BIOQUIMICA MOLECULAR, 26

Autor: MARGARETO SÁNCHEZ JAVIER.
Año: 2000.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: En el presente trabajose ha desarrollado un modelo animal de obesidad inducido por el consumo de una dieta de cafetería. Una vez generado el modelo de obesidad, se investió la influencia de la dieta sobre parámetros sanguíneos realcionados con el metabolismo glucídico y lipídico así como sobre la expresión de genes implicados en procesos como la termogénesis y adipogénesis. Por otro lado, se ha estudiado el efecto de la administración de un agonsita adrenérgico B3 (tertatolol) sobre la expresión de genes relacionados con al termogénesis, UCP1, UCP2 y UCP· en tejido adiposo blanco, pardo y músculo esquelético, y con la adipogénesis del tejido adiposo blanco (PPARy, RXRa, C/EBPa y aP2). La administración de Tertatolol a una dosis de 1 mg/kg día en ratas alimentadas con una dieta de cafetería disminuyó el peso corporal y los depósitos grasos, redujo los niveles circulantes de leptina, aumentando, además , los niveles de glicerol en suero, probando así el efecto lipolítico del fármaco. La temepratura corporal aumentó tras el tratamiento con Tertatolol. Este efecto parece estar mediado por el aumento de los niveles de expresión de UCP1 en tejido adiposo blanco y músculo gastroenemius y de UCP2 en músculo. También se detecto una disminución de los niveles de expresión de genes implicados en la diferenciación y desarrollo del tejido adipos o blanco (PPARy, RXRa y aP2), lo que indica que la administración del agonista adrenérgico b3 Tertatolol, fue capaz de inhibir la adipogénesis de este tejido. En conclusión, el Tertatolol constituye una posibilidad para el tratamiento de la obesidad.

Autor: BOLEAS AGUIRRE M. SOLEDAD.
Año: 2000.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: En esta tesis se pretendió estudiar la capacidad de los adenovectores de transducir dos lineas celulares de carcinoma epidermoide. La KB de carcinoma epidermoide bien diferenciado de cavidad oral humano y la SCCVII/SF de carcinoma epidermoide murino. Esto se comprobó in vitro e in vivo con la tinción de X-gal despues de exponer las celulas y tumores KB y SCCVII/SF al adenovirus recombinante portador del gen marcador lacZ)AdCMVlacZ). Tambien se quiso estudiar el efecto antitumoral de la transducción del gen suicida de la enzima timidin-kinasa del virus Herpes simplex (HVS-tk) asociado a la administración de ganciclovir (GCV) en las dos lineas celulares anteriormente referidas. La transfección celular se efectuó con el adenovirus recombinante portador del gen de la enzima timidin-kinasa del virus Herpes simplex con el promotor del citomegalovirus(AdCMVtk). En el modelo experimental in vitro, en ambas lineas celulares, el efecto antitumoral del tratamiento con el gen terapéutico (HVS-tk), se valoró por la comparación del porcentaje de supervivencia de las celulas tratadas con el AdCMVlacZ) y las mismas concentraciones de GCV con respecto a las expuestas al adenovirus marcador (AdCMVlacZ) y las mismas concentraciones de GCV, que sirven como grupo control. La supervivencia del grupo tratado con AdCMVtk/GCV es inversamente proporcional a la dosis de GCV. Asi mismo se comprobó que la supervivencia es menor en las celulas tratadas con AdCMVtk/GCV. Asi mismo se comprobó que la supervivencia es menor en las células tratadas con AdCMVtk/GCV que en las expuesta a AdCMVlacZ/GCV, de manera estadisticamente significativa. En el modelo experimental in vivo, en ambas lineas celulares, se valoró, mediante la tecnica estereológica de estimación de volumenes de Cavalieri, el porcentaje de volumen de necrosis con respecto al volumen total en todos los tumores, y se compararon los resultados entre el grupo de ratones tratados con AdCMVtk y GCV y el control (expuestos al AdCMVlacZ y GCV). Se comprobó que el volumen de necrosis con repecto al total es mayor en el grupo tratado con AcCMVtk/GCV con respecto al que recibió AdCMVlacZ/GCV, de manera estadisticamente significativa. En el modelo experimental in vivo se pretendió establecer un modelo animal para la valoración de la eficacia antitumoral de los genes suicidas y estudiar su viabilidad en cuanto a la capacidad de desarrollar tumores y en la repercusión tóxica hepática y renal. Con estos fines se desarrollaron tumores KB un modelo animal inmunodeficiente y tumores SCCVII/SF en un modelo animal inmunocompetente. En este ultimo tambien se valoro la extensión tumoral lo corregional (local y ganglionar cervical).

