BIOQUIMICA MOLECULAR, 27

Autor: RUZAFA LÓPEZ CAROLINA.
Año: 2000.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: Se ha estudiado el metabolismo de arginina en ratones Swiss CD1 y la influencia de las hormonas sexuales tanto en los niveles tisulares de arginina como en las actividades de las enximas relacionadas con el metabolismo de arginina en riñón de ratón. Se muestra que existe un marcado dimorfismo sexual de arginina en plasma, riñón y músculo esquelético, siendo las concentraciones de arginina de las hembras superiores a las de los machos. Igualmente se demuestra que existe un dimorfismo sexual en arginasa, oxido nítrico sintasa y ornitina a partir de arginina es la misma en ambos sexos. Los resultados descartan la existencia de arginina descarboxilasa en riñón de ratón, enzima que participa en la biosíntesis de pliaminas en bacterias y plantas y que se ha postulado recientemente como responsable de la sítnesis de agmatina en cerebro y riñón de rata. También se ha demostrado que la eliminación de la arginina de la dieta disminuye la actividad renal de muchas de las enzimas del metablismo de arginina que presentan dimorfismo sexual, afectando asimismo al peso corporal y renal de ratones machos, concluyéndose que la arinina de la dieta es requerida para la accióna nabólica de los andrógenos. Los resultados también de muestran que la suplementación de la dieta con arginina disminuye le crecimiento de melanomas B16 en ratones C57B/6J ejerciendo además marcadas acciones anticaquéxicas. Se discute la participación de los sistemas enzimátaicos en la homeostasis de arginina y el papel que este aminoácido puede jercer como secretagogo y regulador indirecto de procesos hipertróficos y proliferativos.

Autor: CARMELO PASCUAL EMMA.
Año: 2000.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La Tesis Doctoral titulada "Caracterización génica y estudio de antigenicidad de proteínas conservadas en Tripanosomátidos" expone los resultados obtenidos en el estudio de diferentes genes y proteínas de los protozoos parásitos Leishmania brazilensis y Trypanosoma cruzi, pertenecientes a la familia Trypanosomatidae. El trabajo desarrollado se ha dirigido al clonaje de dos nuevos genes de L. Braziliensis, los correspondientes a la proteína ribosomal L 14 y a la proteína LMP-11, específica de los tripanosomátidos. En ambos casos se ha caracterizado el locus génico y se han purificado las correspondientes proteínas recombianantes en un sistema de expresión in vitro en Escherichia coli. Del mismo modo, se ha expresado y purificado una forma truncada de la KMP-11 de L. Braziliensis, para realizar un estudio comparativo de la respuesta antigéncia, durante la infección natural por este parásito, contra las formas completa y truncada de estas dos proteínas. Por otra parte, también se han purifiado las proteínas recombinantes H1 y ribosomal L6 de L. Braziliensis, empleándose además una colección de péptidos sintéticos que cubren la secuencia de estas dos proteínas, con el fin de localizar los determinantes antigénicos de las mismas. Finalmente se han purificado otras dos proteínas recombinantes, las correspondientes a las formas truncadas de la KMP-11 de T. Cruzi, con las que se la realizado un estudio que ha permitido comprobar la diferencia en la respuesta frente a la KMP-11 de los enfermos de leishmaniasis y de Enfermedad de Chagas.

Autor: VALLADARES RUIZ ANA.
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y FOTOSINTESIS (UNIVER. SEVILLA).

Resumen: En este trabajo se abordó, por un lado, el estudio del sistema de asimilacion de urea en cianobacterias, y, por otro, la estructura de los promotores funcionales en heterocistos de Anabaena sp. PCC 7120. En el contexto del sistema de metabolizacion de la urea, se ha identificado y caracterizado un sistema de transporte de urea de alta afinidad que media la concentracion de este sustrato en el interior celular. Este sistema de transporte es de tipo ABC y a diferencia de la enzima ureasa, que lleva a cabo la degradacion de la urea hasta amonio y CO2, esta regulado por el regulador transcripcional Ntca. En esta memoria se recoge ademas un estudio realizado sobre algunos promotores activos en los heterocistos de Anabaena sp.PCC 7120. Se ha demostrado la participacion de NtcA en la transcripcion de algunos genes en los heterocistos maduros, la cual puede tener lugar desde distintos tipos de promotores. Asimismo, se ha realizado un estudio detallado de la región promotora del gen glnA, con el fin de analizar la contribucion de cada uno de los promotores de este gen a la expresion genica en distintas condiciones nitrogenadas y en los distintos tipos celulares.

