BIOQUIMICA MOLECULAR, 22

Autor: ABAD MINGUEZ JOSE LUIS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UAM.

Resumen: En este trabajo se describe la construcción y caracterización de una nueva familia de vectores retrovirales derivados del virus de la leucemia murina (Mo-MLV). Todos ellos se han generado con el objetivo final de ser empleados en el desarrollo de protocolos pre-clínicos de Terapia Génica Somática, y de poder obtener, de forma rápida y eficiente, pequeños lotes de las partículas virales correspondientes para su evaluación preliminar. Esto se consigue mediante el uso del sistema de empaquetamiento transitorio, utilizando la linea celular 293T, puesto a punto en el laboratorio durante el transcurso de esta Tesis. El esquema de expresión de los vectores atiende a una estrategia bicistrónica, donde tanto el gen de interés (terapéutico) como el correspondiente marcador de selección se encuentran bajo el control del mismo promotor (LTR), y se co-expresan gracias a la inserción de una secuencia de entrada del ribosoma (IRES) localizada entre ambas unidades. Se han construído cuatro vectores distintos, utilizando marcadores de selección independientes (LacZ, AhNGFR, AhGHR y EGFP). Todos ellos son útiles en distintas fases del desarrollo de los protocolos pre-clínicos. La nueva familia de vectores se ha contrastado tanto en lo relativo a eficiencia de empaquetamiento y capacidad para infectar células primarias murinas y humanas, estabilidad de la expresión y bioseguridad. Tras la evaluación de las nuevas herramientas desarrolladas, éstas se utilizaron para abordar el modelo funcional que ha sido objeto central de esta Tesis: Inhibición funcional de la expresión en superficie de la molécula CCR5, un receptor de quimioquinas, con especial dedicación al modelo de infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1). Se diseñaron, construyeron y evaluaron varias construcciones con potencial de inhibición atendiendo a distintos mecanismos. Inicialmente se ensayaron en sistemas celulares mediante ensayos de co-transfección y posteriormente se clonaron en un miembro de la familia de los vectores retrovirales anteriormente desarrollados. Estas construcciones se estudiaron en líneas celulares modelo y posteriormente en células primarias humanas obtenidas de sangre periférica de donantes sanos. Varias de las construcciones han demostrado una sustancial capacidad para inhibir la expresión de CCR5 en todos los modelos ensayados. Existe una buena correlación entre la disminución de los niveles de CCR5 alcanzados y la protección de las células frente a la entrada y replicación de cepas R5 de HIV-1.

Autor: BARRADAS SOLAS MARTA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La mayoría de esta tesis doctoral recoge la caracterización de la respuesta antiproliferativa inducida por el oncogén ras en fibroblastos primarios humanos. En concreto, se ha llevado a cabo el estudio de tres aspectos diferentes de la misma: la regulación transcripcional del gen p16 humano, mediador importante de esta respuesta, las vías efectoras de las proteínas Ras mediadoras de la respuesta antiproliferativa y la identificación de nuevos genes inducidos de manera específica con la senescencia prematura inducida por Ras. Además como último apartado se incluye el aislamiento y caracterización de un nuevo gen, al que hemos denominado Ris1 (Ras-induced-senescence 1), cuyas características especiales son: 1,- Su inducción de manera específica con la senescencia prematura inducida por Ras, considerándose hasta el momento el único marcador específico de esta respuesta antitumoral de las células primarias. 2,- Sus características que le hacen buen candidato a gen supresor de tumores, entre las que se incluyen su localización cromosómica en zona 3p21.3 que posee una alta frecuencia de LOH y la reducción de su expresión en algunos tipos determinados de tumores. Como resumen de este trabajo se pueden concretar las siguientes aportaciones del mismo al campo objeto de este estudio: * La identificación de los complejos DNA-proteína específicos en el promotor humano del gen p16. La abundancia de uno de estos complejos, el denominado complejo 2, correlaciona con los niveles de expresión constitutiva de la proteína p16 en todos los casos analizados. La eliminación por mutación del complejo 2 disminuye drásticamente la actividad del promotor. Estos resultados indican la importancia de este complejo en la regulación transcripcional de p16. * Se ha demostrado que la activación de las MAPK es necesaria y suficiente para la inducción de senescencia prematura por Ras en células primarias, aunque no excluye la participación de otras vías. * Hemos identificado un marcador altamente específico de la senescencia inducida por Ras, que hemos denominado Ris1. * Se han obtenido evidencias que sugieren que Ris1 podría ser un gen supresor de tumores. Su localización en la región CER1 de 3p21.3, su expresión disminuida en determinados tipos de tumores y estudios preliminares que indican que la sobreexpresión de Ris1 induce una respuesta antiproliferativa, señalan a Ris1 como un gen supresor de tumores implicado en respuestas antioncogénicas.

Autor: AJO RAMOS ROCÍO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL CARLOS III (MADRID).

