BIOQUIMICA MOLECULAR, 28

Autor: LAMAS MACEIRAS MÓNICA.
Año: 2000.
Universidad: A CORUÑA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DA CORUÑA.

Resumen: KIHIS4 El gen KIHIS4 se regula transcripcionalmente en condiciones de limitación de nitrogeno, crecimiento en fuentes de carbono no fermentables, estrés provocado por la presencia de cadmio o peróxido de hidrógeno o crecimiento en medio sintético frente a medio rico, por el contrario no se regula encondiciones de limitación de algún aminoácido, el denominado Control General ni por Control Basal en ausencia de esta limitación. La regulación transcripcional de KlHiS4 es diferente a la de su gen homólogo en S. Cerevisiae. Localizamos la unión a la región promotora de KlHiS4 de una proteína sensible a cadmio que reconcoe la secuencia reguladora para YAp1p. Por otro lado mediante experimentos realizados con mutantes hap comprobamos que Hap2 posee un papel represor. (función que no se le había atribuído hasta este momento) sobre una proteína dependiente de la fuente de carbono. KIBI1 El gen BiK1 de K. Lactis se localizó 5' respecto a a KiHiS4 con lo que en K. Lactis se mantiene la misma disposición en tandem anteriormente localizada en S. Cerevisiae. KlBlK1 es un gen no esencial, de copia única, relacionado con los microtúbulos ya que su interrupción provoca sensibilidad a benomil, un compuesto que produce su despolimerización. La proteína KlBik1p, de localización nuclear y su proteína homológa en S. Cerevisiae presentan un 52% de homología, divergencias estructurales importantes, distinto grado de sensibilidad a benomil y la interrupción de los genes que las codifican producen distintas anomalías nucleares.

Autor: RODRÍGUEZ FARIÑA M. FERNANDA.
Año: 2000.
Universidad: A CORUÑA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Este trabajo se realizó en cinco especies diferentes de mejillón pertenecientes al género Mytilus (M. Galloprovincialis, M. Edulis, M. Trossulus, M. Californianus y M. chilensis) y una especie perteneciente al género Perna (P. Canaliculus), sobre un total de 12 poblaciones distribuidas y recolectadas en diferentes costas. Se ha llevado a cabo el estudio de la variabilidad genética a través del análisis de cinco loci nucleares de copia única y tres secuencias de ADNs satélites altamente repetidos, estableciéndose relaciones filogenéticas entre dichas especies de mejillón. Asimismo,se efectuó un análisis de los posibles sucesos mutacionales que han tenido lugar a lo largo de la evolución de estos organismos, mediante el estudio de las secuencias nucleotídicas de los diferentes ADNs satélites. El análisis de las secuencias consenso obtenidas a partie de las de los ADNs satélites se emplearon para la construcción de filogenias,. Se ha evaluado y valorado el empleo de estos loci de copia única y de los ADNs satélites como posibles maracadores geneticos para la aplicación en productos manufacturados (conservas). Los resultados presentados contribuyen a clarificar el origen del género Mytilus. La evaluación de las diez poblaciones diferentes pertenecientes a las seis especies de mejillón, ha permitido: determinar el número de copias de un gen de copia única (el PLII); determinar las distancias genéticas entre las distintas poblaciones; caracterizar las secuencias de aDNS satélites en cuanto a su contenido en Adenina-Timina y su proporción en el genoma; localizar las secuencias de los ADNs satélites sobre placa metafásica; comparar la variabilidad intraespecífica con la divergencia interespecífica en los tres ADNs satéliltes; obtener los valores del coeficiente transiciones/transversiones para establecer el origen evolutivo de las secuencias de ADNs satélites entre estas especies, permitiendo establecer divergencias entre las mismas. La técnica de Dot blot al ADN satélite tipo II resultó ser un método directo, rápido y eficaz aplicable en la industria conservera, ya que permite la identificación de especies enlatadas.