Autor: MARTIN FIGUEROA EUGENIO.
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: El contenido de esta Tesis Doctoral comprende en una primera parte, el estudio de la enzima ferredoxina-glutamato sintasa de la cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120. El citado estudio ha incluido tanto la clonacion del gen que codifica dicha enzima, como la caracterizacion de la actividad Fd-GOGAT en esta cianobacteria. Los resultados derivados de este estudio han demostrado en primer lugar que Anabaena 7120, contiene una sola glutamato sintasa a diferencia de otras especies cianobacterianas que presentan dos enzima con actividad glutamato sintasa. Por otra parte la caracterizacion de la actividad Fd-GOGAT, mostraba que dicha actividad no se regulaba en Anabaena 7120 por la fuente de nitrogeno disponible. Tambien se ha demostrado, mediante medidas de actividad Fd-GOGAT, experimentos de inmunodetección y analisis de la expresión del correspondiente gen glsF, que esta enzima no se encuentra presente en el heterocisto de Anabaena 7120. Lo que sugiere una clara compartimentacion del metabolismo del nitrogeno entre el heterocisto y las celulas vegetativas. En la segunda parte de esta tesis se ha llevado a cabo un estudio de las tiorredoxinas de la cianobacteria unicelular Synechocystic sp. PCC 6803. Este estudio ha constado del analisis de la regulacion a nivel transcripcional de los gene que codifican estas proteinas en Synechocystis 6803, asi como tambien de los genes ftrC y ftrV que codifican respectivamente las subunidades catalitica y varible de la ferrodoxina tiorredoxina reductasa. La generacion de estirpes mutantes de estos genes ha demostrado que mientras los genes trxA y trxC son esenciales para el crecimiento de Synechocystis, los genes trxB y trxQ son dispensables para dicha cianobacteria. Por ultimo, los mutantes del gen trxC presentan, pese a no segregar completamente la mutacion, un fenotipo pleiotropico que les impide crecer a intensidades de luz moderadas. Este fenotipo tiene como primer resultado la destruccion de al menos uno de los polipeptidos que componen el fotosistema I.

Autor: HERCE MUÑOZ ANTONIA M..
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: HIPÓTESIS Se aprecia una diferencia significativa en los valores obtenidos de un marcador (x) durante las primeras 48 horas de evolución de la Pancreatitis Aguda, y esta diferencia tiene relación con la mortalidad. OBJETIVOS Monitorizar en las primeras 72 h. De evolución de la enfermedad: - Diferentes marcadores bioquímicos de fase aguda - Escores de gravedad generales: APACHE II - Escores de gravedad específicos: Ranson - Escores de fallo multiorgánico Comparar los valores de los marcadores con la etiología. Comparar la evolución de los marcadores de fase aguda con la morbilidad. Comparar la evolución de los escores clínicos con la mortalidad y morbilidad. METODOLOGÍA La muestra estudiada debe cumplir los siguientes criterios de inclusión: - Pacientes diagnosticados de Pancreatitis Aguda por Clínica y Amilasa del doble del valor normal, con más de dos criterios de Ranson. - Adultos de más de 18 años. - Pacientes sin enfermedad concomitante con incapacidad funcional. Se realiza un estudio prospectivo de pacientes que ingresan diagnosticados de PA por el Servicio de Urgencias del Hospital. Se hace una descripción de los escores de gravedad, así como una valoración clínica y medición de los marcadores bioquímicos que a continuación se citan. - Elastasa. - Proteína C reactiva - Complementos - Ceruloplasmina - Alfa 1 antitripsina - Haptoglobina - Albúmina - Prealbúmina - Interleuquinas IL6, IL8, TNF.

Autor: ZAYAS ZAFRA M. DOLORES.
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La esclerosi múltiple (EM) es una enfermedad multifactorial, de etiología desconocida, participando en su pateogenia factores genéticos y ambientales. Parece tratarse de una enfermedad --- que cursa con infiltración de linfocitos T autorreactivos en el sistema nervioso central produciendo inflamación y desmielinización. Los estudios de agregación familiar y de concordancia entre gemelos han cofirmado la existencia de dicho componente genético. En concepto de muerte celular programada o apoptesis ha llegado ha ser atractivo en el estudio de procesos patológicos que cursan, con una destrucción de un determinado tipo de células, o bien con una proliferación descontrolada de las mismas. Este fallo en el mecanismo de apoptesis podría ser un proceso determinado genéticamente. Así, en el caso de la EM se han postulado distintas hipótesis pensando tanto en que el -- puede estar ocasionado por una disminución en el mecanismo de apoptosis de las células T. Autorreactivas en el sistema nervioso central o periférico, como que puede ser debido a una indución de apoptosis en--. Por ello esta tesis se ha centrado en le estudio de asociación del sistema Fas, Fasl con la EM; así como otros genes de interés, que por referencias bibliográficas se ha encontrado alguna asociación de los mismo con esta enfermedad, son el caso del sistema HLA clase II y la proteina -- fesfatosa CD45

