BIOQUIMICA MOLECULAR, 23

Autor: MONTIEL SOSA J. FRANCISCO.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: En este trabajo, se ha realizado el estudio de la asociación del clado mitocondrial KU y la motilidad espermática. Con 142 muestras de semen y sangre de individuos pertenecientes al clado KU, se realizó un estudio pot PCR/RFLP, así como por secuenciación de 400 pb de la primera región hipervariable (HVS I) del D-loop en el mtDNA, con el propósito de observar la estructura del clado KU en la población española. Al efectuar el cálculo de frecuencias y construir los árboles correspondientes, se observó que la estructura es similar al de otras poblaciones europeas. Por otra parte con 102 muestras de semen de pacientes atendidos en clínicas de fertilidad, se analizó la asociación de la variabilidad interna del clado KU y la motilidad espermática, para ello se evaluaron los seminogrmas de las muestras, como son; la motilidad, la progresión vertical, % de vitales y la concentración de espermatozoides, observandose una acumulación estadísticamente significativa del subhaplogrupo U5a y la agrupación UG (U1, U2, U3, U4, U6, U7 y U8) en la motilidad normal y la astenozzospermia severa respectivamente. Al analizar el fenotipo bioquímico en estas muestras de semen, consistiendo en la evaluación de las actividades enzimáticas de los complejos respiratorios, se observa un valor divergente para el cociente C IV/CS en la agrupación UG, lo que no solo está de acuerdo con el fenotipo de astenozzospermia severa observado, sino que apunta también a una posible afectación de la espermatogénesis. Con el propósito de evaluar las bases genéticas mitocondriales que sustentan estas asociaciones, se realizó la secuenciación del genoma mitocondrial completo de 6 muestras de diferentes subhaplogrupos con fenotipos astenozoospermicos. No se localizó alguna mutación asociada con la astenozzospermia, sin embargo se propone la participación de mutaciones favorables (3197 y 1721) en U5a y desfavorables (1811) en UG, que corresponden al rRNA 16S, que pudieran asociarse al comportamiento fenotípico.

Autor: MONLEÓN BRAU M. INMACULADA.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En el presente trabajo se ha estudiado la muerte celular inducida por activación (AICD) en la leucemia T humana Jurkat, sublíneas derivadas (J.RT3-T3.5 Jhp y Jws) y blastos T humanos normales. Se ha comprobado la implicación de FasL y APO2L en el proceso de AICD inducido por PHA o por anti-CD3, además los resultados obtenidos sugieren la participación de algún mensajero de muerte adicional, todavía sin caracterizar. Asimismo, se ha estudiado la AICD en estas células a través de glicoproteínas de superficie distintas del TCR, en concreto CD59. FasL y APO2L son secretados al sobrenadante durante el proceso de AICD en las células Jurkat o blastos T humanos en su forma intacta, no proteolizada, asociadas a una fracción particulada y ultracentrifugable. Se ha caracterizado la localización intracelular de estas proteínas, comprobando que FasL y APO2L se encuentran mayoritariamente almacenados en cuerpos multivesiculares (MVBs) del citoplasma de estas células con un tamaño entre 400 y 600 nm y su secreción está asociada con microvesículas. La ligación de CD59 induce la secreción preferente de APO2L, sobre todo en los blastos T normales. Se ha caracterizado que las sublíneas hiperproliferativas derivadas de Jurkat generadas previamente en nuestro laboratorio Jhp y Jws son resistentes a la AICD. Esto se correlaciona con la ausencia de expresión en su membrana plasmática tanto de moléculas de activación propias de las células T (CD3, CD2, CD59), como del receptor proapoptótico Fas/CD95. La importancia del sistema Fas/FasL en la AICD se confirma por el hecho de que las sublíneas han perdido también la expresión intracelular de FasL. Se ha analizado el mecanismo por el que Fas se acumula en el interior celular de las sublíneas proliferativas derivadas de Jurkat. Debido a un fallo en la ruta secretora, Fas es conducido hacia compartimentos lisomonales para su degradación. Esto se correlaciona con la ausencia total de expresión de CtBP/BARS y endofilina-I en las sublíneas, enzimas relacionadas con la formación y fisión de vesículas secretoras a partir del Golgi. Los fallos en la ruta secretora se asocian con la aparición de grandes cuerpos multilamelares en ls sublíneas, con características de lisosomas, ausentes en las células Jurkat parentales. Usando estas sublíneas se ha estudiado también el mecanismo apoptótico tardío activado por la droga citotóxica doxorrubicina, independientemente de caspasas, en el cuál interviene el factor inductor de apoptosis mitocondrial (AIF). Finalmente, se ha identificado en estas sublíneas una proteína de 85 kDa fosforilada en tirosina, ausente en las células parentales.

Autor: AZNAR ANTOÑANZAS YOLANDA.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DE AULA DEI (CSIC).