Resumen: Los mecanismos que controlan la diferenciación y desarrollo del Sistema Nervioso Central no están claramente establecidos. Un área de interés y poco conocida es la implicación del sistema GH-IGF-I en el desarrollo cerebral. A pesar de la identificación del receptor de hormona de crecimiento (GHR) y su ARNm en hemisferio cerebral de rata y otras zonas del sistema nervioso central (SNC), su papel fisiológico como factor neurotrófico en el mismo no está establecido. El objetivo fundamental de este trabajo es estudiar las acciones neurotróficas que la hormona de crecimiento (GH) pudiera ejercer en el desarrollo del SNC, analizar la posible implicación de IGF-I como mediador de sus acciones y dilucidar la vía de señalización predominante en las acciones biológicas de GH. Para ello se han empleado células cerebrocorticales de feto de rata procedentes de los días fetales E14 y E17 y se han llevado a cabo estudios de proliferación, diferenciación, prevención de apoptosis y de señalización intracelular. Para todos los estudios se ha utilizado hormona de crecimiento recombinante humana que tiene 100% de acción biológica en rata. Los resultados obtenidos demuestran que: 1,- GH ejerce una acción potente sobre la proliferación de células cerebrocorticales fetales de rata en cultivo primario mixto. Ello se demuestra mediante contaje celular, cuantificación de PCNA, incorporación de Timidina-3H e incorporación de BrdU. Esta acción ocurre a dosis críticas siendo más intensa en concentraciones fisiológicas. 2,- La hormona de crecimiento induce una potente acción proliferativa sobre células precursoras y neuronales procedentes del día E14 y sobre células gliales procedentes del día E17. Ello evidencia la acción de GH en los distintos momentos cronológicos de la neurogénesis y gliogénesis en cerebro de rata. 3,- La hormona de crecimiento promueve la diferenciación de células precursoras cerebrocorticales fetales de rata a células que expresan marcadores y características fenotípicas específicas de células gliales y neuronales. Esta acción es mas intensa a dosis crítica de 50 mg/ml, levemente superior a las concentraciones fisiológicas. 4,- GH ejerce una acción potentee sobre la prevención de apoptosis en células cerebrocorticales fetales de rata del día E17 en cultivo primario mixto, siendo mucho mas intensa esta acción en concentraciones fisiológicas de GH. 5,- La hormona de crecimiento induce un aumento en la expresión de IGF-I en células cerebrocorticales fetales de rata en cultivo. Esta acción se observa también sobre la síntesis de IGFBP-3, y esta acción ocurre con un perfil lineal de relación dosis-respuesta. 6,- GH induce un aumento en la síntesis y fosforilación de la subunidad beta del receptor de IGF-I, indicando su efecto sobre la activación funcional de este receptor. 7,- La hormona de crecimiento señaliza sus acciones proliferativa, diferenciadora y preventiva de apoptosis a través de la acción predominante de las vía de señalización MAP-quinasa en células cerebrocorticales fetales de 17 días de edad embrionaria en cultivo primario mixto. 8,- GH es capaz de aumentar la fosforilación de ERK 1/2 de forma persistente. La fosforilación de la subunidad reguladora de PI3-quinasa p85 está ligeramente aumentada de forma persistente, lo que sugiere que esta vía podría tener alguna función en la proliferación, diferenciación y prevención de apoptosis, en células cerebrocorticales de feto de rata del día E17 en cultivo primario mixto. Todo ello confirmaría que la vía predominante sería ERK/MAP quinasa. 9,- Las acciones de GH sobre las prolieferación, diferenciación y prevención de apoptosis en el cerebro fetal de rata están mediadas por IGF-I o por la interacción IGF-BP3.

Autor: DIEZ DIEZ MIGUEL ANGEL.
Año: 2001.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Los datos presentados en esta tesis muestran como la introducción del transgén de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 humana (hBcl-2) en ratones C57BL/6, dirige selectivamente su expresión a todos los estadios de la diferenciación de los linfocitos B. Esta hiperexpresión de hBcl-2 prolonga la vida media de estas células, pero no parece afectar a algunas de sus funciones fisiológicas, como son su respuesta frente a antígenos T-dependientes o la maduración del grado de avidez de los anticuerpos. Sin embargo, provoca un marcado incremento de los niveles séricos de IgA, incluso con especificidades autorreactivas. La inhibición de la apoptósis de las células B de los ratones transgénicos de hBcl-2 no provoca respuestas autoinmunes en ratones normales, como los de la cepa C57BL/6, pero cuando se cruzan con ratones pro-autoinmunes (NZW o BXSB) se desencadena una enfermedad autoinmune severa con producción de múltiples auto-anticuerpos, alteraciones a nivel de los glomérulos renales con depósito de inmunocomplejos predominantemente de IgA e IgM y aceleración de la mortalidad. El análisis de los mecanismos celulares implicados en la producción de auto-Acs con actividad factor reumatoide, mediante construcción de dobles quimeras, sugiere que la activación de las células B autorreactivas en los animales transgénicos de hBcl-2 se debe a una colaboración mediada por linfocitos T autorreactivos asociados al fondo génico pro-autoinmune de los ratones NZW o BXSB. La implicación de los linfocitos CD4+ en la activación de las células B hBcl-2+ se manifiesta con la prevención de las manifestaciones autoinmunes, tanto serológicas como anatomopatológicas, tras el tratamiento de estos ratones con el anticuerpo monoclonal GK1.5 que induce la eliminación de las células.