Autor: TAMAYO CANUL ELSY NOEMI.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo se estudió a nivel molecular el mecanismo de inducción por xilano o xilosa de la síntesis de los genes del complejo xilanolítico de Aspergillus nidulans. Se clonó el gen regulardor de xlnR de A. Nidulans. El producto génico deducido, llamado xlnR, es una proteína de 875 aminoácidos que presenta en la región aminotermianl el motivo Zn(II)2Cys6, que caracteriza a un grupo de activadores transcripcionales de Ascomicetes. Además posee una región rica enprolina, varios motivos SP (T) XX y una región de localización nuclear, similares a los descritos en otras proteínas reguladoras. La disrupción del gen xlnR afecta la producción de las xilanasas X22, X24, y X34 y la de la B-xilosidasa como consecuencia de la pérdida de transcripción de los genes codificantes. De ello se deduce que la proteína XlnR es el activador transcripcional del sistema xilanolítico de A. Nidulans. El producto del gen xlnR no afecta la transcripción del gen abfB y en consecuencia la producicón de la arabiono furanosidasa B y tampoco regula al producción de ramnosidasa. Los estudios de regulación demostraron que al expresión del gen xlnR está regulada por glucosa y en ausencia de esta fuente de carbono existe una desrepresión , y que su transcripción no es inducible por xilosa ni se autoregula. Además la expresión del gen xlnR no está regulada por el pH amibental. Respecto al comportamiento de los genes estructurales existe un requerimiento absoluto por xilosa para su transcripción. La falta de coincidencia en la transcripción del gen reguladores y los genes estructurales en algunas condicones de cultivo sugiere una regulación postranscripcional del gen. Se proponen dos mecanismso diferentes de expresión de los genes estructurales del complejo xilanolítico en relación con la fuente de carbono: un mecanismo de represión en cascada para los genes xlnA y xlnD y una represión indirecta para los genes xlnB y xlnC. El gen xlnR es limitante en las codniciones de cultivo utilizadas en las cepas silvestre. La expresión del gen xlnB se incrementó notablemnte en cepas xlnR constitutivas, lo que indica un interés de dicha cepa en la producción industrial de la xilanasa x24.

Autor: MULET SALORT JOSE MIGUEL.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: El nucleo principal de trabajo de esta tesis doctoral ha sido el tratar de determinar que mecanismos son responsables del mantenimiento de la homeostasis ionica en la levadura S.cerevisiae. Con este proposito tratamos de determinar el papel que desempeñan las Ser/THR proteinquinasas Ha14,5p, que por sobreexpresion confieren tolerancia a salir en la levadura previamente mencionada. Según los experimentos aportados por esta tesis doctoral llegamos a la conclusion que estas dos proteinquinasas determinan un sistema nuevo de tolerancia que seria responsable de despolarizar la membrana plasmatica por la activacion del transportador TRK1,2 y prevenir la entrada inespecifica de cationes toxicos. Este seria el primer sistema general de tolerancia a cationes tóxicos descrito en levadura. Asi mismo hemos demostrado que el sistema determinado por el regulador iónico HAL1 es dependiente de estas proteinquinasas.

Autor: ROIG MONTOYA PATRICIA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Se han aislado y caracterizado los genes UB13 y UB14 de Candida albicans. El gen UB14 codifica la poliubiquitina, proteína formada por tres subunidades ubiquitina. El análisis mediante Southern blot demostró la existencia de una sóla copia de UB14 por genoma haploide. El análisis mediante Northern blot demostró qu este gen se expresa tanto en levadura como en micclio y que su expresión se induce por estrés térmico. La función del gen clonado se caracterizó por su capacidad para complementar el fenotipo de hipersensibilidad al estrés térmico en el mutante UB14 de Saccharomyces cerevisial. El estudio fenotípico del mutante nulo reveló que el gen UB14 mantiene bloqueada la capacidad de medición en condiciones en los que c. Albicans crece como levadura y además mantiene unos niveles bajos de "switching fenotípico". El gen UB13 codifica una proteína ribosomal unida en su extremo N-terminal a una subunidad de ubiquitina. El análisis mediante southern blot demostró la existencia de una sola copia de UB13 por genoma haploide. El análisis mediante Northern blot indicó que la expresión de este gen se inhibe en condiciones de estrés térmico y nutricional y ésta se correlaciona con el crecimiento celular. La función del gen clonado se caracterizó por su capacidad para complementar el fenotipo de lento crecimiento en el mutante UB13 de S. Cerevisiae. El análisis fenotípico del mutante nulo condicioanl reveló que se trata de un gen esencial.

