BIOQUIMICA MOLECULAR, 24

Autor: MARTÍNEZ RODRÍGUEZ SUSANA EVA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: En la presente Tesis, se ha abordado el estudio detallado de la localización de distintas formas de alcohol deshidrogenasa (ADH) en tejidos de rata y, en particular, en el sistema vascular, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central y tejidos oculares. Se han estudiado esencialmente ADH1 y ADH4, que son los enzimas más relevantes en la oxidación de etanol a acetaldehído, y en la oxidación de retinoll al retinal en la vía de síntesis del ácido retinoico. ADH4 y ADH1B1 se detectaron como las formas principales en los vasos sanguíneos de rata y humano, respectivamente. Tanto ADH1 como ADH4, se han detectado a lo largo de todo el tracto gastrointestinal, principalmente en la mucosa, variando su cantidad relativa y su ubicación celular en función del área estudiada. ADH4 es más abundante en las partes más externas del tracto (boca, esófago, colon y recto), mientras que ADH1 es la forma mayoritaria en el intestino. En el cerebro, mediante hibridación in situ, ambas formas de ADH se han localizado en el cerebelo, formación hipocampal, áreas muy concretas de la corteza cerebral, y en el sistema ventricular y vascular asociados al SNC. En los tejidos oculares, tan sólo ADH4, el mRNA y la proteína, se ha localizado en la coroides, cuerpo ciliar, nervio óptico y en capas concretas de la córnea y retina. Finalmente, se ha comparado el patrón de expresión ADH en tejido hepático con el de una línea celular de hepatocarcinoma. La línea de hepatocarcinoma de rata HY4IIEC3 mostró la expresión de ADH1 y ADH3, presentes en hígado normal, y, además, ADH4, ausente en hígado. Se investigó el efecto del áctido retinoico sobre la expresión de cada una de las tres formas de ADH. Se ha observado un aumento de los niveles de mRNA de ADH1 y un descenso de los de ADH4, mientras que los niveles de mRNA de ADH3 se mantuvieron constantes. La distribución de ADH1 y ADH4, junto con sus propiedades cinéticas y su regulación, permiten inferir algunas de sus funciones fisiológicas en el metabolismo del etanol y de los retinoides, la reducción de aldehídos citotóxicos derivados de la peroxidación lipídica y el catabolismo de las catecolaminas. Asimismo, el metabolismo end´goeno de etanol, proporciona una base molecular para comprender las alteraciones causadas por el abuso del alcohol en determinados órganos y tejidos. En este sendido, proponemos la hipótesis de que algunos de los efectos tóxicos del etanol podrían explicarse por la interferencia, a nivel de la ADH, con la vía de síntesis del ácido retinoico.

Autor: CEDANO RODRÍGUEZ JUAN ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Resumen: INTRODUCCIÓN Las beta(l-3)(l-4) glucanasas son enzimas de gran interés biotecnólogico tanto en la industria cervezera como en la de fabricación de piensos. Los objetivos de esta tesis han sido: rediseñar la glucanasa de bacillus licheniformis con objeto de tratar de mejorar la actividad enzimática y determinar la función del lazo mayor del centro activo en dicho proceso, así como analizar y rediseñar la estabilidad térmica del enzima, en particular determinar la influencia del lazo mayor en la desnaturalización térmica, relacionándolo con el proceso y tipo de plegamiento. ANÁLISIS DE LOS MUTANTES DE SATURACIÓN EN LA POSICIÓN 58 DE GLUCANASAS 1,- La reducción de volumen de la cadena lateral aumenta la actividad, aumentando la constante catalítica Kcat, si bien disminuye la Km. El mutante M58G presenta la actividad más alta, hasta 6 veces más que el silvestre, y elmutante M58A presenta más de 4 veces la actividad del silvestre, ambos, en términos de Kcat/Km. 2,- Los residuos hidrófilos disminuyen la actividad. 3,- Unicamente en mutantes aromáticos como M58F y M58W, se aprecia una disminución de valores de Km, respecto al enzima silvestre. EL ANÁLISIS DE LA TERMORRESISTENCIA 1,- Con respecto al medio, serían claves el pH (por pérdida de interacciones pH dependientes), el tampón (por su posible papel quelante), y la presencia de sustrato (porque estabilizaría). 2,- Con respecto a la estructura serían claves los aminoácidos del lazo y la coordinación del Ca++. La coordinación del CA++ puede ser mejorada introduciendo una nueva interacción entre el catión y la beta 15, como en el caso del mutante N236D. 3,- Finalmente, la termoinactivación de la glucanasa de Bacillus licheniformis, en todos los mutantes estudiados, siguen un patrón bifásico. Su análisis cinético permite justificar el efecto de diversos mutantes y el comportamiento del enzima frente a la temperatura.