Autor: AJENJO DÍEZ NURIA .
Año: 2001.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En esta tesis se ha analizado el papel de la actividad ERK (Extracellular-signal regulated Kinase) en la regulación de los fenómenos de proliferación, diferenciación y apoptosis en el contexto de la leucemia mieloide. La vía de señalización Raf/MEK/ERK que conduce a la activación de las proteínas ERK1 y ERK2 se ha revelado como un elemento clave en el control de estos procesos celulares. Sin embargo, el efecto concreto de la actividad ERK es dependiente del contexto celular. En este trabajo se han utilizado varias líneas celulares derivadas de leucemia mieloide. Se analizó el estado de activación de ERK en estas líneas proliferando o bajo estimulación mitogénica y en estado quiescente. Por otra parte, se estudió el efecto de varios agentes diferenciadores utilizados en terapia antileucémica sobre la actividad ERK de las diversas líneas celulares. Además se estudió el requerimiento de ERK durante la proliferación y diferenciación mieloides utilizando un fármaco inhibidor de la ruta ERK y un mutante inhibitorio de ERK que es catalíticamente inactivo, con el que se obtuvieron líneas transfectantes estables. Utilizando vectores de expresión que portaban distintas versiones activadas constitutivamente de MEK o ERK, se obtuvieron líneas trasnfectantes estables en las que se analizó el efecto de una activación constitutiva de ERK en la proliferación, diferenciación y supervivencia frente a estímulos apoptópicos. Se comprobó que la proliferación y diferenciación de células de leucemia mieloide son independientes de la actividad ERK. Sin embargo, la activación constitutiva de ERK generó una señal de supervivencia ante distintos estímulos apoptóticos. La localización de la actividad ERK, citoplásmica o nuclear, parece ser importante para la protección.

Autor: GARCILLÁN BARCIA M. PILAR.
Año: 2001.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CANTABRIA.

Resumen: Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que los intermediarios circulares de dsDNA de IS91 son intermediarios funcionales en el proceso de transposición de esta secuencia de inserción. Se ha demostrado que los residuos de tirosina Y249 y Y253 de la transposasa de IS91, que son análogos a los residuos catalíticos de la proteína iniciadora de la replicación por círculo rodante del fago 0X174, son esenciales en el proceso de transposición de esta secuencia. Estos residuos resultan imprescindibles tanto para el paso de producción de intermediarios circulares de ssDNA y dsDNA de IS91 como para la integración de los mismos, pero desempeñan roles funcionales diferentes en la reacción. También ha quedado demostrado que la transposasa de IS91 es capaz de reconocer un conjunto de tetranucléotidos adyacentes a la secuencia ori91 mayor que el reportado hasta el momento. Sin embargo, el reconocimiento de la secuencia blanco en el recipiente continúa siendo extremadamente específico por las secuencias 5'CTTG y 5'GTTC. La conversión de los intermediarios circulares de ssDNA en dsDNA debe transcurrir por un mecanismo de primado no dependiente de la RNA polimerasa. Se analizó también la distribución de isoformas de la familia de IS91, así como las implicaciones ecológicas de su transposición monoterminal como medio de diseminación de genes relacionados con la virulencia y patogenicidad. Por otra parte, se ha estudiado la influencia de la complementariedad entre las secuencias núcleo y núcleo invertido de los casetes de genes en la tasa de integración y escisión de los mismos, poniendo a punto ensayos de integración y escisión de casetes.

Autor: LLANO CUADRA ELENA .
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Las metaloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) o matrixinas constituyen una familia de Zn-endopeptidasas estructuralmente relacionadas que median la degradación de los diversos componentes de la matriz extracelular y membranas basales. Estos enzimas proteolíticos participan en una serie de procesos de remodelación tisular que ocurren en condiciones fisiológicas tales como el desarrollo embrionario, la osificación fetal, la angiogénesis o la cicatrización de heridas (Birkedal-Hansen y col., 1995). Además, la expresión anormal de estos enzimas se ha asociado con los procesos degradativos que acompañan condiciones patológicas como la artritis, la aterosclerosis, el enfisma pulmonar y la invasión metastática tumoral (Stetler-Stevenson y col., 1993). Actualmente, la familia de las MMPs se compone de 24 miembros que, atendiendo a su estructura primaria, su especificidad de sustrato y su localización celular pueden clasificarse en cuatro principales subfamilias: colagenasas, gelatinasas , estromelisinas y MMPs de membrana (MT-MMPs) (Birkedal-Hansen y col., 1995; Stetler-Stevenson y col., 1993; Gururajan y col., 1998; Velasco y col., 1999); otras MMPs como la estromelisina-3 ó la macrófago metaloelastasa tienen características propias que las distinguen de los grupos anteriores (Birkedal-Hansen y col., 1993). En la presente tesis doctoral hemos intentado aproximarnos al conocimiento de la función y la relevancia que tienen las metalproteasas de matriz extracelular (MMPs) en los procesos fisiológicos y de desarrollo que acontecen en todos los organismos. En este contexto, se han identificado y caracterizado estructural y enzimáticamente tres nuevas metaloproteasas de matriz extracelular humanas; la MMP-19, la MMP-20 y la MT5-MMP o MMP-24. Todo ello con el fin de completar el sistema proteolítico de las MMPs, paso clave para poder entender de forma global la función in vivo de este sistema. En el caso de la MMP-19, además, se han llevado a cabo estudios funcionales más exhaustivos mediante la generación de ratones mutantes deficientes en esta proteasa. Por otro lado y de forma paralela, se abordó la caracterización de miembros de esta familia en el organismo modelo Drosophila melanogaster con el fin de resolver las implicaciones de este sistema proteolítico durante sus procesos de desarrollo y posteriormente intentar extrapolar los resultados obtenidos al sistema humano. En este sentido, se han caracterizado estructural y enzimáticamente las dos únicas metaloproteasas de matriz extracelular presentes en el genoma de Drosophila.