Autor: HITA MESEGUER M. TERESA.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: D. Melanogaster es parasitada por varias especies de avispa, entre otras leptopilina boulardi y Asobara tabida. Cuando el sistema inmunoligoc de Drosophila detecta la presencia de un cuerpo extraño, por ejemplo un huevo, se desarrollo una reaccion de defensa caracterizada por la formacion de una capsula multicapa compuesta por lamelocitos y melanina. Esta encapsulacion normalmente no se lleva a cabo ya que el parasitoide posee un mecanismo de virulencia que impide el desarrollo de la reaccion de defensa del huesped. Las cepas virulenta y avirulenta de himenoptero (capaces de impedir la formacion de la capsula o no), asi como las cepas resistente y sensible de huesped (capaces de llevar a cabo a formacion de la capsula o no ) han sido seleccionadas. El estudio genetico de las cepas resistentes de uestra que este fenomeno se debe a la existencia de un gen llmado R1b para la resistencia contrea Leptopilina boulardi y de otro gen llamado Rat para la resistencia contra Asobara tbida, siendo el alelo resistente dominante. Ambos genes se localizan en el cromosoma 2R, separados por 35 cM. R1b esta localizado en 2-86.7 y Rat en 2-51.3 cerca del centromero. Mediante la utilizacion de cepas deleccionadas sobre el segundo cromosoma, R1b ha sido localizado en la region 55C1-C3;55F3, estando la region 55E2-E4,55F3 particularmente envuelta. Ha sido realizado un mapa fisico de la region 55C, 56A mediante la utilizacion de socmidos y fagos P1. El tamaño de la region 55E2-E4; 55F3 ha sido estimado en aproximadamente 300 kb. Para establecer una relacion entre el mapa fisico y los limites de las regiones delecionadas de las cepas que nos han permitido localizar la region, se han hecho hibridaciones in situ sobre los cromosomas politenicos de estas cepas con los clones de mapa fisico. Asi hemos reducido el tamaño de la region a 100kb. La existencia de una cepa que contiene un elemento P unico, nos ha ayudado, tras los cruzamientos necesarios, a obtener machos recombinantes. Esta tecnica permite localizar un gen autosmico a la derecha o a la izquierda del elemento P. Nuestros resultados sugieren que R1b esta localizado cerca del elemento P o interrumpido por el mismo. El analisis informatico de la secuencia de la region de 100kb nos indica que en esta region se localizan 11 hipoteticos genes. Dos de ellos estan situados en las proximidades del elemento P. El situado a la izquierda corresponde con un factor de transcripcion o regulador del ciclo celular y el localizado a la derecha posee similitudes con una proteina de secrecion inmunogenica, pudiendo ambos desempeñar el papel de R1b.

Autor: TORRES MUÑOZ PEDRO.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE VALENCIA.

Resumen: Se comparar la sensibilidad y especificidad de los métodos convencionales (badiloscopia e histopatología) frente a métodos serológicos por ELISA con antígenos específivos de M. Leprae (PGL-1 y DBSA) y técnicas de amplificación por PCR de un fragmento de 531 pb DNA M. Leprae específico del gen 36 kDa para la detección de infecciones por Mycobacterium leprae en un grupo de 60 pacientes de lepra y 4 controles no leprosos.También, se analizan las posibildiades de una combianción de técncas (reacción intradermica a la lepromina, detección de DNA M. Leprae nasal y seropositividad frente a antígenos específicos PGL-1 y D-BSA) para la detección de infecciones de tipo sublínico en un grupo de población de contactos de lepra. Los resultados presentan una buena correlación entre las respuestas humorales (90%) y ambos rupos de técncias de detección, sobre todo en el grupo multibacialr donde algunas técncias (histopatología- PCR y torunda post biopsia) presentan una sensibilidad del 100% durante los tres primeros meses del periodo de tratamiento conla multiterpia recomendada por la OMS.Después de los tres meses sólo el D-BSA mantienen niveles aceptables de sensibilidad (80%) junto a las dos técnicas anteriores, destacando la mayor sensibilidad de las técnicas de amplificación DNA sobre los métodos convencionales para el seguimiento y control de la evolución de los pacientes de lepra multibacilares. En el grupo paucibacilar no se detectan casos positivos con ninguna de las dos grupos de técnicas. De entre los 43 contactos analizados dos invidivuos formarían un grupo potencial de alto riesgo.

