BIOQUIMICA MOLECULAR, 21

Autor: MARTÍN APARICIO M. ESTER.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" (CBMSO).

Resumen: La Enfermedad de Huntington es una de las nueve enfermedades neurológicas causadas por una mutación de expansión de tripletes de CAG codificantes para secuencias de poliglutamina. Afecta al 3-7 por 100.000 de la población descendiente de Europa occidental y su sintomatología abarca trastornos de tipo motor (corea y rigidez entre otros), cognitivo (demencia subcortical) y psicológico (irritabilidad y depresión entre otros), que terminan con la muerte del individuo. La neuropatología de la enfermedad de Huntington es extremadamente restringida, con una marcada atrofia del estriado y en menor medida de la corteza cerebral. Microscópicamente, la patología estriatal está caracterizada por pérdida neuronal, gliosis y presencia de agregados proteicos. Desde que en el año 1872 el doctor George Huntington describiera por primera vez la enfermedad, ha habido múltiples avances en el conocimiento de la misma. El descubrimiento del gen responsable de la enfermedad (el de la huntingtina) en el año 1993 ha dado lugar a la generación de múltiples modelos in vitro, celulares, y animales que han permitido ahondar en las bases moleculares de esta neuropatología. En base a estos estudios han surgido varias líneas de investigación que intentan explicar el mecanismo por el cual la huntingtina (htt) con la poliglutamina expandida provoca la neuropatología. En este trabajo hemos pretendido ahondar en los mecanismos moleculares implicados en la patogénesis de la enfermedad mediante la caracterización de un modelo transgénico condicional de la Enfermedad de Huntington (HD94). Los ratones HD94 expresan el exón 1 de la htt con un tramo de 94 glutaminas de un modo condicional, lo que permite explorar la posible reversibilidad de la neuropatología y la sintomatología. En la caracterización inicial del modelo, los agregados y la sintomatología revirtieron en paralelo por completo, impidiendo así descartar o confirmar que los agregados fueran causantes de la patología. En esta tesis, mediante el uso de cultivos primarios estriatales de este ratón, así como del modelo in vivo, hemos establecido que: la eficiente translocación y/o retención en el núcleo de la htt mutada amino terminal ocurre sólo en células que no se dividen; que la expresión de la htt mutada amino terminal no afecta a la localización ni a los niveles de expresión de la htt endógena en cultivo; que la formación y reversión de los agregados son procesos rápidos tanto en cultivo como in vivo, siendo en este caso la reversión más rápida que la recuperación motora; que la reversión de los agregados depende de la actividad del proteosoma y que dicha actividad no varía en neuronas de estriado HD94 en cultivo con respecto a los controles; que la actividad del proteosoma es menor en el estriado que en la corteza y el cerebelo de animales control; que los ratones HD94 muestran un aumento de la actividad del proteosoma en extractos de corteza y estriado que no revierte tras 12 semanas de inhibición del transgén; y que la expresión de htt mutada amino terminal no afecta a la supervivencia neuronal, ni en cultivo, ni en ratones HD94 sintomáticos.

Autor: GONZÁLEZ PACHERO FRANCISCO ROMÁN.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UAM.

Resumen: Se estudió el efecto de los radicales libres de oxigeno (H2O2) aplicados exógenamente sobre células vasculares en cultivo (células de musculo liso y células endoteliales) y sobre fragmentos de tejido. La respuesta endotelial a la agresión oxidativa es diferente en estas células, dependiendo de la concentración del H2O2 a bajas concentraciones se manifiestan una respuesta citoprotectora, mientras que a altas concentraciones aparece citotoxicidad. En ambos tipos celulares el estrés oxidativo induce la expresión de VEGF que ejerce un papel crítico en la respuesta citoprotectora a la agresión oxidativa. En vasos enteros, la expresión del mRNA de VEGF, así como la producción de proteína se estimulan durante la incubación extracorpórea y tras la exposición a H2O2. La exposición de células endoteliales y de músculo liso vascular a H2O2 provoca movilización de calcio libre citosólico y activación de PLCgamma. En células endoteliales, el estrés oxidativo induce la expresión del VEGFR2, en forma independiente de la inducción de VEGF, sugiriendo una respuesta no regulada por el ligando. En cambio, no se detectaron cambios en la expresión del receptor VEGFR1. La expresión de VEGF autocrino es multiregulada y depende de al menos tres mecanismos de señalización intracelular, que pueden ser a su vez interdependientes: fosforilación de tirosinas, P13K/Akt y PKC. La exposición de las células endoteliales a agentes oxidantes estimula un grado notable de activación de al menos tres factores de transcripción, HIF-1, Sp-1 y NFkB.

