y desempeña un papel esencial tanto en la hemostasia sanguínea como en la regulación fisiológicas de los distintos órganos. La función endotelial está mediada por la expresión de receptores de superficie cuya interacción con sus ligandos específicos (como es el caso de VEGF y sus receptores) regula, entre otros, los procesos de tráfico leucocitario y la angiogénesis. La formación de nuevos vasos sanguíneos o el proceso angiogénico tiene lugar en condiciones normales y patológicas. Así, el crecimiento embrionario o la cicatrización de heridas son procesos fisiológicos que cursan con la neoformación de vasos, que también aparecen, entre otros, en procesos patológicos como son el crecimiento de tumores sólidos, metástasis, retinopatías diabéticas o hemangiomas. Los objetivos planteados para la realización de esta tesis doctoral han sido: * Estudio de la expresión de los receptores de VEGF, KDR y Flt-1 en respuesta a la denudación mecánica en células endoteliales. * Estudio de los mecanismos transcripcionales que dan lugar a la inducción del gen flt-1 tras procesos de denudación endotelial. * Estudio de la expresión del receptor de VEGF 165 neuropolina-1 frente a diversos estímulos angiogénicos. Después del trabajo experimental pudimos llegar a las siguientes conclusiones: * La expresión de proteína de la molécula KDR (VEGFR-2) aumenta a partir de las 16 horas tanto en respuesta a la denudación mecánica como al tratamiento con el éster de forbol PMA en células endoteliales, mientras que el nivel de RNA mensajero se mantiene estable. * Los niveles de proteína de Flt-1 (VEGFR-1) aumentan a partir de las 5 horas y con un máximo a las 15 horas en respuesta a la denudación mecánica de células endotelilales. Esta inducción viene acompañada de una fuerte subida de su RNA mensajero a 3 horas tras la estimulación. * La actividad transcripcional dependiente de la secuencia promotora del gen flt-1 (-1195 a + 284) esta fuertemente aumentada en respuesta a la denudación mecánica y al tratamiento con PMA. Esta inducción es en gran medida debida a la transactivación mediada por el factor de transcripción Egr-1, que se expresa en el núcleo de células endoteliales tras la estimulación, uniéndose a un sitio consenso situado en las posiciones -24a -16pb del promotor de flt-1. * El bFGF, pero no otros estímulos angiogénicos como el VEGF, TNF-alfa o la deferroxiamina, produce un aumento en la expresión de neuropilina-1, receptora para VEGF 165, en células endoteliales. Esta inducción tiene un máximo a las 24 horas y es dosis dependiente.

Autor: HERRANZ MUÑOZ HÉCTOR.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Durante el desarrollo de esta tesis hemos descrito el patrón de expresión del gen pannier durante el desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster, así como distintos aspectos de la regulación de su expresión. Finalmente hemos determinado su función durante este periodo del desarrollo como gen que especifica el desarrollo de la región dorso-medial de la larva y sus distintas implicaciones en el proceso de cierre dorsal y a cerca de la regulación sobre otros genes necesarios para el desarrollo embrionario.

Autor: YUS NÁJERA EVA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO CAJAL.

Resumen: Los canales de potasio de la familia KCNQ se hallan mutados en enfermedades humanas como arritmia cardíaca (afecta a KCNQ1), sordera (KCNQ4) o epilepsia (KCNQ2 y KCNQ3). Juegan un papel capital en el establecimiento del potencial de membrana. Esta memoria describe en primer lugar, el desarrollo de anticuerpos contra los miembros neuronales de la familia, esto es KCNQ2, -3 y el último miembro en clonarse, KCNQ5, responsables de la corriente M. Estos anticuerpos son específicos de subunidad y permiten detectar y purificar las proteínas. En cuanto a las propiedades bioquímicas, las proteínas presentan una forma a parte de la teórica en expresión heteróloga, asociada a distintos grados de N-glicosilación, siendo las dos formas de superficie. En tejido nativo presentan una movilidad intermedia, y en todos los casos se localizan en una fracción de membrana altamente soluble. KCNQ2 y KCNQ5 se hallan además en músculo esquelético, con otra movilidad y asociadas a una fracción de baja densidad de membrana (asociadas a una balsas de colesterol o ancladas de citoesqueleto). KCNQ3 es capaz de formar heterómeros con KCNQ2 y -5, pero estas dos subunidades no se ensamblan entre si. La potenciación por heteromerización no se debe a un aumento en la síntesis de las proteínas. En el desarrollo, KCNQ3 permanece constante; KCNQ2 se expresa tempranamente y luego da paso a KCNQ5. Se cree que esta es la razón por la que la epilepsia asociada a mutaciones en KCNQ2 sea de tipo neonatal. En estudios de inmunohistoquímica, se observa una expresión ubicua, en el soma y árbol dendrítico proximal. En segundo lugar, en un cribado de doble híbrido, se detectó una interacción con calmodulina de la región C-terminal de los canales M. Concretamente se une a los primeros 200 aminoácidos. En este segmento son imprescindibles dos subdominios, probablemente alfa-hélices, se 40 y 30, separados por un lazo de 130 residuos dispensable. La unión a calmodulina requiere toda la molécula, aunque los motivos EF1 y EF3 son importantes, al contrario de otras proteínas estudiadas, que se unen al C-terminal. Los dos subdominios por separado unen en presencia de calcio. Pero cuando están en la misma cadena surge una nueva propiedad: la unión Ca-independiente. En cuanto a los canales completos, la unión es preferentemente a apo-calmodulina. Los mutantes de KCNQ2 incapaces de unir CaM no son funcionales. Esto es debido a que no se destinan adecuadamente a la superficie. Por lo tanto CaM puede ser una subunidad beta que favorezca el tráfico o bien un mediador de la inhibición por calcio en respuesta a agonista de la corriente M.