Autor: RODRÍGUEZ GONZÁLEZ RENE.
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El TNF puede inducir tanto la muerte como la proliferación celular según el tipo celular y las distintas condiciones ambientales. En el presente trabajo se aborda el estudio de ambos efectos en un mismo tipo celular, los fibroblastos murinos no transformados NIH 3T3. Estas células no son sensibles al efecto tóxico del TNF a menos que se encuentre inhibida la expresión génica. Así, el tratamiento con TNF en presencia de actinomicina D (Act-D) induce un mecanismo apoptótico en el que la mitocondria es esencial. La inhibición general de las caspasas provoca el cambio a un mecanismo necrótico. En células sincronizadas en fase G0, el TNF induce la síntesis de ADN; sin embargo, simultáneamente provoca la muerte de las células que no pueden proliferar. Los factores de crecimiento del suero evitan la aparición de este efecto tóxico. La muerte celular inducida por TNF y Act-D se produce en todas las fases del ciclo celular y la parada en distintos puntos del ciclo sensibiliza las células al efecto tóxico del TNF, eliminando el requerimiento de Act-D. Las señales apoptóticas inducidas por el TNF en células paradas en fase G1/S son análogas a las inducidas en células no sicronizadas por TNF y Act-D excepto que la pérdida de potencial mitocondrial es más tardía en las primeras.

Autor: RODRÍGUEZ NIETO SALVADOR.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: El trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral persigue cubrir los siguientes objetivos: 1,- Puesta en marcha y validación de una bateria de técnicas in vitro e in vivo para detectar y caracterizar inhibidores de angiogénesis. 2,- Caracterización de la actividad de nuevos inhibidores de angiogénesis empleando los procedimientos experimentales puestos en marcha y validados. Los resultados recogidos en la presente Memoria, permiten enunciar las siguientes conclusiones: 1,- La batería de pruebas puesta en marcha permite seleccionar potenciales inhibidores de la angiogénesis y caracterizar su efecto modulador sobre las diversas etapas de la misma. 2,- Se ha demostrado que la aeroplisinina-1 es un potente inhibidor de la angiogénesis en modelos in vivo y, específicamente, de diversas etapas de la angiogénesis simuladas mediante modelos in vitro, obteniéndose valores de inhibidores menores o igulaes que los publicados para otros compuestos descritos como inhibidores de angiogénesis.

Autor: RODRÍGUEZ OLIVERA ELÍAS.
Año: 2001.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El metabolismo aeróbico del ácido fenilacético y del ácido 4-hidroxifenilacético en Pseudomonas putida U tiene lugar mediante dos rutas metabólicas diferentes. El ácido 4-hidroxifenilacético es degradado en P.putida U mediante una serie de reacciones encaminadas a la formación de un intermediario dihidroxilado (ácido homoprotocatéquico) que sufrirá la apertura del anillo aromático y la posterior transformación en intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ácido fenilacético es degradado por P.putida U a través de una nueva ruta catabólica en la que el primer evento de la secuencia de degradación va a ser la esterificación del ácido fenilacético con CoA para dar lugar a fenilacetil-CoA. Se han caracterizado los genes que codifican las funciones necesarias para la degradación del ácido fenilacético. Estos genes (15) están incluidos en un segmento de DNA de 18 kb y están organizados en tres operones catabólicos consecutivos. Adicionalmente, asociados con los operones catabólicos aparecen dos genes reguladores. Los genes catabólicos codifican las siguientes unidades funcionales: 1,- Un sistema responsable de la incorporación celular de ácido fenilacético (PaaL y PaaM). 2,- Una enzima que activa este compuesto a su CoA derivado (PaaF). 3,- Un sistema responsable de la hidroxilación del anillo aromático del fenilacetil-CoA (PaaGHIJK). 4,- Una proteína responsable de la apertura del anillo (PaaN). 5,- Un sistema de beta-oxidación (PaaABCE). Los genes reguladores están constituidos por paaX, que codifica una proteína que actúa como represor de la ruta degradativa y que reconoce específicamente al fenilacetil-CoA como molécula desrepresora de la ruta, y paaY, que codifica una proteína reguladora que aún no ha sido caracterizada completamente. Se define el concepto de catabolón como una unidad catabólica compleja integrada por diferentes rutas degradativas, implicadas en el catabolismo de diferentes moléculas que convergen todas ellas en una ruta central, denominada núcleo del catabolón y que están, o pueden estar, reguladas de formas coordinada. De este modo, el catabolón del fenilacetil-CoA está compuesto por el conjunto de reacciones periféricas que van a transformar compuestos como el ácido fenilacético, la feniletilamina, el fenilacetaldehído, los ácidos n-fenilalcanoicos con un número par de átomos de carbono, los poli-3-hidroxifenilalcanoatos sintetizados a partir de estos ácido sy el ácido trans-estirilacético en fenilacetil-CoA, así como por la serie de reacciones que permitirán la transformación del fenilacetil-CoA en metabolitos generales. Se han encontrado genes ortólogos a los que codifican la ruta de degradación del ácido fenilacético en condiciones de aerobiosis en P.putida U, en distintas bacterias pertenecientes a grupos taxonómicamente diversos, lo que demuestra la amplia distribución de esta ruta catabólica entre las bacterias.

Autor: SALINERO HERNÁNDEZ JOSÉ.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GRANADA (FACULTAD DE MEDICINA).

Resumen: Se ha realizado estudio de la expresión de moléculas HLA y de adhesión en el cáncer epidermoide de laringe, cuyos valores se ha correlacionado con factores clínicos e histopatológicos. Apoyado en un tratamiento estadístico, con los resultados obtenidos se trata de determinar que tipo de alteraciones de dichas moléculas inciden en el comportamiento biológico del tumor. Encontramos datos significativos tanto en la pérdida de expresión de moléculas HLA clase I, como en la pérdida de expresión de la molécula ICAM-1 y su asociación con la producción de metástasis ganglionares regionales como indicador de mayor agresividad tumoral junto con parámetros como localización tumoral, grado de diferenciación y fibrosis.