Autor: POMAR BALLESTERO NATALIA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: En eucariotas, la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eIF2 en la Ser 51 por proteínas quinasas específicas (eIF2alfa quinasa) representa uno de los mecanismos mejor caracterizados en la regulación de la síntesis de proteínas en condiciones de estrés celular. Sin embargo, en Drosophila melanogaster, la existencia de este mecanismo era incierta y por ello se planteó la búsqueda de evidencias que probaran la operatividad de este mecanismo de control de la expresión génica en células de Drosophila. Así se han clonado y caracterizado estructural y funcionalmente el factor eIF2B, constituído por cinco subunidades polipeptídicas, y la segunda eIF2alfa quinasa de Drosophila melanogaster (DPERK). Se ha mostrado que la expresión del RNA mensajero de DPERK está regulado durante el desarrollo embrionario. DPERK es una glicoproteína que se localiza en el retículo endoplásmico (RE), es capaz de formar oligómeros, muestra actividad el IF2alfa quinasa específica in vivo e in vitro y es sensible a tratamientos celulares son agentes que promueven estrés en el RRE. También se ha estudiado el efecto diferencial de distintas condiciones de estrés en células S2 sobre la actividad de las dos eIF2alfa quinasas existentes en Drosophila: DPERK y DGCN2. Todos estos resultados nos permiten apoyar dos conclusiones de evidente relevancia: A,- La organización estructural y funcional de algunos genes así como posiblemente los mecanismos de regulación de sus productos génicos (en nuestro caso el factor eIF2B y las eIF2alfa quinasa PERK y GCN2) están conservados desde las levaduras hasta el hombre. B,- El mecanismo de regulación de la traducción mediado por el IF2alfa quinasa también opera en Drosophila y está conservado a lo largo de la escala evolutiva.

Autor: BLANCO COLIO LUIS MIGUEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La enfermedad cardiovascular es la 1ª causa de mortalidad de los países occidentales. La formación de la placa aterosclerótica es debida a un proceso inflamatorio y proliferativo en el que están implicadas tanto células residentes en la pared vascular (células de músculo liso y células endoteliales) como células inflamatorias (monocitos/macrófagos y linfocitos T). El número de células de la pared vascular esta implicado en el desarrollo y progresión de las lesiones ateroscleróticas. Existen diferentes factores de riesgo cardiovascular entre los que se encuentran los lípidos. Los fármacos hipolipemiantes y, en concreto, los inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas), han demostrado una alta eficiencia en reducir la mortalidad debida a eventos coronarios. Sin embargo, los efectos beneficiosos de estos fármacos no pueden ser explicados únicamente por su acción hipolipemiante y deben de tener acciones independientes de la síntesis de colesterol. Hemos observado que el tratamiento con diferentes inhibidores de la HMG-CoA reductasa da lugar a la muerte celular por apoptosis de células de músculo liso vascular en cultivo. Este efecto esta relacionado con la inhibición de la síntesis de isoprenoides y, en particular, con la inhibición de la isoprenilación de proteínas G pequeñas y con la disminución de la expresión de la proteína proapoptótica Bcl-2, dando lugar a la activación de la vía mitocondrial de muerte celular. También, hemos estudiado la presencia de Fas y de su ligando (LFas) en la lesión aterosclerótica humana y hemos observado que estas dos proteínas proapoptóticas se expresan preferentemente en la zona con mayor predisposición a la rotura, los hombros. En un modelo de aterosclerosis experimental hemos observado que el tratamiento con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, atorvastatina, reduce la presencia de Fas y de LFas en la lesión. Además, el tratamiento con atorvastatina disminuye la expresión de LFas en células T activadas in vitro, efecto relacionado con la disminución de la síntesis de isoprenoides y con la inhibición de la isoprenilación proteica, jugando un papel principal la proteína G pequeña RhoA. Esta reducción se correlaciona con la disminución de la citotoxicidad de estas células sobre células diana sensibles a LFas. Por lo tanto, los inhibidores de la HMG-CoA reductasa, a través de la inhibición de la isoprenilación proteica, son capaces de regular la muerte celular diferentes células presentes en la lesión aterosclerótica. La celularidad de la lesión vascular parece ser clave en el desarrollo y progresión de la placa de aterona y su control puede ayudar a mantener la estabilidad de las lesiones ateroscleróticas.

Autor: ARCE MARTÍNEZ IGNACIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El funcionamiento del sistema inmune se basa en gran medida en la discriminación de elementos extraños al organismo, potencialmente patogénicos, frente a elementos propios. Esta capacidad la presentan diferentes tipos celulares del sistema inmune que expresan en su membrana diferentes receptores encargados de mediar el reconocimiento de estructuras propias o extrañas y modular la actividad de la célula. En este sentido, las células natural Killer y las células dendríticas presentan en su superficie, entre otros, receptores pertenecientes a la familia de las lectinas dependientes de Ca2+ encargados de realizar esta función. Algunos de los genes que codifican estos receptores, expresados preferencialmente por células natural killer, han sido localizados formando un agrupamiento génico en el brazo corto del cromosoma 12 (12p12.3-13.2). Este agrupamiento ha sido denominado Natural Killer gene Complex. En este trabajo se describe un mapa físico de alta resolución que abarca 2,5 Mb de la región genómica Natural Killer gene Complex, basado en un continuo de cromosomas artificiales de bacteria (BACs y PACs) que permite localizar, ordenar y orientar transcripcionalmente 19 genes de tipo lectina identidicados en esta región y expresados en diferentes tipos celulares, aunque mayoritariamente en células dendríticas y natural Killer. Este mapa ha servido de sustrato para la secuenciación de esta región en el contexto del Programa Genoma Humano en el Baylor School of Medicine (Houston, USA) y la disponibilidad de los resultados en las bases de datos ha permitido la búsqueda de nuevos genes por comparación de secuencias. Así, a partir de secuencias homólogas al dominio de unión de carbohidratos, característico de la familia de las lectinas, se han identificado dos genes nuevos (DLEC y DECTIN-1), y un pseudogen (CLR) homólogo a una familia génica de ratón. Estos genes han sido clonados y se ha caracterizado su estructura genómica, su relación con otros genes de la familia de las lectinas por estudios filogenéticos y su localización precisa en el mapa físico del NKC. Además, se han identificado isoformas de cada uno de ellos y se ha realizado un análisis de su expresión a nivel de RNAm en diferentes poblaciones celulares, observando que ambos genes se expresan en células dendríticas y son modulados negativamente durante la maduración. En conclusión, el complejo génico Natural Killer contiene un agrupamiento de genes de tipo lectina con una diversa especificidad de expresión no sólo restingida a células natural killer pero sí mayoritariamente en células del sistema inmune e implicados en la modulación de la función celular.

