BIOQUIMICA MOLECULAR, 30

Autor: ALVAREZ NIETO GEMA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM-UAM.

Resumen: El trabajo realizado se ha orientado a desarrollar un modelo celular de la enfermedad de Alzheimer en el que poder testar diferentes hipotesis de trabajo sobre los mecanismo patogénicos del péptido B-amiloide, componente mayoritario de las placas seniles, y posibles intervenciones terapeuticas. Se han caracterizado una serie de sucesos tempranos implicados en los efectos neurodegenerativos del péptido amiloide (estrés oxidativo, disfunción mitocondrial/estado redox celular, caspasas activadas por la via intrinseca asociada a la mitocondria) y establecido su relación jerarquica. Además, se ha continuado el trabajo de nuestro grupo sobre el aporte de sustratos respiratoriosa la mitocondria en relacion con la funcion neuronal. Los resultados obtenidos en esta Tesis han permitido concluir que la disponibilidad de piruvato protege frente a la muerte neuronal inducida por el péptido B-amiloide, por un mecanismo que requiere su utilización mitocondrial y que probablemente implica el suministro de poder redox a las vias de destoxificación de radicales de oxigeno. Sin embargo, han revelado que el mecanismo neurodegenerativo que activa el péptido B-amiloide incluye procesos de señalización paralelos, de forma que siendo posible bloquear la muerte celular a un tiempo definido, otros signos de deterioro neuronal se siguen manifestando. Uno de los resultados mas novedosos de esta Tesis ha sido el hallazgo de que uno de los sucesos más novesos de esta Tesis ha sido el hallazgo de que uno de los sucesos mas tempranos de la acción del péptido B-amiloide sobre las neuronas es un cambio en la morfologia y distribucion mitocondriales. Este cambio probablemente está relacionado con modificaciones en proteinas del citoesqueleto neuronal, observables tanto en los modelos celulares como in vivo, en los enfermos de Alzheimer.

Autor: ARAGON AMONARRIZ TOMAS .
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA (C.S.I.C.).

Resumen: La proteina NS1 del virus de la gripe estimula la traducibilidad de los RNAs mensajeros del virus de la gripe. La especificidad de dicha estimulación es conferida por la region 5´no codificante de los mensajeros virales, y sucede en la fase de la iniciación de la traducción. El objetivo general de esta tesis doctoral es el de tratar de conocer el mecanismo molecular por el que la proteina NS1 estimula el reclutamiento de complejos de preiniciacion 43S a la region 5´no codificante del mRNA gripal. Para ello se abordó el analisis mutacional de la proteína NS1. Se generó una colección de mutantes de deleción de la proteina viral, que se sometio a una caracterizacion previa, en la que se observó que los niveles de acumulación, la distribución subcelular y la capacidad de union a RNA de todos los mutantes generados eran semajantes a los de la proteina silvestre. A continuación se analizó su capacidad para estimular la traducibilidad de un mRNA viral, y para inducir la retención en el nucleo de los mensajeros poliadenilados. Se demostró que la mitad amino terminal de la proteina NS1 es responsable de ambas funciones, y que la capacidad de union a RNA no es suficiente para retener en el nucleo el mensajero de la nucleoproteina viral, ni para estimular la traducibilidad de las moleculas del mRNA de NP presentes en el citosol. Se llevó a cabo la búsqueda de factores de la maquinaria de iniciación con los que la proteina NS1 interacciona para llevar a cabo la estimulación traduccional. Así, se ha demostrado que la proteina NS1 es capaz de interaccionar directamente con el factor el IF4GI. El analisis mutacional de ambas proteinas indico que los 113 aminoacidos de la proteina NS1 para estimular la tasa de traducción y su capacidad de interaccionar fisicamente con eIF4GI. La proteina NS1 interacciona con PABP1, la proteina de unión a poliA citosolica, a traves de sus primeros 81 aminoacidos. Esta unión, directa y no mediada por RNA tiene lugar tanto in vivo como in vitro.

Autor: FERNANDEZ MOREIRA ESTEBAN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III C.N.B.F..

Resumen: En España hay un 50% de cepas de de S.pneumoniae resistentes a penicilina. Las fluoroquinolonas (Fqs) son un grupo de antimicrobianos alternativos para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria. Los blancos de las Fqs son las DNA topoisomerasas de tipo II (DNA girasay topoisomerasa IV), enzimas esenciales para la viabilidad celular que controlan la topologia del DNA. Para determinar cúal de estas enzimas es el blanco primario para estos compuestos, clonamos, superproducimos y purificamos por separado mediante cromatografia las subunidades GyrA y GyrB de la DNA girasa y ParC y ParE de la topoisomerasa IV. Reconstituimos las enzimas a partir de sus subuinades. Establecimos un ensayo de superenrrollamiento de DNA mediado por girasa y otro de decatenación de kDNA mediado por topoisomerasa IV. Probamos la potencia inhiboria de cuatro Fqs representativas sobre estos ensayos. Estos experimentos permitieron determinar bioquimicamente que la topoisomerasa IV es el blanco primario de la Fqs en S.pneumoniae. Asimismo se clonó superprodujo y purificó mediante colas de histidinas el dominio amino terminal de GyrA, el cual posee el sitio activo de la enzima en concentración y pureza suficiente para su cristalización. Este dominio presento actividad de rotura de doble cadena en presencia de Fqs cuando se acompleja con GyrB.