Autor: GONZALEZ AGUILAR M. NIEVES .
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En nuestro trabajo hemos estudiado los mecanismos de resistencia a los principales antimicrobianos frente a Mycobacterium tuberculosis, la rifampicina (RMP) y la isoniacida (INH) en 429 aislamientos clinicos de la Seccion de Micobacterias del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla, durante los años 1994,1995 y 1996. Para ello hemos utilizado cuatro metodos moleculares diferentes: 1) PCR-SSCP (Polimorfismo de la Conformacion de las Cadenas Sencillas de ADN). 2) el sistema comercial INNOLIPA Rif. TB para la resistencia a RMP. 3) Amplificacion con los cebadores B1/B2 y electroforesis del producto amplificado y digerido con la enzima Ncil, para la resistencia a INH. 4) Secuenciacion. En la resistencia a RMP de las 22 cepas resistentes estudiadas, tras la evaluacion de los patrones de RFLP, consideramos solo 17 cepas encontrando alteraciones geneticas en el gen rpoB en el 90,9%. Identificamos cuatro mutaciones puntuales. Ser531 Leu (12 cepas), His 526 Asp(1 cepa), Asn 518 Ser(1 cepa) y Gln 513 Leu (1 cepa). Y una deleccion parcial del gen rpoB de nueve nucleotidos cuya secuencia es GCTGAGCCA, entre los codones 510 y 513. En la cepa restante no encontramos alteracion genetica en el fragmento estudiado por lo que suponemos presenta algun mecanismo alternativo de resitencia frente a este antimicrobiano. La mutacion puntual en el codon 518 y la deleccion no habian sido descritas antes de nuestro estudio. En la resistencia a INH existe mayor numero de cepa, 29, las cuales tras los resultados de la tecnica de RFLP quedan reducidas a 26 cepas. Sin embargo tan solo en un 57,7% de las cepas llegamos a identificar alguna alteracion genetica en alguno de los genes implicados, hasta hoy, en esta resistencia: katG, inhA y ahpC. En el gen katG se identifican dos mutaciones puntuales: Ser315 Thr(n 9 cepas) e lle304 Val(1 cepa), y dos delecciones parciales, en una de las cepas es de dos nucleotidos localizados en las posiciones 872 y 873, y en la otra cepa la deleccion es mayor de 641 pb, la cual justifica la perdida total de actividad de la enzima catalasa-peroxidasa de esta cepa. En todas las cepas con alguna mutacion en el gen katG la actividad de la catalasa estaba dsminuida. La mutacion puntual en el codon 304 y las dos delecciones tampoco se habian descrito antes de nuestro estudio. En la zona reguladora del gen inhA encontramos 3 cepas que presentan alteracion genetica: la sustitucion nucleotidica de una citosina por una timina en la posicion 209(C209T). No presentan alteracion en la actividad de la enzima catalasa-peroxidasa, ni detectamos ninguna alteracion en el gen katG. Esto supone un 25% del total de las mutaciones localizadas en las cepas resistentes a INH, frente al 75% de las alteraciones del gen katG. En el gen ahpC no identificamos ninguna alteracion genetica, ya que la unica cepa que presento un patron de SSCP diferente resulto ser un falso positivo pues tras secuenciar el fragmento esto no presento diferencia de la secuencia con las cepas sensibles consideradas como patron.

Autor: CEBALLOS GARCIA EVA M..
Año: 2000.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE CANTABRIA.

Resumen: c-myc se sobrexpresa en gran numero de tumores y algunas leucemias. Hemos utilizado la linea celular K562, derivada de una leucemia mieloide cronica (LMC) humana, como modelo para estudiar la interaccion funcional entre c-Myc y p53. Utilizando dos metodos diferentes, generamos dobles transfectantes K562 con expresion condicional para c-Myc y p53. Las celulas transfectadas expresan p53val135 mutante, que adopta una conformacion silvestre a 32ºC, mientras que la induccion de c-Myc fue aumentada con un vector de expresion inducible por Zn. Hemos visto que con la conformacion silvestre de p53 resulta en una parada del ciclo celular y apoptosis en k562, pero que c-Myc es capaz de rescatarlas de las apoptosis. La inhibicion de la apoptosis fue determinada por estudios morfologicos, union de Anexina V, actividad metabolica y fragmentacion internucleosomal del DNA. Ademas Myc no interfiere con la localizacion y degradacion de p53. Por otro lado, la expresion de Myc inhibe la transactivacion mediada por p53 de varios gees diana de p53 como Mdm2, Bax, p21waf1, PG13, 14-3-3, Perp pero no de Ciclina G. Para estudiar si c-Myc afectaba a p53 a nivel transcripcional, contrasfectamos el gen indicador luciferasa que lleva el promotor del gen diana de p53 a estudiar, con un vector de expresion c-myc. Ademas el cambio a 32ºC va acompañado de una bajada de la actividad quinasa de Ciclina E/Cdk2, medida mediante un ensayo quinasa. Los datos son consistentes con la sobreexpresion de c-Myc en presencia de p53 silvestre observada en la mayoria de las LMC en crisis blastica. Ademas, c-Myc es capaz de inhibir la transactivacion de p53 en otras lineas celulares derivadas de LMC, leucemia mieloide aguda, linfoma de Burkitt, cancer de prostata y epitelio de pulmon.