Autor: BARCELONA ANDRES BELEN.
Año: 2000.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: En esta tesis se han caracterizado los genes que codifican la via catabólica de la arginina deiminasa en Enterococcus faecalis, microorganismos en el que se descubrió y caracterizó bioquimicamente dicha ruta, que, en tres pasos enzimáticos catalizados por la arginina deiminasa, la ornitina transcarbamilasa catabolica y carbamato quimasa, produce fermentativamente 1 mol de ATP por mol de arginina degradada. El paso clave en la obtención de energia es la transferencia del fosfato desde el carbomilfosfato al ADP, catalizada por la carbamato quinasa. Tras secuenciar un fragmento del cromosomo de E.faecalis de 8228 pb por ambas hebras en pequeños fragmentos solapantes, hemos localizado los genes para estos tres enzimas estrechamente agrupados junto con un gen para el transporte de arginina y un posible regulador transcripcional de la familia CRP-FNR. La identidad de los genes para la arginina deiminasa y la carbamato quinasa ha sido corroborada por sobreexpresion en E.coli, y el de la ornitina trancarbamilasa por comparación de la secuencia predicha con la composicion de aminoacidos conocida de esta proteina y mediante secuenciacion aminoterminal. La implicación del gen para el posible transportador de arginina ha sido corroborada por el analisis del fenotipo de una cepa mutante de E.faecalis, fabricada por nosotros mediante tecnicas de recombinacion homologa, con dicho gen interrumpido por un gen de resistencia a un antibiotico. Estos cinco genes son transcritos en un mensajero policistronico, producido a partir de un unico promotor, como revelan los analisis por Northern blot de extractos de RNA total de E.faecalis y de determinacion de puntos de inicio de la transcripcion. Tambien mediante Northern blot hemos demostrado la induccion del mensajero del operon en cultivos de E.faecalis crecidos en presencia de arginina, y la falta de induccion cuando se añade glucosa el medio. En la region situada aguas arriba del operon, hemos localizado dos genes homologos con orientacion divergente y similitud de secuencia con el regulador transcripcional ArgR, implicado en otros organismos en la regulacion de la expresion de genes para el metabolismo de la arginina. Hemos detectado mensajeros monocistronicos para ambos genes y determinado los dos puntos de inicio de la transcripcion. Su patron de expresión en diferentes condiciones de crecimiento sugiere su implicacion en la regulacion de la expresion del operon arginina deiminasa. Ademas, en la hebra complementaria hemos localizado tres genes, uno de ellos incompleto, que parecen no estar relacionados con el metabolismo de la arginina.

Autor: PRADO CONZÁLEZ MIGUEL ANGEL.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UPV/EHU).

Resumen: Se ha caracterizado a homogeneidad la isocitrato deshidrogenasa de la cianobacteria termófila Phormidium laminosum. Este enzima es clave para la provisión de esqueletos carbonados al metabolismo del nitrógeno. Se ha caracterizado a nivel bioquímico, estudiando su masa molecular, y fisicoquímico: en relación al pH la temperatura y diferentes activadores e inhibidores de su actividad. Además se ha caracterizado el gen icd que codifica esta proteína, estudiando su expresión en relación a la presencia o ausencia de nitrógeno en el medio.

Autor: MARTÍNEZ DE ALBA ANGEL EMILIO.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UPV-EHU.

Resumen: Los viroides son parásitos intracelulares, formados por una molécula circular de RNA de cadena simple.Los genomas viroidales no tienen ninguna pauta de lectura, por lo que necesitan tomar prestada la maquinaria transcripcional de la célula huésped. La identificación de los factores de dicha célula huésped que interaccionan con los viroides es necesaria para entender las interacciones y funciones de estos peculiares patógenos. Durante esta tesis doctoral, se aislaron y caracterizarón proteínas que interaccionan con RNA viroidal, para lo cual se desarrolló una nueva técnica denomiada "RNA-Ligand Screening". Las proteínas fueron aisladas de una genoteca de cDNA de expresión, generada a partir de mRNA extraido de plantas Lycopersicum esculentum infectadas con el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) que se rastreó con una sonda de RNA de dicho viroide: Durante el curso de estos estudios se aislaron dos proteínas que intraccionan con el viroide PSTVd.Estas proteínas denomiandas Virp1 y Virp2 tienen un peso molecular de 66 y 50 Kda, respectivamente. Mientras que Virp1 interacciona únicamente con RNAs viroidales pertenecientes al grupo del PSTVd, la proteína Virp-2 es capaza de intraccionar con cualquier tipo de RNA, siempre y cuando sea de tipo viroidal. Los análisis comparativos de estas dos secuencias con las bases de datos reveló que Virp1 no mostraba homología significativa con proteína alguna conocida,por el contrario Virp2 mostraba una homología del 92% a nivel de la secuencia de aminoácidos con una Amonitransferasa. La proteína Virp1 fue caracterizada en mas detalle que Virp2. Por los resultados experimentales obtenidos durante la caracterización de Virp1 se pudo concluir que esta proteína es un factor de transcripción.,En esta tesis se discute la posible función o funciones de esta proteína en el ciclo de vida del viroide.

Autor: GARAGORRI GANCHEGI NEREA.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UPV/EHU.

Resumen: Esta memoria de tesis doctoral pretende desarrollar un material bioactivo a partir de un material tradicional con el objeto de mejorar la acomodacion de este en el tejido humano. El nuevo material, un derivado acrilico, cuenta en su superficie con la presencia de unos compuestos funcionales dirigidos a la inactivacion de enzimas considerados potentes destructores de tejidos y que son generalmente, secretados por el hospededor como defensa ante la presencia de un implante. El objeto principal de este estudio ha consistido en la valoracion biológica de este nuevo material bioactivo desde las etapas iniciales de su desarrollo (actividad y funcionalidad de estructuras B-lactamicas), hasta la obtencion final del matrial (bioactividad y biocompatibilidad del nuevo copolimero). El desarrollo de este nuevo material no hubiera sido posible sin la participacion de tres departamentos, cuya colaboracion ha mantenido un flujo constante de informacion. El Dpto. de Quimica Organica de la UPV, encargado de la sintesis de los monómeros cuyo grupo de investigacion es reconocido internacionalmente en el ambioto de la sintesis de B-lactamas. El Dpto. de Ciencia y Tecnologia de Polimeros de la UPV que desarrolla desde hace años una linea dedicada al estudio y conocimiento de los biopolímeros con aplicación biomedica y cuya aportacion a este trabajo ha sido la copolimerizacion final del material. Y finalmente, la Seccion de Bioquimica y Toxicologia de INASMET que desarrolla su actividad en la mejora de los biomateriales y donde ha sido elaborado este trabajo, caracterizando biologicamente las estructuras sintetizadas. Primeramente las moleculas de nueva sintesis y en etapas posteriores los monómeros y el polímero final, comprobando que la actividad biologica "añadida" permanece y que su biocompatibilidad cumple todos los requerimientos de un material implantable.

Autor: MURGA COSTA MATILDE.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FAC. MEDICINA UPV/EHU.

Resumen: En el presente trabajo se planteó como objetivo principal el estudio de la función in vivo de genes de la familia de E2F en el control del ciclo celular, utilizando como modelo experimental ratones "Knockout" para los genes E2F1 y E2F2. En primer lugar analizamos el papel de E2F1 en la regulación de la proliferación celular. Nuestros resultados indican que E2F1 es un regulador positivo de la proliferación de los linfociots T. La mutación del gen E2F1 resulta en un retraso en la entrada y en la progresión de la fase S del cilo celular.Hemos identificado los genes de las cilcinas E, A y B1 como posibles dianas transcripcionales de E2F1 responsables de la proliferación mediada por este gen. Por otro lado, los ratos E2F2 knockout desarrollan cuando son adultos desórdenes autoinmunes similares al lapus eritematoso sistémico. Nuestros análisis indican que E2F2 está implicado en la homeostasis del sistema inmune peirférico. Los linfocitos T protadores de la mutación E2F2 presentan respuestas hiperproliferativas después de su estimación, así como defectos en la apoptosis, lo que resulta en la pérdida de tolerancia inmunolóigca y el desarrollo de la autoinmunidad. Así, se han obtendio resultados contrapuestos al analizar la función de los fenes E2F1 y E2F2 en la proliferaicón de los linfocitos T. E2F1 es un inductor de la proliferaicón en estas células, mientras que E2F2 es un supresor de la proliferción mediante la terminación de las señales proliferativas generadas por la vía de E2F1 y podría contribuir a la finalización de las respuesta inmune. Por lo tanto, la pareja génica E2F1-E2F2 se presenta como un regulador importante de la homeostasis inmunológica. Finalmente, la generación del ratón doble knockout para los genes E2F1 y E2F2 nos ha permitido determinar las funciones únicas de E2F1 y E2F2, así como el nivel de solapamiento funcional de ambos genes. Los ratones dobles knockout presentan un fenotipo complejo de atrofia en varios órganos que da como resultado el desarrollo de diabetes y la muerte temprana de los ratones.

Autor: MENDIZABAL GONZALEZ IRATXE.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTA DE FARMACIA.