Resumen: El bitter pit es una alteración que se desarrola durante el almacenamiento y normalmente ataca a las células superficiales y adyacentes que, junto con otras alteraciones fisiológicas, causa cuantiosas pérdidas económicas a lo productores de manzanas. Tras más de 100 años de investigación todavía no se conocen las causas que lo desencadenan. Numerosos trabajos de investigación coinciden en resaltar el papel del metabolismo de calcio en el desarrollo del bitter pit ya que, según Poovaiah (1993) niveles bajos de calcio en determinados órganos de una planta no indican que se produzca una absorción insuficiente de este macronutriente, si no que es posible que pueden ser fruto de una mala distribución. En este trabajo se ha pretendido profundizar en el conocimiento de esta fisiopatía y en sus causas. El estudio agronómico nos ha permitido cuestionar tanto el uso de tratamiento foliares con distintas formulaciones de calcio como el de reguladores de crecimiento en relación a la correción del bitter pit. Se estimó el estatus nutricional de la plantación mediante el método DOP encontrándose en hoja de excesos de N, K y Mg; y valores bajos de Ca, Fe, Mn y Zn. En fruto se registraron deficiencias de calcio y excesos de magnesio. La concentración de nutrientes en fruto disminuyó conforme aumentaba su tamaño, pero no se interrumpió la entrada de elementos minerales en ningún momento de su desarrollo, demostrándose que el calcio y el resto de nutrientes se acumulan en el fruto con una tasa prácticamente constante a lo largo de su desarrollo. Estos resultados contradicen la teoría tradicional que afirma que, a partir del cuajado, se detiene la asimilación de calcio por parte del fruto. Además en este trabajo se introduce el uso del análisis floral como herramienta de diagnóstico e incluso predición del estatus nutricional de los frutos. A través de un método de tinción selectiva para el calcio se comprobó que se produce una acumulación de dicho nutriente en las áreas afectadas por dicha fisiopatía, menor concentración en las zonas circundantes y una distribución uniforme en la pulpa del tejido sano. La observación al microscopio de las zonas afectadas teñidas directamente indicó que la fracción apoplástica de éstas células, debe contener algún complejo insoluble de calcio que no está presente en el resto del fruto. Los análisis de tejido demostraron que las áreas de bitter pit contienen más calcio insoluble y magnesio soluble que el tejido sano adyacente y que la pulpa de manzanas sanas por lo que se plantea que la baja concentración de calcio en fruto, per se, no desencadena el bitter pit. Únicamente cuando la cantidad del elemento en fruto es limitante, cobrarán relevancia otros procesos que induzcan a la aparición de la fisiopatía, entre otros, el exceso de magnesio libre en el citosol. Por último, se demuestra la heterogénea distribución de cationes y aniones no solo respecto al eje longitudinal de la manzana, sino también en la superficie ecuatorial de la misma.

Autor: GUTIERREZ REVILLA JOSE IGNACIO.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los defectos del tubo neural (DTNs) son un conjunto de alteraciones con una prevalencia importante en la CCAA de Aragón. Su etiología es multifactorial pudiendo interactuar, de forma conjunta o separada, factores bioquímicos, genéticos y medio ambientales. A fin de estudiar dichos factores se realizó un estudio formado por controles, pacientes, madres y hermanos de afectos. Dentro de estos grupos se estudiaron distintas pruebas bioquímicas relacionadas con el metabolismo del folato, como las concentraciones de folato, vitamina B12, folato en células rojas y homocisteína, además de los polimorfismos C677T y A1298C descritos en el gen MTHFR. Por último, se analizaron diversos factores medioambientales mediante encuesta a partir de la cual se determinó la ingesta dietética de folato. Debido a la existencia de numerosos estudios en los que se establece una relación entre la ingesta de preparados farmacológicos con ácido fólico y la prevención de ocurrencias y recurrencias de DTNs, se procedió a su estudio mediante encuesta a 928 mujeres gestantes. Además, se estudiaron distintos factores que pudieran influenciar en la correcta ingesta de ácido fólico, así como la ingesta dietética de folato. Por último, se ha realizado un estudio farmacoeconómico sobre las distintas especialidades farmacéuticas compuestas por ácido fólilco o derivados, existentes en el mercado, calculándose el coste de la dosis diaria definida ajustada (DDDA) a la prevención de la ocurrencia de DTNs. Al definir el perfil de consumo de las especialidades farmacéuticas en un subgrupo de 101 gestantes, se extrapolaron los resultados al conjunto de mujeres que dieron a luza en el año 2000, calculándose el coste que hubiese supuesto la suplementación adecuada a toda la población de gestantes y ser comparada con la especialidad con mejor DDDA. RESULTADOS Establecidos los valores de referencia en el grupo control y la influencia de variables como la edad fértil y el sexo, se realizó la comparativa de las distintas pruebas bioquímicas entre los distintos grupos estudiados. El grupo de madres con hijo afecto presentan concentraciones de folato superiores a las del grupo control, no pudiéndose achacar a diferencias en la ingesta de folato; mientras que el grupo de pacientes y hermanos de los mismos, difieren ambos con el grupo control en las concentraciones de vitamina B12 (inferiores al grupo control) y homocisteína (superiores al grupo control). La prevalencia de los dos polimorfismos no varió en función del grupo estudiado. Además, teniendo en cuenta que la recomendación de la suplementación con ácido fólico en España comenzó aproximadamente en 1982, no se ha encontrado vinculación con un aumento en la prevalencia del genotipo mutado para los dos polimorfismos, así como en su frecuencia alélica. Por lo que respecta a la suplementación farmacológica en mujeres gestantes, sólo el 15,4% llevó a cabo una suplementación adecuada con ácido fólico, siendo uno de los factores influyentes la realización de planificación familiar. También se detectaron errores conceptuales acerca de la relación ácido fólico-DTN, por lo que lleva consigo la necesidad de realizar campañas educativas en torno a la correcta suplementación farmacológica con ácido fólico. Además, sólo el 13% ingiere unas cantidades de folato superiores a 400 ug/día, que teniendo en cuenta el porcentaje de mujeres que realizan suplementación adecuada, llevaría a que sólo un 28% de las mujeres tuvieran cubiertas las necesidades de folato para prevenir la aparición de DTNs.