Autor: CID ROLDÓS EMILI.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: La glucógeno sintasa muscular es una enzima altamente regulada. Esta tesis doctoral ha profundizado en diversos aspectos no resueltos como la descriptción de su mecanismo catalítico y las relaciones estructura-función o la distribución subcelular de la enzima. Además la presente tesis ha combinado diferentes técnicas, bien bioinformaticas, bioquímicas y de biología celular y molecular. Los resultados se encuentran resumidos en los siguientes párrafos. Los resultados de la comparación de las glucógeno (almidón sintasas y las glucógeno sintasas indican que además de catalizar la misma reacción, la síntesis del alfa(1-4)-glucano, comparten características similares así como zonas de estructura secundaria predicha homólogas. Por lo tanto podrían incluirse en una misma "superfamilia". Además se detectó que las glucógeno (almidón) sintasas que arqueobacterias son filogenéticamente cercanas a las glucogeno sintasas de hongos y mamíferos. A parte de ser similares a nivel de secuencia y estructura secundaria predicha presentan una especificidad de substrato parecida y un tamaño más reducido. Por tanto son buenos modelos para estudiar a nivel estructural tanto las glucógeno sintasas como las glucógeno (almidón) sintasas. También se ha demostrado que el residuo Glu-510 de la sintasa muscular humana (HsMGS) es esencial para la catálisis y que el Glu-518 juega un papel importante en ella, aunque secundario. Proponemos que los equivalentes de estos residuos en las glicosiltransferasas de las familias, 4,5 y 15 también son fundamentales en el mecanismo de catálisis. La glucógeno sintasa muscular de mamíferos presenta una localización subcelular regulada entre el núcleo y el citoplasma. Esta translocación no es exclusiva de la enzima humana ni de las células de tipo muscular ya que también se presenta en la línea celular 3T3-L1, un modelo de adipocitos de ratón. Ni la sobreexpresión ni la fusión de la enzima a GFP alterna esta distribución regulada. Además cuando se sobreexpresa la glucógeno sintasa muscular en células que no la expresan también se mantiene la distribución regulada. De diferentes experimentos de mutagénesis dirigida también se ha observado que la glucosa 6-fosfato juega un papel estimulador en el exporte de la HsMGS desde el núcleo. El aumento de la concentración de glucosa 6-fosfato es necesaria para favorecer su correcta localización en el momento de sintetizar glucógeno, para suministrar substrato y para activar a la glucógeno sintasa. La concentración de la HsMGS en el núcleo se produce en respuesta a la depleción del glucógeno intracelular. El glucógeno realizaría una función de retención de la proteína en el citoplasma impidiendo su translocación hacia el núcleo. Dentro del núcleo, la HsMGS forma agregaciones esféricas que se distribuyen por el nucleoplasma. Estas agrupaciones colocalizan con p80-coilina y PML. La capacidad de la enzima de catalizar la síntesis del alfa(1-4)-glucano no es necesaria para el control de la localización subcelular, ya que el mutante Glu-510 (Catalíticamente incapaz) se distribuye en la célula de la misma forma que la enzima salvaje. La fosforilación y desfosforilación de los lugares descritos que controlan la actividad de la HsMGS no regulan la distribución subcelular de esta enzima. Sin embargo, existen ciertas evidencias que otros residuos no identificados se fosforilan, y si se tiene en cuenta que el transporte núcleo-citoplasmático se regula muy frecuentemente mediante fosforilación-desfosforilación, seria posible que estos nuevos lugares controlaran de algún modo la translocación de la HsMGS. Finalmente también se ha demostrado que el exporte nuclear de la HsMGS esta mediado por la vía clásica de exporte, que es leptomicina B sensible.

Autor: CABANA SUMSI MARTA .
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Los inhibidores de la transcriptasa inversa y la proteasa víricas, son dos tipos de fármacos ampliamente usados en la lucha contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo-1 (VIH-1). Un correcto uso y diseño de los tratamientos ha logrado disminuir de forma drástica y sostenida la replicación vírica, a pesar de no haber sido capaz en ningún caso de eliminar la infección. Uno de los mayores obstáculos a los que se enfrenta la terapia es la aparición de mutaciones en el genoma vírico que se asocian a una disminución de la eficacia terapéutica. Las propias características del virus favorecen la aparición de estas mutaciones, haciendo factible la imposición de variantes capaces de escapar a las situaciones adversas como el tratamiento antiretroviral. En este trabajo se ha analizado el efecto que una mayor o menor inhibición de la replicación vírica puede tener sobre la evolución vírica y la aparición de mutantes. De los trabajos pudimos concluir que, el nivel de supresión de la replicación vírica, condiciona la facilidad de aparición de mutaciones asociadas a resistencia, a pesar de existir evolución genética. También se analizó el uso de un sistema de cribaje genético. Este sistema fue diseñado para el análisis de proteasas específicas de sitio de corte como es la proteasa del VIH-1. Tanto la actividad como la susceptibilidad a los inhibidores de la proteasa son dos parámetros importantes a determinar de las diferentes variantes genéticas de este enzima. Los resultados mostraron que el sistema eran útil para el análisis de proteasas obtenidas de muestras de pacientes y permitía prever la respuesta a un cambio posterior de tratamiento. Por otro lado era altamente sensible a cambios en la actividad proteolítica inducidos por mutaciones simples en la cadena aminoacídica, así como también permitía detectar cambios en la susceptibilidad a los diferentes inhibidores de la proteasa. En resumen, concluimos que, el sistema de cribaje genético basado en el bacterófago lambda constituye un buen sistema para la caracterización de proteasas del VIH-1 relevantes clínicamente, así como, para la profundización en el estudio y caracterización de esta proteína y sus variantes.