Autor: GALETTO MEARDI ROMAN ARIEL.
Año: 2000.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CANTABRIA. FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La apolipoproteina E (apoE) es una proteina plasmatica que participa en el transporte lipidico en el organismo e interviene en diferentes procesos celulares. La expresion de esta proteina en tejidos extrahepaticos tiene gran importancia ya que se relaciona con diversos procesos patologicos. La expresion en macrofagos en el espacio subendotelial de la pared arterial esta asociada a la transformacion de estas celulas en celulas espumosas, proceso fundamental durante la formacion dela placa de ateroma y en el desarrollo de las ateroesclerosis. ApoE tiene un efecto protector evitanto la formacion de celulas espumosas. En el sistema nervioso apoE tiene funciones relacionadas al desarrollo, la remodelacion, y la regeneracion del mismo. Ademas la expresion de uno de los alelos de esta proteina esta relacionada con la aparicion de ciertas formas de la enfermedad de Alzheimer. El Receptor Activado por Proliferadores Peroxisomales tipo gamma(PPARgamma) es un factor de transcripcion que se encuetnra involucrado tambien en procesos como la aterosclerosis y la enfermedad de Alzheimer y tiene un papel fundamental en la formacion de celulas espumosas en la placa de ateroma. Este factor de transcripcion es activado, entre oros, por Tiazolidinodionas, un grupo de drogas que se utilizan en el tratamiento de la diabetes tipo II. En esta tesis se presenta evidencia de la regulacion de la expresion del gen de apoE por PPARgamma, debido a la presencia de un elemento de respuesta a PPAR en la regioni intergenica apoE/apoC-I, que es una region de control de la expresion del gen de apoE. Estos resultados pueden contribuir a entender los efectos antiaterogeicos observados en el tratamiento con Tiazolidinodionas.

Autor: MANCHADO CAMPAÑA MANUEL.
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: DPTO. BIOQU. Y BIOL. MOLECULAR.

Resumen: Escherichia coli posee distintos regulones de defensa frente a situaciones de estrés. Mediante RT-PCR multiple se ha estudiado la regulación transcripcional de 17 genes, miembros de los regulones OxyR, SoxR/S, RpoS y MarA, en distintas condiciones de crecimiento y frente a diversos agentes estresantes (H2O2, paraquat, salicilato o NaC1). Se ha establecido la necesidad de fijar las condiciones de amplificacion mediante RT-PCR tipos C y T y la de incluir un estandar externo que monitorice posibles variaciones en la expresion del estandar interno o en control. El crecimiento en medio nutritivo LB induce la transcripcion de los miembros del regulon OxyR (oxyR, KatG,dps, gorA y ahpCF). La osmolaridad de este medio podria explicar dicha induccion, al no detectarse esta en medio minimo pero si en respuesta a estrés con NaC1. El H2O2, a dosis bajas (10 uM), induce el regulon OxyR y a concentraciones moderadas (100 uM) el regulon SoxR/S. Ambas inducciones son totalmente dependiente de los reguladores especificos (OxyR o SoxR, respectivamente). El regulon SoxR/S(soxS, micF, tolC y marA) responde tambien a paraquat, salicilato y NaC1. En todos los casos es una respuesta especifica dependiente de SoxR. La transcripcion del rob, homologo de soxS y marA, se reprime en respuesta a paraquat y salicilato, lo que explicaria el funcionamiento de ambos regulones en presencia de altos niveles basales de la proteina Rob. El regulon RpoS(rpoS, katE y osmY) no se induce con oxidantes (H2O2 o parquat) pero si con salicilato (estrés acido) y NaC1(estrés osmotico).

Autor: LUQUE RECIO FERNANDO .
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La vitamina D en su forma activa coordina la homeostasis del calcio y el fósforo, intervienen procesos como la proliferación, diferenciación celular y respuesta inmune. En el presente trabajo se han estudiado polimorfismos en varios genes relacionados con el metabolismo mineral.Para el estudio de los polimorfismos, se ha optimizado el método de extracción del DNA, así como la amplificación de los fragmentos polimórficos por PCR. Los resultados obtenidos han demostrado la exisencia de alguna relación de los gnees vdr y receptor de estrógenos con los niveles de masa ósea. No obstante, el gen del colágneo tiene un mayor efecto que el resto de genes analizados. Se ha estudiado además la posible relación de los polimorfismos del vdr.sobre la tendencia a rechazo en transplante cardiaco. Los resultados obtenidos no muestran efecto alguno de los polimorfismos para las restrictasas Bsm I y Taq I. Por otra parte, sí se ha observado cierta influencia en el polilmorfismo en el sitio para la restrictasa Fok I, sólo en hombre (el número de mujeres incluidas en el estudio fue muy bajo). Por otra parte, se ha puesto a punto la técnica RT-PCR cuantitativa para el estudio de la expresión géncia del receptor de vitamina D (vdr) y otros genes relacionados con el metabolismo mineral, como el de la hormona paratiroidea (pth), y el receptro de calcio (rCa). Una vez opitimizada, se ha aplicado al estudio de la expresión de estos genes en glándulas paratiorides de pacientes humanos enfermos (hiperparatiroidesmo secundario o enfermedad renal) en comparación con glándulas de ratas sanas. Para ello se han cultivado las glándulas en presencia de diferentes concentraciones de calcio, fósforo y calcitriol. Los resultados obtenidos muestran un aumento de los niveles de vdr en presencia de concentraciones altas de calcio. Finalmente, se ha estudiado la expresión diferencial del vdr entre ratas adultas-jovenes y viejas. Los resultados obtenidos muestran un aumento de los niveles de PTH en las ratas observado cambios en el resto de tejidos estudiados.