Autor: RIOS MENDES FRANCISCO DIOGO .
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Existen evidencias que sugieren que el TGF-beta1 juega un papel importante en la patogénesis y fibrosis en la nefropatía crónica del injerto. No obstante, el papel fisiológico que juega el TGF-beta1 en las fases iniciales del trasplante no está todavía adecuadamente aclarado. El objetivo de la tesis fue estudiar dicho TGF-beta1 y otros marcadores que son factores relevantes en la lesión por isquemia-reperfusión, durante el postrasplante renal inmediato de donante a corazón parado. Cuarenta parejas (donante-receptor) de cerdo ibérico fueron distribuidos en 4 grupos: Grupo I: sin isquemia caliente (IC grupo control). Grupo II: sometidos a 30 min., a IC. Grupo III: sometidos a 45 min., a IC. Grupo IV: sometidos a 90 min., a IC. Todos los grupos fueron sometidos a 6h de isquemia fría (IF) hasta el trasplante, durante el que se extrajeron las muestras (sangre y tejido) en los momentos que se denominaron Basal (justo después de estabilizar al animal), IC, IF, I-R (1 hora después de la reperfusión) y al momento final, al quinto día (5D), después de dicho trasplante, cuando los animales supervivientes había sido ya sacrificados. La expresión del TGF-beta1 fue medida por el método de la PCR cuantitativa. La concentración de ATP, ADP y AMP fueron determinadas en tejido renal por medidas de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase reversa. La carga energética (EC) fue calculada. El flujo renal arterial fue calculado en el donante, y después de reperfusión en el receptor mediante un probe electromagnético (Transonic®). La presencia de necrosis cortical fue utilizada como criterio de viabilidad. Los niveles del TGF-beta1 mRNA aumentaron significativamente en el postoperatorio inmediato al trasplante renal (5D) en todos los frupos estudiados. Estos resultados sugieren que la isquemia fría "per se" hizo aumentar la expresión del TGF-beta1. Los tiempos progresivos de isquemia caliente no indujeron mayores niveles del TGF-beta1 mRNA. Sin embargo, la presencia de isquemia caliente determinó un mayor nivel de expresión de TGF-beta1 mRNA respecto a los riñones con tan solo isquemia fría. La isquemia caliente disminuye la producción de NO, que se mantiene en niveles bajos durante la reperfusión, para posteriormente aumentar durante el postoperatorio del trasplante. Existe una correlación directa entre la viabilidad y la producción NO en el postoperatorio el NO tiene un efecto beneficioso sobre la viabilidad del órgano durante la isquemia-reperfusión. El TGF-beta1 juega un papel beneficioso en los primeros momentos de los tejidos dañados por la isquemia-reperfusión y en las primeras fases del trasplante renal. Parece que el TGF-beta1 actuaría como un mecanismo "on/off". Y su producción durante la isquemia-reperfusión no influiría en el evolución tardía del injerto.

Autor: TORRES DE PINEDO JESÚS MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Testosterona (T) y dihidrotestosterona (DHT) son dos hormonas fundamentales en el proceso de virilización de mamífero. En algunos órganos diana, entre ellos la próstata, la T se convirte en DHT por acción del enzima 5-alfa-Reductasa. Actualmente se conocen dos isoenzimas de la 5-alfa-R, la tipo 1 y la tipo 2. Ambas isoenzimas presentan propiedades físico-químicas diferentes. La tipo 1 está ampliamente distribuida por todos los tejidos del organismo, mientras que la tipo 2 sólo se expresa en tejidos dependientes de andrógenos como la próstata. DHT no sólo juega un papel fundamental en el desarrollo, maduración y funcionaldiad de la próstata, sino que también es el andrógeno responsable de patologías prostáticas como la hipertrofia benigna de próstata (HBP) y algunos adenocarcinomas prostáticos dependientes de andrógenos. En el sistema nervioso central (SNC) se conoce también la existencia de la vía de la 5-alfa-reducción implicada en la síntesis de neuroesteroides. Los neuroesteroides podrían participar en el desarrollo del SNC y en la diferenciación sexual del cerebro. Por todo lo anteriormente expuesto, es necesario disponer de una metodología adecuada que nos permita poder detectar y cuantificar los niveles de mRNA de ambos isoenzimas de la 5-alfa-Reductasa y poner de manifiesto su regulación por los andrógenos T y DHT en distintos tejidos y situaciones experimentales. En esta tesis doctoral se desarrolla un nuevo método rápido, fiable y preciso de RT-PCR competitiva acoplada a electroforesis capilar para la cuantificación de los niveles de mRNA de los isoenzimas de la 5-alfa-R en distintos tejidos y situaciones experimentales.

Autor: CAMPA FERNÁNDEZ VICTOR M..
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El ácido poli inosínico (poli I), en un proceso mediado por "Scavenger Receptors" (SRs), induce un proceso de diferenciación hacia un fenotipo inflamatorio en la línea celular de tipo monocito-macrófago RAW 264.7. Este se caracteriza por un cambio en la morfología de las células desde una morfología monocítica hacia una de tipo macrófago, una parada del crecimiento y por la producción de los mediadores proinflamatorios TNF y NO. Durante este proceso de diferenciación también se produce la regulación de la expresión de los mRNAs de los receptroes del TNF y del "Scavenger Receptor A" (SR-A). El poli I induce un aumento persistente de la actividad transcripciónal de NFkB como consecuencia de la degradación de IkBbeta y un aumento de la actividad transcripcional de AP1 debido la activación de las MAPKs ERK, JNK y p38, siendo necesaria la participación de los dos factores de transcripción para adquisición del fenotipo inflamatorio, pero solamente la de AP1 para el proceso morfogénico. El sulfato de dextrano (SD) inhibe eficazmente tanto el proceso de diferenciación inducido por poli I como el aumento de la actividad transcripcional de NFkB y de AP1. Además, la línea celular SR negativa NIH 3T3 no responde a la estimulación con poliI. Esto sugiere que los SRs son los receptores que median la respuesta a poli I en la línea celular RAW 264.7. La activación de los macrófagos a través de los SRs podría ser relevante en la etiología de enfermedades inflamatorias como la arteriosclerosis o la asbestosis en las que parecen estar implicados los SRs. Por último, la línea celular RAW 264.7 es resistente a los efectos citotóxicos del TNF debido a que se encuentra en un estado de anergia frente a esta citocina y adquiere la resistencia al radical NO durante el proceso de diferenciación, posiblemente como consecuencia de la activación de NFkB y de AP1.