Autor: MARTINEZ TIRADO OSCAR.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: ESTÉBANEZ PERPIÑA EVA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: BENEDIT HERNÁNDEZ PATRICIA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El cáncer de próstata es una de las enfermedades con mayor índice de mortalidad en la población masculina. En los últimos años, hemos comprendido que para combatir esta enfermedad, es necesaria una complementación entre los conocimientos clínicos y moleculares de esta. El objetivo de esta tesis ha sido la búsqueda de nuevos genes cuya expresión estuviera asociada al fenotipo tumoral de la próstata. Para ello, se ha aplicado la técnica del differential display. A través de esta hemos encontrado dos genes sobreexpresados en cáncer de próstata respecto a la próstata normal, resultado que hemos corroborado mediante RT-PCR semicuantitativa, inmunohistoquímica y Western blot. Uno de ellos, corresponde a un gen de identidad desconocida, al que hemos denominado PTOV1 (Prostate Tumor Overexpressed 1), constituído por un nuevo módulo proteíco, repetido en tándem que se encuentra también en otra proteína (PTOV2). PTOV1 se localiza en el cromosoma 19q13 y su expresión está regulada por andrógenos. La localización nuclear de PTOV1, así como su expresión, estan relacionadas con el ciclo celular. Mediante la técnica del doble híbrido hemos encontrado varias proteínas que posiblemente con PTOV1. En cuanto al segundo gen, corresponde a EMT (Extraneurona Monoamine Transporter). La expresión de EMT en determinados tumores de próstata es interesante como herramienta terapéutica, desde que se conoce que EMT actúa como transportador del análogo de la cloroetilnitrosourea SarcNU, que es una citotoxina selectiva que se internaliza en la célula específicamente a través de EMT y que actualmente se encuentra en fase clínica 1.

Autor: COLOMER VALERO ANNA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: SOLER CODINA MONTSERRAT.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La expresión de la Kidney Androgen-regulated Protein (KAP) está regulada específica y diferencialmente por andrógenos y hormona tiroidea (T3) en el túbulo proximal renal. Hemos analizado la transactivación del promotor del gen KAP en células PCT (pars convoluta) y PR (recta) derivadas de ratones transgénicos L-PK/Tag1. Transfecciones transitorias con diferentes construcciones del promotor del KAP indicaban que el fragmento de 224 bp era suficiente para mediar la expresión célula específica de dicho promotor. Ensayos de retraso en gel también mostraban que un putativo elemento de respuesta a andrógenos (ARE), localizado a -39bp del inicio de transcripción, unia el receptor de andrógenos. La Dehidrotestosterona (DHT) estimulaba de manera andrógeno dpendiente la transactivación del KAP en células PCT pero no en PR y la mutación de la putativa secuencia ARE eliminaba dicha activación. Además, el IGF-1 pero no la T3 aumentaba la transactivación andrógeno dependiente de KAP en PCT. Por lo tanto, se sugeria que el efecto coperativo de T3 en la expresión del KAP existia in vivo pudiendo afectar a la activación producida por T3 de la hormona del crecimiento (GH) y a su turno de IGF-I. Estos resultados demostraban la expresión específica del corto fragmento de 224 bp del promotor del KAP y sugerian interacciones sinérgicas entre IGF-1 y andrógenos en la regulación del gen del KAP en PCT. La expresión cortical andrógeno dependiente del KAP está afectada en hipotiroidismo postnatal. La síntesis puntual de T3 a partir del día 11 postnatal, empieza una respuesta cortical débil de KAP que va aumentando hacia los día 15-16, cuando se produce un pico fisilógico de T4 y el desarrollo puberal de los ratones. Dado que las CCAAT/Enhancer-Binding proteins (C/EBPs) participan en respuestas mediadas por T3 y que en el promotor del KAP existen cuatro elementos de respuesta consenso para C/EBPs, hemos analizado su participación en la respuesta androgénica de KAP mediada por T3. La detección de p42C/EBP y p35C/EBP se encontraba correlacionada con la expresión del KAP, apareciendo en extractos renales nucleares de ratones machos control y hipotiroideos no tratados. Mediante transfecciones transitorias se mostraba como C/EBPalfa y C/EBPbeta eran capaces de inducir respuestas máximas del promotor del KAP y que la deleción de las putativas cajas de unión a C/EBPs localizadas a -429/-420 y -457/-448 producia una gran disminución de la actividad basal del promtor, irrecuperable con la sobreexpresión de C/EBPs. Tanto la deplección androgénica como la mutación del ARE conjuntamente con la delección de las cajas mencionadas aumentaba la disminución de la actividad basal del promotor producida por la delección de dichas cajas. Por lo tanto, postulamos que los andrógenos y la T3 mediante el control de C/EBPs sinergizan en la transactivación del gen del KAP.