Autor: RICO ERRAZQUIN ANA ISABEL.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Las proteínas de choque térmico o HSP se han descrito como antígenos inmunodominantes en multitud de procesos autoinmunes, infecciosos y tumorales. Probablemente, la abundancia y conservación de estas proteínas contribuyen a que sean unas dianas tan atractivas para el sistema inmune. Desde hace poco más de una década se está estudiando el potencial de las HSP como moléculas inmunoestimuladoras. Concretamente, se ha observado que las HSP de M.tuberculosis son capaces de estimular la respuesta inmune contra péptidos y proteínas fusionadas. Conociendo este dato y el papel que tienen la HSP70 y la HSP83 de Leishmania infantum como antígenos, nos planteamos estudiar la capacidad inmunoestimuladora de estas proteínas. Para ello, diseñamos plásmidos que nos permitieron expresar y purificar en condiciones nativas las proteínas HSP70 y HSP83 de L.infantum fusionadas al extremo carboxilo de la proteína de unión a maltosa MBP de E.coli, que se utilizó como antígeno. La administración de este antígeno, fusionado al extremo amino de las HSP de L.infantum, promueve una fuerte respuesta humoral específica contra el antígeno inoculado. Además, comprobamos que es necesario que el antígeno esté unido físicamente a las HSP para que se potencia la respuesta inmune. La inoculación de ratones con las proteínas de fusión MBP-HSP origina una respuesta de anticuerpos relativamente débil y, en ningún caso, se detectaron anticuerpos anti-HSP autoinmunes. La administración de estas proteínas de fusión es capaz de inducir una respuesta humoral en ratones atímicos, en los que se detectan niveles significativos de anticuerpos IgG e IgM específicos. También, observamos que las proteínas HSP70 y HSP83 de L. Infantum son capaces de promover la proliferación de esplenocitos de ratones sin preinmunizar. La linfoproliferación depende del estado conformación de estas proteínas. Mediante estudios de citometría de flujo y el empleo de diferentes cepas mutantes de ratón hemos demostrado una activación específica de la población de linfocitos B. La cinética y magnitud de esta proliferación son similares a las que ocurren al estimular con LPS, conocido activador policlonal de células B de ratón. En resumen, en esta tesis hemos demostrado que las HSP de L.infantum, además de su ya conocido papel como antígenos inmunodominantes, presentan otras dos características inmunológicas: son proteínas inmunoestimuladoras de la respuesta humoral frente a un antígeno fusionado a ellas y tienen la capacidad de inducir la proliferación de células B in vitro. El hecho de que ambas propiedades estén localizadas en el mismo dominio de la HSP70 sugiere que podrían estar correlacionadas. Finalmente, proponemos un modelo que explica estas propiedades de las HSP basado en el modelo de activación de las células B en dos fases. Durante la primera fase se produciría la expansión clonal de la poblaciones de células B específicas de antígeno, y una segunda fase donde se producirá la interacción entre ambos tipos celulares.

Autor: CAMPILLOS GONZALEZ MONICA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: En esta tesis hemos profundizado en los mecanismos moleculares mediante los cuales el factor de transcripción AP-2 regula uno de los genes asociados a la enfermedad de Alzheimer: el gen APOE. En este sentido, hemos localizado una región de AP-2 que comprende desde el aminoácido 252 y 260 que interacciona directamente con el DNA probablemente a traves de una estructura de alfa hélice. Las formas de AP-2 conteniendo mutaciones puntuales en esta subregión modulan la actividad de la forma salvaje formando dimeros con esta y atenuando su efecto sobre la actividad transcripcional del promotor. En este mismo contexto, hemos identificado dos proteinas que interaccionan directamente con el AP-2: SET y DEK que aumentan su actividad transcripcional sobre el promotor del gen APOE. El efecto de DEK sobre AP-2 parece deberse a una estimulacion de su afinidad por el promotor. Hemos identificado proteínas que interaccionan con las regiones polimórficas del promotor APOE asociadas a un aumento del riesgo por la enfermedad de Alzheimer -219T/G, -491A/T y -427T/C. La proteina CBF-A de rata interacciona directamente con la region -219 del promotor inhibiendo la actividad del promotor de manera más acusada sobre el alelo T que sobre el alelo G que podría deberse a la mayor afinidad por la forma alélica T que por la G. Existe una proteina humana que muestra las mismas caracteristicas de unión al promotor de APOE que el factor CBF-A que podría dar cuenta de las diferencias en la actividad transcripcional basal de las formas -219T y -219G del promotor. Esta proteina podria tratarse de la ribonucleoproteina heterogenea A1, que muestra una alta homologia con CBF-A,es capaz de interaccionar con la region -219 del promotor y muestra una afinidad preferente por la forma alélica-219T. La proteina A1 contacta con el promotor a traves de una subregión contigua a la posicion -219 que muestra homologia con las secuencias repetidas de los telomeros. La afinidad de A1 por esta region disminuye cuando hay una guanina en la posicion -219.

Autor: CARDONA GOMEZ GLORIA PATRICIA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO CAJAL CSIC.

Resumen: Estudios previos sugieren que el estrogeno y el IGF-I tienen efectos coordinados sobre la regulación endocrina, la plasticidad sináptica y la respuesta del tejido nervioso a una lesión. El principal objetivo de este estudio fue determinar los mecanismos celulares y moleculares de esta interación. La distribucion de los receptores de estrógeno (Ers) y el receptor de IGF-I(IGF-IR) fue estudiada en el cerbro de ratas hembras por medio de microscopia confocal. La inmunoreactividad del Eralfa y el Erbeta fue colocalizada con la inmunoreactividad del IGF-IR en muchas neuronas de la region preoptica, el hipotalamo, el hipocampo, y la corteza cerebral. Además, el Erbeta y el IGF-IR fueron colocalizados en las cellas de Purkinje del cerebro, se emplearon ratas ovariectomizadas infundidas en el ventriculo lateral con IGF-I, un antagonista del IGF-IR(JB1), o con un antagonista del receptor de estrogeno (ICI 182,780). Se observó una regulación interdependiente y especifica de cada region cerebral. Adicionalmente, se evaluo el efecto del estrogeno sobre la activacion del IGF-IR. El estrogeno activo ERK1/2 y AKT y aemas tuvo un efecto sinergico con el IGF-I sobre la activacion de Akt. La implicación fisiologica de la interaccion del estrogeno y el IGF-I fue evaluada en el Hipotalamo. Se observó que las hormonas ovaricas regulan la expresion del IGF-IR y la IGFBP-2 en los tanicitos, un tipo de celulas gliales implicadas en la acumulacion de IGF-I de fuentes extrahipotalamicas. El papel de los Ers y el IGF-IR en la plasticidad sinpatica inducida por estrogeno, se estudio evaluando el numero de sinapsis axosomaticas en ratas ovariectomizadas inyectadas cono JB1 e ICI. La administracion del estradiol produjo una disminucion significativa el numero de sinapsis bloqueada por ambos antagonistas. En conclusión, existe una interaccion generalizada del estrogeno y el IGF-I en el cerebro. En el hipotalamo, esta interaccion esta asociada a platicidad sinaptica implicada en regulacion neuroendocrina.

Autor: BURGOS MUÑOZ JAVIER SANTOS.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: Los receptores de aminoácidos excitatorios son los principales receptores implicados en la excitación sinaptica del sistema nervioso central de los vertebrados. El objetivo de este trabajo fue la demostración de la capacidad inhibitoria de los nucleótidos de guanina (NG), en sus vertientes como desplazantes, antagonistas y neuroprotectores, de los efectos causados por la interacción de los aminoacidos excitatorios con los receptores ionotropicos de glutamato. El abordaje teorico y experimental se realizó considerando tres niveles de experimentacion, analisis de resultados y discusion de los mismos: en primer lugar, confirmamos la afinidad de los NG por el sitio de reconocimiento de agonistas y antagonistas competitivos radiactivos en los receptores de glutamato, en el modelo de retina de pollo, a continuación, analizamos en carácter antagonista de los NG sobre las acciones mediadas por los agonistas de glutamato, mediante dos sitemas experimentales: la evocación de respuestas eléctricas en ovocitos de Xnopus trasplantados con membranas de retina de polli, y la estimulacion del flujo de 45Ca2+ por diversos agonistas e glutamato en explantes de retina, por ultimo, analizamos el comportamiento neuroprotector de los NG sobre diferentes agresiones exitotoxicas causadas por la hiperactivacion de los receptores de glutamato, para ello, y en el modelo de explantes de retina de pollo, estudiamos la destruccion celular, mediante detección de la liberacion del enzima intracelular lactato deshidrogenasa, causada tanto por la adicion de agonistas como por la ausencia de calcio. El efecto neuroprotector de algunos NG fue corroborado por y mediante el uso de un modelo de epilepsia causado por administración intracerebroventricular de un agonista del receptor de NMDA, el ácido quinolinico.

Autor: RUBIO MUÑOZ VICENTE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las plantas han desarrollado respuestas encaminadas a adaptar su crecimiento a suelos pobres en fosfato (Pi). Algunas de estas respuestas incluyen cambios a nivel metabólico, fisiológico, molecular y del desarrollo de la planta. Con el fin de identificar genes implicados en la regulación de dichas respuetas, se selccionaron mutantes alterados en la expresión de un trangén marcador del ayuno de Pi, AtlPS1:GUS, a partir de una población M2 de Arabidopsis thaliana portadora de dicho transgén. Se identificaron diferentes mutantes, dos de ellos, Atphr1 y Atphr2, además de tener alterada la expresión de AtlPS1: GUS, presentaban alteraciones en diversas respuestas al ayuno de Pi, incluyendo la expresión de otros genes inducibles por carencia de Pi, así como otras respuestas fisiológicas y del desarrollo de la planta. El gen AtPHR1, identificado a través de una estrategia de clonación posiconal, forma parte de una nueva familia génica a la cual también pertenece el gen Phosphate Starvation Response 1 de Chlamydomonas reinhardtii. Los miembros de esta familia (MYB-CC) se caracterizan por compartir un dominio de unión a DNA tipo MYB y un motivo "coiled-coil" implicado en interacciones proteína-proteína. En consonancia con la presencia en esta proteína de estos dominios, la proteína AtPHR1 se une en forma de dímero a una secuencia específica de naturaleza palindrómica imperfecta. El hecho de que la secuencia reconocida por AtPHR1 se encuentre en los promotores de genes inducibles por carencia de Pi sugieren que dicha proteína actúa como un factor transcripcional en una etapa final de la ruta de transducción de señal de ayuno de Pi.

Autor: FELIPE FERNANDEZ PABLO DE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Se han conseguido completar los siguientes tres objetivos propuestos: 1)Construcción de un vector retroviral conteniendo el gen para la linamarasa (lis). Este nuevo gen suicida cataliza la ruptura del substrato natural linamarina (lin) que permite la obtención final del HCN que destruye la célula. Este nuevo sistema "asesino-suicida" lis/lin está siendo estudiado en nuestro laboratorio para la destruccion de tumores. 2)Construcción de vectores retrovirales bicistronicos utilizando un peptido autocortante (secuencia 2A del viurs de la fiebre aftosa, FMDV). Estos vectores producen un buen titulo viral del orden de 10 6 u.f.c/ml y expresan correctamente los genes clonados delante y detrás de 2A. Igualmente se comprobó que la secuencia 2A permite la ruptura de la proteina fusion formada por ella misma y las dos proteinas que flanquean. 3)Construcción de vectores retrovirales policistronicos combinando la secuencia 2A del FMDV y varios IRES de diferentes origenes virales. Se han construido tres vectores tricistrónicos y dos tetracistronicos. Todos funcionan correctamente, obteniendose titulos virales alrededor 10 6 u.f.c./ml. Las expresiones de los genes se ha demostrado en cultivos celulares. Para comprobar la coexpresion de todos los genes, se obtuvieron clones celulares de dos vectores tricistronicos y dos tetracistrónicos. En estas líneas celulares clonales se estudiaron las expresiones de todos los genes y la integridad del provirus (mediante PCRs genómicas largas). Estos resultados indican la posibilidad de utilizar rutinariamente vectores retrovirales tricistrónicos y tetracistrónicos. Finalmente, construimos un vector pentacistronico con la secuencia 2A y tres IRES distintos. Con esta construcción no se detectó titulo viral y solamente se expresaron los primeros tres genes. Actualmente estamos diseñados nuevos vectores pentacistronicos para comprobar si los problemas antes descritos se limitan a la construccion pentacistronica aquí estudiada, o se trata de un problema más general (tal vez debido al tamaño total de la construccion retroviral).

Autor: MARTÍN RIVERA LUIS.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Los telómeros son los extremos de los cromosomas lineales. En la mayoría de los ecuariotas consisten en repeticiones cortas cuya secuencia está determinada por la enzima ribonucleoproteica denominada telomersa. Estas secuencias son ricas en nucleótidos de guanina (G) y están repetidas en tándem a lo largo del telómero. La hebra de DNA rica en Gs está orientada de 5' a 3' desde el centrómero. Además, el cromosoma termina en un extremo 3' de cadena sencilla en el que la hebra rica en Gs sobresale con respecto de su complementaria. Los telómeros funcionan principalmente como protectores de los cromosomas frente a fusiones o pérdida de material genético. La protección que ofrecen los telómero se debe a un complejo proceso en el que están implicadas proteínas que interaccionan con el telómero. La telomerasa es un complejo ribonucleoproteico que sintetiza repeticiones telómericas cuyo núcleo enzimático mínimo está formado por una subunidad proteica denominada TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) y una molécula de RNA denominada TR (Telomerase RNA). La actividad de la telomerasa se detecta principalmente en tejidos embrionarios y en tejidos somáticos que presentan alta tasa proliferativa. En ausencia de mecanismos de mantenimiento de la longitud de los telómeros como la telomerasa éstos se acortan en cada división celular. Esta Tesis ha tenido como objetivo una mejor comprensión del complejo enzimático telomerasa de mamíferos a nivel molecular. Para ello se han utilizado ratones modificados genéticamente de forma que carecen del RNA de la telomerasa. También se ha usado línes celulares humanas. En esta Tesis se describe la identificación y asilamiento del gen de la subunidad catalítica de la telomerasa de ratón denominada mTERT. Éste presenta motivos estructurales conservados entre las telomerasas de otras especies ecuariotas y en todas las reversotranscriptasas. La conservación del complejo telomerasa entre ratón y humano no sólo se da a nivel estructural sí no también a nivel funcional. También se ha llevado a cabo un estudio de expresión de mTERT a nivel de mRNA y de proteína en distintos tejidos somáticos. Se determinó que la expresión del gen se produce en tejidos con y sin actividad telomerasa, mientras que la presencia de la proteína correlaciona mejor con la actividad, indicando que existen mecanismos de regulación post-transcripcionales que controlan la actividad telomerasa. Además, se comprobó que la localización subcelular de TERT es nuclear, en células de ratón y humanas, sin que varíe en las distintas fases del ciclo celular. También hemos realizado un extenso estudio de estructura-función del mTR basándonos en un modelo de estructura secundaria propuesto para dicha molécula que presenta cuantro dominios estructurales conservados en todos los vertebrados: el pseudoknot, CR4-CR5, box H/ACA y CR7. Por mutagénesis dirigida contra las regiones más conservadas, determinamos que el mTR presenta dos dominios funcionales: mientras que el pseudoknot y CR4-CR5 son muy importantes para la actividad telomerasa, box H/ACA y CR7 en la región 3' de la molécula son esenciales para la estabilidad de mTR in vivo. Además, se han desarrollado mutantes que son capaces de inhbir específicamente la actividad telomerasa.

Autor: SUÁREZ DELGADO YAJAIRA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO BIOLOGIA MOLECULAR (F. CIENCIAS).

Resumen: El colesterol, además de ser el precursor de las hormonas esteroídicas y ácidos biliares, es una molécular esencial para las células de mamíferos al ser uno de los principales componentes de la membrana plasmática, siendo necesaria en los procesos de embriogénesis y de proliferación celular. En este útlimo caso, el colesterol no se limita a ser un componente estructural sino que ejerce un papel regulador del ciclo celular, permitiendo la transición de G2 a mitosis. La importancia del colesterol para la biología celular explica que las células proliferantes presenten una alta tasa de síntesis de colesterol así como una elevada actividad del receptor LDL. Es por ello que en esta tesis doctoral se ha profundizado en el conocimiento de las relaciones entre el metabolismo del colesterol, el receptor LDL y la proliferación celular. Se han determinado las relaciones entre la funcionalidad del receptor LDL y la proliferación celular, mediante dos tipos de ensayos funcionales en linfocitos de pacientes con hipercolesterolemia. Se ha determinado el efecto de la disponibilidad de colesterol así como de sus precursores no esteroídicos sobre la actividad del receptor LDL. Y la proliferación celular, mediante el empleo de distintos inhibidores de la colesterogénesis, lo que ha permitido establecer que la inhibición de la colesterogénesis produce una estimulación del receptor LDL siempre y cuando no se comprometa la síntesis de mevalonato y de sus derivados no esteroídicos, ya que lo contrario produce una disminución de la actividad del receptor LDL que se acompaña de una inhibición de la proliferación celular. Se ha profundizado en los mecanismos hipolipemiantes del tamoxifeno, mediante el estudio de sus efectos sobre la expresión y la actividad del receptor LDL y su relación con la proliferación celular. Así se ha observado que éste produce una estimulación del receptor LDL, que se manterializa en un aumento de su actividad, su expresión en la superficie celular y los niveles de ARNm, como consecuencia de la mayor actividad transcripcional mediada por los SREBP, efectos que se manifiestan muy notablemente en presencia de LDL en el medio, ya que altera el mecanismo de retrorregulación por LDL al interferir en la utilización del colesterol de la membrana plamática. Por último se ha determinado la especificidad del papel del colesterol en la progresión del ciclo celular, comparando sus efectos con los del ergosterol y ciertos análogos estructurales del mismo. Así se ha observado que a diferencia del colesterol el ergosterol no es capaz de activar a la Cdk1 y por tanto de permitir la transición de G2 a M si bien si que puede ejercer funciones homeostáticas similares a las del colesterol. Además para las acciones del colesterol sobre el ciclo celular existen unos requerimientos estructurales muy estrictos como el grupo hidroxilo en C3 con configuración beta yla insaturación en --, si bien la saturación del anillo B también es tolerada si ésta se encuentra en configuración trans.

Autor: GARCIA BRIONES M. MERCEDES.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL-INIA.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se han estudiado distintos aspectos de la respuesta inmune inducida en hospedadores naturales y de la patogenia producida por el VFA en lineas celulares susceptibles. Estos estudios se han realizado con el objetivo de profundizar en el conocimiento de mecanismos implicados en procesos fundamentales en las interacción de este virus y sus hospedadores. Con tal fin, se ha pretendido determinar el papel del MHC bovino (BoLA) de clase II en la respuesta inmune protectora frente al VFA, inducida en bovinos inmunizados con péptidos sinteticos conteniendo epitopos B y t del virus. Los resultados obtenidos indican que los tipos alélicos DRB3.2*12 y 18 del BoLA de clase II seasocian con la falta de protección frente a la infección con VFA en bovinos inmunizados con peptidos sinteticos. Tambien se ha pretenddo evaluar la capacidad de la proteina 3D del VFA, expresada como parte de un virus vaccinia recombinante, para inducir na respuesta inmune protectora en el cerdo frente al VFA. Los resultados indican que la inmunización de cerdos con un VV-rec que expresa la proteina 3D del VFA induce una respuesta inmune protectora en el cerdo frente al VFA. Los resultados indican que la inmunizacion de cerdos con un VV-rec que expresa la proteina 3D del VFA induce una respuesta humoral detectable frente a esta proteina y confiere proteccion parcial frente al desavio viral. El siguiente objetivo ha sido identificar epitopos T presentes en la proteina 3D del VFA, que sean reconocidos por linfocitos porcinos de manera inmunodominante y heterotipica, como resultado, se han identificado cinco regiones en la secuencia aminoacidica de la proteina 3D del virus C-S8 que inducen respuestas linfoproliferativas inmunodominantes en CMSP de cerdos infectados con el virus C-S8. Estas cinco regiones son eficientemente reconocidas, de manera heterotipica, por linfocitos de los animales tras su reinfección con el aislado O-BSF. Los linfocitos de los animales reinfectados reconocen, ademas, seis nuevas regiones de la proteina 3D. Para continuar con la caracterizacion de la proteina 3D, y de otros PNE del VFA, durante la infección viral y tras su expresión transitoria en celulas BHK-21. Los resultados obtenidos indican que los PNE virales 2B,2C,3A,3AB y 3D, presentan una distribución similar, preferentemente yuxtanulear, durante la infección de celulas BHK-21 por VFA. La expresión transitoria de 2C se detecta en un porcentaje bajo de las celulas transfectadas, las cuales muestran una morfologia generalmente ahusada y un tamaño pequeño. La expresión transitoria de 3A no porvoca cambios aparentes en la morfologia del RE y del AG. Esta proteina parece localizarse, preferentemente, en el citoplasma siguiendo un patrón punteado. La expresión transitoria de 3AB presenta un patrón de fluorescencia claramente diferente al mostrado por 3A. Su distribución es fibrosa y/o tubular alrededor del nucleo y colocaliza con cisternas del AG. La expresión transitoria de 3D se observa en toda la celula, incluyendo al núcleo. Su expresión induce alteraciones en el patrón de fluorescencia del RE, indicando que la expresion de 3D altera la estructura celular a la que 3AB se asocia, y/o que existe una asociación de ambos polipeptidos durante su coexpresión transitoria.

Autor: GARCIA DURAN MARGARITA .
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: El óxido nitrico (NO) es un gas de rápida difusión que interviene en múltiples procesos fisiológicos, entre ellos destacan los relacionados con la función cardiovascular gracias a su capacidad vasodilatadora, antiagregante y reguladora del tono vascular. El NO es sintetizado por un familia de enzimas denominadas óxido nítrico sintasa de las que se han descrito varias isoformas. Una de ellas, denominada óxido nitrico sintasa neuronal (NOSn), se expresa entre otras células en los neutrofilos o leucocitos polimorfonucleares (PMNs) y su expresión puede ser regulada por estrógenos. Por ello, la hipotesis de esta tesis fue que los niveles de 17B-estradiol son capaces de regular la expresión de la NOSn en PMNs humanos mediante un mecanismo genómico en el que están implicados los receptores estrogénicos (RE). Se llevaron a cabo dos tipos de experimentos a partir de PMNs circulantes aislados de varios grupos de voluntarios: in vivo a) mujeres premenopausicas (preMP) sanas de las que se obtuvieron PMNs en 2 puntos del ciclo mestrual (fase folicular, correspondiente a niveles bajos de 17B-estradiol (E2)) y fase ovulatoria (correspondiente a niveles altos de E2), b)mujeres postmenopausicas (postMP) sanas de las que se obtuvieron PMNs antes y después de 4 meses de tratamiento hormonal sustitutivo (THS) con E2 trandemico y acetato de medroxiprogesterona de forma ciclica y por via oral, in vitro a partir de PMNs de voluntarios varones sanos incubados con E2. Se observó mediante Wesernblot que in vivo, los niveles sericos de E2 más altos se correspondian con una mayor expresión de la enzima NOSn apartir de las 6 horas y dosis crecientes de E2(10-10 M a 10-8 M) produjeron un aumento progresivo de la expresión de la enzima hasta la concentración de 10-8 M, dosis superiores a esta tendian a disminuirla. Este efecto de E2 era esteroespecifico y estaba acompañado por un aumento de la produccion de No por los PMNs tanto de varones como de postMP tras THS. Asimismo, en esta acción de E2 sobre NOSn intervenian los Res puesto que 2 antagonistas de los Res revirtieron el incremento de NOSn. Por otro lado, los Res eran capaces de aumentar su propia expresión en respuesta a E2, tanto in vitro como in vivo. In vitro, sólo el subtipo de RE alfa (Rea y REB) aumentaron durante la fase ovulatoria. Mediante ensayos de movilidad electroforética (EMSA) se comprobó que E2 es capaz de aumentar la capacidad de unión a su secuencia consenso de ADN de dos factores transcripcionales: proteina activadora 1(AP1) y factor de transcripcion especifico de promotor tipo 1(Sp1) y este aumento de la unión de AP1 y Sp1 esta implicado en el incremento de la expresiónde NOSn y de Rea inducido por E2 en los PMNs. Funcionalemnte, el aumento de NO asociado al incremento de NOS1 implica una mayor capacidad de los PMNs para inhibir la agregación plaquetaria, así como una menor capacidad de adhesion de los mismos por una disminución de la expresión de la subunidad CD18 de las B2-integrinas medido por citometria del flujo. Estos resultados estarían de acuerdo con el hecho descrito de que las preMP presentan menor agregabilidad plaquetaria que las postMP, así como la mejora en la incidencia de enfermedades cardiovasculares en postMP que siguen THS, asimismo reafirman la idea de la gran complejidad y selectividad de las acciones de los estrógenos y de la importancia de su estudio para un mayor conocimiento de sus efectos cardioprotectores y de is en estados como la posmenopausia la THS reestablece estos efectos.

Autor: YÁÑEZ MÓ MARÍA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: U.A.M.

Resumen: En este trabajo de investigación hemos abordado el estudio de la posible implicación funcional de los complejos tetraspaninas/integrinas en las uniones intercelulares y en los procesos de adhesión y migración de células endoteliales, queratinocitos y células epiteliales. En primer lugar nos planteamos la identificación y caracterización molecular y funcional de nuevos receptores de uniones intercelulares de células endotelilales mediante la generación de anticuerpos monoclonales específicos frente a células endoteliales de cordón umbilical humanas. Así caracterizamos a la tetraspanina CD151, que forma complejos multimoleculares con las tetraspaninas CD9 y CD81 y con la integrina alfa3beta1 y que se localizan en las uniones intercelulares de células adherentes (endoteliales y epiteliales). Estudiados funcionales indican que los complejos tetraspaninas/integrina alfa3beta1 intervienen en la migración de las células endoteliales y los queratinocitos humanos asociada a procesos de reparación de heridas y reendotelización. A continuación estudiamos la respuesta de distintos antígenos de uniones intercelulares endoteliales al péptido vasocativo Angiotensina II. La Ang II induce específicamente la redistribución subcelular de la integrian alfa3beta1 y de las tetraspaninas CD9 y CD151 asociadas sin afectar a otros antígenos de uniones intercelulares ni la función de barrera de la monocapa endotelial. Esta recolización puede ser responsable del fenotipo angiogénico inducido por la Ang II a través de su receptor AT1 en células endoteliales, puesto que en un modelo in vitro con células endoteliales aisladas inhibimos el efecto proangiogénico de Ang II con anticuerpos específicos frente a la cadena alfa3 de las integrinas. El estudio de la distribución de antígenos de la superfamilia de las tetraspaninas en células epiteliales polarizadas nos permitió caracterizar el estado conformacional de las integrinas asociadas a ellas. Así determinamos que los complejos tetraspaninas/integrinas actúan como receptores de adhesión intercelular independientes de la adhesión mediada por cadherinas y que dicha adhesión intercelular no implica ni requiere de un cambio conformacional en la integrina asociada.

Autor: HORCAJADAS ALMANSA JOSE ANTONIO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El estudio del ciclo vital de los bacteriofagos ha proporcionado informacion muy valiosa sobre la regulación de la transcripción en procariotas. En este trabajo se ha estudiado el programa transcripcional del bacteriofago GA-1 de Bacillus sp. G1R, filogeneticamente relacionado con el fago o29. Se ha analizado la capacidad de GA-1 para infectar otras estirpes de Bacillus, y se ha realizado un análisis filogenético de Bacillus sp. G1R. Como en otros fagos, la transcripción del genoma de GA-1 se produce en dos estadios, temprano y tardio. La mayoria de los genes tempranos se expresan desde dos promotores llamados A2b y A2c. Los genes tardios se expresan desde el promotor A3. Se ha caracterizado la proteina p4G, producto del gen temprano 4, que es homologa al regulador transcripcional del fago o29, la proteina p4. La proteina p4 reprime los principales promotores tempranos y activa el promotor tardio de o29. El programa transcripcional del fago GA-1 observando in vivo es bastante similar al de o29. In vitro, sin embargo, hay diferencias importantes. Aunque la proteina p4G reprime el promotor temprano A2b, no activa el promotor A3, como cabia esperar. Este promotor es activo in vitro en ausencia de p4G, a diferencia de la que ocurre con el promotor tardio de o29. Nuestra hipotesis es que otras proteinas de la bacteria deben estar implicadas en la regulacion de este promotor tardio. Hemos aislado dos proteinas, PurR y Hbsu, que se unen de forma especifica al mismo. Se ha comprobado la existencia de una region o elemento "UP" en el promotor A3 de GA-1 que explicaria su expresion in vitro en ausencia de una proteina activadora. Se han estudiado tambien otros promotores del fago GA-1. Algunos son homologos a promotores de o29, como C2 y C1b, mientras que otros no tienen equivalente en o29, y son responsables de la transcripcion de una serie de genes cuyos productos no tienen una funcion asignada.

Autor: JIMENEZ SAINZ M. CARMEN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: En esta tesis doctoral se describen nuevos mecanismos de señalización y regulación de receptores de quimioquinas. Estos receptores desempeñan un papel muy importante los procesos de migración, desarrollo y diferenciación de distintas poblaciones leucocitarias, así como también están implicados en el desarrollo de diversas patologías como asma, artritis reumatoide, esclerosis múltiple o infección por VIH-1. El estudio con el receptor de quimioquinas CCR2B ha demostrado la implicacion de la quinasa GRK2 en los mecanismos de la desensibilización de la señal de calcio mediada por el mismo tras su estimulacion com MCP-1. Esta quinasa es capaz de fosforilar a este receptor en residuos de serina y treonina en su extremo C-terminal, sin embargo la isoforma CCR2A de este receptor se fosforila en menor grado que CCR2B. La internalización de estos receptores se regula por la proteína B-arrestina 1, aunque la afinidad de estos receptores por la otra isoforma de esta failia de proteinas desacoplantes B-arrestina2 es distinta, puesto que solo CCR2B es capaz de promover una redistribucion de esta proteina, tras su estimulación con MCP-1. Estos estudios se han realizado mediante análisis de fosforilación in vitro con la quinasa recombinante, asi como por estudios de microscopía confocal y coinmunoprecipitación. Además el estudio de las proteínas implicadas en la activación de la vía de ERK a través de CCR2B indica la participación de las proteínas PKC y PI3K, así como la GTPasas dinamina y Ras. Aunque en estos procesos no es indispensable la internalización del receptor, sí que la via es modulada negativamente por la quinasa GRK2 tanto de manera dependiente como independiente de fosforilación del receptor. Estos analisis se llevaron a cabo mediante reconocimiento de la forma fosforilada y por tanto activa de ERK en células transfectadas con el receptor y la quinasa, y se confirmaron en línas celulares que expresan el receptor endógeno. Además se corroboró el papel modulador que la quinasa en un sistema in vivo, mediante el análisis en celulas de bazo de ratones heterocigotos para el gen de GRK2. Estas celulas con menores niveles de GRK2 tienen una mayor capacidad para activar vías mitogénicas, así como tambien esta aumentada su capacidad de migración, en respuesta a quimioquinas. Además se han descrito nuevas vias de señalización promovidas por estos receptores de quimioquinas, en las que participan proteínas como Rho y Ga12, sugiriendo que puedan ser fundamentales para los procesos de migración celular en los que se hayan involucrados. El conocimento detallado de las proteínas implicadas en las vías tras activación de los receptores de quimioquinas son fundamentales para entender todos los procesos fisiológicos y patológicos en los que participan.

Autor: LARA PEZZI ENRIQUE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS, UNIVERSIDAD AUTONOMA, MADRID.

Resumen: La infección crónica del hígado por el virus de la hepatitis B está estrechamente relacionada con el desarrollo del hepatocarcinoma. Los mecanismos responsables de la transformacion maligna en la infeccion a viral aún no han sido bien definidos, y se piensa que tanto factores virales como celulares pueden estar implicados en el proceso. Por una parte, la respuesta inmune del húesped es la responsable de la eliminación del viurs. Si la acción del sistema inmunológico no es del todo eficaz, la replicacion viral persiste y la enfermedad cronifica. El daño hepatico crónico producido por el sistema inmonológico del huesped se convierte en una condición premaligna, debido a que produce un ciclo sin fin de necrosis, inflamación y regeneración que favorecen la aparición del hepatocarcinoma. Por otra parte, la proteina viral HBx favorece el desarrollo del carcinoma, mediante la activación de distintas cascadas de señalización que dan lugar a la transcripción de distintos genes implicados en la respuesta inmune y la carcinogénesis. En este sentido, se describe en este trabajo la capacidad de HBx de inducir la activación transcripcional del gen de TNFay de activarel factor de transcripción NF-AT, que participa en la transcripción de esta y otras citoquinas proinflamatorias. La expresión de estas citoquinas conduce la inhibición parcial de la replicación viral, favoreciendo así la persistencia de la infección. Además, HBx es a menudo la única proteina viral que se expresa tras el establecimiento del carcioma, sugiriendo que podria desempeñar algun papel en los últimos estadios del desarrollo tumoral. En este trabajo presentamos evidencias que demuestran que HBx interfiere con las uniones inercelulares, produce un reajuste de la expresion, distribucion y activacion de los receptores de adhesion, alterando la adhesión a la matriz extracelular, e induce un fenotipo migratorio. En conjunto, estos datos sugieren que HBx participa no sólo en la transformación celular, como se ha propuesto hasta ahora, sino tambien en la inducción de los distintos procesos que facilitan la progresion del tumor hacia la metástasis.

Autor: GONZALEZ MARTIENZ JOSE MANUEL.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA (C.S.I.C.).

Resumen: El objetivo final de este trabajo ha sido la obtención de un cDNA infectivo correspondiente al genoma del coronavirus de la gastroenteritis porcina transmisible (VGPT), que permita realizar realizar genetica inversa con el genoma viral para estudiar los mecanismos de replicacion y transcripcion y su uso como vector viral. Los objetivos parciales llevados a cabo han sido: 1. Estudio de la capacidad autorreplicativa del genoma defectivo DI-A, que contiene el gen la replicasa viral. Se ha demostrado que el genoma defectivo DI-A, derivado del VGPT, es un RNA que se replica autonomamente sin el requerimiento de un virus complementador. 2. Clonaje del RNA autorreplicativo en un plásmido procariotico utilizando estrategias que evitan la toxicidad de la secuencia viral en las celulas procarioticos. Se ha obtenido cDNA que codifica el genoma DI-A bajo el control del promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus. Se ha localizado una secuencia viral situada en el gen de la replicasa que es tóxica en celulas procarioticas. Esta toxicidad se ha minimizado mediante el ensamblaje del cDNA DI-A como un cromosoma artificial de bacterias, que permite la amplificacion estable del cDNA durante al menos 40 generaciones. La introducción en lar egion toxica de un intrón de 133 nt, que es procesado en el 15-20% de las moleculas de RNA en celulas ST transfectadas, estabiliza el cDNA durante al menos 120 generaciones. 3. