BIOQUIMICA MOLECULAR, 29

Autor: SOGUERO SERRANO CAROLINA.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: La extracción y amplificación del ARN del virus de la hepatitis C, ARN-VHC, proveniente de material de archivo parafinado, presenta serias dificultades permitiendo únicamente amplificar la región conservada 5'NC en biopsias almacenadas hasta 10 años. OBJETIVOS 1,- Desarrollar un sistema para amplificar el ARN-VHC a partir de biopsias hepáticas incluidas en parafina, que permita hacer estudios retrospectivos de más de 10 años de antigüedad. 2,- Adecuar un sistema de genotipado para este tipo de material. 3,- Optimizar la RT-PCR para poder analizar otras regiones genómicas del VHC distintas a la región 5'NC. MATERIAL Y MÉTODOS El ARN fue extraído de 50 biopsias hepáticas incluidas en parafina: 23 biopsias de aguja (11 de pacientes con hepatitis crónica NANB diagnosticadas entre 1971-1985-8, con histología hepática normal y 4 biopsias secuenciales de un paciente con recurrencia de la infección por VHC tras el trasplante hepático) y 27 explantes hepáticos entre 1988-1996 (16 por cirrosis asociada al VHC y 11 de otras etiologías). Los factores que se estudiaron para optimizar la amplificación de la región 5'NC fueron: A,- rendimiento del fenol en función del pH (4.5, 5.0-5.5, 6.7-7.0). B,- temperatura y tiempo de digestión con proteinasa K: 60ºC durante 5 horas o bien, 42ºC durante 4 días. C,- tamaño de la secuencia diana del VHC: 171 pb, 286 pd. D,- sistema de retrotranscripción: acoplada directamente a la PCR con la AMV o bien en dos viales separados con la MMLV. Sistemas de genotipado utilizados fueron RFLP y por secuenciación. Las regiones del genoma del VHC diferente a la 5'NC que se intentaron amplificar fueron HVR-1 e ISDR. RESULTADOS Las condiciones óptimas para amplificar la región 5'NC del VHC para realizar estudios retrospectivos de más de 10 años fueron: fenol pH 4.5, sistema de digestión con proteinasa K a 42ºC durante 4 días con producto de PCR-2 de 171 pb y la retrotranscripción con MMLV separada de la PCR. La amplificación de la región 5'NC se consiguió en 28/31 (90%) que eran NANB/VHC positivo: 20/20 (100%) de las biopsias de menos de 10 años de antigüedad, 8/11 (73%) de las diagnosticadas NANB. No hubo falsos positivos. El genotipo de las biopsias fue 1b en todas salvo en dos de ellas que fueron 1a. Las regiones HVR-1 e ISDR se amplificaron en 24/28 (86%) de las muestras 5'NC. El éxito de la amplificación fue inversamente proporcional a la edad de la biopsia. Se consiguió analizar la evolución de las regiones HVR-1 e ISDR en un estudio longitudinal de 8 años, de 4 biopsias de aguja parafinadas de un paciente que recurrió la infección por VHC tras el trasplante hepático. CONCLUSIONES Las biopsias hepáticas incluidas en parafina son aptas para realizar estudios retrospecvtivos de hasta más de 20 años de antigüedad, incluidas otras regiones genómicas del virus de la hepatitis C.

Autor: JULVE GIL JOSEP.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: SERVEI DE BIOQUÍMICA. HOSPITAL DE LA SANTA CREU I SANT PAU.

Resumen: Las apolipoproteínas (apo) más abundante de las lipoproteínas de alta tensidad (HDL) son la apoA-I y la apoA-II. La apoA-I tiene un papel estructural muy importante en las HDL, ya que interacciona con el receptor(es) de las HDL y es cofactor de la lecitina: colesterol aciltransferasa (LCAT). En cambio, el papel que juega la apoA-II en el metabolismo lipoproteico y en el desarrollo de arteriosclerosis es menos conocido. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado y caracterizado diferentes líneas de ratones transgénicos con fondo genético C5BL/6 que expresan la apoA-II humana (líneas 25.3 y 11.1). Los ratones con menos expresión de apoA-II humana no mostraron diferencias fenotípicas respecto de los ratones control. En cambio, los ratones con más expresión de apoA-II humana en plasma (línea 11.1) presentaron, alimentados con una dieta de mantenimiento, hipertrigliceridemia y hipocolesterolemia, ésta última fundamentalmente debida a una deficiencia de colesterol de HDL. Los ratones transgénicos 11.1 alimentados con una dieta rica en grasas y colesterol desarrollaron una hiperlipemia combinada que resultó en unos niveles de colesterol moderadamente aumentados y un aumento más importante de los triglicéridos plasmáticos, acompañado de una deficiencia de colesterol de HDL respecto de los ratones control. Por este motivo, en el presente trabajo se estudiaron los mecanismos involucrados en la aparición del fenotipo lipoproteico descrito en los ratones transgénicos 11.1. La sobreexpresión de apoA-II humana provocó una deficiencia parcial en plasma de apoA-I y HDL. En dieta de mantenimiento, los ratones transgénicos 11.1 presentaron una disminución en la síntesis hepática de apoA-I como consecuencia de un mecanismo, sólo en parte, transcripcional, dado que la tasa de secreción de apoA-I como consecuencia de un mecanismo, sólo en parte, transcripcional, dado que la tasa de secreción de apoA-I estuvo consecuencia de un mecanismo, sólo en parte, transcripcional, dado que la tasa de secreción de apoA-I estuvo proporcionalmente más disminuída. El desplazamiento in vitro de la apoA-I de raón de las partículas HDL por parte de la apoA-II humana se ecnontró asociado con una disminución en el tamaño de las HDL y un catabolismo más acelerado. El fenotipo bioquímico plasmático que presentaron estos ratones transgénicos es consistente con la existencia de una deficiencia funcional parcial de la actividad LCAT muy probablemente causada por la deficiencia de apoA-I. Además, el contenido lipídico de las HDL, de estos ratones fue catablizado más rápidamente por el hígado y tejido esteroidogénicos y esto último se asoció a una reactividad de las HDL por la lipasa hepática aumentada. Por otro lado, la hiperlipemia combinada fue debida a un aumento en la producción hepática de VLDL en los ratones transgénicos 11.1 alimentados con una dieta rica en grasas y colesterol. Este aumento en la síntesis de VLDL se encontró asociado a una concentración plasmática de ácidos grasos libres ciruclantes signficativamente elevada. A su vez, el aumento de los ácidos grasos libres plasmáticos coincidió con una mobilización aumentada de los depósitos de triglicéridos del tejido adiposo blanco epididimal/parametrial, una disminución gravimétrica de dicho tejdio y una síntesis de ácidos grasos endógena y sensibilidad a la insulina normales. Los ratones transgénicos de la apoA-II humana pueden ser un modelo fenotípico de la hiperlipemia familiar combinada humana, una enfermedad con un potencial aterogénico muy elevado que afecta al 1% de la sociedad occidental, ya que comparten la característica principal que consiste en un aumento de la síntesi de VLDL y, por tanto, pueden ser útiles en el estudio de terapias farmacológicas dirigidas a la prevención/regresión de los efectos del perfil lipoproteico sobre la progresión de arteriosclerosis

Autor: LOPEZ FONTANALS MARTA.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD BIOLOGÍA.

Autor: RUBIO VIDAL NURIA.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACION ONCOLOGICA.

Resumen: La metástasis es un proceso complejo, en el cual intervienen la migración celular, la invasión de los tejidos del huésped, la adhesión a los endotelios, la colonización de los organos diana y, finalmente, los múltiples procesos asociados a la proliferación celular. Nuestro objetivo fue el estudio de los mecanismos que intervienen en la dispersión metastática y su regulación, utilizando como modelos tumores humanos de próstata y mama, que son socialmente relevantes. La estrategia para estos estudios se basó en la medición de la capacidad metastática de los modelos tumorales y de los cambios resultantes de su manipulación genica. Para conseguir este objetivo fue necesario establecer un procedimiento que permitiese medir de forma objetiva, cuantitativa y sensible la presencia de células tumorales en los órganos diana, desde los momentos iniciales de la metástasis. El método debería ser, además, aplicable a diferentes tipos de tumores y de fácil utilización para poder explorar un gran número de órganos. Se utilizó el gen de la luciferasa para marcar las células tumorales con un trazador detectable en los organos del animal de experimentación. Se desarrollo un procedimiento de transfección permanente de células que es más rápido que las existentes, se eliminan algunas manipulaciones engorrosas y se facilita la selección del clon transfectante con más alto nivel de expresión del gen de interés (Capitulo I: Simultaneous Selection and Cloning of Transfected Eukaryotic Cells, Biotechniques 21:622-624,1996). Una vez lograda la obtención de células de adenocarcinoma de próstata PC-3 con un alto grado de expresión de luciferasa, se utilizaron como modelo para el estudio de la metástasis a ganglios linfáticos y su relación cuantitativa con el tumor primario. (Capitulo II: Traffic to Lymph Nodes of PC-3 Prostate Tumor Cells in Nude Mice Visualized Using the Luciferase Gene as a Tumor Cell Marker, Lab. Invest. 78: 1315-1325,1998). El siguiente objetivo fue la ampliación del estudio a un conjunto extenso de órganos del ratón, para detectar el grado de dispersión sistémica de las células tumorales y a la vez, establecer la relación entre estas metástasis y el tumor primario. (Capitulo III: Metastatic Burden in Nude Mice Organs Measured Using Prostate Tumor PC-3 Cells Expressing the Luciferase Gene as a Quantifiable Tumor Cell Marker, The Prostate, 44: 133-143,2000). Como objetivo final se propuso estudiar el efecto que tiene la inducción, por manipulación génica, de la sobreexpresion de Bcl-Xl, sobre la diseminación metastática de las células MDA-MB-435, un tumor de mama humano. (Capitulo IV: Metastatic Behavior of Human Breast Carcinomas Overexpressing the Bc1-xL Gene: a Role in Dormancy and Organospecificity. Sometido)

Autor: MEZQUITA MAS PAU.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINE.

Autor: BUSQUETS RIUS SILVIA .
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: La pérdida de masa muscular es una de las características comunes que se presentan durante situaciones catabólicas como por ejemplo durante el crecimiento de un tumor, la sepsis o el ayuno. En esta tesis se ha profundizado en el estudio de la regulación de la proteolisis leucina presenta un papel inhibidor de la proteolisis incrementada en situación de crecimiento tumoral a nivel tanto sobre la actividad enzimática del sistema lisosomal como sobre la expresión génica de algunos componentes del sistema proteolítico dependiente de ubiquitina y lisosomal. Se ha demostrado también un papel contraregulador y lisosomal. Se ha demostrado también un papel contraregulador de calcio en la proteolisis incrementada durante la presencia de un tumor. En esta tesis se ha pretendido también el estudio de la expresión de los nuevos miembros de la familia de las proteínas desacopladoras de la respiración mitocondrial: UCP2, UCP3 y BMCP-1. Se ha demostrado que durante el crecimiento tumoral incrmenta la expresión génica de la UCP2 y UCP3 en el músculo esquelético, de la UCP2 en el cerebro. Este último efecto se observa también en ratones a los que se ha administrado LPS agudamente. Los factores que estan implicados en la regulación de la expresión génica de dichas proteínas son las concentraciones circulantes de los ácidos grasos y la citoquina TNF-a. Por último se realizó un estudio para analizar la existencia del fenómeno de la apoptosis en el músculo esquelético de animales portadores de tumor. Este fenómeno tiene lugar en estos animales y está contribuyendo al desgaste muscular caracteríctico del síndrome de la caquexia ancerosa. El TNF-a se encuentra implicado en la inducción a la apoptosis en el músculo esquelético.

Autor: CARMONA OROZCO M. CARMEN.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En mamíferos existe un tejido especializado en disipar energía en forma de calor con el fin de mantener la temperatura corporal. Es el tejido adiposo marrón TAM. Su función viene determinada por la presencia de una proteína específica, UCP1, en la membrana mitocondrial interna. En 1997 se clonaron dos nuevas proteínas desacopladoras, UCP2 y UCP3, con una distribución más ubicua. En la presente tesis se ha determinado el perfil de expresión de las nuevas UCPs durante el desarrollo fetal y la diferenciación del TAM. Así, el mRNA de UCP2 se detecta con anterioridad al de UCP1 y el de UCP3 solamente es detectable a partir del nacimiento. En animales adultos el mRNA de UCP2 incrementada como respuesta al frío, al igual que el de UCP1, pero no así el de UCP3. Además hemos identificado a los agonistas PPARy y el isómero 9-cis del ácido retinoico como principales reguladores de los niveles de mRNA de UCP2 en adipocitos marrones maduros. Los factores de transcripción C/EBP regulan el promotor del gen marcador del TAM, el promotor UCP1, in vitro. Por eso, nos planteamos analizar el papel de dos de los miembros de la familia, C/EBPalfa y C/EBPbeta en la diferenciación y función del TAM in vivo. Para ello utilizamos dos modelos de animales, los ratones con disrupción dirigida (knockout, KO) de C/EBPalfa o de C/EBPbeta. La falta de C/EBPbeta determina en los ratones una deficiente termoregulación; esta incapacidad para regular la temperatura corporal se debe a una falta de substratos energéticos tanto endógenos como exógenos, asociada a una deficiente actividad del enzima lipoproteína lipasa en TAM. Los ratones KO C/EBPalfa, presentan importantes alteraciones en el proceso de diferenciación del TAM. Así, no sólo se halla impedida la diferenciación adipogénica y termogénica del tejido, sino que también lo están la biogénesis mitocondrial y la adquisición del estado tiroroideo maduro del TAM. Por tanto C/EBPalfa es imprescindible para todos estos procesos, relacionando por primera vez y de forma específica un factor de transcripción típicamente adipogénico C/EBPalfa con la mitocondriogénesis y el estado tiroideo del tejido adiposo marrón.

Autor: DELGADO ESTEBAN MARIA.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Las lesiones hipóxico-isquémicas constituyen la principal causa de muerte en el recién nacido y en las enfermedades cerebrovasculares. En este sentido, el cerebro es especialmente sensible a cambios en el aporte de oxígeno y de sustratos metabólicos, principalmente la glucosa. En el presente trabajo, hemos estudiado el mecanismo por el cual las neuronas son susceptibles a la hipoxia-isquemia. Nuestros resultados muestran que las neuronas son resistentes a la hipoxia-isquemia. Nuestros resultados muestran que las neuronas son resistentes a la hipoxia, pero no a la isquemia. Esta última situación conduce a una situación de estrés oxidativo, inhibiéndose el complejo I mitocondrial y provocando la muerte neuronal por recrosis. La presencia de superóxido dismutasa junto con catalasa durante la hora de isquemia previno del daño neuronal. Lo que implica al anión superóxido en dicho proceso. Aunque se desconoce el mecanismo que media el daño mitocondrial asociado a la hipoxia-isquemia,numerosos estudios lo relacionan con un aumento en la producción de radicales libres, entre los que se encuentra el óxido nítrico. El óxido nitrico se sintetiza por la óxido nitrico sintasa (NOS), en presencia de su cofactor esencial, la tetrahidrobiopterina (BH4). Asi, mostramos que le tratamiento con 2,4-diamino-6-hidroxipirimidina DAHP durante 18 horas,un inhibidor especifico de la GTP ciclohidrolasa I, disminuye los niveles intracelulares de BH4, determinados por HPLC con detección electroquímica. Es más, la deficiencia en BH4 produjo la caída en la sintesis de óxido nitrico, efecto que se previno con el suplemento de BH4. Estos resultados podrian tener relevancia fisiopatologica, puesto que se ha comprobado que los enfermos de ciertas enfermedades neurológicas, como son el Alzheimer o el Parkinson, presentan niveles bajos de BH4 en el liquido cefalorraquídeo, y que, además, están sometidos a un gran numero de episodios hipóxido-isquemicos.

Autor: PALOMERO LABAJOS JESÚS.
Año: 2000.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: EDIFICIO DEPARTAMENTAL (CAMPUS MIGUEL DE UNAMUNO) .

Resumen: OBJETIVO GENERAL Evaluar los cambios que experimenta la homeostasis del glutatión, como mecanismo de defensa antioxidante celular, con la edad, y como se modifica la susceptibilidad del hígado y del riñón ante los efectos tóxicos de la ciclosporina A (CyA) con el evejecimiento. MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL Se emplearon ratas Wistar macho de cuatro edades diferentes: JOVEN (1 mes), ADULTA (2 meses), MADURA (4 meses) y SENESCENTE (24 meses) y tres tipos de tratamientos farmacológicos cuya duración fue de una semana: CONTROL (aceite de oliva 1 mL/Kg/día), CyA (CyA 10 mg/Kg/día), y el cotratamiento SAMe+CyA (CyA 10 mg/Kg/días y simultáneamente S-adenosilmetionina (SAMe) 10 mg/Kg/12 horas). PARÁMETROS DETERMINADOS Parámetros generales (flujo, biliar, peso corporal y hepático), las concentraciones de glutatión total (GS) y oxidado (GSSG) en bilis, plasma, hígado y riñón, la secreción biliar de GS y GSSG, la concentración de sustratos plasmáticos (bilirrubina, ácidos biliares, creatinina, urea, ácido úrico, glucosa y colesterol), las actividades enzimáticas: aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y fosfatasa alcalina (ALP) en plasma, y glutamil cisteinil sintetasa (GCS), superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión S-transferasa (GST) en hígado, y la concentración hepática y renal de TBARS. CONCLUSIONES El envejecimiento biológico cursa con desequilibrio de los procesos antioxidantes y prooxidantes hepáticos, y se manifiesta aun cuando aumenta la actividad de las principales enzimas antioxidantes y el glutatión reducido. El contenido biliar de glutatión disminuye con la edad debido a los cambios que experimentan tres factores determinantes de su homeostasis hepática: el tamaño del pool de GS y GSSG, su transporte canalicular y su catabolismo intrabiliar. El tratamiento con CyA depelciona el GS hepático, altera las defensas antioxidantes enzimáticas del hígado y produce estrés oxidativo y/o lipoperoxidación, siendo los efectos muy acusados en los animales senescentes. La CyA reduce el GS biliar debido a que estimula el catabolismo intrabiliar del GS, que es menor a medida que aumenta la edad, e inhibe el transporte canalicular del mismo. El cotratamiento con SAMe y CyA antagoniza total o parcialmente los efectos hepatotóxicos de la CyA, normalizando la eficacia de los sistemas antioxidantes, el estado redox del glutatión y su transporte y catabolismo intrabiliar. PALABRAS CLAVES Envejecimiento, glutatión, ciclosporina A, S-adenosilmetionina, defensas antioxidantes enzimáticas, estrés oxidativo, estado redox, lipoperoxidación, bilis, hígado.

Autor: PÉREZ BRANGULLZ FRANCESC.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FAC. MEDICINA CAMPUS BELLUITGE.

Resumen: Las necrosecreción es uno de los procesos de -- regulada más estudiando en los últimos años y, en concreto, las bases moleculares que contoe-- la fusión de la vesícula sináptica con en membrana presináptica. Dicho proceso se explica mediante en hipótesis SNARE, la cual nos habla de la formación de un complejo SNARE el cual está formado por Sintaxinal y SNAP-25C proteina de la membrana prasináptica y sinoptobreniva/VAMP (proteina vesicular). En el sistema nervioso (SN) se conocen dos isoformas para sintaxina 1 (1A y 1B) y dos más para AMP (1 y 2). Hasta la fecha no se conoce claramente que posibles papeles pueden desempeñar en el neurona la presencia de diferentes isoformas SNARE. Por ello, nuestro laboratorio ha desarrollado diferentes, herramientas moleculares que han determinado la posible formación de diferentes complejos SNARE integrados por el -- combinaciones de isoformas de sintaxina i --, las cuales se encontrarian sometidas a mismos niveles de regulación como pueden ser SNAP-25 i MUNC-18 a.

Autor: MOZAS ALONSO M. PILAR.
Año: 2000.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La hipercolesterolemia familiar (HF) es una hiperlipemia que se caracteriza por un aumento de la concentración plasmática de colesterol total (CT) y colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (cLDL) y que está causada por mutaciones en el gen del receptor de LDL (rLDL). El objetivo que nos planteamos fue establecer las bases genéticas de la HF en nuestra población y estudiar la influencia de otros genes en los niveles de cLDL y en el riesgo de enfermedad cardiovascular de los sujetos con HF. Para ello, seleccionamos 36 sujetos no relacionados con diagnóstico clínico de HF. Mediante análisis de restricción, analizamos la mutación R3500Q en el gen de apo B y, mediante análisis por SSCP, buscamos otras mutaciones puntuales en la zona del gen de apo B que condifica el dominio de unión al rLDL y que podría ser la causa de la hipercolesterolemia presente en estos sujetos. Tras descartar la presencia de mutaciones en el gen de apo B, llevamos a cabo el análisis mutacional del gen del rLDL. Así, mediante análisis de SSCP y secuenciación, detectamos 21 mutaciones puntuales o pequeñas delecciones/inserciones y 9 polimorfismos comunes en el gen del rLDL, y mediante la técnica de Southern detectamos 1 gran reordenamiento. Estas 22 mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/inserciones y 9 polimorfismos comunes en el gen del rLDL, y mediante la técnica de Southern detectamos 1 gran reordenamiento. Estas 22 mutaciones explican la hipercolesterolemia presente en 29 de los 36 sujetos estudiados, lo que supone el 81% de los casos. Entre las mutaciones detectadas 4 ((-49) C>T, 1045 del C, 1845 + 1G > C y 2207 insT) son mutaciones nuevas, no identificadas previamente en otras poblaciones. En este estudio, hemos observado que los sujetos con HF portadores de mutaciones de cambio de aminoácido en el gen del rLDL tenían niveles de cLDL más bajos que los portadores de otros tipos de mutaciones, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística. Para analizar la influencia del gen de apo E y del LpL en los niveles de cLDL y en el riesgo de enfermedad coronaria de los sujetos con HF, mediante análisis de restricción determinamos el genotipo de apo E y analizamos las mutaciones D9N, N291S y S447X en el gen de LpL, observando que los sujetos portadores del genotipo de apo E 3/4 tenían niveles de cLDL más altos que los portadores del genotipo 3/3, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística, y que los sujetos portadores de la mutación S447X en el gen de LpL mostraban una mayor tendencia a desarrollar ECP que los no portadores. En conclusión, la caracterización molecular de los defectos genéticos responsables de la HF, así como el estudio de la influencia de otros genes en la expresión fenotípica de la enfermedad: simplificará el diagnóstico preciso de la hiperlipemia, facilitará el consejo genético y posibilitará la detección precoz de los sujetos afectos, lo que permitirá el tratamiento de los pacientes de forma más específica.

Autor: PÉREZ PÉ ROSAURA .
Año: 2000.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA DE ZARAGOZA.