Autor: RUÍZ VILLÉN M. CONCEPCIÓN.
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El tema de esta Tesis Doctoral tiene como principal objetivo valorar los efectos de Melatonina, Vitamina E y de estas sustancias asociadas en la diabetes inducida por el modelo Estreptozotocina más Nicotinamida. Se plantea investigar las repercusiones sobre: peso, glucemia, glucosuria; %GHb y %HbA1c; nivel de lipoperóxidos referidos a malonildialdehído, glutatión reducido, catalasa y glutatión peroxidasa; triglicéridos, colesterol total y fracción HDL-colesterol. La reserva pancreática de insulina e insulinemia. De forma rutinaria se han realizado determinaciones de urea, creatinina, albúmina y proteínas totales en plasma. Respecto al material y los métodos, nuestra investigación la hemos realizado en ratas Wistar macho. Para la ejecución del trabajo se orgnanizaron los siguientes grupos experimentales, el número 1 son los animales control, grupo 2, ratas diabéticas por estreptoxotocina, el 3 recibió estreptozotocina, nicotinamida, los grupos 5, 4 y 6 los vehículos de nicotinamida, melatonina y vitamina E, respectivamente, el número 7 fue tratado con nicotinamida, grupo 8 con melatonina, el nueve con vitamina E, al grupo 10 se le administró estreptozotocina y melatonina, al 11 estreptozotocina y vitamina E, los animales del grupo 12 se trataron con estreptozotocina, nicotinamida y melatonina, por último, el grupo 13 recibio estreptoxotocina, nicotinamida y vitamina E. El periodo de mantenimiento de la diabetes fue de coho semanas. Los datos obtenidos revelan varios hechos importantes: inducción de un cuadro dibético y de estrés oxidativo en el modelo estreptozotocina, potente acción protectora sobre el curso e intensidad de la diabetes y estrés oxidativo de la nicotinamida y melatonina, fundamentalmente, y la vitamina E muestra menor efectividad en la reversión del estrés oxidativo, normalizacion de los niveles plasmáticos y pancreáticos de insulina.

Autor: GIRALT MUIÑA PATRICIO.
Año: 2000.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD MEDICINA UNIVERSIDAD DE CORDOBA.

Resumen: En el presente estudio se ha planteado la hipotesis de que la presentación de la Diabetes mellitus tipo 1 A(DM1A), depende en parte de las caracteristicas geneticas del paciente. Para ello, hemos comparado los grupos geneticos, (Biologia molecular), con distintos parametros tales como: edad, sexo, reserva pancreatica y gravedad clinica. Ademas hemos analizado la relación existente entre DR y DQ. La asociacion de la DM1A con otras enfermedades autoinmunes y la relacion genetica de los pacientes con sus hermanos. Otro aspecto del trabajo ha sido realizar un analisis epidemiologico de nuestro medio. Para ello hemos estudiado a 86 pacientes, 52 de ellos menores de 16 años. 43 son de cada sexo, no como producto de una selección sino del azar. De los resultados obtenidos podemos concluir: El 89,5%de los diabeticos tipo 1 de nuestro estudio son de los grupos geneticos DQA1*0501/DQB1*0201(36%), DQA1*0301/DQB1*0302(29%) y DQA1*0501,0301/DQB1*0201,0302(24%), lo que confirma que estos son los locus mas importantes en el origen genetico de la enfermedad. La heterozigocidad HLA:DQA1*0501,0301/DQB1*0201,0302 en pacientes DM1A esta asociada con un debut precoz de la enfermedad y con una mayor destruccion de celulas productoras de insulina. No se demuestra una diferencia significativa en cuanto al sexo en funcion del grupo genetico. Solamente el 58% de los DQ analizados corresponden con el DR esperado, lo que demuestra que los estudios realizados con serología o biologia molecular generan grandes diferencias si no se analizan los subgrupos. Se observa que el riesgo de padecer enfermedad celiaca o hipotiroidismo autoinmune entre los pacientes diabeticos es mayor que en la poblacion general. La incidencia de la DM1A en menores de 16 años, en la provincia de Ciudad Real, es de 26 por 100000 habitantes, y la prevalencia es de: 0,88x1000 habitantes y de 2 por mil entre los menores de 16 años lo que las hace la mayor de entre todos los estudios efectuados en España hasta la actualidad. La incidencia entre hermanos diabeticos en nuestro estudio es escasa-2 hermanos entre 86 diabeticos, a pesar de que el 70% presentan alelos de riesgo diabetogenico.

Autor: CROSAS NAVARRO BERNAT.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO FORMACION CONTINUADA.

Autor: VILA CASES PAU.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA.
Centro de realización: ESCUELA DOCTORADO Y FORMACION CONTINUADA.