Autor: VARELA REY MARTA M..
Año: 2000.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El factor de necrosis tumoral-a(TNF-a), disminuye la expresión del gen de procolágeno z1(I) en las celulas estelares hepaticas en cultivo (CEH). En este trabajo se ha estudiado tanto el papel del estrés oxidativo,como el de la señalizacion intracelular en la acción antifibrogénica del TNF-a. Hemos encontrado que el TNF-a no aumenta en la CEG las especies de oxigeno reactivas y que los antioxidantes no previenen el efecto antifibrogenico de la citoquina. Sin embargo, el tratamiento con TNF-a disminuye la concentración intracelular de glutation reducido,y este efecto esta implicado en la acción antifibrogenica del TNF-a. Ademas, hemos estudiado, tanto el papel de las esfingomielinasa ácida (Emasa-A),como el de quinasas miembros de la superfamilia de las MAPKinasas, concretamente el de la MAPK, la SAPK y el de la p38 MAPK, en la acción antiofibrogénica del TNF-a. Hemos encontrado que tras el tratamiento con TNF-a disminuye la fosforilación de la p38 MAPK, y que esta disminución se correlaciona con la inhibición en los niveles de RNAm del procolágeno 1a(I) debida a la citoquina. Ambos efectos son dependientes de Emasa-A, ya que pueden prevenirse con el pretratamiento con el inhibidor SR33557. La implicacion de la p38 MAPK en la regulación de los niveles de RNAm de procolágeno 1a (I) se confirmó por el incremento en los niveles de fosforilación de la p38MAPK en respuesta a una citoquina que induce la exprexión del colágeno en CEH, el TGF-B. El inhibidor de la p38MAPK,SB203580, mimetiza el efecto inhibitorio del TNF-a sobre los niveles de RNAm de procolágeno 1a(I) y previene la induccion en los mismos debida al TGF-B. Estos resultados sugieren que la p38 MAPK juega, en las CEH, un papel importante en la regulación de la expresión de la expresión del gen de procolágeno 1a(I).

Autor: SESMA PASCUAL M. TERESA.
Año: 2000.
Universidad: NAVARRA .
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El objetivo del presente trabajo ha sido la identificación de genes que se expresan de manera diferencial durante la maduración de los monocitos. Utilizamos la tecnica del RNA fingerprint para comparar la expresión génica tras la incubación de células mononucleares con un péptido inmunopotenciador. El gen de la beta-hemoglobina aparecia inducido durante el proceso y otros seis genes reprimidos: piruvato quinasa, GRASP65, ubinucleina, y tres secuencias desconocidas hasta el momento (22C2b,23C1b,23C1a). La expresion diferencial de estos genes fue analizada por RT-PCR mediante el uso de cebadores especificos para cada uno de ellos en celulas obtenidas de seis individuos diferentes. La evolución fenotípica durante el proceso junto con la expresión de una serie de genes previamente identificados como diferenciales fueron analizados con el fin de establecer el nivel de maduración de cada muestra ya que el patrón de respuesta de cada muestra depende del estado de maduración de cada una de ellas.

Autor: GOMEZ PARDO M. BELEN.
Año: 2000.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: En el presente estudio se realiza un analisis de los genes ARNr, utilizando tecnicas citogenéticas y moleculares, con el objetivo de contribuir al conocimiento de aspectos basicos, funcionales y evolutivos de esta importante familia génica, asi como de las caracteristicas poblacionales y la filogenia de este grupo de peces escasamente analizado. El analisis cariotípico realizado en cinco especies de este Orden, Scophthalmus maximus, Scophthalmus rhombus, Plstichthys flesus, Solea solea y Solea lascaris, ha permitido establecer el cariotipo estandar, asi como la localización de los NOR en estas especies. Los análisis realizados no han permitido detectar la existencia de heteromorfismos cromosómicos asociados al del sexo en ninguna de las especies analizadas. Los resultados obtenidos reflejan una constitución cariotípica y una localización de las regiones NOR muy similar dentro de cada una de las familias analizadas de este Orden. El análisis molecular de los genes ADNr nos ha permitido obtener un primer mapa de restricción de la totalidad de la unidad ribosómica en cinco especies de este Orden: S.maximus, S.rhombus,P.flesus, S.solea y S.lascaris. Asimismo, hemos demostrado la existencia de una importante variabilidad en el tamaño de los espaciadores intergénicos (IGS) de las cinco especies. Este analisis ha demostrado que la escasa diversidad detectada en S.maximus para isoenzimas no es extensible a otras regiones del genoma. Finalmente, los resultados obtenidos del analisis filogenetico realizado, tras la secuenciación de parte del ADNr mitocondrial 16S en 29 especies de este Orden y mediante tres métodos de reconstrucción filogenética, y la comparación de estos con los datos previos existentes, ha demostrado la existencia de una elevada divergencia evolutiva entre las diferentes familias analizadas.