Resumen: * La combinación del método de swin-up/dextrano con la aglutinación producida por la lectina de Ricinus communis, permite la selección de espermatozoides con alta motilidad, viabilidad y heterogeneidad. * La criopreservación de espermatozoides ovinos con diluyentes basados en Tris y suplementados con una alta cantidad de yema de huevo, reduce significativamente la pérdida de calidad espermática asociada a este proceso. La adición de lactalbúmina bovina y vitamina E al diluyente criprotector, incrementa los valores de los parámetros de calidad en semen congelado/descongelado. * Las proteínas del plasma seminal ovino son capaces de revertir y de proteger del daño producido por el choque térmico por frío sobre la membrana espermática. La adsorción a la superficie celular restaura la integridad de la membrana dañada. * La inducción de la capacitación en espermatozoides ovinos aumenta la fosforilación en residuos de tirosina de proteínas de la membrana. El choque térmico por frío produce un aumento de esta fosforilación que corresponde, parcialmente, con el patrón observado en células capacitadas. Las proteínas del plasma seminal inhiben este aumento de la fosforilación asociado al cold-shock. * La participación en un sistema bifásico formado por dextramo, polietilenglilcol y Ficoll, y cargado con bromuro potásico, permite la separación de poblaciones espermáticas enriquecidas en cromosomas X o Y con alta variabilidad celular. * La distribución en contracorriente con centrifugación se puede utilizar para estimar la capacidad fertilizante de una muestra seminal, teniendo en cuenta conjuntamente la heterogeneidad del perfil obtenido y la viabilidad celular recuperada tras el proceso.

Autor: BAYONA BAFALUY M. PILAR.
Año: 2000.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Se conocen numerosas mutaciones en el mtDNA que producen enfermedades en humanos. Es difícil obtener modelos animales de estas enfermedades porque no se puede introducir DNA exógeno dentro de la mitocondria. Por esto, este trabajo describe una estrategia que permite aislar lineas celulares de ratón con mutaciones en el mtDNA. En esta estrategia se realiza en primer lugar una mutagénesis al azar, a continuación se manipula el nº de copias de mtDNA por célula de ratón, utilizando un tratamiento que hemos probado que consiste en crecer clones celulares individuales en glucosa y en galactosa. Los clones incapaces de vivir en galactosa posiblemente tendrán dañado su sistema OXPHOS. Para comprobarlo se mide su respiración en electrodo de oxígeno. Para análisis de ábridos se ensaya si se trata de una mutación mitocondrial o nuclear. Hemos aislado numerosos clones con mutaciones mitocondriales que producen defectos OXPMOS que se transmiten con la mitocondria. En el trabajo se describe la mutación causante del fenotípo en seis de ellos.

Autor: RODRÍGUEZ-VILARIÑO POZA SONIA-SUSANA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA UAM.

Resumen: El proteasoma es la principal proteasa extralisosomal responsable de la mayor parte de la proteolisis celular, tanto dependiente como independiente de ubiquitinilación. El proteasoma 20S es un heteroligómero, alfa7beta7beta7alfa7, con estructura de cilindro compuesto de cuatro anillo. Habitualmente el proteasoma produce la degradación total de proteínas sustrato a oligopéptidos. Este trabajo se centra en la caracterización de la actividad proteolítica limitada del proteasoma 20S. Esta actividad se manifiesta en el procesamiento de los precursores de las subunidades beta del proteasoma. Este procesamiento ocurre en cis para las subunidades pro-beta activas y en trans para las pro-beta inactivas. Hemos demostrado que la subunidades beta pro-C5 (inactiva) se sintetiza libre en la célula y su procesamiento está acoplado al proceso de ensamblaje en el complejo del proteasoma, no existiendo pro-C5 asociada a precursores de proteasomas. Hemos caracterizado una nueva actividad del proteasoma, el autoprocesamiento por una reacción intermolecular entre proteasomas (procesamiento limitado post-ensamblaje) del extremo C-terminal de la subunidad alfa C2 inducido por la proteína básica de la mielina. Finalmente, hemos identificado un nuevo sustrato que sufre proteolisis limitada en lugar de degradación, la proteína tirosina quinasa p60c-Src. Esta tirosina quinasa es procesada por el proteasoma en su extremo N-terminal, produciendo una disminución de la actividad quinasa y una perdida de la región necesaria para su localización en membranas. El hecho de que la variante oncogénica, v-Src, no sea procesada por el proteasoma sugiere que esta proteólisis diferencial puede ser un mecanismo adicional que contribuye a la transformación celular por Src.