Autor: AVELLANDESA GOICURÍA ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: Se ha estudiado la epidemiología del melanoma en una población española (n=158), así como la caracterización de genes aparentemente implicados (Tirosinasa, p14ARF y p16INK4a) en la enfermedad. Se trata de un estudio molecular observacional y descriptivo, siguiendo protocolos clínicos y moleculares específicamente diseñados, con objeto de determinar la correlación entre dichos genes y la evolución del melanoma para diseñar protocolos de identificación de individuos de alto riesgo para la enfermedad. Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que: El melanoma de extensión superficial, y con localización en tronco, fue mayoritario en la muestra poblacional estudiada, afectando fundamentalmente a personas de edad media con fototipo cutáneo 3, observándose una mayor incidencia en mujeres y hasta un 4% de la población estudiada tenía antecedentes de algún miembro familiar con melanoma. Se ha validado un test de rutina para la detección de melanocitos circulantes mediante el análisis del ARN mensajero del gen de la tirosinasa a partir de muestras de sangre periférica, mostrando una elevada sensibilidad, (1 célula melanocítica/ml de sangre). La aplicación de este test sobre una población de 120 pacientes de melanoma en diferentes estadios de progresión, demostró una fuerte asociación entre la expresión positiva del test y el estadio clínico del paciente. Además, los pacientes de melanoma en estadios iniciales y con un test positivo para la tirosinasa en sangre, muestran un claro y significativo peor pronóstico de la enfermedad, evolucionando hacia la generación de metástasis en un plazo inferior a 12 meses, estableciendose por tanto el valor que este test posee como marcador de progresión del melanoma. La expresión del gen p16INK4a en lesiones de melanoma se pierde de forma directamente proporcional a la desdiferenciación del tumor, siendo mayor en metástasis distales que en adenopatías primarias. La pérdida de expresión a nivel inmunohistoquímico no se asocia con la presencia de mutaciones o deleciones en el gen codificante de esta proteína, sugiriendo la existencia de otros factores, capaces de regular la expresión del gen p16INK4a. El análisis de melanomas esporádicos refleja la presencia de polimorfismos genéticos consistentes en mutaciones silenciosas, en heterocigosis, dentro del exón 2 del gen p16INK4a. El 43% y el 71% de las mutaciones detectadas para el locus INK4a/ARF en tejido tumoral y en línea germinal consistente en cambios de C por T, indicando la posible implicación de la luz ultravioleta como inductor de estos cambios heterocigóticos en dicho locus. Las mutaciones del gen p14ARF no afectan al exón 1b ni en melanomas esporádicos ni en línea germinal. Los cambio encontrados en heterocigosis ocurrieron dentro del exón 2, traduciéndose en sustituciones de aminoácidos e incluso en el truncamiento de la proteína. Estos resultados indican que otros genes adicionales deben estar implicados en la predisposición genética del melanoma, sin que se descarte el importante papel que el locus INK4a/ARF posee en la progresión de la enfermedad.

Autor: RODRÍGUEZ GARCÍA ARANCHA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: Si bien se ha descrito que, aproximadamente un 50% de tumores humanos presentan mutaciones/delecciones de la proteína p53, la mayoría de éstos corresponden a tumores de origen mesenquimal, habiéndose descrito casos en los que la proteína está presente, y normal, en tumores de origen mesenquimal. Nuestro proyecto ha intentado responder a la pregunta de por qué una célula tumoral portadora de una anomalía cromosómica y que expresa proteína p53 normal no muere. Los ensayos realizados parecen indicar que el producto de la anomalía cromosómica ejerce una interferencia con la capacidad transactivadora de la proteína p53, interferencia que se lleva a cabo de modo funcional, interfiriendo con los coactivadores CBP/p300 encargados de su activación. Hemos comprobado como esto se aplica a demás a otros transactivadores transcripcionales dependientes a su vez de CBP/p300. Así pues, este mecanismo de interferecnia podría considerarse un mecanismo universal en el desarrollo del cáncer mesenquimal. Las implicaciones terapéuticas de nuestros estudios afectan a la actuación sobre el pool de coactivadores transcripcionales de la célula, y al aumento "controlado" de p53 en células tumorales que expresan proteína p53 y son portadoras de una anomalóa cromosómica, induciéndolas a la apoptosis.

Autor: ALVAR ALVAREZ FRANCISCO.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: MEDICINA.

Resumen: En nuestro trabajo hemos clonado y caracterizado un nuevo gen en el pez cebra (Danio rerio), al que hemos denominado ZFOR3. Este gen presenta una alta homología con los receptores opioides de mamíferos, así como con otros receptores tipo opioide clonados por nuestro grupo en este pez, siendo esta homología mayor con el receptor opioide kappa de mamíferos. La estructura génica de ZFOR3 presenta al menos 4 exones. El primero de ellos se transcribe pero no se traduce, mientras que los tres restantes contienen la secuencia codificante de este gen. Además, ZFOR3 mantiene la estructura génica de los receptores opioides Kappa clonados en mamíferos. Su cDNA tiene un tamaño aproximado de 2.7 kb, y presenta una única fase de lectura abierta que codifica para 377 aminoácidos. El estudio de hidrofobicidad de la proteína deducida en nuestro nuevo clon muestra la existencia de siete dominios transmembrana, lo que agrupa a XFOR3 dentro de la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G. Los estudios farmacológicos realizados sobre la proteína del gen ZFOR3, transfectado en la línea celular HEK293, indican que no se comporta como un receptor opioide clásico, al desplazar la naloxona entre un 20 y un 30% a los ligandos unidos a este receptor. Sin embargo, los agonistas opioides clásicos, sí producen estimulación de proteínas G, siendo esta mayor por agonistas tipo kappa, como son el peptido dinorfina A, y su análogo de síntesis (D-Arg6)-Dinorfina A. La expresión en el sistema nervioso del pez cebra del gen ZFOR3, difere de la obtenida para los otros receptores tipo opioide caracterizados en el pez cebra; y es similar a la observada para el receptor opioide kappa, en las estructuras conservadas entre teleosteos y mamíferos.