Autor: LLAMAS LORENTE MARIAN.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN (CSIC).

Resumen: El género Pseudomonas engloba a una amplia variedad de microorganismos, miembros comunes de la microbiota del suelo y del agua, que se caracterizan entre otros aspectos por presentar flagelos de inserción polar y por mostrar una gran versatilidad metabólica, gracias a la cual pueden colonizar una gran diversidad de ecosistemas. Así, por ejemplo, dentro de este género existen bacterias patógenas de animales y de plantas, baceterias que colonizan la rizosfera de plantas potenciando el crecimiento de éstas a través de un conjunto de efectos antagonistas contra posibles agentes patógenos, fundamentalmente hongos, bacterias y de ambiente acuáticos. También existen muchas cepas tolerantes a disolventes orgánicos, de gran interés en procesos de biodegradación de compuestos contaminantes y en procesos de biotransformación para la obtención de productos de valor añadido. Dado que el contacto entre una célula bacteriana y su entorno tiene lugar a través de estructuras de la superficie celular, el estudio de la organización y la función de los distintos elementos que componen la envoltura celular es uno de los aspectos importantes para comprender como las bacterias del género Pseudomonas son capaces de colonizar nichos ecológicos tan variados. Este trabajo se ha centrado en la construcción y caracterización de cepas mutantes en los genes del sistema proteico de membrana Tol-OprL de P.putida KT2440, y en el análisis de su expresión génica, con objeto de dilucidar la función que este complejo proteico de membrana desempeña en P.putida. El sistema Tol-IprL de Pseudomonas putida es un complejo multiproteico formado por tres proteínas de membrana interna (TolQ, TolR y TolA), dos proteínas periplásmicas (TolB y Orf2), una proteína de la membrana externa (OprL) y una proteína citoplásmica (Orfl). A pesar de que este sistema proteico está conservado en un gran número de bacterias gram negativas sus funciones fisiológicas aún no se han dilucidado por completo. Con tal fin, se construyeron una serie de mutantes presentaron una morfología celular alterada, una mayor sensibilidad a detergentes y antibióticos, y liberaron enzimas periplásmicos al medio extracelular. Además, su capacidad de crecimiento en medio mínimo con diferentes fuentes de carbono también resultó afectada. El análisis del transporte de distintos compuestos indicó que los mutantes tol-oprL presentaban un defecto en el transporte a nivel de la membrana interna. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia del sistema Tol-OprL en el mantenimiento de la envoltura celular.

Autor: VALDERRAMA MARCOS JOSÉ FRANCISCO .
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Resumen: INTRODUCCIÓN Tanto el ejercicio físico como el entrenamiento inducen respuestas y adaptaciones sobre los principales sistemas de la economía humana. La exposición aguda a la altitud produce cambios sobre el organismo. Ambos factores pueden hacer variar los resultados en las pruebas bioquímicas de rutina. El entrenamiento en altura es cada día más habitual entre los deportistas de élite siendo el CAR sierra Nevada un lugar idóneo para llevarlo a cabo. OBJETIVOS 1,- Determinar los intervalos de referencia para glucosa, urea, creatinina, ácido úrico, sodio, potasio, cloro, calcio, fósforo, colesterol, triglicéridos (TG), bilirrubina total, bilirrubina directa, amilasa, fosfatasa alcalina (ALP), CPK, GOT, GPT, GGT, LDH, albúmina, proteínas totales, magnesio y hierro en deportistas de élite sometidos a exposición aguda a la altitud moderada. 2,- Estudiar el perfil antropométrico y la distribución por sexo, edad y deporte practicado de la población a estudio. 3,- Comprobar si existen diferencias entre los diferentes deportes que justifiquen unos intervalos de referencia específicos para cada una de las especialidades deportivas practicadas. MATERIAL Y MÉTODO Se estudiaron 24 parámetros bioquímicos en 367 deportistas de élite sometidos a exposición aguda a la altitud (48-72 horas), sin patología conocida, y usuarios del CAR Sierra Nevada, distribuidos en tres grupos de edad ( 18 años), empleando para ello un autoanalizador Hitachi 917 así como los reactivos y calibradores distribuidos por la firma Roche. Tras la extracción de la muestra y centrifugación a 3000 rpm durante 10' se extrajo el suero para su congelación y transporte al laboratorio del Servicio de Bioquímica del H. Clínico Univ. S. Cecilio de Granada donde en menos de 24 horas se procedió a su análisis. RESULTADOS Se han observado las diferencias estadísticamente significativas en todas las pruebas realizadas, con excepción de la amilasa, la GPT y el magnesio. Hay diferencias estadísticamente significativas entre las medidas de los deportes estudiados. La natación es el deporte más practicado con un 43% del total de la muestra. CONCLUSIONES 1,- Los factores analizados modifican los valores de todas las pruebas realizadas, con excepción de la amilasa, la GPT y el magnesio. 2,- Recomendamos el uso de los intervalos de referencia propuestos en este estudio en centros de alto rendimiento en altitud moderada. 3,- El perfil antropométrico de la muestra de referencia no difiere significativamente de la población general de nuestra región para una misma edad estudiada. 4,- Predeominan los varones excepto en la edad pediátrica donde el sexo femenino es más numerosos. Conforme aumenta la edad se incrementa el número de deportistas que acuden al CAR Sierra Nevada. La natación es el deporte más practicado, por delante del ciclismo. 5,- No encontramos fundamentos objetivos para recomendar la utilización de diferentes intervalos de referencia en los distintos deprotes analizados para las pruebas bioquímicas realizadas en este estudio.