Autor: CALLES ARENALES BELÉN.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOOLOGÍA MOLECULAR "SERVERO OCHOA".

Resumen: La transcripción del fago 029 tiene lugar en dos etapas reguladas por la proteína viral p4, que reprime los principales promotores tempranos, A2b y A2c, y activa el promotor tardío A3. La proteína p4 tiene dos sitios de unión en el promotor A2c (Sitio 1, centrado en posición -39, y sitio 2, centrado en -71 y reconocido por p4 solo en presencia de RNA polimerasa) y un tercer sitio localizado por detrás del promotor A3 (centrado en -82). Tanto la activación del promotor A3 como la represión del promotor A2c dependen de la interacción directa entre el residuo Arg-120 de p4 y el dominio C-terminal de la subunidad alfa de la RNAP. No se conocían los residuos del alfa-CTD de la RNAP implicados en la interacción con la proteína reguladora p4, aunque se había determinado que la regulación de la transcripción de los promotores A3 y A2c, se pierde en presencia de una RNAP reconstituída con subunidades alfa delecionadas, que carecen de los útlimos 15 residuos. En conjunto, estos resultados sugerían que podía existir una interacción de tipo electrostático que implicarse la Arg 120 de p4 y alguno de los residuos de carga negativa entre los útlimos 15 de la subunidad alfa, o cercano a ellos. Tras sustituir todos los residuos de carga negativa de esta región por Ala se ha podido comprobar que ninguno de ellos es necesario en la interacción con p4. Sin embargo, la sustitución de uno de los residuos, concretamente un Glu en posición 297 de la subunidad alfa, dio lugar a una RNAP que no puede transcribir el promotor A3 en presencia de p4, es decir, la activación del promotor A3 se pierde en presencia de una RNAP reconstituída con subunidades alfa en las que se ha mutado este residuo de carga negativa. Aunque p4 puede estabilizar la RNAP mutante como complejo cerrado en el promotor A3, con la misma eficiencia que a la RNAP silvestre, y estos complejos cerrados evolucionan a complejos abiertos, se ha comprobado que los complejos abiertos son inestables en condiciones de alta fuerza iónica, lo que relaciona el Glu 297 de la subunidad alfa de la RNAP con la estabilidad de los complejos abiertos. Otra proteína viral, la proteína p6, también juega un papel importante en la regulación de la transcripción junto con p4. P6 es una proteína de tipo histona, o de unión a cromatina, que interviene en la replicación y la compactación del genoma viral y es responsable directa de la represión del promotor temprano C2. Además, p6 favorece la actividad reguladora de la proteína p4 formando un complejo nucleoprotéico junto con esta proteína, que cubre los promotores A3, A2b y A2c. La formación de este complejo incrementa notablemente tanto la eficiencia de represión de los promotores A2c y A2b como la eficiencia de activación del promotor A3. Se ha abordado la caracterización estructural y funcional del complejo regulador formado por las proteínas p4 y p6, encontrándose que en este complejo que p4 favorece la estabilización de p6 hacia los promotores tempranos, pero produce su desestabilización en el promotor tardío A3. La formación del complejo parece requerir contactos directos proteína-proteína, en los que están implicados una serie de residuos de carga negativa del extremo C-terminal de la proteína p4, que no incluyen el residuo crítico de interacción con la RNAP. En el promotor A2c el complejo nucleoprotéico p4-p6 implica el desplazamiento de la RNAP y por tanto la represión de la transcripción. En el promotor A3, la presencia de p6 aumenta la afinidad de p4 por su sitio de unión y por tanto aumenta la eficiencia de la formación de complejos cerrados. Además, p6 parece favorecer pasos posteriores del inicio de la transcripción, probablemente la formación de complejos abiertos.

Autor: NAVARRO YUBERO ANA CRISTINA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS "ALBERTO SOLS". CSIC-UAM.

Resumen: La hormona tiroidea, mediante la regulación de múltiples genes, ejerce un papel fundamental en el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso central de mamíferos. El control transcripcional, vía interacción de la hormona con sus receptores nucleares (TR), ha sido el mecanismo tradicionalmente más estudiado. Sin embargo, dada la amplia variedad de genes regulados por el estado tiroideo que no presentan elementos de respuesta en su promotor, se ha propuesto en los últimos años que los efectos reguladores de T3 sobre un gran número de genes cerebrales se puedan deber al control de un reducido grupo de genes implicados en la regulación génica post-transcripcional. Aparte HuD es una proteína específica neuronal implicada en el control de la vida media de distintos mRNAs relevante para la diferenciación cuya expresión está modulada por el estado tiroideo en el cerebro de rata. En este trabajo nos hemos propuesto identificar genes regulados por HuD que medien la acción de T3 en el cerebro. En concreto, hemos estudiado los genes neurotripsina y neuroserpina, los cuales se cree que están implicados en la regulación de los procesos migratorios durante el desarrollo cerebral y en la plasticida sináptica en el adulto, procesos ambos alterados en el hipotiroidismo. Hemos demostrado que T3 regula negativamente de modo transcripcional la expresión de huD en células PC12 + TRalfa1. La proteína HuD, por su parte, estabiliza el mRNA de neuroserpina a través de su unión a la zona 3'-UTR, aumentando los niveles de proteína en células PC12. Además, tanto neuroserpina como huD se regulan por hormona tiroidea en estas células y en cerebro de rata, existiendo alguna zona concreta, como la capa V de la corteza cerebral, donde la regulación de neuroserpina por T3 puede estar mediada por el efecto estabilizador de HuD. En un intento de explicar el significado funcional de esta estabilización, sobre-expresamos la proteína Neuroserpina en células PC12. Altos niveles de Neuroserpina indujeron la extensión de neuritas en estas células, requiriéndose la presencia del factor neurotrófico NGF para el mantenimiento y potenciación de este fenotipo. Por otra parte, demostramos que el gen neurotripsina también se regula de forma específica regional por hormona tiroidea a lo largo del desarrollo cerebral de la rata, aunque en este caso, su regulación no parece estar mediada por HuD.

Autor: DILLA QUINTERO TATIANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: En el presente trabajo hemos analizado la participación de la oncoproteína MDM2 en la regulación del crecimiento, tumorogénesis, y en la respuesta a la radiación de la línea de carcinoma medular de tiroides MTT. Estas células se caracterizan por la ausencia de expresión de p53 y MDM2. La expresión estable de MDM2 provoca una disminución significativa de la proliferación celular. En el análisis de citometría de flujo de los clones MTT -mdm2 se obseva una fracción importante de células hipodiploides, características de procesos apoptóticos. Esta población desaparece parcialmente mediante la expresión de p53 y p19 ARF. La participación de MDM2 en el fenotipo transformante de la línea MTT se realizó mediante ensayos de crecimiento en medio semisólido, e inyección de células en ratones desnudos. En el primero, observamos que la expresión de MDM2 reduce la capacidad de proliferación de las células MTT en medio semisólido, aunque observamos la aparición de tumores tanto en células MTT como en la línea MTT-mdm2. En la apoptosis inducida por MDM2 comprobamos una disminución de los niveles proteicos de bcl-2, y un aumento de los niveles de procaspasa-2. Hemos analizado también la respuesta a la radiación ionizante de las células MTT y la participación de MDM2 en dicha respuesta. La sobre-expresión de MDM2 provoca un aumento de la sensibilidad de las células MTT al tratamiento con radiación. Además, mientras que las células MTT se acumulan en la fase G2-M tras la radiación, en las células MTT -mdm2 se observa un incremento de la población apoptótica. Paralelamente, los niveles de E2F-1 aumentan en las células que sobre-expresan MDM2, lo que sugiere que la inducción de apoptosis en las células MTT -mdm2 puede ser debida a E2F-1. Asimismo, la unión de E2F-1 a secuencias de promotor específicas así como su actividad transcripcional están incrementadas en estas células. Tras el tratamiento con radiación, se observa un aumento de la actividad transcripcional de E2F-1 en las células MTT -mdm2. Para analizar la implicación de E2F-1 en la apoptosis observada en las células MTT -mdm2, generamos líneas estables que sobre-expresaban este factor. E2F-1 ejerce un efecto negativo sobre la proliferación celular, como se desprende tanto del análisis de las colonias resultantes de la transfección como de las curvas de crecimiento realizadas. El análisis mediante citometría de flujo refleja que E2F-1 induce apoptosis en las células MTT. Además, las curvas de supervivencia muestran que, tal y como observamos para MDM2, E2F-1 confiere radio-sensibilidad a la línea MTT.

Autor: DORADO DE LA CORTE BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los resultados del trabajo realizado han permitido determinar que en linfocitos Th2, activados a través del receptor parantígeno (TCR), se produce la inducción nuclear del factor de transcripción NFKB siguiendo una cinética atípicamente lenta y sostenida en el proceso de activación. Esta lenta inducción dependiente de la sístesis proteica "de novo", esta relacionada con la falta de degradación del inhibidor citoplásmico IKBa en las etapas inmediatas de activación. Respecto a la regulación transcripcional de la IL4 a través del sitio P1 de su promotor, se ha determinado que en las etapas tempranas de activación por TCR, es la proteína NFAT1 la que se une mayoritariamente al sitio P1, y en fases más tardías de activación es el factor Stat-6 el mayoritariamente unido al sitio P1. La unión de estos factores, correlaciona respectivamente, con la inducción o inhibición de la actividad transcripcional dirigida por dicho elemento, y con el aumento o disminución de tránscritos para el gen de IL4 presentes en células Th2. Por último, se ha determinado en la región de DNA que se extiende desde la posición - 995 a la + 85 en el gen murino IL4Ra, que el elemento Sp1 localizado alrededor de la posición - 43, es criterio en la actividad transcripcional basal del promotor, y los elementos NFAT (-295) y Stat-6 (-395) contribuyen positivamente a su actividad inducible en respuesta a estímulos extracelulares.

Autor: FERNÁNDEZ TORNERO CARLOS .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOLÓGICAS -CSIC.

Resumen: El fuerte incremento en las tasas de resistencia a los distintos antibióticos y la baja eficiencia clínica de la vacuna disponible impiden el control del Streptococcus pneumoniae, el agente bacteriano con mayor índice de mortalidad en el mundo. La necesidad de nuevos fármacos ha dirigido a los científicos hacia el estudio de factores de virulencia bacteriana tales como las proteínas de unión a colina, una familia de quince polipéptidos localizados en la superficie celular de este patógeno. La primera estructura de un dominio de unión a colina, el de la principal autolisina de neumococo, descubre un nuevo plegamiento que consiste exclusivamente en una serie de horquillas beta que se empaquetan para formar un solenoide o superhélice a izquierdas. Esta estructura única se estabiliza a través de una serie de moléculas de colina, localizadas en pequeñas cavidades hidrofóbicas de la superficie proteica que aparecen en la interfaz de horquillas beta consecutivas. Además, la estructura resuelta presenta una serie de surcos en la superficie, que podrían estar implicados en la interacción con el componente glicídico de los ácidos teicoico y lipoteicoico a los cuales se encuentran ancladas las proteínas de unión a colina. Puesto que dicho anclaje es esencial para la virulencia bacteriana, su liberalización de la pared celular está considerada como una vía terapéutica alternativa contra este patógeno. El conocimiento de la estructura del dominio de anclaje de una de estas proteínas nos ha permitido el hallazgo de un posible nuevo fármaco que podría, no sólo ser efectivo contra el neumococo sino también contra otras bacterias Gram-positivas que contienen proteínas con este dominio.

Autor: CAÑÓN SÁNCHEZ ESTELA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El ácido Retinoico (RA) ejerce sus efectos transcripcionales a través de la interacción con sus receptores nucleares los cuales interaccionan con zonas específicas del DNA en los promotores de los genes diana, llamados Elementos de Respuesta a Hormona. Hemos comprobado que este ligando de receptores nucleares es capaz de inducir diferenciación en las células A126-1B2, un clon de células PC12 caracterizado por su dificiencia en actividad PKA y por expresar elevados niveles de receptores de RA. El RA induce en estas células la expresión y la actividad de los promotores de los genes de respuesta tempranas c-fos, c-Jun y Jun-B, normalmente inducidos en las células parentales en respuesta a neurotrofinas como el NGF que actúan a través de receptores de membrana. Además el RA es capaz de inducir una rápida fosforilación de las quinasas ERK1-2 y del factor de transcripción CREB, un hecho compatible con un mecanismo de acción de tipo extragenómico que parece ser dependiente del receptor RAR. Nuestros datos aportan la primera evidencia de participación de los receptores de RA en la regulación de las quinasas ERK1-2 y de CREB. La deficiencia en PKA y la elevada expresión de receptores de RA que expresan estas células, parecen ser factores significativos en la respuesta de diferenciación que induce en ellas el RA.

Autor: ALFRANCA GONZÁLEZ ARANTZAZU.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE LA UAM.

Resumen: En condiciones de baja presión de oxígeno, las células ponen en marcha un programa adaptativo que lleva a la inducción de varios genes, que son regulados transcripcionalmente por el factor inducible en hipoxia HIF-1. Por otro lado, hay otros factores de transcripción que se unen a secuencias en cis de los promotores y modulan la inducción por HIF-1 de algunos genes. En este trabajo, mostramos que c-Jun coopera funcionalmente con la actividad transcripcional de HIF-1 en varios tipos celulares. Un dominante negativo de c-Jun, que carece de su dominio de transactivación, inhibe parcialmente la transcripción mediada por HIF-1. Por otro lado, la proteína coactivadora p300 potencia la cooperación funcional entre ambos factores. Este efecto cooperativo no se debe a un aumento de la cantidad de HIF-1alfa nuclear, ni requiere la unión directa de c-Jun a ADN., c-Jun y HIF-1 se asocian in vivo, pero no in vitro, sugiriendo que esta interación implica la participación de proteínas adicionales y/o una modificación postraduccional de estos factores. En este contexto, la hipoxia induce la fosforilación de c-Jun por JNK en células endoteliales. Este proceso está implicado en su efecto cooperativo, ya que el bloqueo específico de la ruta de JNK, y la mutación de c-Jun en Ser 63/73 inhiben su cooperación funcional con HIF-1. La cooperación funcional entre c-Jun y HIF-1 proporciona una nueva perspectiva de la regulación de algunos genes como VEGF, que es un factor clave en la angiogénesis tumoral.

Autor: CASTELLANO MORENO M. MAR.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La iniciación de la replicación es un proceso muy controlado durante el cual se produce la formación y consiguiente activación de los complejos pre-replicativos. La formación de dichos complejos pre-replicativos consiste en un ensamblaje secuencial y ordenado de las proteínas o macrocomplejos proteícos ORC, CDC6, CDT1 y MCMs al origen del replicación, siendo este ensamblaje uno de los principales sistemas de control de la iniciación de la replicación. A esta Tesis Doctoral hemos aislado y caracterizado los componentes CDC6, CDT1 y ORC1 de Arabidopsis thaliana, componentes que no habían sido caracterizados hasta la fecha. Esta identificación nos ha permitido estudiar los diferentes mecanismos que regulan la disponibilidad de dichas proteínas en plantas. Hemos encontrado que cada una de estos tres componentes posee dos isoformas codificadas por dos genes diferentes, pero sólo en el caso de AtCDC6, esta duplicación génica se debe a una duplicación cromosómica. Los datos que se presentan demuestran que AtCDC6 está altamente regulada a nivel de transcripción, tanto durante el desarrollo como durante el ciclo celular. AtCDC6 también está regulada a nivel de fosforilación ya que interacciona y se fosforila in vitro por complejos ciclina/CDK. Además, AtCDC6 se degrada en extractos de Arabidopsis por la ruta del proteosoma. Asímismo, AtCDT1 también interacciona tanto in vitro como in vivo con complejos CDK/ciclina y concretamente se fosforila in vitro por AtCDC2a/CycD2 y AtCDC2/CycA, sugiriendo que la regulación de CDT1 por fosforilación es dependiente de ciclo celular. Por su parte, AtORC1 está sujeto a regulación por transcripción tanto a lo largo del ciclo celular, poseyendo un pico de expresión al comienzo de la fase S, como durante el desarrollo. Es más, el uso de diferentes técnicas de detección de transcripción, apuntan a que los dos genes que codifican AtORC1 están sujetos a expresión diferencial, expresándose AtORC1b en células que proliferan o que son competentes para proliferar, mientras que AtORC1a lo haría en células que endorreplican. La observación de la unión del complejo EdF/DP a los sitios consenso de E2F, situados en los promotores de AtCDC6a y AtORC1, junto con el aumento de expresión que muestran estos genes al comienzo de la fase S, sugiere que dichos genes podrían estar regulados en plantas por la ruta RBR. Por otra parte hemos demostrado que la expresión ectopica de AtCDC6a como AtCDT1a es suficiente para producir un aumento de ploidía en los nucleos de las hojas. El hecho de que la expresión de AtCDC6 se salte el control de re-iniciación implica que, posiblemente, no haya en plantas mecanismos de control de la re-iniciación sobre otros componentes del complejo pre-replicativo, análogos a la regulación de CDT1 por geminina en metazoos.

Autor: CASTILLA MORO M. ÁNGELES.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La cohesión del endotelio se mantiene mediante diferentes tipos de uniones de estructura variada y compleja. Las uniones más importantes entre las células endoteliales son las uniones de tipo de adherente, que en el endotelio están formadas por cadherinas específicas, las VE-cadherinas. Estas uniones son muy importantes para el mantenimiento de la monocapa celular. En nuestro trabajo describimos que la rotura de este tipo de uniones, realizada de distintas maneras: con EGTA, Citocalasina D y un anticuerpo anti-VE-cadherina, inducen la expresión de ARNm y proteína de VEGF autocrino en células endoteliales, este VEGF autocrino ejerce efectos protectores sobre las CE. También se ha descrito el efecto que puede ejercer un medio condicionado tumoral, sobre células endoteliales, con particular referencia al papel que puede ejercer VEGF: El medio condicionado (MC) de células tumorales MG63, tiene efectos protectores sobre las CE. Estos efectos protectores están mediados en proporción significativa por VEGF. El bloqueo de VEGF o se su receptor VEGFR2, transforma el efecto del MC de MG63 de citoprotector a citotóxico. Este fenómeno es más marcado en presencia de agentes con propiedades citotóxicas para el endotelio, como la mitomicina C. Es decir el medio tumoral, cuando no está presente el VEGF, es tóxico para las células endoteliales. El MC de células tumorales también induce una serie de cambios fenotípicos en el endotelio. Cuando se bloquea el VEGF contenido en el medio tumoral, estos cambios desaparecen en gran medida, indicando que el VEGF es el factor principal implicado. El estado de activación del estímulo producido por el medio tumoral continúa aún después de quitar el estímulo, ya que aumenta el rendimiento de una posterior resiembra, y éste es debido al VEGF. El MC de MG63 hace aumentar la expresión de uno de los dos receptores más importantes del VEGF, el VEGFR2, donde se encuentra implicado la presencia del VEGF exógeno del medio tumoral. Sin embargo, inhibe la de VEGF autocrino endotelial.

Autor: SILLES MCLANEY EDUARDO .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INS. INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS "ALBERTO SOLS".

Resumen: La aminopeptidasa I (API) de Saccharomyces cerevisiae es una enzima vacuolar que llega a este orgánulo por una vía de transporte vesicular diferente de la ruta secretora clásica. API se sintetiza en el citoplasma y es transportada a la vacuola en el interior de vesículas llamadas vesículas cvt o autofagosomas, según las condiciones metabólicas en que se encuentre la célula. El extremo amino terminal de la proteína API es determinante para su localización en estas vesículas. Para encontrar proteínas implicadas en este sistema de transporte, decidimos buscar aquéllas que interaccionaran in vitro con el extremo amino terminal de API, o in vivo, utilizando el sistema de doble híbrido. En el estudio in vitro se detectó la interacción de las chaperonas citosólicas de la familia de Hsp70, Ssa1p y Ssa2p, con la región amino terminal. Mediante el uso de un mutante portador de un alelo termosensible del gen SSA1 y carente del resto de3 los genes SSA, se pudo demostrar que la proteína Ssa1p es requerida in vivo para el transporte de API a la vacuola en un paso previo a la formación de las vesículas transportadoras. Utilizando el sistema de doble híbrido, confirmamos y caracterizamos la interacción entre API y una proteína, codificada por el gen YOL082w, entonces de función desconocida. El estudio del fenotipo de un mutante en dicho gen permitió demostrar la implicación de esta proteína, que se denominó Cvt19p, en la ruta de API a la vacuola. Los datos obtenidos nos permiten proponer que la proteína Cvt19p es necesaria para la carga selectiva de API en las vesículas cvt y en los autofagosomas.

Autor: DÍAZ GALLARDO MARTHA YADIRA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: El factor de transcripción GHF-1/Pit-1 regula el desarrollo y la expresión génica en tejido hipofisario. Este factor se caracteriza por tener tres dominios estructurales: un dominio transactivador y dos dominios de unión al ADN. La proteína Pit-1 se expresa en el lóbulo anterior de la glándula pituitaria durante todo la vida, y solamente en sistema nervioso central en etapas fetales. GHF-1 regula la expresión de los genes hipofisario GH, PRL y TSH beta. El objetivo principal de este trabajo fue identificar proteínas co-reguladoras que interaccionen con el factor de transcripción GHF-1. Para ello, se construyeron dos genotecas de gran calidad de ADNc de una línea celular hipofisaria, una fenoteca en fago, y la otra en vectores de expresión en levaduras. Se seleccionaron tres regiones del extremo N-terminal del factor transcripcional GHF-1 para utilizarse como proteína señuelo en el ensayo del doble híbrido en levaduras. Se identificaron más de 1600 clones positivos que interaccionan con algún subdominio de GHF-1 mediante el ensayo del doble híbrido. Se confirmó la interacción proteica in vivo entre las proteínas utilizadas como señuelo y las proteínas aisladas de las genotecas de 180 clones positivos. Se eliminaron clones repetidos e incompletos mediante los patrones de restricción enzimática. Posteriormente, se secuenciaron los clones positivos, y con la ayuda de programas presentes en internet se analizaron tanto las secuencias nucleotidicas como aminoacídicas de las proteínas aisladas por el ensayo del doble híbrido. Las proteínas aisladas fueron expresadas in vitro y, a continuación, se confirmó la interacción proteica in vitro e in vivo entre las regiones señuelo de GHF-1 y las proteínas aisladas de las genotecas de hipófisis y de cerebro. Mediante la técnica del doble híbrido, identificamos diversas proteínas que interaccionan con las regiones STA, CHG y STA/CHG de GFH-1, que no habían sido descritas: * TRABID, esta proteína fue aislada de la genoteca de hipófisis y se caracteriza por tener tres dominios estructurales denominados dedos de zinc. * Cathepsina L, es una proteína con actividad de ubiquitinación por lo que proponemos que podría ser una proteína co-reguladora de GHF-1. * La proteína Unc5H2 se identificó a partir de la genoteca de cerebro, es un receptor de membrana y hasta el momento no es posible asignarle un papel importante en su interacción con el factor transcripcional GHF-1. * Se identificó una hsp90 aislada de la genoteca de hipófisis, sugerimos que podrían existir complejos proteícos hsp90/TR/GHF-1 o hsp90/RXR/GHF-1. Otros mecanismos alternativos de esta proteína hsp90 serían: participar en el transporte de GHF-1 al núcleo, por su actividad de ubiquitinación podría participar en la descondensación de la cromatina activando la transcripción de los promotores a los que este unido con GHF-1. También, se identificó a la proteína Rhes, y proponemos que puede existir un complejo entre TR/GHF-1/Rhes.

Autor: DÍAZ CASTILLO CARLOS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UAM).

Resumen: El vuelo es el medio de locomoción a través del aire que algunos animales han adquiridos. La consecución de esta función en los insectos ha conllevado una serie de adaptaciones. Por un lado se ha generado una estructura par que media la propulsión del insecto a través del aire: el ala. La segunda adaptación supone la modificación de una estructura ya existente, el músculo que permite los diversos movimientos de las alas, y con ello el vuelo. Varios son los laboratorios que están intentando desentrañar el proceso de adaptación que el músculo ha sufrido para permitir el vuelo. La modificación que más ha llamado la atención entre los científicos, ha sido la de la activación por estiramiento, que supone un escape del control de la contracción via Ca2+. El sistema modelo más utilizado ha sido la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster. Este animal lleva siendo utilizado casi cien años como sujeto de investigación, y sus ventajas sobre todo a nivel genético, hacen que sea una modelo ideal. Durante la realización de esta tesis, nuestro propósito ha sido el de conocer los procesos que han llevado a la adaptación muscular al vuelo, fijándonos para ello en uno de los elementos sarcoméricos: la Troponina C. Este es el elemento del filamento fino responsabilizando del control de la regulación mediante la unión de los cationes Ca2+. Además de avanzar en la caracterización de los genes previamente descritos, nosotros hemos encontrado un nuevo gen que codifica para la Troponina C en Drosophila melanogaster. Por otro lado, hemos desarrollado un método de purificación y hemos producido una serie de anticuerpos policlonales, que nos ayudarán en el futuro a avanzar en la caracterización de las distintas isoformas de la Troponina C. Mediante la comparación de algunas cualidades de los genes y las proteínas para las que codifican, hemos intentado conocer mejor los procesos que han llevado a la consecución de estos cuatro genes y como esto puede haber contribuido a la adaptación muscular al ejercicio del vuelo.

Autor: CEREZO MONTEMAYOR ANA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: GERMAN CANCER RESEARCH CENTER.

Resumen: El objetivo principal del presente estudio ha sido la caracterización de algunos de los principales mecanismos que regulan la proliferación y la actividad telomerasa en células epidérmicas. En particular se ha analizado la respuesta de queratinocitos HaCaT al Factor de Crecimiento Transformante-Beta1. Asimismo, se ha estudiado la función que desempeñan la regulación de la proliferación y de la actividad telomerasa, así como la señalización a partir del receptor de TGF-beta1, en el proceso de diferenciación epidérmica in vitro. A partir de los resultados obtenidos se describe la existencia de diferentes vías de señalización a partir del receptor de TGF-beta1, que conducen a la parada del ciclo celular, la inhibición de la actividad telomerasa y la regulación de la diferenciación de células epidérmicas. La reducción de los niveles de la proteína c-Myc es fundamental para el bloqueo del ciclo celular, aunque también se requiere la inducción de las proteínas p15 y p21. Mediante el análisis de células HaCaT transfectantes, que sobreexpresan Smad7 (HaCaT-Smad7), se pudo determinar que la activación de la cascada de Smad, iniciada con la fosforilación de la proteína Smad2, no interviene en la regulación de los niveles de c-Myc, pero es necesaria para la inducción de p15 y p21. El trabajo describe, además, la inhibición de la actividad telomerasa por parte de TGF-beta1. Por una parte, la transcripción del gen hTERT depende en gran medida de los niveles de la proteína c-Myc, lo cual se pudo comprobar mediante el análisis de transfectantes HaCaT que expresan c-Myc de manera constitutiva (HaCaT-myc). De manera adicional, en este trabajo se describe un mecanismo novedoso de regulación de la actividad telomerasa mediante la regulación, reversible, del splicing alternativo del pre-mRNA de hTER por parte de TGF-beta1. Durante el proceso normal de estratificación y diferenciación epidérmicas se observa una inhibición de la proliferación y la actividad telomerasa. Por esta razón se ha estudiado la capacidad de diferenciación in vitro de células HaCaT, HaCaT-myc, HaCaT-Smad7, o HaCaT que sobreexpresan hTERT (HaCaT-TERT), en cultivos organotípicos tridimensionales. Las células HaCaT-myc y HaCaT-TERT mostraron una capacidad menor de estratificación en cultivos organotípicos. Sin embargo, mientras que la expresión constitutiva de c-Myc no interfiere de manera significativa con la expresión de marcadores de diferenciación epidérmica, los epitelios formados por células HaCaT-TERT mostraron una morfología característica de células indiferencias, así como una expresión reducida de marcadores de diferenciación. Las células HaCaT-Smad7, en las que la cascada de señalización de Smads se encuentra bloqueada, formaron epitelios hiperplásicos, que además mostraron graves alteraciones en la polaridad, organización y expresión de marcadores epidérmicos de diferenciación. De todo esto se ha concluído la necesidad de una vía de señalización intacta a partir del receptor de TGF-beta, así como el control estricto de la proliferación y de la actividad telomerasa para la adecuada estratificación y diferenciación de células epidérmicas in vitro.

Autor: PAÑEDA VÁZQUEZ-PRADA COVADONGA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La metionina adenosiltransferasa es un enzima fundamental para el metabolismo de la metionina y cataliza la síntesis de S-adenosil-metionina a partir de metionina y ATP. Hay dos isoenzimas de la MAT, la MAT 1A que se expresa en el hígado adulto y la MAT 2A que es de expresión ubicua. Durante la regeneración hepática hay un cambio en el patrón de expresión de las isoenzimas, en este trabajo se ha estudiado el efecto de las citoquinas y factores que regulan la regeneración hepática sobre la expresión de las isoenzimas de la MAT. Los resultados de este trabajo muestran que la IL-6, el TNF-a y la ceramida, un mediador de la acción del TNF-a disminuyen la expresión de la MAT 1A, mientras que los factores de crecimiento como el HGF yla insulina aumentan la expresión de 1a MTA 2A en células hepáticas. Por último se ha estudiado el efecto del tratamiento con AdoMet, un conocido hepatoprotector, sobre la regeneración hepática y sobre la regeneración hepática precedida de isquemia-reperfusión. Los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento con AdoMet tiene efectos beneficiosos sobre la regeneración hepática sólo si hay un daño hepatocelular previo a la regeneración.

Autor: CALANDRIA PÉREZ CARLOS MARIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: Para profundizar en el estudio de la citoxicidad producida por la expresión de las proteasas 2A y 3C del virus de la polio, hemos analizado la muerte celular provocada por la expresión de estas proteasas. Para ello, hemos utilizado clones de células HeLa que expresan de forma inducible y dependiente de tetraciclina las proteasas virales mediante el sistema Tet-Off. Mediante el análisis de algunas alteraciones morfológicas y bioquímicas que se producen en las células después de la expresión de las proteasa virales, pudimos concluir que la expresión inducible de estas proteasas de virus de la polio inducen una respuesta apoptótica en células HeLa dpendiente de caspasas. La diferencia más importante que encontramos fue la cinética de aparición de los distintos cambios característicos de apoptosis: en las células que expresan 3C estos cambios se apreciaban más tarde. Además hemos estudiado el efecto de la expresión de estas proteasas sobre la síntesis de macromoléculas. En particular el efecto de la proteasa 2A sobre la síntesis de proteínas y el de la 3C sobre la transcripción celular. En este caso se reforzó la opinión existente que implica a la proteasa 2A en la inhibición de la traducción dependiente de cap, y a la 3C en la inhibición de la transcripción celular, ambos efectos encontrados en la infección con el virus de la polio.