Autor: FREIRE GALLARDO JAVIER.
Año: 2000.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La Protimosina a(ProTx) es una proteina nuclear ampliamente en todos los tejidos de mamiferos, cuya función se relaciona con la proliferación celular, aunque no son conocidos los mecanismos mediante los cuales esta proteina ejerce su actividad. Con la intención de esclarecer su función, llevamos a cabo la caracterización de componentes celulares que, en los diferentes fraccionados subcelulares de celulas linfoides(NC37), muestran afinidad por ProTz,enlazada a Sepharosa. Este procedimiento nos ha permitido establecer la capacidad de interacción in vitro de ProTa con proteinas como las historias H2A,H2B,H3 y H4 cuya interacción ya habia sido demostrada en otros tipos celulares en nuestro laboratorio, y tambien con la proteina quinasa de fosforila ProTa(ProTaK), cuyo estudio se completa con la investigación de su localización subcelular y evolución de su actividad con el ciclo celular. Para profundizar en la función nuclear de ProTa,investigamos su movilización al núcleo, demostrando, que la interación de ProTa con los nucleos es dependiente de la presencia conjunta de proteinas que interactuan con ella y que estan presentes tanto en los fraccionados subcelulares citoplasmaticos como nucleoplasmáticos. Mediante tecnicas de transferencia o inmunoreacción con anticuerpos especificios, identificamos entre estas proteinas a las Karioferinas B y a; a la proteina Ran y a la proteina RCC-1, relacionada con la actividad de Ran. Esta interacción in vitro evidencia una intervención de estas proteinas en el transporte al núcleo de la ProTa. Dada la aparente implicación de ProTa en los procesos de proliferación celular, investigamos entre las proteinas que interaccionan con ella, algunas de las que pudieran estar relacionadas en el metabolismo del DNA y en el control del ciclo celular. Asi, experimentos de inmunodetección nos permitieron demostrar que la ProTa interactúa con las proteinas PCNA,Cdk2 y ciclina A, implicadas en la replicación y organización estructural de la cromatina. Esta propiedad, junto con la interacción con las historias, evidencian una función nuclear de la ProTa relacionada con la actividad replicativa y de organización estructural de la cromatina.

Autor: MENENDEZ FERNANDEZ M. CARMEN.
Año: 2000.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA. SANTIAGO DE COMPOSTELA.

Resumen: El tejido adiposo humano segrega leptina en cantidades detectables y los niveles de leptina plasmáticos son una manifestación directa de la masa adiposa total. No obstante, otros factores hormonales contribuyen de forma destacada a modular la secreción de leptina acutando directamente sobre el adipocito, por lo cual, y sobre todo en la mujer, las cifras plasmáticas de leptina reflejan no solo masa adiposa sino tambien estado hormonal. Como ejemplo de lo anterior, en el presente hemos demostrado por vez primera, que factores hormonales proteicos y reguladores de recptores nucleares no clásicos modulan la secreción adipocitaria de leptina, si bien su peso en las cifras circulantes de la misma no están clarificadas. La tecnica de determinación semicuantitiva de ARNm de leptina en adipocitos por RT-PCR no tiene la precisión suficiente para su utilización sistemática.

Autor: HURTADO GUERRERO RAMÓN.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARSICOLOGÍA Y BIOMEDICINA.

Resumen: 1,- Se ha llevado a cabo la purificaicón de la 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA (HMGR) de Trpanosoma cruzi y se ha caracterizado cinéticamente, demostrando ser una proteína soluble y de clase I, con propiedades similares a las HMGRs eucarióticas descritas. 2,- Todas las estatinas utilizadas se comportan como inhibidores competitivos clásicos, excepto la cerivastatina. Este último inhibidor presenta un proceso de isomerización del complejo formado inicialmente con el enzima, lo que provoca un incremento de la afinidad por el inhibidor de aproximadamente 50 veces para la HMGR de T. Cruzi. 3,- El modelo obtenido de la HMGR de T. Cruzi es muy similar a la estructura de la HMGR humana, aunque existen pequeñas diferencias en el sitio activo que podrían se explotadas en el desarrollo de fármacos específicos. 4,- La HMGR de Leishamania major se localiza enla matriz mitocondrial y el dominio amino terminal de la proteína es responsable del transporte hacia el interior de esa organela. 5,- De acuerdo con los experimentos realizados con el m-RNA antisentido, la HMGR es esencial para la viabilidad de Leishmania major que incluso en presencia del producto de la reacción, el mevalonato, es incapaz de tolerar niveles disminuidos de actividad.

Autor: SARKER MALABIKA.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA, CSIC..

Resumen: La presente disertación comprende los estudios realizados sobre el papel de CD95L/FasL en la muerte celular por activiación inducida con carbacol, producida en la línea de células humanas lelucémicas T Jurkat JHM.1 (que expresan el receptor muscarínico para carbacol) y los estudios sobre la regulación de la expresión del receptor de muerte CD95/Fas. Además, se aclara el papel de PKC en la regulación de la apoptosis inducida por TRAIL, tanto en la línea celular leucémica T Jurkat, como en la línea celular de cancer de mama MCF-7, y se analiza la implicación de MEK-1, de la vía de ERK, en la apoptosis producida por TRAIL, CD95/Fas y la droga doxorubicina. Hemos encontrado que en la línea celular leucémica humana T Jurkat, la vía de ERK es necesaria para la muerte celular a través del HMR1, estimulado con carbacol, y que la expresión del ARNm de CD95 se regula positivamente con agentes farmacológicos, PDBu e ionóforo, que imitan la activación de células T. La inducción del promotor de CD95 dependiente de activación requiere los nucleótidos -391 a -331. La estimación por activación del CD3 en combinación con ésteres de forbl, también induce la actividad del promotor de Fas. P21 Ras esta parcialmente implicado en las vías de señalización al servir de enlace en la activación de células T Jurkat por ionóforo y PDBu. MEK-1 participa parcialmente en la transmisión de señales estimuladores desde Ras al gen Fas; Rac no esta implicado en la activación del promotor de Vas, el estimularlo con ionóforo y PDBu. La activación del promotor de Fas a través de PDBu/ionóforo y de CD3/ionóforo, es sensible al inhibidor de calcineurina CsA. También el facor de transcripción NFAT esta parcialmente implicado en la activación del promotor de Fas inducida por PDBu e ionóforo. En la línea de células leucémicas humanas T Jurkat, hemos encontrado que la activación de PKC previene la activación de caspasas, la fragmentación de PARP y la apoptosis inducidas tras el tratamiento conTRAIL. Admeás hemos encontrado una disminución tanto del potencial de membrana mitocondrial como de la translocación de citocromo c de la mitocondria al citosol, al inducir las células con TRAIL, en presencia de activación de PKC. La activación de MAPK esta implicada en el mecanismo de prevención por PKC de la liberación de citocromo c desde la mitocondria, mediada por TRAIL. La inhibición de la vía de MAPK revertió parcialmente la prevención, por PKC, de la apoptosis mediada por TRAIL. A parte de esto, la activación de PKC podría también inhibir la apoptosis inducida por TRAIL a través de un mecanismo independiente de MAPK.De este modo, la activación de PKC juega un papel negativo en la regulación de señales de paoptosis inducidas por TRAIL. En la línea celular de cancer de mama humano MCF-7, PKC previno la apoptosis mediada por TRAIL mas debajo de la activación de caspasa 8 y de la fragmentación de Bid, a través de la inhibición de la translocación de Bax desde el citosol. Hemos encontrado que la inhibición en la liberación de citocromo c mitocondrial, inducida por TRAIL, es idependiente de la vía de MAPK. La estimación de células Jurkat conTRAIL/anti-CD95/doxorubicina induce la fragmentación del MEK1 endógeno como respuesta tardía de apoptosis. Ya que TRAIL es un ligando de uso potencial en inducción selectiva de apoptosis en células tumorales, estos hallazgos pueden aportar información relevante en la terapia del cáncer.

Autor: PLANELLES CARAZO LOURDES.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA .
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICICA "LOPEZ NEYRA". CSIC.

Resumen: Trypanosoma cruzi es un protozoo parásito, agente causal de la enfermedad de Chagas. En el desarrollo de la Tesis se establecen los modelos murinos de susceptibilidad y resistencia a la infección. Cuando los ratones BALB/c se infectan con T. Cruzi,experimentan elevadas parasitemias que conducen a la muerte de lso animales. Sin embargo, los ratones de la cepa C57BL/6, tras la infección, controlan rápidamente el pico de parasitemia con una tasa de supervivencia del 100%. El análisis del perfil de citoquinas para las células T CD3+ del bazo muestra que los ratones resistentes C57BL/6 presentan una mayor producicón d eIFN-y e IL-2 y menor de IL-10 que la observa en los ratones BAKB/c sensibles. Las poblaciones de macrófagos y células dentríticas de bazo se encuentran incrementadas en ambas cepas tras la infección por T. Cruzi. En esta células las moléculas de coestimulación CD40 y CD86 están inhibidas enla cepa susceptible y no en la resitente. El análisis del peritoneo revela que los ratones BALB/c y C57BL/6 presentan tras la infección, un aumento de la población de células T CD3+ con un diferente perfil de citoquinas, caracterizado por uan mayor producción de IL-4 y menor de TNF-a en ratones susceptibles, y un incremento de IFN-y en los resistentes. Además, solo en los ratones resistentes aumentan los macrófagos del peritoneo, mostrando una expresión preferente de citoquinas de tipo Th1. El análisis sobre la antigenicidad de la proteína KMP11 de T. Cruzi pone de manifiesto que los sueros de pacientes chagásicos presentan altos títulos de anticuerpos frente a la proteína KMP11 de T. Cruzi, los cuales, a diferencia de lo que ocurre con sueros de personas con leishmaniasis, reconocen de manera sensible y específica dos determinantes antigénicos lineales. Por otra parte,la proteína recombiante KMP11 de T. Cruzi muestra ser en modelos experimental es murinos un potente inmunógeno celular. En el contexto de inmunizaciones genéticas, también el gen KMP11 es un buen inductor de respuesta proliferatiava. La fusión de la proteína HSP70 a la KMP11, como vacuna genética, modual la respuesta inmune generada frente a este antígeno, estimulando la producción de anticuerpos IgG de isotipo IgG2a y la activación de CTLs CD8+ espcíficos frente a dos péptidos dela proteína KMP11. Los ensayos de protectividad en ratones BALB/c muestran que el gen KMP11 solo o fusionado al gen HSP70 provoca un claro descenso de la prasitemia y confiere protección frente a la infección experimental con T. Cruzi a corto plazo (2 semanas tras la última inmunización). Después del reto a medio plazo (9 semanas tras la última inmunización) únicamente los ratones inmunizados con el plásmido conteniendo fusionados ambos genes sobreviven a la infección por T. Cruzi en un porcentaje del 33%. Otro aspecto analizado en este trabajo es la capacidad de la proteína HSP70 de T. Cruzzi para inducir in vitro la maduración de células dentríticas. Los resultados indican que la incubación de las células dendríticas murinas con las proteínas HSP70 ó KMP11-HSP70 estimula la producción de IL-12 y TNF-a así como aumenta la expresión en superficie de las moléculas CD80, CD86, ICAM-1, CD25,CD40 e IA, fenómeno indicativos de que las células dentríticas están maduras y activadas.

Autor: HIDALGO ZARCO FERNANDO.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA "LÓPEZ-NEYRA" CSIC.

Resumen: Leishmania major es el protozoo parásito agente causal de la leishmaniasis, la cual afecta a 12 millones de personas en 88 países de todo el mundo. El tratamiento actual está basado en antimoniales pentavalentes, los cuales además de su baja efectividad, presentan alta toxicidad, por lo que se hace necesarios desarrollar nuevos compuestos para controlar esta enfermedad. La enxima desoxiuridina 5'-trofosfato-nucleótido hidrolasa (dUTPasa) cataliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato, siendo crítica en el mantenimiento de los niveles intracelulares de nucleótidos pirimidínicos, y carece de homología con las enzimas descritas en otros organismos, por lo que podría ser un atractivo blanco de acción de fármacos en el futuro. En primer lugar, se ha llevado a cabo una caracterización cinética exhaustiva, basada en un método de cinética rápida continuo, poniéndose de manifiesto notables diferencias con la enzima humana, tales como la capacidad de hidrolizar eficientemente dUDPO, además del derivado trifosfato, y la alta inhibición producida por el producto (dUMP). Otra gran diferencia encontrada es también la conformación cuaternaria dimérica, siendo la primera vez que se describe una dUTPasa no trimérica o monomérica. Además, se ha estudiado la inhibición "in vitro" del enzima por distintos compuestos análogos al dUTP, algunos de los cuales inhiben selectivamente la enzima parasitria, lo que junto con las diferencias catalíticas y estructurales, la hacen una atractiva diana terapéutica. Al mismo tiempo, se ha descrito una localización dual del enzima (nuclear y mitocondrial), presentando una única forma en ambos orgánulos. Con objeto de determinar la estructura tridimensional de esta enzima se han puesto a punto condiciones de cristalizaicón en condiciones nativas y formando complejos con dUDP y dUTP, a partir de los cuales en un futuro próximo se podrá obtener dicha estructura tridimensional permitiendo el desarrollo racional de fármacos. No obstante, se ha realizado un modelo a partir de la estrucutra de la dUTPasa de Trupanosoma cruzi, con la cual posee un 52% de identidad en su secuencia aminocídica. La estructura está formada por dos subunidades idénticas, y presenta una estructura secundaria en a-hélice, lo que la diferencia de las estructuras resueltas a partir de enzimas triméricas, por lo que se corroboran las posibles diferencias estructurales en el sitio activo de esta dUTPasa con las descritas hasta el momento. Finalmente, se han estudiado aspectos biológicos de esta enzima, como su regulación con el cilco celular, presentando niveles máximos de transcripción durante la fas S, lo cual es lógico, debido a que es en esta fase donde se realiza la replicación del ADN, y por esto los niveles de nucleótidos deben estar correctamente regulados para evitar la introducion de mutaciones. Finalmente, se ha puesto de manifiesto la esencialidad del enzima para la viabilidad del parásito, mediante experimentos de "RNA-antisense", aunque encondicioens de supresión de la actividad dUTPasa, son auxótrofos para la timidina, debido a que aumentan la concentración de dTTP intracelular, evitando así la incoporación de uracilo al ADN, y la posterior muerte celular. En definitiva, los resutlados obtendios en esta Tesis Doctoral, confirman la idoneidad de esta enzima como potencial blanco de acción de fármacos para el tratamiento específico de la leishmaniasis en el futuro.

Autor: CARNICERO ZÁRRAGA DAVID.
Año: 2000.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: VETERINARIA.

Resumen: En este trabajo se ha obtenido una cepa de la especie Pseudomonas putida capaz de degradar ácido 4-fenilbutírico. A esta cepa se la ha dominado P. Putida PB. La cepa a partir de la cual se obtuvo ésta fue P. Putida U. Se ha determinado la diferencia de crecimiento que existe entre las dos cepas cuando crecen en medios mínimos suplementados con distintas fuentes de carbono. También se ha secuenciado una zona del genoma de 9 Kb correspondiente con el sistema de transporte de ácido 4-fenilbutírico. Este es un sistema de trandporte ABC. Se han obtenido mutantes en esta zona del genoma y caracterizado el crecimiento en medio mínimo suplementado con ácido 4-fenilbutírico. Por útlimo se han obtenido mutantes en los genes fadA y fadB (codifican el complejo enzimático de B-oxidación) y se han analizado los productos que acumulan estos mutantes cuando crecen en medio mínimo suplementado con ácido 4-fenilbutírico como única fuente de carbono, determinando que el intermediario de la degradación del ácido 4-fenilbutírico en P. Putida PB es el ácido 4-fenil-2-butenoico.

Autor: CALLEJO DE PRADO AINHOA ITZIAR.
Año: 2000.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las quinasas activadas por señales extracelulares (ERKs) constituyen una superfamilia de proteinas cuyos componentes se agrupan en tres principales familias: ERK/MAPK, JNK/SAPK y p38MAPK. Estas familias descriten tres rutas de transducción de señal en respuesta a gran variedad de estímulos (mitogenicos y de tipo estrés). Estas rutas se inician a nivel de la membrana celular gracias a la percepción del cambio extracelular, se interiorizan y progresan en el citoplasma gracias a la activación en cascada de los componentes de la ruta por fenomenos de fosforilación reversible, y alcanzan el nucleo donde se verifica un cambio en el patrón de expresión genica que se traduce en una respuesta celular frente al estímulo. Las funciones celulares en las que se encuentran involucradas estas rutas son: proliferación y diferenciación celular (ERK/MAPK) y parada de ciclo celular, reparación del daño genetico y entrada en apoptosis(KNK/SAPK y p38MAPK) y parada del ciclo celular, reparación del daño genetico y entrada en apoptosis (JNK/SAPK y p38MAPK). Esta Memoria de Tesis centra su estudio en la caracterización del gen de una isoforma de las quinasas activadas por estrés celular, JNK/SAPKa. En dicha Memoria se detallan las caracteristicas más destacadas del gen de esta quinasa en ratón: Se trata de un gen de alrededor de 36Kpb, que consta de 13 exones que representan apenas un 8% de la secuencia completa y 12 intrones de tamaños muy variables. El codón de inicio de la traducción de localiza en el segundo exón, y el codón de fin de la traducción en el ultimo. El primer exon es pues zona transcrita del cDNA pero no codificante. Tres de los exones centrales del gen estan implicados en la genesis de las cuatro variantes descritas para la isoforma alfa de raton. La quinasa JNK/SAPKa posee 423 aminoacidos y su configuracion espacial/tridimensional guarda un modelo estructural comun con el resto de otras quinasas ERKs. Se ha identificado el extremo 5´del gen, el cual alberga el inicio de la transcripción y laregión reguladora/promotora que gobierna la expresión de dicho gen, gracias a ensayos amplificación 5´RACE, de hibridación complementarios y de analisis de estructuras o secuencias caracteristicas que marcan estos extremos ("islas CG"). Por último, se ha caracterizado, y estudiado pormenorizadamente la región reguladora 5´del gen que precede al primer exón, mediante experimentos de transfección transitoria en celulas HepG2 y ensayos luciferasa. Estos resultados permitieron postular la existencia de tres subregiones con diferentes actividad inductora y la contribución relativa de distintos elementos reguladores en la eficacia del promotor, entre ellos elementos AP-1,RORA-1, AP-2 Y CAAT. Se destaca la ausencia de caja TATA, fenomeno caracteristico y descrito en muchos genes de expresión constitutiva.

Autor: MARTINEZ GARCIA ESTEBAN.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR I.

Resumen: En este trabajo se ha detectado la presencia del gen spoS en varias bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Se ha caracterizado y secuenciado este gen en Kluyvera cryocrescens y en Enterobacter cloacae. Se ha estudiado la importancia de este factor sigma alternativo en la adquisicion de resistencia a diferentes condiciones de estrés como pueden ser pHs extremos, presion osmótica, temperatura e irradiación con luz UV. En general se puede concluir que el producto de este gen interviene en la adquisicion a resistencia a estrés durante la fase estacionaria aunque en ciertas bacterias dicha resistencia puede producirse por vias independientes a RpoS. Se ha estudiado la expresion del gen rpoS en E. Cloacae CETC 960. En esta estirpe la transcripcion de ropS viene dirigida por un promotor desconocido hasta ahora y que se encuentra presente en la secuencia de inserción IS1OR. Este promotor al que proponemos denominar p-OUTII, se encuentra regulado por RpoS y presenta una serie de caracteristicas en su regulacion comunes al promotor original de RpoS y presenta una serie de caracteristicas en su regulacion comunes al promotor original por rpoS en E.cloacae, rpoSp. Entre lo factores que pudieran estar relacionados con la regulacion se ha estudiado la relacion con fase de crecimiento, medios agotados, represion catabolica, proteinas CRP e IHF,ppGpp,etc. Finalmente se ha estudiado la relacion entre RpoS y fenotipo GASP, concluyendose la universalidad de este comportamiento en enterobacterias y la existencia de via de adquisición RpoS-dependientes e independientes.

Autor: JIMENEZ ANTON ANA ISABEL.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPART. BIOQUIMICA, FAC. VETERINARIA, UCM.

Resumen: En los últimos años se ha demostrado que el ATP actua como neurotransmisor en el SNC, al igual que esta implicado en la comunicación entre las neuronas y las celulas gliales adyacentes. Por ello, pensamos que las celulas gliales, concretamente los astrocitos de cerebelo podrian tener receptores para ATP y dinucleotidos. En este trabajo hemos caracterizado los diferentes receptores purinérgicos que se expresan en los astrocitos individuales. Todos estos estudios se han llevado a cabo con cultivos purificados de astrocitos tipo 1, los cuales se identificaron por un marcaje especifico con anticuerpos frente a la proteina glial fibrilar acida (GFAP+). Mediante tecnicas microfluorimetricas con la sonda fluorescente fura-2, hemos observado que todos los astrocitos respondian a estimulaciones con ATP movilizando calcio de reservorios intracelulares. Estas respuestas de ATP se producen por su interacción con receptores metabotrópicos P2Y. Todos los astrocitos coexpresan receptores P2Y1, P2Y2/P2Y4, los cuales se acoplan a la activación de la fosfolipasa C a traves de las distintas proteinas G. Una subpoblacion de astrocitos presentan además receptores de pirimidinas, del tipo P2Y6. Asimismo, hemos demostrado que los astrocitos tambien expresan receptores de adenosina del tipo A2B acoplados a la activacion de la adenilato ciclasa, cuya estimulacion potencia las señales intracelulares de calcio inducidas por ATP. Finalmente, los astrocitos cerebelosos tambien presentan un receptor especifico para el dinucleotido pentafosfato, Ap5A. La estimulacion de este receptor con concentraciones nanomolares de Ap5A produce la activacion de las proteinas ERKs e induce la potenciacion de las señales de calcio inducidas por ATP. Esta potenciación es diferente de la que se produce con adenosina ya que mantiene durante largos periodos de tiempo y se mimetiza por EGF. Por el contrario la inducida por adenosina era reversible. Todos estos datos sugieren que el ATP debe ejercer funciones importantes en estas celulas.

Autor: GORGOJO MARTINEZ M. BEGOÑA.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: Se ha clonado el cDNA del gen de la ATPasa de protones de membrana plasmática de Cryptococcus neoformans var.neoformans. Este tiene una longitud de 3475 pb y presenta un marco de lectura abierto de 2994 pb. La secuencia de aminoacidos deducida presenta un tamaño de 997 aminoacidos, con una masa molecular de 108.682 Da., constituyendo la proteina PMA descrita de mayor longitud. El perfil hidropatico de PMA1 presenta 10 supuestos segmentos transmembrana que concuerda con el modelo de estructura secundaria sugerido para todas las ATPasas de tipo P. En su secuencia de aminoácidos se identifican las regiones conservadas presentas en todas las ATPasas de tipo P. Igualmente, se han identificado la mayoria de los residuos conservados entre las ATPasas transportadoras de protones. La secuencia de aminoacidos de CnPMA1 comparte una mayor homologia de secuencia con la ATPasa de protones de membrana plasmatica del hongo basidiomiceto Uromyces fabae y con las ATPasas de protones de plantas, mostrando una menor homologia con las de hongos pertenecientes o relacionados con la division Ascomycotina. Se ha conseguido complementar una cepa de Saccharomyces cerevisiae defectiva en sus genes PMA1 y PMA2, demostrando asi que el cDNA clonado es una ATPasa de protones de membrana plasmatica. A partir de la proteina expresada de forma heterologa se ha estudiado a nivel bioquimico sus constantes cineticas y se han comparado con las de la proteina PMA de S.cerevisiae. A diferencia de esta ultima, la PMA de C.neoformans parece no activarse por glucosa. Se ha reconstituido la membrana plasmatica con la ATPasa PMA1 de C.neoformans en proteoliposomas. En este sistema se ha estudiado el bombeo de protones por parte de la enzima, probandose que es una ATPasa transportadora de protones susceptible de ser inhibida por el protonoforo FCCP.

Autor: BLAZQUEZ ORTIZ CRISTINA.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (UCM).

Resumen: Los cuerpos cetonicos pueden reemplazar a la glucosa como principal fuente energetica cerebral en situaciones en las que está es escasa. Aunque se ha asumido que el higado es el organo que aporta cuerpos cetonicos a los tejidos extrahepaticos, existian algunas evidencias en la bibliografia de que los astrocitos tambien son capaces de producirlos. Asi, en este trabajo se ha tratado de caracterizar la ruta cetogenica en astrocitos, estudiar sus mecanismos de regulacion, y evaluar su posible papel citoprotector en situaciones patologicas, como la hipoxia y la apoptosis inducida por acidos grasos. A partir de los resultados obtenidos y a modo de resumen, pueden extraerse las siguientes conclusiones generales: 1,- Los astrocitos son capaces de producir cantidades significativas de cuerpos cetónicos, que podrian ser cedidos a las neuronas para ser utilizados como fuente energetica alternativa a la glucosa. Las propiedades de la cetogenesis en astrocitos son muy semejantes a las de la cetogenesis en hepatocitos, lo cual apoya una posible funcionalidad biologica de aquella. 2.-La cetogenesis en astrocitos es un proceso flexible, y se encuentra finamente regulado por al menos dos proteina quinasas, la PKA y la AMPK. Así, un incremento en la concentracion de cAMP (que activa la PKA) o de AMP (que activa la AMPK) estimula la producción de cuerpos cetónicos por inactivación de la ACC, descenso en la concentracion de malonil-CoA y desinhibicion de la CPT-I. Ademas, la accion activadora directa de la ceramida sobre la CPT-I estimula la produccion de cuerpos cetonicos. 3.- La AMPK astrogial podria ejercer un papel ciprotector en situaciones de hipoxia(aumentando el aporte de cuerpos cetónicos a las neuronas) y apoptosis inducida por acidos grasos (inhibiendo la sintesis de novo de ceramida). La cetogenesis astroglial tambien podrian impedir algunos de los efectos perjudiciales provocados por la acumulacion de acidos grasos en el cerebro. Asi, el equilibrio entre la oxidacion de acidos grasos y la sintesis de ceramida desempeñaria un papel importante en el control de la decision supervivencia/muerte celular.

Autor: GALLARDO PEREZ M. ESTHER.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FUNDACION JIMENEZ DIAZ/CIB (CSIC).