Autor: LOUKILI NOUREDDINE.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Nuestros objetivos en esta tesis han sido: 1,- Estudiar la función de la proteína UEV1, un nuevo regulador de poliubiquitinación encontrado en la búsqueda de nuevos genes implicados en el control de la diferenciación y la proliferación celular. 2,- Analizar la arquitectura genómica del gen para UEV1. 3,- Establecer un análisis comparativo de estos genes y proteínas, incluyendo estudios filogenéticos y evolutivos. Mediante diferencial display (RAP) con RNA de una línea celular TH29 M6 de Cáncer de colon hemos identificado una nueva familia de proteínas altamente conservadas en todos los eucariotas que son variantes de los enzimas de conjugación de ubiquitinas y que no posen el centro catalítico intrínseco de estas. A estas proteínas las hemos denominado UEV. Hemos demostrado que la proteína UEV por si sola no promueve la conjugación de la ubiquitina. Hemos encontrado al menos tres isoformas para este transcrito y que este transcrito mediante secuenciación y comparación con datos genomicos hemos deducido que estas 3 isoformas se deben a un splicing alternativo. Mediante Fish utilizando clones PAC que contienen el gen UEV1 hemos podido localizar este gen UEV1 en el cromosoma 20q13.2. Desde el punto de vista funcional hemos observado mediante citometria de flujo que células M6 transfectadas para una expresión constitutiva del UEV1 presentan una mayor acumulación en fase S y G2M. Además de la alta proporción de células en fase S y G2M que en el control hemos observado una acumulación de células multinucleadas y que aumenta en proporción con el tiempo de cultivo. También hemos detectado un 3% de células apoptóticas que no existen en el control. Hemos visto que el menos parte de este fenotipo se asocia a una inhibición de la actividad de la Kinasa mitotica cdk1. Hemos demostrado la presencia de un nuevo gen, que hemos llamado kua, en el mismo locus que UEV. Hemos demostrado que, en humanos, el gen para UEV1 está fusionado con Kua. En otros organismos, como Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans, los genes Kua y UEV se encuentran en loci separados. En el locus humano Kua-UEV1, se producen tres clases principales de tránscritos, como consecuencia del posible uso de dos promotores independientes y de un "splicing" alternativo. Estos tránscritos se traducen a tres tipos de proteínas, UEV1A, Kua y el híbrido Kua.UEV. Hemos demostrado que la proteína UEV1A se localiza sobre todo en el núcleo de la célula, mientras que Kua y Kua-UEV se localizan en estructuras citoplasmáticas. Otro aspecto que hemos estudiado es la expresión de estos genes en el desarrollo embrionario en Drosophila melanogaster y en el ratón. En el desarrollo embrionario temprano del ratón, Kua se expresa inicialmente sobre todo en el sistema nervioso central, con una peculiar expresión en ciertos tejidos como en el ojo en desarrollo. En estadios más tardíos, Kua se expresa de forma más amplia. La proteína Kua se conserva en todos los eucariotas, excepto hongos y levaduras y en el principio tampoco encontramos ninguna proteína con alguna similitud en procariotas. Muy recientemente hemos encontrado en los bancos de datos la secuencia de un gen llamado carF del procariota M.xanthus cuya secuencia proteica presenta una alta similitud a nuestra proteína Kua. Nuestro análisis filogenético del gen Kua y la predicción de la proteína sugieren que este gen sufrió un evento de transferencia horizontal entre eucariotas y la bacteria Myxococcus xanthus o su ancestro. En este organismo, el ortólogo de Kua es la proteína CarF, un sensor de luz azul que regula la expresión de los enzimas de la ruta biosintética de carotenoides. CarF bacteriano y Kua humano colocalizan cuando se expresan en células eucariotas superiores. Así por analogía con CarF, especulamos que Kua pueda ser un sensor de cambios redox intracelulares.