Autor: CRUZ ZAMBRANO CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA CAMPUS BELLVITGE.

Resumen: La familia de proteínas HERC se caracteriza por la presencia de un dominio HECT, común a la subclase HECT de E3 ubiquitina-proteína ligasas, y uno o más dominios RLD, relacionado con el intercambiador de nucleótidos de guanina RCC1. La familia HERC consta de cuatro miembros en humanos. El primero, HERC1, está codificado por un gen que fue aislado durante la búsqueda de nuevos oncogenes. Durante el estudio de su posible actividad intercambiadora de nucleótidos de guanina se demostró una doble relación con el tráfico intracelular: por una parte, su dominio RLD1 es capaz de estimular la disociación de nucleótidos de guanina para GTPasas de la Superfamilia Ras implicadas en el tráfico vesicular (ARF1 y ciertas proteínas Rab); por otra parte, su dominio RLD2 puede interaccionar con las proteínas ARF1 y clatrina, una proteína de cubierta vesicular. En este trabajo se ha analizado la relación entre HERC1 y la endocitosis. Se ha comprobado la presencia de HERC1 en endosomas y la capacidad del dominio RLD1 de estimular la disociación de nucleótidos de guanina para ARF6, implicada en la endocitosis. Estos resultados sugieren un posible papel de HERC1 en la endocitosis a través de la regulación de ARF6. La proteína HERC3, de la cual no se disponía de ninguna información al iniciarse esta tesis doctoral, es el producto hipotético de una secuencia codificante que fue aislada mediante un procedimiento destinado a la búsqueda al azar de nuevos ADNc. En este estudio se han generado anticuerpos específicos contra los dominios RLD y HECT de HERC3 que han permitido comprobar una amplia expresión de esta proteína en distintos tipos celulares y tejidos. HERC3 se localiza mayoritariamente en citosol, aunque una pequeña proporción está asociada a membranas intracelulares, donde colocaliza con las proteínas vesiculares beta-COP, Rab5 y ARF. En los estudios realizados no s e ha podido detectar actividad intercambiadora de nucleótidos de guanina frente a distitnas GTPasas de la Superfamilia Ras. En cambio, la proteína HERC3 es capaz de interaccionar de forma no covalente con ubiquitina a través de su dominio carboxiterminal, lo que es compatible con un posible papel como E3 ubiquitina-proteína ligasa. Por último, HERC3 parece estar fuertemente regulada por poliubiquitinación en distintas regiones y posterior degradación por el proteasoma. Adicionalmente, este trabajo incluye la localización cromosómica del gen HERC1 en 15q22 y de HERC3 en 4q21, ambos muy próximos a sus homólogos HERC2 y HERC4, respectivamente, así como el análisis de su posible actividad oncogénica, que no se ha podido poner de manifiesto en este estudio.

Autor: VALDÉS ANGUES RAQUEL.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Se han caracterizado anticuerpos policlonales monoespecíficos contra las isoformas de los transportadores concentrativos de nucleósidos (CNT1 y CNT2) de rata, estudiándose su expresión, distribución tisular y aspectos diversos de su regulación en diferentes modelos celulares. El análisis de una gran variedad de situaciones fisiológicas y fisiopatológicas como la regeneración hepática, el desarrollo fetal y la heptogarcinogénesis ha permitido demostrar que estas proteínas de membrana presentan una regulación diferencial, específica de isoforma y tejido, en función de la proliferación y del grado de diferenciación y transformación celular. Del mismo modo existe un fuerte control nutricional, endocrino y por factores de crecimiento que permitiría la adaptación de las células a los diferentes requerimientos de nucleósidos, modulando de esta manera la bivasequibilidad a los diferentes fármacos derivados de esos substratos y utilizados frecuentemente en la terapias antivirales y antineoplásicas. Estas aportaciones se estan estudiando en la actualidad a nivel transcripcional, gracias a la clonación de un fragmento de 2kb correspondiente al promotor del gen murino de CNT2, que presenta una frente actividad basal y parece regulable por hormonas glucoconti-- como la dexametasona y por asequibilidad de substrato.