Resumen: La familia de los genes SIX es una clase nueva de genes homeobox tipicos que fue fundada por el gen so de Drosophila que es un gen esencial para el desarrollo del sistema visual de la mosca en la larva y en el adulto. Al inicio de esta Tesis se conocian algunos miembros de esta familia en el hombre: hSIX1,hSIX5 y en raton: Six1,Six2,Six3,Six4 y Six5. Todos los genes de esta familia codifican para factores de transcripcion, que tienen en su estructura dos dominios muy conservados, que se denominan dominio SIX y homeodominio, que son muy importantes porque se requieren para la union especifica al DNA. A lo largo de esta memoria se describe la clonación y caracterización de los genes humanos de la familia SIX ortologos a los genes SIX identificados en otras especies y un gen nuevo de la familia, hasta ahora no identificado, que hemos denominado hSIX6. Asimismo, se describe la organización genomica y la estructura de los genes humanos SIX y se discuten sus relaciones filogeneticas en el contexto de la evolucion de la familia de los genes SIX. El analisis estructural completo de los genes humanos de la familia SIX presentados en esta Tesis ha sido una herramienta decisiva, pues ha permitido poner a punto estrategias para el analisis mutacional de dichos genes en pacientes candidatos y , asi establecer la implicacion de los genes SIX en malformaciones congenitas. Para seleccionar patologias que pudieran ser el resultado de mutaciones en los genes humanos de la familia SIX se ha utilizado la informacion generada acerca de la localización cromosómica de cada uno de los genes, asi como de sus patrones de expresion durante el desarrollo embrionario.

Autor: CONEJO GONZALEZ RUBEN.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo se ha investigado la señalizacion implicada en las diferentes procesos relacionados con el desarrollo del musculo esqueletico inducido por la insulina. Para ello, hemos utilizado la linea de celulas musculares de raton C2C12. Esta linea celular presenta un elevado numero de receptores, de alta afinidad, para la insulina, y en respuesta a la estimulacion con la insulina se produce la autofosforilacion de su receptor, la fosforilación y asociación con PI3 quinasa de IRS-1, asi como la activación de las cascadas PI3 quinasa/Akt/p70S6 quinasa, p42/p44 MAP quinasa y p38 MAP quinasa. Mediante inhibidores especificos de estas rutas de señalizacion hemos observado: 1.-La proliferación de la linea celular C2C12 inducida por la insulina a las 24 horas de tratamiento, implica la activación de la ruta p44/p42 MAP quinasa y de la ruta PI3 quinasa/p70S6 quinasa. Este efecto de la insulina es similar al producido por IGF-I. 2.-La insulina actua como factor de supervivencia celular en la linea muscular C2C12 a traves de la activacion de la via PI3 quinasa/Akt. 3.-La linea celular C2C12 sufre una rapida reorganizacion del citoesqueleto de actina en respuesta a la insulina, produciendose la ruptura de las fibras de estrés y la formacion de los lamelipodios de membrana. Este efecto es dependiente de la activación de la ruta p38 MAP quinasa. 4.-El tratamiento cronico con insulina (72 horas) induce la Miogenesis de la linea celular C2C12. Este efecto se producen a traves de la activacion de las rutas PI3 quinasa/Akt/p70S6 quinasa y p38 MAP quinasa,y requieren la inhibición de la ruta p44/p42 MAP quinasa. En este proceso esta implicado la activación del factor de transcripcion NF-kB y la inhibición de la actividad de union al DNA del factor de transcripcion AP-1. 6.-La transformacion por v-ras inhibe la diferenciación muscular de la linea celular C2C12. El tratamiento con insulina y PD098059(inhibidor de MEK) restaura la miogenesis de esta linea celular transformada mediante la activacion de las rutas PI3 quinasa/Akt/p70S6 quinasa y p38 MAP quinasa y la inhibicion de la ruta p44/p42 MAP quinasa. 7.-Una construccion constitutivamente activa de Akt(en presencia de PD098059) es capaz de restaurar la miogenesis de la linea celular C2C12 transformada por v-ras, activando las rutas p38 MAP quinasa y 970S6 quinasa.

Autor: FERRERO BOVEDA RUT.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA UCM.

Resumen: El presente trabajo de investigación se ha centrado en determinar el/los mecanismo/s de regulación de la enzima guanilato ciclasa soluble. Para ello se ha desarrollado un estudio sobre las herramientas farmacológicas disponibles, centrándonos en algunos donadores de NO de carácter y propiedades muy diferentes entre sí. Gracias a este estudio se consiguieron determinar las sustancias idoneas para los estudios desarrollados a continuaicón. Seguidamente se procedió al estudio del mecanismo de desensiblización a corto plazo de la enzima guanilato ciclasa soluble originada por tratamiento con agentes estimulantes de la vía. Los resultados demostraron que el proceso conduce a una defosforilación de la enzima que provoca la incapacidad por parte de la GCs de responder a estímulos posteriores. Este estado es reversible en el timpo por foforilación de la proteína. Finalmente se abordó el tema de la tolerancia que se desencadena como consecuencia de tratamientos prolongados con NO. El estuido de los mecanismos moleculares responsables de este fenómeno, que conduce a una disminución en la capacidad de respuesta a NO y, por tanto, a una menor efecto del compuesto, nos llevó a estudiar los niveles de expresión de la proteína y del ARNm que codidifca para ésta. Los resultados indican un complejo mecanismo de regulación que incluye una modificación y posterior degradación de guanilato ciclasa soluble y una disminución de los niveles de ARNm que codifica para la proteína. Este efecto de modulación negativa de la vía está mediado por los segundos mensajeros de la ruta.