Autor: RISQUES FERNÁNDEZ ROSA ANA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCOLA DE DOCTORAR I DE FORAMCIÓ CONTINUADA.

Resumen: La inestabilidad genómica presente en el tumor determina su evolución. Esta evolución puede ocurrir por diferentes vías de progresión tumoral que comportan unas características molecuares, cromosómicas y clínico-patológicas concretas. El estudio del daño genómico, consecuencia de la inestabilidad genómica, puede ayudar a caracterizar las vías de progresión tumoral y puede permitir la identificación de los grupos de tumores con peor pronóstico. Con el objetivo de caracterizar las distintas formas de daño genómico presentes en el cáncer colorectal y de determinar su relación con el comportamiento biológico del tumor se procedió a analizar el daño genómico de 131 tumores colorectales esporádicos mediante dos técnicas distintas: la citometría de flujo para medir aneuploidía, yla AP-PCR para cuantificar ganancias y pérdidas alélica. A continuación se realizó la comparación de los dos tipos de daño genómico entre ellos y con las variables clínico-patológicas y moleculares de los tumores y se determinó el valor pronóstico de las medidas de daño genómico. También se analizó el papel de la aneuploidía en la diseminación metastásica. Con la intención de mejorar la cuantificción de la aneuploidía de los tumores decidimos crear un nuevo índice (Aneuploidy Index, Al) que tuviera en cuenta el grado y la extensión de la aneuploidía en el tumor. El Al tiene valor pronóstico independiente del estadió de Dukes y pemrite identificar un subgrupo de pacientes con tumores en estadiós tempranos, pero con alto riesgo de muerte .Por otra parte, el daño genómico medido por AP-PCR (GDF) cuantifica desequilibrios alélicos y tambien presenta valor prónostico independiete. El alto GDF se asocia a mutaciones en p53, lo que indica que la inactivación de este gen podría ser una de las causas de producción de desequilibrios alélicos. Además, el GDF y el Al son independientes y por este motivo la combinación de las dos variables es el mejor predictor de supervivencia en los pacientes con resección quirúrgica radical. En cuánto al análisis de la ploidía en las metástasis, hemos observado que la mayoría presenta una población de células tumorales diploides, lo que indicaría que la diseminación ha sido llevada a cabo por este tipo de células. Además las metástasis reproducen el patrón de ploidía existente en el tumor primario. En base a los distintos tipos de daño genómico observado proponemos que éstos son la manifestación de 4 vías de profresión tumoral con factores pronósticos diferentes:vía de la inestabilidad de mcirosatéliles, vía diploide, sin inestabilidad de microsatélites (factor pronóstico; estadío de Dukes), vía aneuploide numérica (factor pronóstico: Al) y vía aneuploide numérico estructural (factor pronóstico: DGF).

Autor: RIQUÉ REBULL SUSANNA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCOLA DE DOCTORAT I FORMACIÓ CONTINUADA.

Resumen: Desde el descubrimiento de la insulina por Banting y Best el 1992 se ha hecho un gran progreso en el conocimiento y la comprensión de su química, fisiología y modo de acción. Todas las acciones que lleva a cabo esta hormona pancreática, tanto las metabólicas como las mitogéncias, se dan a través de su receptor. Este es un receptor de membrana, constituido por dos subunidades alfa que son extracelulares y que unen la insulina, y dos subunidades beta, con una región transmembrana y una región intracelular que tiene actividad tirosina quinasa intrínseca. Ya que el receptor es el primer paso en la señalización iniciada por la insulina, ha sido considerado como un candidato a presentar mutaciones responsables de la disrupción de la señal iniciada por la insulina y que consecuentemente darían lugar a la resitencia a la insulina. Se han descrito tres síndromes genéticos de resistencia a la insulina asociados a mutaciones en el gen del receptor de insulina: síndrome de Leprechaunismo, síndrome de Rabson-Mendenhall y síndrome de resistencia a la insulina Tipo A o de Kahn, aunque también de han descrito algunas mutaciones en algunos pacientes afectos de Lipodistrofia y obesidad. En el presente trabajo se han estudiado 18 pacientes con síndromes asociados a la resistencia a la insulina. El estudio molecular de los receptores mediante amplificación por PCR y secuenciación automática, permitió detectar tres nuevas mutaciones en heteroxigosis en tres pacientes afectas de resistencia a la insulina Tipo A (A1; Leu 40/aceptor de splilcing-1239Stop, A2; aceptor de splicing-1239 Stop y A3; Val1028), dos mutaciones en un paciente afecto del síndromte de Rabson-Mendengall previamente descritas (Lys 15 y Stop 1000), y una variación en un individuo control (Val985Met), además de diferentes polimorfismos. El estudio funcional de los receptores portadores de las nuevas mutaciones, mediante mutagénesis dirigida y transfección en células de ovario de hámster concluyeron que la mutación Leu 140 se expresa en los que el receptor WT y en consecuencia une menos insulina y presenta una actividad tirosina quinasa disminuida. La mutación Vall 1028 afecta a la secuencia consenso de unión del ATP por lo que impide la autofosforilaicón y anula la actividad tirosina quinasa. Por último la mutación de splicing-1239Stop da como resultado dos mRNA anómalos y diferentes, pero que al ser traducidos dan lugar a la misma proteína: al receptor le faltan 117 aminoácidos terminales que codifican para el extremo C-terminal. Este receptor se expresa normalmente, une un 50% de isnulina comparado con los receptores WT y no presenta autofosforilación ni actividad tirosina quinasa. Por tanto se puede concluir que la resistencia a la insulian que padecen los pacientes portadores de estas mutaciones, es debida al efecto que las mutaciones ejercen sobre la funcionalidad de los receptores.

Autor: ESPUMYA PRAT M. CARME.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DOCTORADO Y FORMACION CONTINUADA.

Resumen: La proteína quinasa CK2 es una Ser/Thr fosfotransferasa que participa en las rutas de transducción de señal relacionadas con la proliferación celular. En su forma más común, es una enzima oligomérica formada por dos tipos de subunidades, catalítica (alfa) y reguladora (beta), que se organizan en un tetrámero activo del tipo alfa2 y beta2. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio a nivel bioquímico y funcional de la proteína quinasa CK2 de sistemas vegetales, especialmente en relación a la proliferación celular. Se purificó por cromatografía líquida la CK2 de plantas de Arabidopsis thaliana. En esta especie, como en la mayoría de plantas, se demostró que coexisten isoformas monoméricas (alfa9 con isoformas oligoméricas (alfa2beta2), ambas activas enzimáticamente y que muestran propiedades bioquímicas diferentes. Para el estudio de la regulación de la CK2 durante la división celular, se utilizó como sistema biológico la línea celular BY-2 de tabaco, que es altamente sincronizable. La expresión global de las subunidades alfa y beta era constitutiva a lo largo del ciclo celular. La actividad enzimática oscilaba a lo largo de ciclo y mostraba picos en la transición G1/S y en Mitosis. Se propone que las pliaminas, los moduladores alostéricos más importantes de la actividad CK2, podrían ser en parte responsables de las oscilaciones de actividad. La inhibición in vivo de la CK2 con el inhibidor específico 4,5,6,7-tetrabromebenzotriazole, corroboró los picos de actividad. El bloqueo del ciclo celular en las fases S y G2 provocó la muerte de las células en un intervalo corto de tiempo. El bloqueo en la fase G1 no impedía que éstas iniciasen la replicación en el momento previsto, si bien no eran capaces de completarla porque condensaban prematurament la cromatina. Se discute la posible funcionalidad de la CK2 en el cumplimiento del checkpoint G2/M. El análisis de la expresión y la actividad de la CK2 en la curba de crecimiento de las células BY-2, junto con el establecimiento del patrón de expresión de la CK2 en diferentes órganos vegetales de A. Thaliana y Raphanus sativus por hibridación in situ, reveló que éstas aumentaban cuando se entraba a un estadio de proliferación. Además, la actividad CK2 se regula a través de la interacción alostérica con las poliaminas, así como por la presencia de la subunidad beta, controlada por mecanismos post-transcripcionales. Por hibridación in situ, se observó una expresión coordianda de las dos subundiades, la cual era alta en tipos celulares en división, como los meristemos, los diferentes primoridios vegetales y el periciclo. El cribaje de una biblioteca de cDNA de tabaco peritió aislar dos cDNAs para la subunidad alfa y uno para la subunidad beta, cuya secuencia conserva los motivos estructurales cracterísticos. Se postula que la presencia de una extensión de unos 80 aminoácidos en el extremo N-terminal de plipéptido beta, que es exclusiva de las plantas, puede ser determinante para el plegamiento de la forma tetramérica activa.

Autor: AMADOR ESPINOSA VIRGINIA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La tuberización (formación de los tubérculos de patata) es un proceso del desarrollo cracterístico de las plantas de patatera. En condiciones inductoras de la tuberización, en la punta de los estolones (tallos subterráneos modificados) empiezan a engordar hasta formar el tubérculo. Este engrosamiento viene dado por un cambio en el plano de división celular, en la punta del estolón, que cambia de longitudional a transversal y viene acompañado de una gran acumulación de almidón y una glicoproteína llamada patatina. La tuberización está fuertemente influenciada por factores ambientales como la temperatura, el aporte de nitrógeno y el fotoperiodo (horas de luz y oscuridad que recibe la planta durante las 24 horas del día) y factores endógenos como la edad fisiológica de la planta y el efecto de las hormonas vegetales. "In vivo" se ha demostrado al capacidad inhibitoria, de la tuberización, de las hormonas giberelinas. Fotoperiodos de días cortos (8 horas de luz y 16 horas de oscuridad) favorecen la tuberización pero existen algunas variedades de patatera, por ejemplo Soanum tubersosum, que requieren días cortos para tuberizar. En mi laboratorio se asiló mediante la técnica de "Differential Display", en la que se comparaba el patrón de expresión de las hojas de plantas de S. Tuberosum crecidas en condiciones inductoras y no inductoras para la tuberización, una proteína llamda por (PHOtoperiod Responsive 1). PHOR1 presenta una expresión incrementada en las plantas crecidas en condiciones inductoras para la tuberización, días cortos. PHOR1 codifica para una proteína que presenta un dominio homólogo al dominio "Arm-repeat" de la proteína de segmentación polarizada Armadillo de Drosophila melanogaster. Las plantas transgénicas de una construcción antisentido para el gen de PHOR1, con niveles reducidos de expresión de la proteína PHOR1, presentan un fenotipo semi-enano dado por una redución en la parte apical de la planta, similar al de las plantas deficientes en las hormonas vegetales giberlinas.Las plantas transgéncias con niveles reducidos d ePHOR1 presentan una respuesta reducida a giberlinas. Las plantas transgéncias con niveles reducidos de PHOR1 presentan una respuesta reducida a giberelians combiando con un incremento en los niveles endógenos de estas hormonas. El control por regulación negativa y positiva de la expresión de los genes de los enximas biosintéticos GA20-oxidasa y GA2-oxidasa, respectivamente, se ve alterado en las plantas transgénica en comparación a las plantas salvajes. Al contrario pasa con las plantas transgénicas portadoras de una construcción de sobreexpresión de la proteína PHOR1. Las plantas que sobreexpresan elevados niveles de esta proteína presentan un fenotipo parecido a las plantas salvajes tratadas con giberrelinas y presentna un incremento de sensibilidad a estas hormonas, en comparación a las plantas salvajes. La aplicación de giberelinas al medio induce una rápida migración de la proteína PHOR1 al núcleo de las células. Todos estos resultados nos están indicando que PHOR1 és una proteína involucrada en la vía de transducción de señal de las giberelinas, ejerciendo un papel activador de ésta.

Autor: CAMARASA SABATER M. VICENTE .
Año: 2000.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La resistencia tumoral a multiples farmacos (conocida como fenotipo MDR) es comun en los pacientes oncológicos y frecuentemente limita la eficacia de la quimioterapia. El tratamiento con agentes antineoplasicos resulta entonces inefectivo debido a la sobreexpresion de bombas de eflujo que expulsan los farmacos al exterior celular, disminuyendo en gran medida su concentracion intracelular y por tanto su efecto citotoxico. Alternativamente el tratamiento antiproliferativo se ha propuesto el uso de tratamientos de diferenciacion, basados en la consideracion de que la proliferacion tumoral incontrolada supone tambien un proceso de maduracion celular alterado. Las relaciones entre los procesos de adquisicion de resistencia a multiples farmacos y de diferenciacion celular se analizan en la linea de leucemia promielocitica humana HL-60, que constituye un buen modelo puesto que madura en respuesta a agentes quimicos originando poblaciones semejantes a las correspondientes normales, en concreto en las vias monocitica y granulocitica. Los resultados de infuencia de la adquisición de resistencia sobre la maduracion indican que esta se encuentra bloqueada o en cualquier caso retardada en las celulas que previamente han adquirido un fenotipo resistencia. El analisis de celulas previamente sensibles inducidas a maduracion indica que el bloqueo del ciclo celular inherente a la diferenciacion puede ser causa suficiente de la incrementada resistencia que presentan. En cambio los tratamientos de diferenciacion en celulas que ya han adquirido el fenotipo MDR ofrecen resultados diversos dependiendo de la via madurativa estudiada. Sin embargo la expresion de MRP, proteina conferidora de MDR sobreexpresada en nuestras celulas resistentes, disminuye en respuestaa los tratamientos inductores de maduracion ensayados, en concreto el ester de forbol 12-miristato, 13-acetato (TPA) en la via monocitica, y el dimetilsulfoxido (DMSO) en la via granulocitica. El gen supresor de tumores p53 esta implicado en la carcinogenesis gastrica, y su papel en la regulacion de la expresion del gen mdr-1, que codifica la Glicoproteina-P (PGP), conferidora de MDR, es controvertido. El adenocarcinoma gastrico es intrinsecamente resistente puesto que PGP se expresa normalmente en la mucosa gastrica. En el analisis de la influencia entre el estado (nativo o mutado) de p53 y la expresion de PGP en adenocarcinomas gastricos, los resultados muestran presencia de mutaciones puntuales en el 16% de las biopsias tumorales analizadas, todas ellas asociadas a expresion media o alta de PGP. Dichas mutaciones han sido descritas previamente en la literatura, y el estudio de su efecto sobre el fenotipo en relacion a la multirresistencia permitira la instauración de terapias antitumorales mas eficaces.

Autor: CARRASCO SERRAO M. CARMEN .
Año: 2000.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: INSTITUTO DE NEUROCIENCIAS.

Resumen: La subunidad alfa 7 del receptor nicotinico neuronal de ACh presenta, al igual que la mayoria de los receptores nicotinicos neuronales, un promotor sin caja TATA. Presenta, sin embargo, varias cajas GC a las que Egr-1 puede unirse activando la expresion del gen de la subunidad alfa 7. Las proteinas USF tambien son criticas en la transcripcion del gen de la subunidad alfa 7 al interaccionar con la caja E. USF1 y USF2 se unen a este elemento como horno-o heterodimeros. La subunidad alfa 7 puede estar presente en tejidos no neuronales tales como el musculo esqueletico embrionario. La regulacion del promotor de la subunidad alfa 7 en celulas de origen muscular es muy similar a la observada previamente en celulas de origen neuronal. Se ha observado ademas que, el promotor de la subunidad alfa 7 se activa durante el proceso de diferenciacion de mioblastos a miotubos de las celulas C2C12. Esta activacion ocurre al menos en parte como consecuencia de un incremento en la cantidad de Egr-1. Los esteres de forbol tambien activan la transcripcion del promotor de alfa 7 por un mecanismo dependiente de Egr-1. Por otro lado, los datos experimentales parecen apoyar la hipotesis de que los glucocorticoides secretados por la corteza de la glandula adrenal bovina esten determinando la colonizacion en la medula adrenal bovina de la enzima PNMT, del factor de transcripcion Egr-1 y de la subunidad alfa 7.

Autor: MITJANS PRAT FRANCESC.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: UNIVERSITAT DE BARCELONA.

Autor: FANDES ESPALLARGES CÉSAR.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Los tejidos animales requieren glucosa como principal sustrato metabólico. La captación de glucosa se debe principalmente a los transportadores de difusión facilitada de la familia GLUT. El transportador de glucosa GLUT1 es el responsable de la captación basal de glucosa y presenta una alta expresión en tejidos fetales. Durante el desarrollo del músculo, uno de los principales tejidos sensibles a la insulina, se produce la represión de la expresión transcripcional de GLUT1 y, parcialmente, se induce la expresión del transportador GLUT4, responsable de la captación de glucosa en respuesta a la insulina. En esta tesis se ha estudiado la región promotora del gen GLUT1 y se han identificado algunos de los factores de transcripción responsables de la regulación a nivel transcripcionalde dicho gen. La región -99/-33 del promotor proximal del gen GLUT1 contiene los elementos necesarios para mantener la actividad transcripcional del gen. En esta región se ha identificado una caja GC, lugar de unión para los factores de transcripción Sp1 y Sp3. Sp1 actúa como activador de la transcripción del gen GLUT1, mientras que las diferentes isoformas de Sp3 (110 kDa y 70 kDa) expresadas en las células y tejidos estudiados son inhibidoras. La relación Sp1/Sp3 determina el tipo de regulación (activación o represión) ejercida a través del lugar de unión. Durante la proliferación celular y la etapa fetal Sp1 y Sp3 son relativamente abundantes siendo su expresión reprimida durante la diferenciación muscular y el desarrollo perinatal. La diferenciación miogénica promueve una variación transitoria en la relación Sp1/Sp3 que contribuye a la represión de la transcripción del gen GLUT1. Este modelo permite explicar la represión transcripcional de GLUT1 durante el desarrollo muscular y su re-expresión en respuesta a la denervación, proceso en el que el músculo revierte a un fenotipo fetal. La expresión de Sp1 y Sp3 durante la diferenciación miogénica está regulada, al menos en parte, por mecanismos post-transcripcionales. Adicionalmente se ha estudiado la regulación a nivel transcripcional de la expresión de GLUT1 por AMPc, mensajero secundario implicado en situaciones de resistencia a la insulina. El AMPc estimula la actividad transcripcional del gen GLUT1. En estas condiciones, inhibe la expresión de las proteínas Sp1 y Sp3. En consecuencia, los mecanismos responsables de la activación transcripcional son independientes de la caja GC y deben implicar la función del resto factores reguladores que se unen a la región -99/-33 del promotor proximal de GLUT1.

Autor: ROURA FERRER SANTIAGO.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: IMIM DE BARCELONA.

Resumen: Esta tesis demuestra la implicación directa de los procesos de fosforilación en tirosina en la regulación de la interacción entre la B y la piro-cateninas con la E-cadherina en las uniones adherentes. Así mismo demuestra el efecto de la piro-catenina, o al menos de algunas de sus isoformas, en la regulación de la expresión de snail, el factor represor del gen de la E-cadherina en células epiteliales tumorales. En último lugar, demuestra un papel positivo o activo de las formas truncadas de la proteína APC, expresadas en la mavioria de tumores colorectales, en la regulación de la actividad transcripcional del complejo formado por la p-catenina y el factor de transcripción TCF-4.