Autor: CAPILLA CAMPOS ENCARNACIÓN.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Los peces presentan altos requerimientos proteicos que han de estar contemplados en la dieta, lo que comporta un encarecimiento de los piensos y una contaminación del medio a causa de la excreta de productos nitrogenados, por lo que la substitución de esta proteína por otras fuentes de energía ha presentado un crecimiento interés en acuicultura. En la primera parte de esta tesis, se ha estudiado la utilización de los carbohidratos procedentes de fuentes vegetales en teleósteos con el propósito de encontrar dietas adecuadas que permitan la disminución de la harina de pescado en la formulación. Los estudios se realizaron con tres especies de peces de interés comercial con diferentes hábitos alimentarios como son: la trucha (Oncorhynchus mykiss), la carpa (Cyprinus carpio) y la dorada (Sparus aurata) y los parámetros analizados fueron aquellos que han estado descritos como posibles limitantes del metabolismo de la glucosa: niveles de insulina y glucosa en plasma, actividad de las hexoquinasas hepáticas y receptores de insulina en músculo esquelético. La ingesta de dietas ricas en carbohidratos proporcionó en las tres especies de peces un crecimiento adecuado, no obstante, según los hábitos alimentarios de estas especies, las respuestas encontradas en relación al contenido en almidón digerible fueron diferentes. En carpa (omnívora), y en menor grado en trucha (carnívora), se observó un aumento de la retención proteica, mientras que en la especie marina y carnívora, la dorada, se aumentaron las reservas de glicógeno hepático. La carpa gracias a una alta actividad hexoquinasa en el hígado fue capaz de mantener los niveles de glucemia estables independientemente del nivel de carbohidratos en la dieta, mientras que trucha y dorada presentaron unos niveles de actividad más altos en glucoquinasa. La actividad de este enzima parece que no está directamente regulada por los niveles de insulina en plasma pero si por los incrementos de glucosa postpandriales por la dieta. En general, el uso de estas dietas en estas especies es favorable, especialmente si la fuente de carbohidratos es el guisante. La glucosa entra al interior de las células a través de la membrana plasmática gracias a una familia de proteínas transportadoras denominadas GLUTs. En mamíferos y aves se han identificado diversos miembros de esta familia que se caracterizan por tener una distribución tejido-específica y unas características bioquímicas y funcionales determinadas. En vertebrados inferiores, el transporte de glucosa había sido estudiado en ciertos sistemas celulares pero las moléculas responsables de dicho transporte no habían sido identificadas. En la segunda parte de esta tesis, estas moléculas han sido identificadas y caracterizadas funcionalmente. Se ha demostrado por primera vez la existencia de transportadores de glucosa de difusión facilitada (GLUTs) en peces, clonados a partir de músculo rojo de trucha (Salmo trutta) y una librería de tejido adiposo de salmón (Oncorynchus kisutch). Estas proteínas, denominadas btGLUT y okGLUT4, presentan una homología de secuencia respecto el GLUT4 de mamíferos del 80% y contienen en su secuencia de aminoácidos motivos importantes para la funcionalidad y otros característicos de GLUT4. Se expresan principalmente en músculo esquelético blanco y rojo, en branquia y riñón. La expresión del ARNm de btGLUT en músculo rojo in vivo se ha demostrado que está regulada por los niveles de insulina circulante, incrementando significativamente cuando se aumentan los niveles de insulina en plasma tanto por una inyección de insulina como de arginina, y disminuyendo significativamente si los niveles de insulina son reducidos por ayuno o bien por la ingestión de una dieta baja en proteína y rica en carbohidratos. La expresión del GLUT4 en oocitos de Xenopus demostró que este transportador en peces es funcional, con una Km o constante de afinidad por la glucosa inferior a la que presentan los GLUT4 de mamíferos, pero siendo igualmente estereoespecíficos, inhiben de forma concentración-dependiente por etilidene glucosa y citocalasina B y estimulado significativamente por insulina. En conjunto, podemos concluir que los peces presentan en hígado una glucoquinasa inducible y en los tejidos sensibles a la insulina un transportador de glucosa de difusión facilitada homólogo al GLUT4 de mamíferos, resultados que demuestran que en absoluto estos son pasos limitante de la utilización de la glucosa en estos animales y que por lo tanto pueden adaptarse al consumo de dietas con un nivel de carbohidratos alto como las utilizadas en esta tesis.

Autor: FARRE VALLE LOURDES .
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En esta tesis se estudia como el órgano en el que se implanta el tumor en el modelo de ratón atímico influye el comportamiento tumoral para el cáncer de páncreas y colon comparando la implantación ortotópica con las implantaciones heterotópicas (subuitis, hígado y colon) de tumores páncreaticos se observa que el lugar de implantación modifica: * El crecimiento tumoral, regulando los procesos de apoptosis y ciclo celular. * La capacidad invasiva y metastásica y los contactos célula a célula a matriz extracelular, la implantación en el hígado y en el colón provocó un nuevo patrón de metástasis, no observado en el paciente del que derivaba el tumor. * La respuesta a los fármacos aplidina y 5-Fu comparando el modelo de implantación subcutania y ortotópica. La acción de los fármacos indujo la actuación de diferentes vías de transducción de señales o no projujo efecto según la localización de implantación del tumor. Se concluyó que el lugar de implantación en el modelo de ratón a-- influye el comportamiento de los tumores de pancreas y colon alterando sus vías de tranasmisión de señales. La respuesta a los fármacos aplidina y 5-Fu depende del modelo usado para analizarla y digiere de la observada in vitro.

Autor: GONZÁLEZ MIGUEL VÍCTOR MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAT DE QUÍMICA, UNIV. DE BARCELONA.