Autor: MARTINEZ SELVA DAVID.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La finalidad de esta tesis ha sido la de estudiar las funciones alternativas para la proteína transportadora de esteroides sexuales (SHBG/ABP) en la espermatogenesis y el cáncer de prostata. 1,- En la espermatogenesis se han usado dos modelos: El ratón transgénico que sobreexpresa la SHBG/ABP de rata y el ratón transgénico que sobreexpresa la SHBG/ABP humana. A,- Ratón transgénico para la SHBG/ABP de rata. La sobreexpresión del transgen de rata a nivel del testículo provoca un bloqueo parcial de la promera división meirotica y aumento de la muerte celular programada o apoptosis de las células germinales, específicamente espermatocitos primarios y células meioticas. Estas células apoptoticas sobreexpresan el mRNa y la proteína del receptor de estrogenos beta. La proteina, ADMEAs, se cumula a nivel del citoplasma de dichas células apoptoticas. B,- Ratón transgénico para la SHBG/ABP humana. El transcrito que se sobreexpresa a nivel del testiculo de la línea shbg 11 procede del promotor alternativo y contiene el exón alternativo; además la SHBG/ABP humana se expresa en las células germinales. La proteína SHBG/ABP humana se encuentra a nivel de acrosoma de las células germinales a lo largo de la fase de elongación de la espermatogenesis y a nivel del acrosoma en los espermatozoides epididimarios. 2,- Para el estudio del cancer de prostata se han usado diferentes lineas celulares de prostata y muestras de pacientes con cáncer de prostata. A,- Lineas celulares de cáncer de prostata. Se ha trabajado con dos lineas celulares tumorales (PC3 y LNCaP) y líneas celulares normales (CAHVP10 y PZHVP7). Las lineas PC3 y LNCaP sobreexpresan tres transcritos que codifican para la SHBG/ABP humana. El transcrito maioritario da lugar a la proteína secretada, mientras que los otros dos transcritos, a los que les fatan respectivamente los exones 7 y 6-7, dan lugar a una proteina intracelular. La diferencia entre la línea PC3 (andrógeno-independiente) y las LNCaP (Andrógeno-dependiente), estriban principalmente en que las PC3 expresan la isoforma CX del receptor de estrogenos beta. B,- Pacientes afectos de cáncer de prostata. En 4 de los 6 pacientes analizados se expresa la SHBG/ABP humana, en 3 de ellos se expresan el receptor de estrógenos y en todos se sobreexpresa las P450 Aromatosa. La proteína SHBG se acumula en el interior de las células epiteliales de las glandulas tumorales en las secciones prostáticas de los pacientes analizados.

Autor: PALENZUELA DÍAZ LLUÍS.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DOCTORADO Y FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Se ha abordado el estudio genético-molecular de una extensa familia española afectada por una nueva forma de distrofía muscular de cintura (Limb-girdle muscle dystrophy, LGMD) con herencia autosómica dominante. Una vez definida la clínica de forma detallada, se han comparado sus características con las de las otras 5 formas autosómicas dominantes previamente conocidas. Si bien ya algunos de los rasgos clínicos eran diferenciales, mediante el análisis de ligamiento a 3 puntos (2 marcadores-enfermedad) de marcadores polimórficos ligados a estas formas (regiones 1q11-q21, 3p25, 5q31, 6q23 y 7q), se han podido excluir éstas como responsables de la enfermedad en la familia estudiada. Una vez establecido que nos encontrábamos ante una nuevas forma genéticamente diferenciada, se ha procedido a realizar un análisis de ligamiento completo a 2 puntos (marcador-enfermedad), analizando un amplio grupo de marcadores polimórficos dispersos por los 22 cromosomas autosómicos, comprobando manual y estadísticamente su segragación respecto al fenotipo clínico. Inicialmente se han utilizado microsatélites marcados con fluorescencia y para el fine mapping se han utilizado microsatélites adicionales marcados radiactivamente, habiéndose incluído en esta última parte hast 55 individuos del pedigrí, 27 afectos y 28 sanos. Como resultado, se ha podido encontrar el locus de la enfermedad en el brazo largo del cromosoma 7, concretamente en la región 7q31-q32. Mediante el estudio de marcadores adicionales y considerando la valiosa información de los 4 individuos recombinantes hallados en diferentes partes del pedigrí, se ha podido establecer una región candidata de unas 3,7 megabases, entre los marcadores D7S680 y D7S2544, dentro del mapa genético del consorcio humano y en la cual se han identificado una serie de genes candidatos y de expressed sequence tags (EST). El continuo avance en el proyecto Genoma Humano ha supuesto una gran ayuda a la hora de situar y escoger marcadores y genes dentro del cromosoma 7. Se ha estudiado a fondo uno de los genes candidatos, la Filamina C, proteína que se une a la actina. Se ha podido excluir la Filamina C como gen responsable de nuestra nueva forma de LGMD después de no encontrarse ninguna mutación presente en todos los individuos afectos en co-segregación con la enfermedad ni tampoco alteración en el nivel de expresión a nivel de ARNm (ácido ribonucleico mensajero). Podemos concluir que nos encontramos ante una nueva forma de LGMD autosómica dominante genéticamente diferenciada que convendría denominar LGMD1F, según la nomenclatura del OMIM (On-Line Mendelian Inheritance in Man Database).

Autor: VIVES ARMENGOL JOAQUIM.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Ante la imposibilidad económica y física de controlar ingenierilmente todos los parámetros involucrados en la pérdida de viabilidad de los cultivos in vitro de células animales ya sea debido a limitación en el subministro de nutrientes, así como por la presencia de elevadas concentraciones de subproductos tóxicos del metabolismo, en este trabajo se ha explorado tanto la modificación de la formulación del medio de cultivo como genética de células de hibridoma con el objetivo de prolongar la supervivencia dentro de los bioreactores y rendibilizar el proceso de obtención de anticuerpos monoclonales. La reformulación del medio permitió relantizar la proliferación celular y retardar el agotamiento de nutrientes esenciales. De todas formas, estos cambios favorecieron la inducción de la muerte celular por apoptosis. El bloqueo de la apoptosis mediante el uso de inhibidores peptídicos específicos de Caspasas permitió no sólo retardar la pérdida de viabilidad de los cultivos si no también recuperarlos 36 horas después de haber inducido la muerte por falta de glutamina. Resultados similares se obtuvieron en la inhibición genética de la activación de la ruta bioquímica de las Caspasas mediante la sobreexpresión de genes protectores de la familia de Bcl-2, tanto de origen endógeno como vírico. Además, los cultivos de estas nuevas líneas celulares de hibridoma pueden ser recuperadas después de haber sido sometidas hasta 48 horas bajo condiciones inductoras de la apoptosis. Estos resultados demuestran la viabilidad de la incorporación de una válbula de seguridad genética que permite retardar el proceso de muerte por apoptosis de células que, en otras circunstancias, morirían y se acumularían en el bioreactor. Además, la sobreexpressión de genes antiapoptóticos hace a las células más resistentes y permite recuperar cultivos que, por causas accidentales inherentes a la metodología utilizada en el monitoraje y control de bioproceso o por limitaciones físicas del suministro de nutrientes, factores de crecimiento y oxigeno, se vean sometidas a condiciones inductoras de la apoptosis. De esta forma, este trabajo contribuye a la creación de un sistema de cultivo más robusto que permite evitar la enorme pérdida de rendibilidad en los procesos de obtención del producto deseado cuando los cultivos de células animales entran en la fase de muerte por apoptosis.

Autor: FERNÁNDEZ PÉREZ FRANCISCO JOSÉ.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Ets-1 y USF1 son factores de transcripción implicados en muchos procesos fundamentales del desarrollo y la diferenciación celular. Defectos en su regulación se han asociado con desórdenes patológicos e infecciones virales. Ets-1, en particular, es un paradigma del mecanismo de regulación transcripcional en virtud del cual la capacidad de Est-1 para unir DNA y, por tanto, de transactivación, están silenciadas constitutivamente (autoinhibición). La desrepresión de Ets-1 se puede lograr por medio de interacciones proteína-proteína, que desenmascaran el dominio de unión a DNA de Ets-1 y conducen a la formación de un complejo ternario de gran afinidad entre Ets-1, una proteína compañera y el sitio de unión combinado para ambos factores de transcripción. En este trabajo, emprendimos la elucidación estructural del mecanismo de autoinhibición de Ets-1. Comenzamos con la clonación, expresión y purificación de Ets-1 y las proteínas compañeras USF1 y MafB. A medida que íbamos enfrentando nuevos desafíos, diseñamos métodos y aproximaciones que facilitaran la producción eficaz de proteínas de unión a DNA para biología estructural. Uno de los conceptos fundamentales que ha reaparecido en el presente estudio es la necesidad de proporcionar a cada proteína un entorno lo más parecido posible al que disfrutan en su contexto biológico. Por ejemplo, la estabilización de Ets-1 no fue posible hasta que se añadió el complejo USF1/DNA, que semeja las condiciones fisiológicas en las que USF1, unido a DNA, recluta Ets-1 sobre su sitio de unión. Hemos producido con éxito un conjunto de complejos ternarios Ets-1/USF1/DNA para los cuales hemos buscado condiciones de cristalización. Hemos obtenido cristales, que hemos probado contienen Ets-1, USF1 y DNA. El refinamiento (optimización) de esas condiciones de cristalizaicón preliminares debería conducir en definitiva a la obtención de cristales de suficiente calidad para difracción. Estos cristales ofrecen la posibilidad de profundizar nuestro conocimiento en un mecanismo de regulación que tiene una importancia capital en enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o muchos tipos de leucemias.

Autor: PERICAS BELTRAN JORDI.
Año: 2000.
Universidad: ISLAS BALEARES.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAT DE CIENCIES.