Resumen: Hemos aislado e identificado cuatro factores de transcripción (Hal6-9p) de Saccharomyces cerevisiae que por sobreexpresión en plásmidos multicopia incrementan la tolerancia a sodio y litio en levadura. Este efecto es mediado, al menos en parte, por un incremento en la expresión de la bomba Ena1p que extruye los iones Na+ y Li+. Hal6 y Hal7 son proteinas bZIP cuyo defecto no confiere sensibilidad a sal ni modifica los niveles de expresión de ENA1.Ha18 y Ha19 son proteinas con dominios dedos de zinc, cuyo defecto incrementa la sensibilidad a sal y provoca una reduccion en los niveles de expresión de ENA1, por lo que ambas proteinas se pueden considerar determinantes importantes de la halotolerancia. El gen HAL8 ha sido caracterizado como un componente de la ruta de calcineurina (CaN) necesaria para la maxima expresión de ENA1. Hal8p controla la expresion del gen ENA1 mediante una region activadora UAS ENA1 localizada entre las posiciones-713 pb y -826 pb del promotor. El UAS ENA1 contiene dos elementos de control necesarios para la maxima activacion transcripcional de ENA1. Han sido identificadas las secuencias reguladoras esenciales para el funcion del UAS ENA1 in vivo, y que constituyen dianas de union in vitro para el activador Hal8.

Autor: GONZALEZ MAESO JAVIER.
Año: 2000.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se ha demostrado la existencia de alteraciones en los receptores acoplados a proteinas asociadas a enfermedades psiquiatricas o neurológicas. Por lo tanto, el estudio del acople receptor-proteina G en muestras de cerebro humano postmortem supondria una herramienta muy potente en el estudio de las enfermedades del sistema nervioso central humano. Se optimizó la estimulación de la fijación de [35S]GTPyS en muestras de corteza prefrontal humana postmortem (area 9 de Brodmann) con el objeto de cuantificar el acople receptor-proteina G en este tipo de tejido. Para ello, utilizaron fármacos agonistas de los adrenoceptores a2, receptores de serotonina 5-HT 1A, opioides u, colinergico muscarínicos y GABA B. Asi mismo, se estudio el efecto de variable inherentes a las muestras de cerebro humano postmortem como la edad, el retraso postmortem o el tiempo de almacenamiento de las muestras. En membranas de cerebro humano postmortem de 28 sujetos suicidas con diagnostico psiquiatrico de trastornos del estado de animo(depresión mayor o trastorno bipolar) se encontró una supersensibilidad selectiva de los adrenoceptores a2, estimulando la fijacion de [35S] GTPyS frente a 28 sujetos control. Esta supersensibilidad es debida a un aumento en la funcionalidad de los adrenoceptores a2 y no a una mayor densidad (Western Blotting) y/o capacidad de acople (mastoparan) de las proteinas G. En membranas corticales de sujetos adictos a opiaceos, la capacidad de acople de los adrenoceptores a2 se vio disminuida, mientras que la de los receptores opioides u no se encontró alterada. Asi mismo, se estudió el efecto de la estequiometria receptor: proteina G en los parametros farmacologicos de estimulación de la fijacion de [35S] GTPyS alquilando selectivamente los receptores opioides u con B-funaltrexamina o las proteinas G con N-etilmaleimida.

Autor: CORTÉS GARMENDIA M. PILAR.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: OBJETIVOS 1,- Análisis de la colonización ambiental causada por Pseudomonas aeruginosa mediante la realización de cultivos de los grifos de la Unidad de Cuidados Untensivos (UCI) del Hospital de Sabadell, las superficies adyacentes a los mismos, las manos del personal sanitario y otras posibles fuentes de transmisión. 2,- Análisis del origen de la colonizaicón y/o infección causada por P. Aeruginosa en los enfermos sometidos a ventilación mecáncia (VM), valorando: A,- El origen endógeno o exógeno de la colonización y/o infección por P. Aeruginosa mediante el estudio de diversas localizaciones anatómicas: estómago, faringe, secreciones subglóticas, luz interna del tubo endotraqueal, tráquea y recto. B,- La secuencia de la colonizaicón de dichas localización. 3,- Determinar la existencia de cultivos proliclonales de P. Aeruginosa analizando su implicación en los estudios epidemiológicos de la colonización y/o infección así como en la heterogeneidad de los fenotipos de sensibilidad a los antimicrobianos en los cultivos de P. Aeruginosa. MATERIAL 160 aislamientos ambientales de P. Aeruginosa (analizando, siempre que era posible, 4 colonias por cultivo) procedentes de los 41 cultivos obtenidos de 5 cortes ambientales realizados; 348 aislamientos amibentales de P. Aerugionosa obtenidos de las distintas localizaciones anatómicas estudiadas en los 39 pacientes colonizados. MARCADORES 1,- Electroforesis en campo pulsante PFGE. 2,- Estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se evidenció una importante heterogeneidad genética en las cepas P. Aeruginosa aisladas en la UCI al tipificarlas mediante PFGE. La existencia de variaciones subclonales en algunos de los pulsotipos (PTs) obtenidos se asoció a la persitencia de los PTs y a la frecuencia de su aislamiento P. Aeruginosa mostró espeical predilección por los grifos de los boxes y las superficies adyacentes a los mismos, siendo un reservorio estable. Por el contrario, su aislamiento en las manos del personal sanitario fue infrecuente. La colonización de los pacientes fue, mayoritariamente, de origen exógeno o ambiental. En la mitad de los episodios de neumonía asociada a la VM, las cepas responsables eran propias de los pacientes pro lo que no ser verían influidas por las medidas encaminadas a eliminar el reserviro ambiental. Los grifos de los boxes se identificaron como el reservorio principal de P. Aeruginosa durante el período de VM. Sin embargo, tan sólo 1 de las 8 cepas asociadas a neumonía procedía del grifo. El lugar inicial de colonización sólo pudo identificarse en una tercera parte de los pacientes con colonización del tracto respiratorio superior tuvieron una importancia equivalente. Por otra parte, en los episodios de NAV en los que pudo determinarse el lugar inicial de colonización , el estómago no fue el origen. El 13% de los cultivos fueronpoliclonales.En el 23% de dichos cultivos no pudieron identificarse los distintos PTs presentes en función de la morfología de las colonias. Los cultivos policlonales fueron un hehco frecuente en los cultivos de los grifos y, en consecuencia, en los procedentes del tracto gastrointestinal de los enfermos, especialmente el etómago. En cambio, es importante resaltar que los cultivos provenientes del tracto respiratorio y de las muetras diagnósticas de NAV, con independencia de la morfología de las colonias, han mostrado un único PT. En el 10,6% de los 341 cultivos con una morfología colonial se detectó más de un antibiotipo. El estudio de sensibilidad a apartir de varias colonias permitiría detectar poblaciones mixtas, siendo necesario un estudio posterior para identificar los distintos fenotipos de sensibilidad coexistentes. Se detectó una cierta falta de estabilidad en el antibiotipo ya que el 11,4% de los cultivos por 1 PT mostrba más de un antibiotipo. Por otra parte, también se evidenció la falta de poder discriminativo del antibiotipo ya que en el 69% de los cultivos con más de 1 PT sólo se observó un antibiotipo. Para determinar el origen de las cepas de P. Aeruginosa y las vías de colonización de los enfermos sometidos a VM, es necesario realizar el seguimiento de las distintas localizaciones anatómicas y del ambiente junto con la aplicación de un método de tipificación como el PFGE. Asimismo, es necesario analizar varias colonias pro cultivo.

Autor: FARRAN BLANCH INMACULADA.
Año: 2000.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ESCUELA TECNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: La albumina humana (HSA)es la proteina serica mas utilizada en el mundo, estimandose unas necesidades mundiales de aproximadamente 500 toneladas por año. La albumina comercial se obtiene basicamente de plasma humano, por lo que la produccion de albumina recombinante es muy atractiva, tanto para eliminar el riesgo de trasmision de enfermedades, como para reducir el consumo de sangre procedente de bancos. La produccion de proteinas recombinantes en plantas transgenicas ofrece una gran flexibilidad en cuanto al tamaño de produccion, asi como unos costes de implantacion bajos. Ademas, presenta ventajas como el procesamiento eucariotico de la proteina recombinante y la bioseguridad. Para expresar albumina humana en tuberculos de plantas transgenicas de patata, la estrategia seguida consistio en producir la secuenica del cDNA de la HSA madura y clonarla bajo el control transcripcional de un promotor especifico de tuberculo (promotor B33 de patatina). El extremo amino de la albumina recombinante se fusionó a un péptido señal tambien de tubérculo (inhibidor de proteasa II), para que se procese correctamente dicha fusion in vivo y de lugar a la albúmina recombinante madura. La transformacion se realizo mediante Agrobacterium tumefaciens a partir de hojas de patata cv. Desiree, Kennebec y Pasc58, y se verificó la inserción del transgen mediante screening por PCR y Southern. La expresion del mismo se analizó mediante Northern blot en tubérculos procedentes de plantas cultivadas en invernadero. Los niveles de produccion de albumina recombinante se analizaron mediante Western blot, y se cuantificaron por ELISA. Los valores máximos de albumina recombinante acumulada en los tuberculos de dichas transgenicas fueron la albumina humana. Se demostro la localizacion apoplastica de la HSAr en hojas de plantas transgenicas de patata, induciendo su expresión con sacarosa. Asi mismo, la albumina recombinante producida en tuberculos se purifico mediante FPLC y se verifico el correcto procesamiento del peptido señal mediante secuenciacion del extremo amino de la albumina purificada.