Resumen: La existencia de clones de cDNA de las diferentes unidades transcripcionales que dirigen la síntesis de las tres isoformas de esa enzima de Arabidopsis thaliana permitía intentar alterar los niveles de expresión de la actividad HMGR a fin de: 1,- Determinar si HMGR limita la síntesis de esteroles en plantas. 2,- Caracterizar los mecanismos que regulan la expresión génica y actividad HMGR en Arabidopsis. 3,- Determinar posibles diferencias entre las localizaciones subcelulares y respectivas funciones de las diferentes isoformas HMGR de Arabidopsis (HMGR1S, HMCR1L y HMGR2). Para ello, se generaron plantas transgénicas en las que los cDNA de las tres isoformas se colocaron bajo el control de un promotor fuerte y de expresión constitutiva (CaMV 35S). Asimismo, se generaron plantas diseñadas para intentar expresar los dominios catalíticos de HMGR1S y HMGR2, a fin de estudiar las posibles funciones reguladoras de los dominios hidrofóbicos que anclan estas proteínas al retículo endoplasmático, según se ha descrito en animales, plantas y levaduras. Se generó un número variable de líneas transgénicas independientes para cada una de las construcciones utilizadas y las diferentes líneas fueron llevadas hasta homozigosis. Entonces, un número representativo de líneas de cada construcción fue analizado: 1,- Mediante Nothern blot, para estudiar los niveles de expresión de los transgenes. 2,- Mediante Western blot, para analizar los niveles de acumulación de las proteínas expresadas. 3,- Mediante medidas de actividad HMGR. 4,- Mediante medida de los niveles de esteroles, utilizando cromatografía de gases. 5,- Mediante estudio de los fenotipos y análisis ultraestructural (microscopía electrónica de transmisión). 6,- Mediante técnicas de inmunocitoquímica. El resultado de estos materiales permitió concluir: 1,- La expresión de los genes HMG1 y HMG2 y los niveles de HMGR1S, HMGR1L y HMGR2 vienen regulados mediante mecanismos que actúan a nivel transcripcional y postranscripcional. Además, ambos genes responden muy probablemente a mecanismos de regulación diferencial. 2,- Los dominios de inserción a membrana de las tres isoformas intervienen en el control de los niveles de proteína HMGR en Arabidopsis, queizás en respuesta a acumulaciones de esteroles u otro tipo de isoprenoides cuya síntesis esas isodormas dirigen. Este resultado abre la posibilidad de establecer interesantes analogías con procesos ampliamente estudiados en animales y levaduras pero nunca antes descritos en plantas. 3,- HMGR limita efectivamente la síntesis de esteroles en plantas. El exceso de esteroles que las plantas transgénicas acumulan se almacenan preferentemente en forma de esteriléstres en el interior de vesículas lipídicas que derivan probablemente del aparato de Golgil. 4,- Las isoformas HMGR1L de Arabidopsis se localizan en diversos compartimentos subcelulares. En particular, aunque la isoforma HMGR1L parece residir exclusivamente en el retículo endoplasmático, las isoformas HMGR1S y HMGR2 residen además en algún otro compartimento subcelular, probablemente peroxisomas, en base a otros resultados obtenidos en este laboratorio. 5,- La sobreexpresión de las diferentes isoformas HMGR de Arabidopsis provoca fenotipos diferentes en las correspondientes plantas transgénicas, hecho que sugiere la implicación de las isoformas en diferentes procesos metabólicos o fisiológicos. En particular, la sobreexpresión de HMGR1L y HMGR2 provoca déficit en la síntesis de algún tipo de isoprenoide o intermediario de la síntesis de isoprenoides. Este fenómeno sugiere la implicación de estas isoformas en canales metabólicos propios involucrados en la producción de isoprenoides especializados (HMGR1L en la síntesis de isoprenoides relacionados con el control del desarrollo floral; HMGR2 en la de isoprenoides relacionados con la respuesta a estrés biótico o abiótico)

Autor: BARRIL ALONSO XAVIER.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPTO. FÍSICO-QUÍMICA - FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La predicción y la comprensión de las interacciones entre macromoléculas biológicas y sus ligandos específicos resultan de vital importáncia para entender los fenómenos enzimáticos, de transporte molecular o de transmisión de señales, así como para el diseño racional de fármacos. En esta tesis se han estudiado distintos aspectos de los fenómenos de interacción ligando-receptor, tales como el efecto del solvente o la flexibilidad conformacional. También se han aplicado distintas herramientas de la (bio)química computacional al estudio de la inter-acción entre las huprinas (una nueva clase de inhibidores de acetilcolinesterasa) con su enzima diana. Se han establecido un modo de unión del inhibidor y se ha podido predecir el impacto de modificaciones químicas de las huprinas sobre su capacidad inhibidora.

Autor: CHAVES PUERTAS JOSE.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA (UB).

Resumen: La naturaleza genética del gen de la beta-lactamasar SHV-1 ha sido analizada en 97 cepas de Klebsiella pneumoniae procedentes de productos patológicos humanos y no relacionadas epidemiológicamente. Mediante IEEA, se detectaron las bandas de pI 7,6 (SHV-1) en 74 cepas, 7,1 (LEN-1) en 13 cepas y 5,4 (TEM-1) en 10 cepas. Entre las 74 cepas SHC-1, 40 mostraron una doble banda, 20 con pI 7,1 y 20 con pI 5,4. La mayoría de las 74 cepas SHV-1 presentaron plásmidos (76,7%). La transferencia por conjugación de la beta-lactamasa SHV-1 sólo fue posible en 5 casos (9,3%). Se realizó una PCR-RFLP SHV-1 específica del DNA cromosómico que resultó positiva para 93 de las 97 cepas y fue negativa únicamente en 4 cepas productoras de TEM-1. También se analizó el DNA cromosómico de las 97 cepas, en un intento de aproximación al locus génico de SHV-1 mediante restricción por endonucleasas. (RFLP) y Southern-blot. La disgestión con EcoRI mostró al menos una banda positiva de hibridación en 96 cepas, 2 bandas fueron detectadas en 8 muestras. Únicamente en 1 cepa productoras de la beta-lactamasas TEM-1 la hibridación fue negativa. El análisis de las secuencias de DNA no mostró diferencias en las regiones promotoras del gen, ni secuencia de fin de la transcripción adicionales; únicamente mutaciones puntuales que determinaron variantes alélicas. Se describieron algunas nuevas variantes que representaron cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína (SHV-27, 28, 32 y 33 y la LEN-2). Como resultado de los estudios de Southern-blot y secuenciación podemos postular que SHV-1 y LEN-1 están situados muy cercanos y en tándem en el cromosoma bacteriano de K.pneumoniae. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el ancestro de SHV-1 fue originado en el cromosoma bacteriano de K.pneumoniae.