Resumen: Esta tesis doctoral, se ha centrado en el estudio de los cambios en la capacidad termogénica que se producen con la edad y que afectan a los mecanismos de ajuste y mantenimiento del peso corporal. Inicialmente, se plantea la realización del estudio en animales controles, teniendo como objetivo básico determinar la evolución de los prámetros termogénicos y su respuesta al ayuno con la edad, centrándonos en la proteína desacoplante termogénica, denominada termogenia (UCP o UCP1). Se complementan dichos trabjos con la obsevación del comportamiento termogénico de ratas controles comparadas con ratas obesas de postcafertía. Asimismo, se han estudiado en humanos, los cambios relacionados con la edad en la expresión de las proteínas UCP2 y leptina. En los dos modelos animales estudiados, obesidad y envejecimiento, los parámetros termogénicos están alterados, más elevados en las ratas obesas y más bajos en las de mayor edad. Sin embargo, en ambos modelos, los parámetros termogénicos no varían cuando se someten a un período de ayuno de 24 horas. Así pues, la falta de respuesta frente al ayuno parecer ser una señal general de alteración termogénical del tejido adiposo marrón (TAM), que es indepediente del estado termogénico previo al ayuno. Se ha establecido también la implicación de la subpoblación mitocondrial más liegera (M15) en la respuesta adaptativa del TAM frente al ayuno, lo que podría relacionarse con una mayor velocidad de recambio de la UCP1 contenida en esta fracción. EL posterior descubrimiento de otras proteínas homólogadas a la UCP presentes en humanos (UCP2 y UCP3) renovó las expectativas sobre el posible papel termogénico de las proteínas desacoplantes en humanos. Así como segundo ojetivo se plantea la caracterización de los cambios asociados con la edad en la expresión del gen de la UCPO2 en tejido adiposo blanco, y su relación con la expresión de la leptina en humanos. Los datos apuntan, que al menos en individuos con peso normal o moderadamente obesos, la expresión de leptina y UCP2 en el tejido adiposo subcutáneo depende en mayor grado de la edad y del género que del peso corporal. Además, en mujeres, existe una correlaciónpositiva entre la expresión de UCP2 y de leptina en el tejido adiposo subcutáneo lo que podría reflejar una interación autocrina y/o paracrina del la leptina y la UCP2 en el adipocito, dependiente del género.

Autor: RIBOT RIUTORT JOAN.
Año: 2000.
Universidad: ISLAS BALEARES .
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAT DE CIÉNCIES.

Autor: VICENTE RABANEDA SUSANA .
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El óxido nítrico(NO) se forma en las células cromafines de la médula adrenal, principalmente en las células noradrenérgicas, a partir de la L-arginia por activación de la nNOS, enzima cuya velocidad está limitada por la [L-Arg]e que entra en las células a través de un transportador de tipo y+. Una vez formado, el NO activa la GCS, fundamentalmente en células adrenérgicas, dando lugar a la formación de GMPc, que por activación de la PKG, inhibe la secreción basal de Cas, ejerciendo de este modo un papel inhibidor basal tónico. Sin embargo, el NO añadido exogenamente no altera la secreción basal de Cas, a pesar de estimular la movilización de calcio de depósitos intracelulares principalmente de los sensibles de IP3, y de inducir un pequeño influjo del mismo a través de canales de calcio de tipo N y P/Q, no aclopados a la secreción. En cambio, en condiciones de despolarización de la célula, en las cuales los canales de calcio de tipo L estan muy activos, sí se observa este efecto inhibidor de la secreción de Cas por NO, probablemente por el efecto inhibidor de la PKG sobre estos canales o por interacciones específicas del NO o de sus derivados con los canales-iónicos que constituyen los receptores ionotrópicos de los receptores colinérgicos nicotínicos, GABAérgicos y glutamatérgicos presentes en las células cromafines bovinas, cuyo efecto secretor está mediado en parte por la formación de NO y GMPc. Por otra parte, concentraciones más elevadas de NO, que pueden conducir a la formación en las células cromafines de derivados oxidados del mismo, como los peroxinitritos, producen un incremento en la secreción basal de Cas que parece deberse a la excesiva elevación de la [Ca2+]i por disrrupción de los mecanismos homeostáticos de regulación del mismo, así como a la disminución de la síntesis de Cas por inhibición de la TH, enzima limitante de la síntesis de las mismas. Estos efectos son debidos en parte al efecto citotóxico del No y peroxinitritos, demostrado por su efecto depletor del ATP celular, que hace que los mismos produzcan un proceso de muerte celular tanto de tipo necrótica como apoptótica. El proceso de muerte celular por apoptóis inducido por NO cursa con activación de las caspasas 3 y 9 y de las rutas de transducción de señales de las MAPKs y PI3K, así como de la ruta de supervivencia de NF-KB, como protectora de la muerte celular. Los factores de crecimiento NGF e insolulina son capaces de rescatar a las células de la muerte inducida por No mediante su unión a receptores específicos con antividad TK intrínseca y activación subsiguiente de la ruta de MAPK´s, en ambos casos, y de PI3K en el caso de la insulina.