Autor: HERRERA DE VEGA SATURNINO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: La regulación de la expresión génica al nivel de la síntesis de proteínas ocurre principalmente durante la fase de iniciacón. En la fase de iniciación de la traducción intervienen una serie de factores proteicos denominados factores de iniciación o eIFs. Uno de ellos es el eIF2 cuya fosforilación en el residuo Ser51 de su subunidad a tiene como consecuencia la inhibición de la sintesis general de proteinas. Existen cuatro tipos de eIF2a quinasas que se activan en diferentes condiciones de estrés celular. Una de estas eIF2a quinasas es el HRI (inhibidor regulado por hemina) que ha sido caracterizado en reticulocitos de conejo y se activa a bajas concentraciones de hemina. En esta tesis se ha purificado una actividad eIF2a quinasa inhibible por hemina a partir de extractos de hígado de ratón. También se clonó el HRI de raton (mHRI) y se demostró mediante anticuerpos específicos que la actividad eIF2a quinasa antes descrita corresponde al mHRI. Mediante coexpresión de los mHRIs silvestre y mutante K196R en células de mamífero 293, y fusionados a dos epítopos distintos (HA y FLAG), se demostró que el mHRI forma in vivo homodímeros, que el mHRI se expresa en una gran variedad de tejidos y en células NIH-3T3. También se purificó y caracterizó una actividad inhibidora de eIF2a quinasas (MKI) a partir de los extractos de hígado de ratón. Se ha clonado y caracterizado las dos primeras eIF2a quinasas procedentes de la levadura Schizosaccheromyces pombe, SEK1 y SEK2, que guardan gran similitud con el HRI de mamiferos. Las proteinas recombinantes fosforilan especificamente la Ser51 del eIF2a. La actividad eIF2a quinasa de SEK1 y SEK2 se inhibe por hemina a pesar de carácter de los motivos de regulación por hemina (HRM1 y HRM2) descritos en el HRI.SEK1 parece estar regulada en S. Pombe por proteinas de choche térmico. Por ultimo, se hizo un analisis mutacional de mHRI en el que se comprobó que los HRMs y las regiones extracatalíticas de la molécula no están implicadas en el mecanismo de inhibición por hemina. Por tanto, el dominio responsable de la regulación por hemina está localizado en la región catalítica del mHRI.

Autor: RUIZ VELA ANTONIO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CNB.

Resumen: Se ha caracterizado la ruta de apoptosis que induce el receptor de los linfocitos B en el modelo de célula B inmadura WEHI 231 llegandose a las siguientes conclusiones: - La expresión de la proteína BCL2 bloquea la activación de la caspasa 9-7 inducida por la estimulación del BCR. - El mecanismo de inhibición de caspasa 9 se realiza mediante el secuestro del cofactor APAF1, el cual es necesario para la activación de caspasa 9. En este modelo no se detecta liberación de citocromo C durante la apoptosis inducida por el BCR. En cambio, se detecta desolarización de la membrana mitocondrial que es dependiente de caspasa 9. - El mecanismo de activación de caspasa 7 implica el requerimiento de dos procesamientos, el primero mediado por calpaína (una endopeptidasa mediada por calcio) y el segundo causado por caspasa 9. - En conjunto, la apoptosis inducida por la estimulación del BCR es mediada por la activación de calpaínas y la activación de caspasa 9.

Autor: FRUTOS DE DIEGO SONIA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: LAS ISOFORMAS A TIPICAS DE PROTEINA QUINASA C JUEGAN IMPORTANTES PAPELES EN PROLIFERACION Y SUPERVIVENCIA. LA INVESTIGACIÓN DEL PAPEL QUE JUEGAN ESTAS QUINASAS EN EL PROCESO ANTAGONICO DE MUERTE CELULAR POR APOPTOSIS DESVELA QUE SU ACTIVIDAD SE INHIBE COMO CONSECUENCIA DE LA UNION A LA PROTEINA PAR-4 O DE LA RADIACION UV Y QUE ESTA INHIBICION PROMUEVE EL DESARROLLO DE LA APOPTOSIS. EN LA CASCADA DE SEÑALIZACION, INDEPENDIENTE DE P53, DESENCADENADA POR ESTIMULOS APOPTOTICOS, LAS PKCS ATIPICAS SE SITUAN POR DEBAJO DE Bc1-2 Y POR ENCIMA DEL SISTEMA DE CASPASAS. ASIMISMO CPKC, PERO NO /1PKC, SE DEGRADA POR LA CASPASA 3, GENERANDO UN FRAGMENTO CATALITICAMENTE INACTIVO. LOS MECANISMOS A TRAVES DE LOS CUALES LA INHIBICIÓN DE LAS PKCs ATIPICAS PROMUEVE LA APOPTOSIS IMPLICAN LA INACTIVACIÓN DE LA RUTA DE NF-KB, ASI COMO LA INIBHICION DE LA ACTIVIDAD DE MAPK CON LA CONSIGUIENTE ACTIVACION DE P38.