Autor: VEGA AGAPITO M. VICTORIA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: EDIFICIO DEPARTAMENTAL.

Resumen: En cerebro, la arginina se localiza predominantemente en astrocitos, mientras que la concentración en neuronas es muy baja, siendo limitante para la actividad de la oxido nítrico sintasa neuronal (nNOS). A continuación subóptimas de arginina se generan anión superóxido y óxido nítrico por la NOS. Ambos radicales libres reaccionan rápidamente originando anión peroxinitrito (ONOO), un compuesto inestable, tóxico para neuronas pero no para astrocitos. Nosotros pensamos que el ONOO puede tener un papel fisiológico doble actuando como señal moduladora que facilita la liberación de arginina por los astrocitos y además previniendo la formación de ONOO en neuronas tras la activación de la nNOs. Por ello, estudiamos la regulación del transporte de L-(3H)arginina tras un aporte exógeno o endógeno de peroxinitrito en células gliales. La liberación de L-arginina mediada por peroxinitrito aumentó dos veces en C6 de forma sodio-independiente. Este incremento se previno por 5mM de L-arginina en ausencia de sodio y por 5 mM de L-alanina o L-leucina en presencia de sodio. El aumento en la captación de L-arginina mediada por peroxinitrito fue transestimulada por 10 mM de L-arginina e inhibida de manera concentración dependiente por el inhibidor del sistema y+, la N-etilmaleimida, en C6. El peroxinitrito formado endógenamente en astrocitos tratados con LPS, aumentó el transporte de L-arginina sin alterar los niveles del RNA del Cat-1. Análisis de Western Blot de astrocitos y C6 tratadas con ONOO revelaron una banda 3-nitrotirosinada anti-Cat1-inmunopositiva, surgiriendo fuertemente la nitración del transportador Cat1 como causa de su activación. Además, el ONOO no alteró el transporte de L-arginina en fibroblastos carentes (homozigóticos) del gen que codifica para Cat1. Por último, L-arginina liberada por astrocitos tratados con ONOO-, fué eficazmente captada por las neuronas en sistemas de cocultivos. Todos estos resultados sugieren que la activación del transportador Cat1 medida por peroxinitrito en células gliales puede servir como mecanismo dirigido a reaprovisionar de L-arginina las neuronas vecinas.

Autor: GUTIÉRREZ CIANCA NOELIA OLIVA.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DPTO. MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA/INSTO. MICROBIOLOGÍA-BIOQUÍMICA.

Resumen: La consecuencia más frecuente de las traslocaciones cromosómicas en el cáncer humano es la fusión génica. La traslocación t(9;22)(q34;q11) puede dar lugar a la generación de tres genes de fusión que se asocian con fenotipos tumorales diferentes. Así, BCR-ABLp190(p190) es característico de la LLA-B. Los modelos de ratón clásicos han demostrado la capacidad tumorogénica de estos genes de fusión pero no han permitido estudiar cuestiones de gran relevancia en el cáncer humano, debido a que no permiten modular la expresión génica, como por ejemplo, el papel de estos genes de fusión en el inicio y el mantenimiento del tumor o la influencia de la cantidad de producto de fusión en el desarrollo tumoral. Por esta razón, hemos desarrollado un sistema de regulación de la expresión génica basado en el operón de resistencia a tetraciclina de E.coli que reúne en un único plásmido todos los elementos necesarios para modular la expresión del gen de fusión p190. Este sistema nos ha permitido desarrollar un modelo celular (Boff190) y un modelo de ratón fisiológicamente relevante (CombitTAp190), que expresan el gen de fusión de manera dependiente de la adición de un derivado de tetraciclina, doxiciclina, en el medio de cultivo o en el agua de bebida. Estos modelos nos han permitido estudiar aspectos de gran relevancia en el cáncer que se describen a continuación: 1,- La expresión del gen de fusión durante el desarrollo embrionario es capaz de iniciar la leucemia. 2,- Una vez iniciado el tumor, el mantenimiento del mismo es independiente del p190 ya que impone a la células un destino tumoral. 3,- La alteración de la proliferación inducida por p190 depende unicamente de la presencia del oncogén, mientras que el efecto sobre la diferenciación depende de un umbral de expresión. 4-p190 es capaz de alterar los controles de la fase G1/S del ciclo celular a través de la regulación de la expresión del gen p27.

Autor: LÓPEZ PÉREZ RICARDO .
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MEDICINA.

Resumen: La detección de monoclonalidad linfoide B en los síndromes linfoproliferativos malignos de células B es una utilidad no sólo en el diagnóstico sino también en la monitorización de la Enfermedad Mínima Residual tras el tratamiento. Su detección puede realizarse mediante Southern Blot (SB), pero ésta es una técnica laboriosa y complicada que presenta el inconveniente de retrasar el diagnóstico de tres a cuatro semanas. A,- El estudio del reordenamiento genético de la cadena pesada de las inmunoglobulinas mediante PCR, y su posterior análisis mediante heterodúplex o GeneScan, es una metodología útil para el diagnóstico de clonalidad linfoide B. Esto es así, tanto por su sencillez, como por su aplicabilidad en la rutina diaria en un laboratorio clínico. B,- Ambas técnicas permiten la detección de clonalidad en Mieloma múltiple en un porcentaje superior al 80% sin la presencia de falsos positivos. No obstante, la técnica de PCR-Genescan, es más reproducible y aporta una mayor objetividad en los casos en el límite de detección de la técnica (entre 10-2 y 10-3). C,- La detección de células clonales en los productos de aféresis de los pacientes sometidos a autotrasplante de progenitores hematopoyéticos de sangre periférica por ambas técnicas, tiene utilidad clínica. Así, en nuestro estudio, los pacientes trasplantados con productos contaminados con células clonales, tienen una respuesta al trasplante menor y una supervivencia libre de enfermedad y global más corta que los trasplantados con aféresis policlonales. D,- La técnica de PCR/GeneScanning permite detectar monoclonalidad en las muestras de médula ósea en pacientes con MM al finalizar el tratamiento, incluso en pacientes en remisión completa. Además, su detección se relaciona con el tratamiento empleado (mayor tras quimioterapia sola, que tras trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos), peor respuesta clínica y supervivencia libre de enfermedad más corta. Estos datos sugieren que esta técnica puede ser útil en la monitorización de enfermedad mínima residual.

Autor: HERRERO TURRIÓN MANUEL JAVIER.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La expresión de los genes de la superfamilia GH se produce desde los primeros estadios del desarrollo de la dorada. Los transcritos de la GH y la PRL se detectan a partir del segundo día post-eclosión y en los siguientes estadios fluctúan sus niveles de expresión (expresiones transitorias). Por su parte, los transcritos de las SLs se detectan en embriones de dos días post-fertilización e inmediatamente después de la eclosión larvaria sus niveles de expresión disminuyen significativamente. Asimismo, se ha determinado la expresión diferencial de las isoformas SL1 y SL2 en los primeros estadios, desde embriones hasta larvas de 4 días. Los mRNA-SL1 están más expresados que los mRNA-SL2, lo que sugiere diferencias funcionales de ambas isoformas de SL al menos en esos estadios. Los cuatro tipos de mRNAs pertenecientes a la superfamilia GH en la dorada se localizan en células adenohipofisarias a partir de los cuatro días post-eclosión, manteniéndose presentes a lo largo de todo el desarrollo del animal. Además, no se han determinado diferencias cualitativas significativas en las localizaciones y distribuciones de las células somatotropas, lactotropas y somatolactotropas en los tres tamaños de cada una de las edades de juveniles estudiados, producto del crecimiento asincrónico de las doradas en cultivo. Por primera vez se ha demostrado que a lo largo de todo el desarrollo de la dorada las células somatolactotropas co-expresan las dos isoformas de SL caracterizadas hasta el momento. La distribución de grupos de células somatolactotropas en áreas hipofisarias diferentes de la Pl, zona ventral de la PPD y la zona dorsal de la RPD, sugiere la migración de factores que activan la síntesis y/o secreción de las hormonas de SL en esas áreas adenohipofisarias. Asimismo, es posible la presencia de co-expresiones de las SLs con otras hormonas hipofisarias en esas células.

Autor: MESONERO ÁLVAREZ M. JOSÉ.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MEDICINA - FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La mayoría de las enfermedades hepáticas crónicas se caracterizan por el desarrollo de fibrosis con acúmulo de componentes de la matriz extracelular. La cirrosis es el estado evolutivo final de este proceso. Estudios previos describen la relación que existe entre cirrosis y trastornos del ciclo de la metilación. La cirrosis, sea cual sea su etiología, deprime la actividad de la metionina adenosiltransferasa (MAT) que es la enzima responsable de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe). A su vez, se ha demostrado que el óxido nítrico (NO) está intimamente relacionado con la síntesis de SAMe, ya que inhibe directamente la MAT. El modelo experimental de fibrosis inducida por ligadura del conducto biliar común (LCB) provoca además de colestasis, un fenómeno fibrótico ya patente a las dos semanas de la cirugía. El objetivo principal de esta tesis es comprobar el papel de GSH y/o NO en los estadios precoces de la fibrosis hepática, dilucidar las vías por las que esto ocurre y estudiar posibles formas de actuación estudiando el efecto de diferentes tratamientos farmacológicos que, actuando vía GSH/NO, permitan o no evitar o reducir la progresión de la fibrosis. Para ello utilizamos una sustancia que mejora los mecanismos antioxidantes: S-adenosilmetionina (SAMe) y dos sustancias inhibidoras de la producción de NO: NG- nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME) y la aminoguanidina (AG). Las conclusiones del trabajo son las siguientes: La LCB induce, ya a los 17 días, hiperplasia ductular, fibrosis de predominio periportal, deterioro de la función hepática y cambios hemodinámicos confirmando la fiabilidad del modelo experimental elegido. Existe expresión de la isoforma endotelial e inducible de la NO sintasa en hígado de ratas control. La primera se circunscribe a los territorios vasculares y la segunda al parénquima. La expresión permanente de la isoforma inducible la atribuimos a la continua llegada al hígado de estímulos inductores desde el tracto digestivo vía circulación portal. En los animales con LCB la expresión de ambas isoformas y los niveles plasmáticos de nitritos y nitratos están aumentados a los 17 días. La localización de las isoformas se mantiene, aunque en el caso de la inducible aparece expresión ex novo en zonas portales. Esto podría deberse a infiltración celular y/o a procesos de desdiferenciación de células ductulares. Los hallazgos histopatólogicos y las determinaciones de función hepática indican que los tratamientos con SAMe o con inhibidores de la NOS induce una mejoría moderada o ligera, respectivamente. En ambos casos el efecto beneficioso cursa a través de la recuperación parcial del estado de óxido-reducción. En las ratas con LCB, la administración crónica de SAMe, de forma aislada o combinada, aumenta la excreción de bilirrubina por orina. Se propone una acción inductora del tratamiento crónico sobre las enzimas conjugantes renales y/o hepáticas.

Autor: SANZ MORENO VICTORIA.
Año: 2001.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Los resultados obtenidos demuestran que MX12 debido a su particular extremo carboxilo, Exhibe unas características muy diferentes a P38Alfa. En particular, A,- Responde de manera distinta a estímulos externos, particularmente a mitógenos. B,- Se muestra insensible a inhibidores tanto químicos como fisiológicos: Imidazoles y fosfatasas. C,- Presenta baja afinidad por sustratos bien conocidos de P38. MX12 se une a ERK1/2 específicamente tanto en el contexto celular como fisiológico. MX12 atenua la tasa de defosforilación de ERK. MX12 regula las funciones de ERK de una manera dependiente de la sublocalización celular potenciando los eventos que tienen lugar en el núcleo pero sin afectar las funciones citoplasmicas de ERK debido presumiblemente a la localización mayoritariamente nuclear de MX12.

Autor: LÓPEZ MARIN RAFAEL PABLO.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: Se ha estudiado en el modelo de diabetes de ratas inducidas por múltiples dosis subdiabetogénicas de estreptozotocina, el efecto del tratamiento con una dieta rica en guayaba criolla roja. El tratamiento de las ratas diabéticas durante 15 días normaliza todos los signos típicos de la diabetes mellitus, cómo la polifagia, la poliuria, la polidipsia y la pérdida de peso. El hecho más destacable es que al final del tratamiento estos animales presentan una normoglucemia acompañada de una disminución de los niveles de insulina plasmática así cómo del contenido pancreático de esta hormona, comparado con el grupo de ratas diabéticas sin tratamiento. La atomización de la guayaba no induce variación alguna de la actividad biológica descrita anteriormente, representando ésta una forma de conservación válida de esta fruta. El efecto normoglucémico del tratamiento con una dieta rica en guayaba no se debe al conocido cómo efecto fibra, dado que la administración intraperitoneal de guayaba atomizada a ratas diabéticas induce una normoglucemia durante las 48 horas posteriores al tratamiento. Este efecto normoglucémico del tratamiento con guayaba comparado con el tratamiento con Glibenclamida presenta las siguientes diferencias: El tratamiento con guayaba cuantitativa y cualitativamente obtiene mejores resultados sobre la homeostasis de la glucosa en animales diabéticos que los conseguidos mediante la administración de una sulfonilurea clásica, como la Glibenclamida.

Autor: ZAPATA PEDRO DARÍO.
Año: 2001.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALCALÁ.

Resumen: El cáncer de próstata es una de las principales patologías en los varones occidentales y la segunda causa de muerte de cáncer. Actualmente, debido al creciente incremento de la vida media de la población, se esta transformando en un grave problema de salud pública. La propuesta es un órgano regulado no solo por andrógenos, sino también, por los factores de crecimiento y neuropeptidos secretados por las células neuroendocrinas de la prostata. Dentro de estos neuropeptidos se encuentra la somatostatina (SS), un potente inhibidor de la proliferación para una gran cantidad de tumores sólidos y líneas celulares tumorales. Los ensayos clínicos utilizando analogos de SS no han arrojado resultados concluyentes, probablemente porque se desconocen los mecanismos de acción a través de los cuales actúan la SS. Estudiando el papel de este peptido en la prostata, hemos encontrado que las células prostáticas tumorales humanas PC3 y LNCaP presentan un bucle autorino para SS que inhibe la proliferación de ambas lineas celulares. A través de estudios de RT-PCR hemos descrito la presencia de ARNm para SS y para los receptores sst2 y sst5. Además, hemos demostrado la traducción de estos mensajeros a las proteinas correspondientes, a través de técnicas de imunocitoquímica e inmunoblot. El tratamiento de las células con un anticuerpo anti-SS aumenta la proliferación celular lo cual demuestra la funcionalidad del bucle. Esto queda corroborado por la disminución en el crecimiento de las células PC3 que provoca la transfección de las mismas con un plasmido que permita la sobreexpresión transitoria de SS. Con la finalidad de investigar cuales eran los mecanismos moleculares a través de los cuales actuaba el bucle aucotrino descrito, investigamos la presencia de la tirosina fosfatasa SHP-1 en ambas líneas celulares. Esta enzima se expresa tanto en PC3 como en LNCaP, siendo su nivel superior en LNCaP. Para ver que efecto producía la SS sobre la actividad y expresión de SHP-1, se midieron ambos parámetros en células PC3 deprivadas (condiciones que provocan un aumento de los niveles de SS secretados) y en células PC3 transfectadas transitoriamente con un plasmido que sobreesprese la SS. En ambas condiciones se observó un aumento de actividad y expresión del enzima. Este aumento se previno al añadir un anticuerpo anti-SS a las células deprivadas, lo que demuestra que la SS regula la actividad y expresión de SHP-1. Estudios a corto plazo con el analogo de la SS RC-160, demostraron que el aumento de la actividad de SHP-1 es dependiente del tiempo y de la dosis del analogo utilizada. A través del estudio de clones que sobreexpresan la SHP-1 de manera estable, se demostró el papel inhibidor de esta enzima sobre la proliferación celular, y en virtud de la regulación que ejerce la SS sobre ella, podemos decir que froma parte del bucle aucotrino para el peptido en estas líneas celulares. Mediante estudios de adhesión sobre placas cubiertas de fibronectina hemos encontrado que la SHP-1 aumenta los procesos de adherencia y extensión celular. Debido a la importancia de los procesos regulados por SHP-1 y su implicación directa con la carcinogénesis, se investigó la presencia de esta enzima en próstata humana normal y patológica. Si bien la enzima se encontraba en próstata humana normal, en HPB y en adenocarcinomas bien diferenciados, ésta desaparece en adenocarcinomas indiferenciados. Estos resultados guardan relación con lo encontrado en las líneas celulares, ya que en este caso, las células PC3 son células más indiferenciadas que las células LNCaP y presentan menos niveles de SHP-1.

Autor: MUÑOZ POSTIGO FRANCISCO MIGUEL.
Año: 2001.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La isquemia cerebral se origina por una disminución del flujo sanguíneo hasta niveles que interfieren con la funcionalidad del sistema nervioso, provocando múltiples alteraciones que llevan a la muerte celular de la zona afectada, entre ellas la inhibición de la síntesis proteica. La regulación de la síntesis de proteínas se ejerce fundamentalmente a nivel de iniciación, siendo uno de los mecanismos de regulación más importantes el secuestro del factor eIF2B por fosforilación de la subunidad alfa del factor eIF2. Desde 1994 hemos estado interesados en el estudio de la regulación de la síntesis de proteínas durante la isquemia cerebral, y hemos demostrado que tras un periodo de isquemia cerebral transitorio en ratas, se produce una inhibición de la síntesis de proteínas asociado a una disminución de la actividad del factor eIF2B y un aumento de la fosforilación de la subunidad alfa del factor eIF2. Este aumento de fosforilación puede estar regulado a nivel de proteínas quinasas o de proteínas fosfatasas, siendo su estudio complejo en un sistema in vivo, por lo que se utiliza un sistema in vitro en células PC12 diferenciadas con factor de crecimiento nervioso (NGF), en el que ya habíamos demostrado su idoneidad para el estudio de los mecanismos reguladores del proceso de iniciación de la síntesis proteica. Por lo tanto el objetivo fundamental de esta tesis doctoral es estudiar los mecanismos implicados en la regulación de la fosforilación del factor de iniciación el eIF2 en un modelo de isquemia en células PC12 diferenciadas con NGF. Para ello se sigue el siguiente plan de trabajo: A,- Optimización del modelo de isquemia en las PC12. Valoración de la síntesis de proteínas y cuantificación de la fosforilación de eIF2alfa. B,- Estudio de los mecanismos de regulación de eIF2(alfaP) tras las isquemia. Implicación de eIF2alfa quinasas y/o fosfatasas. C,- Estudio de la muerte celular inducida por la isquemia. Búsqueda de estrategias protectoras e implicación del eIF2 en el proceso. Las conclusiones que se obtienen en el trabajo son; 1,- En el modelo de isquemia, la síntesis de proteínas está inhibida en paralelo al aumento de los niveles de eIF2(alfaP). 2,- No hay aumento en la actividad de ninguna eIF2alfa quinasa, por el contrario sí hay inhibición en la actividad eIF2alfa fosfatasa (sugiriendo que es PP1). 3,- La liberación de calcio mitocondrial por FCCP induce la fosforilación de eIF2alfa a través de la activación de una quinasa: PKR. 4,- Los receptores de glutamato, tanto ionotrópicos como metabotrópicos, no están implicados en la muerte celular que se produce durante la isquemia. 5,- Las células PC12 precargadas con PDC (un análogo de glutamato, son más resistentes a la mortalidad inducida por la isquemia. De igual modo, la NAC, un precursor de la síntesis de glutation, mejora la supervivencia celular. 6,- Nuestros resultados proponen un efecto protector, tanto del tratamiento con NAC, como de la precarga con PDC, mediado por el aumento en los niveles de glutation reducido.

Autor: ANDRÉS PERNI ANA M..
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La rodopsina es el fotopigmento de los bastones, las células fotorreceptoras de la retina de los vertebrados. Esta proteína es un receptor de siete hélices transmembranales que pertenece a la familia de los receptores acoplados a proteína G (GPCR). Se han estudiado mutantes puntuales de la rodopsina relacionados con la Retinosis pigmentaria (RP), una enfermedad degenerativa progresiva de la retina, utilizando técnicas de mutagénesis dirigida y técnicas espectroscópicas. Estos ha permitido aportar nuevos conocimientos sobre el estudio de la estructura-función en la rodopsina. Hemos realizado el análisis de varias mutaciones asociadas a RP, localizadas en los diferentes dominios de la proteína: transmembranal, intradiscal y citoplasmático. Por otro lado se ha llevado a cabo un estudio detallado de diferentes mutaciones en la posición 125, asociada a RP, para aportar información precisa sobre la implicación de este residuo en la estructura y el mecanismo de activación del receptor. Mediante espectroscopia de absorción en el UV-Vis se ha determinado la capacidad de regeneración de las proteínas con el 11-cis-retinal. La capacidad de los mutantes de activar la proteína G ha sido determinada mediante espectroscopia de fluorescencia. Las mutaciones de RP G106W, G114D, P171Q y H211R provocan un mal plegamiento de las proteínas ya que impiden la regeneración con el cromóforo. Los mutantes de rodospsina M44T, R135L, V137M y L328P pueden unir 11-cis-retinal pero presentan una activación de la proteína G alterada. El conjunto de resultados obtenidos de la caracterización de los mutantes en la posición 125, indican que este residuo es clave para mentener la estructura del bolsillo de unión del cromóforo. Esta posición afecta, además de la estructura, la señalización del receptor ya que modifica la conformación óptima del bolsillo de unión del cromóforo en el entorno del anillo de beta-ionona. Estos resultados obtenidos a nivel molecular se discuten en relación con los procesos degenerativos observados en la RP.