Autor: ANDRES GARCIA DAVID.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo se han investigado los efectos proliferativos y tóxicos de la ciclosporinaA(CsA) utilizando como modelo experimental los cultivos primarios de hepatocitos de rata. El tratamiento de los hepatocitos con concentraciones crecientes de este fármaco(0-50 uM) provoca un incremento en los niveles de especies reactivas de oxígeno(concretamente de peróxidos) como consecuencia de la pérdida de coordinación entre los sistemas enzimáticos antioxidantes endógenos superóxido dismutasa(SOD) y catalasa, lo que da lugar a una situación de estrés oxidativo que induce la muerte celular por apoptosis o necrosis dependiendo de la dosis de CsA utilizada. La CsA durante tiempos cortos de incubación(1 y 3 horas),induce la activación de los factores de transcripción NF-kB y AP-1 implicados, entre otros, en el control de la proliferación celular y en situaciones de estrés oxidativo. El tratamiento de los hepatocitos con elevadas dosis de CsA(50 uM) y durante largos tiempos de incubación, induce la respuesta al estrés en dichas células, como queda demostrado por la activación del factor HSF1 e incrementos en la proteína y en el RNAm de la HSP70, relacionándose estos hechos con la situación de estrés oxidativo. La CsA induce el aumento en los niveles de ciclina D1.PCNA, y ciclina E a las 3 y 6 horas de incubación, lo que conduce a una situación proliferativa de los hepatocitos. Sin embargo a las 22 horas de incubación, el incremento de p27 y posiblemente la situación de estrés oxidativo generada por la CsA, junto con la disminución de los niveles de ciclina D1,PCNA y ciclina E, provocaría la salida de los hepatocitos de la fase de síntesis(fase S) o impediría su entrada enla misma. La incubación de los hepatocitos con vitamina E, atenúa la situación de estrés oxidativo provocada por la CsA, disminuyendo así la muerte celular por necrosis, lo que corrobora el papel de las especies reactivas de oxígeno en la hepatotoxicidad de la CsA.

Autor: ALVAREZ TERUEL YOLANDA.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: En este trabajo se estudian las relaciones filogenéticas existentes entre los distintos grupos englobados dentro del suborden Megachiroptera(murciélagos frugívoros o zorros voladores). Para ello se secuenciaron dos fragmentos de DNA pertenecientes a dos genes mitocondriales, el citocromo b y el RNA ribosomal 16S, y se efectuó un análisis filogenético melecular exhaustivo basado en criterios de distancias, parsimonia y máxima verosimilitud. La información contenida en ambas secuencias sirvió para esclarecer muchos de los problemas evolutivos planteados dentro de este suborden, en el que los datos morfológicos y otros datos moleculares previos, habían llevado a conclusiones conflictivas entre ellas.

Autor: DELGADO MORATO JERONIMO .
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLOGICAS.

Resumen: Aunque el efecto del ejercicio fisico sobre el músculo estriado ha sido objeto de numerosas investigaciones, el conocimiento de las posibles adaptaciones experimentadas por los sitemas de membrana, y por los sistemas antioxidantes, cuya respuesta a un incremento en la actividad concráctil podría constituir la base de las mejoras en la contractilidad cardíaca o del retraso en la aparición de la fatiga muscular, son escasos y no concluyentes y posiblemente el tipo, duración e intensidad del ejercicio realizado sean factores que determinen la diversidad de resultados descritos. Por otra parte, también son escasas las investigaciones llevadas a cabo para analizar los efectos bioquímicos que producen los esteroides anabólico androgénicos(EAA) sobre dichos sistemas en el músculo estriado. Asimismo, en los efectos adversos que los EAA puden producir sobre la función hepatica podrían estar implicadas alteraciones de los sistemas antioxidantes en hígado. En la presente Tesis se ha estudiado el efecto de distintos tipos entrenamiento, de una sesión de ejercicio exhaustivo y del tratamiento con el EAA estanozolol sobre los sistemas anteriormente mencionados. En EDL, en respuesta a un entrenamiento de intensidad alta se ha observado una tendencia a la disminución en el contenido en receptores de DHP y rianodina y un descenso de la actividad Ca2+-ATPasa, mientras que un entrenamiento moderado no origina cambios. Por otro lado, una sesión de ejercicio exhaustivo afecta únicamente al sóleo, observándose la disminución de la unión de rianodina y de la actividad Ca2+-ATPasa, tanto en ratas sedentarias como entranadas; la recuperación de los niveles es más rapida en animales entrenados. Respecto a la capacidad antioxidantes de músculo estriado, el entrenamiento de resistencia parece inducir cierta adaptación, observándose incrementos en algunas de las enzimas antioxidantes en corazón y músculo esquelético. La modificación más consistente es el aumento de la actividad SOD, lo que sugiere la importancia el radical O2 en el estrés oxidativo asociado el ejercicio. Inmediatamente después de una sesión de ejercicio exhaustivo se detecta un descenso de las actividades catalasa, glutatión peroxidasa y glutatión reductasa en sóleo y EDL de los animales sedentarios un aumento en los niveles de ejercicio exhaustivo produce un suero,sóleo y EDL de animales sedentarios un aumento en los niveles de glutatión, probablemente asociado a mecanismos de transporte interórganos en los que podría estar implicado el hígado; el entrenamiento previo es capaz de prevenir o atenuar dichos incrementos. El tratamiento con estanozolol nos induce cambios en el rendimiento físico, ni en los componentes moleculares implicados en la regulación de los flujos de Ca2+ en músculo esquelético y corazón. Por el contrario, en musculo esquelético dicho esteroide causa un incremento en las actividades antioxidantes SOD total y Gr que podría estar relacionado con las tendencias al descenso del marcador de daño oxidativo y el aumento en contenido de glutatión total. Además, el tratamiento con estanozolol produce un incremento importante en las actividades antioxidantes hepáticas que es insuficiente para evitar la inducción de estrés oxidativo.