Autor: FERNANDEZ PEREZ MONICA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La presente Tesis Doctoral ha abordado el estudio de lipasas con dos orientaciones distintas (i) fenómenos de activación/inhibición de lipasas en presencia y ausencia de interfases, y (ii) la síntesis enzimatica de emulgentes no iónicos con enlace amida, alcanolamidas, que presentan entre otras ventajas al ser biodegradables y quimicamente muy estables icluso en medios alcalinos. Los estudios de activación/inhibición de lipasas se han realizado con el fin de profundizar en el conocimiento del fenómeno de activación interfacial exclusivo de estas enzimas, utilizando un sistema modelo isoenzimas de C.rugosa con alta homología en secuencia y marcadas diferencias en su especificidad por substratos y respuesta en presencia de interfases. Para ellos se han empleado tecnicas de espectroscopia UV, dicroismo circular, fluorescencia entre otras. Los estudios de biotransformaciones de orientación aplicada han sido realizados dadas las ventajas de la biotransformaciones frente a la sintesis quimica tradicional, especialmente el uso de las enzimas en medios organicos anhidridos. Para llevar a buen termino los estudios sinteticos se han realizado un estudio sistematico de ingenieria enzimatica, de la reaccion y del medio, en medios organicos anhidros de distinta polaridad. Los productos han sido caracterizados por tres tecnicas: resonancia magnetica nuclear, espectroscopia de infrarrojo. El estudio sisteático se ha aplicado a dos tipos de amina, una primaria y otra secundaria, determinándose las condiciones más idóneas para una sintesis cuantitativa, en el menor tiempo y condiciones de reacción suaves. Las limitaciones encontradas en los procesos optimizados en condiciones de alta productividad volumetrica, han podido ser minimizadas mediante sustitucion del biocatalizador por otros de mayor actividad (mayor relacion carga/soporte). Ello implicó la preparación de soportes para el biocatalizador a base de sílice activada con residuos hidrofobicos, octilo, en distintas condiciones, donde posteriormente se inmovilizaron distintas cargas de enzima. Los derivados así obtenidas han permitido superar ampliamente las productividades volumetricas descritas en la bibliografia.

Autor: SÁNCHEZ MARTINEZ ANA BELEN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) es un virus icosaédrico de 60 nm de diámetro que carece de envuelta. Esta constituido por dos segmentos de ARN bicatenario. El segmento A de 3,2 kpb contiene dos fases de lectura abierta. La ORF1 codifica la proteína VP5 de 17kDa. La segunda fase de lectura abierta ORF2 codifica la poliproteína de 110kDa que es procesada autocatalíticamente dando lugar a las proteínas VPX, VP3 y VP4, siendo esta última una Lon-proteasa responsable del procesamiento. Posteriormente mediante procesamiento post-traduccional la proteína VPX genera la proteína VP2. El segmento B de 3kpb codifica la proteína VP1 de 90 kDa que es la ARN polimerasa dependiente de ARN. En la presente tesis se ha caracterizado en primer lugar los sitios de procesamiento en la poliproteína mediante mutagénesis dirigida y posterior análisis por expresión transitoria. Se ha demostrado que las secuencias 511LAA513 y 754MAA756 son las dianas de procesamiento entre las regiones VPX-VP4 y VP4-VP3 485 AQAASGTARAASGKARAAS503 contiene tres sitios secundarios de procesamiento en la región VPX y VP4. En busca de un mayor conocimiento y caracterización se analizaron las proteínas virales, mediante electroforesis bidimensional. Esta metodología nos ha permitido determinar la presencia de modificaciones post-traduccionales. Se identificaron las proteínas VPX, VP4 y VP3 mediante autoradiografía, tinción de plata y Western-blot. Así se demostró la presencia de 4 isoformas mayoritarias de la proteína VP3. Para la detección de las modificaciones responsables de la presencia de las diferentes isoformas de la proteína de VP3 se utilizaron las técnicas de espectrometría de masas y Nanoelectrospray. Así se pudo confirmar la dimetilación de los residuos 827K y 832K en dos de las isoformas de la proteína VP3.

Autor: SAUGAR GÓMEZ IRENE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHEA" CSIC-UAM.

Resumen: El antibiótico nucleosídico A201A posee una estructura química híbrida entre la del aminoglucósido higromicina A y la del también nucleósido puromicina. Este antibiótico es sintetizado por Streptomyces capreolus NRRL 3817. Se han aislado a partir de una genoteca del mismo cuatro cósmidos, en cuyos insertos solapantes se podría localizar el "cluster" génico de biosíntesis del antibiótico y los determinantes de resistencia frente al mismo. El fragmento de ADN cromosómico mide aproximadamente 35 kb y su secuenciación ha relevado la presencia de 28 posibles ORFs. Los productos deducidos de dichas ORFs se han comparado con las proteínas existentes en los bancos de datos y de esta manera, se ha elaborado una hipotética ruta de biosíntesis del antibiótico. Entre las ORFs secuenciadas se han localizado homólogos a los genes pur3, pur4, pur5, pur7 y pur10 del cluster pur para la biosíntesis de puromicina en Streptomyces alboniger. Disponemos en nuestro laboratorio de mutantes de delección de S.alboniger en los genes pur5, pur4 y pur10, defectivos en la producción de puromicina. Se ha conseguido restablecer la producción de puromicina en dichos mutantes mediante la complementación en trans con sus respectivos genes homólogs A2Apur5, A2A-pur4 y A2Apur10 respectivamente. También se han tratado de determinar los posibles mecanismos de regulación de la biosíntesis de A201A, así como de obtener un método para la transformación de S.capreolus, pero en ninguno de los dos casosse han conseguido resultados positivos.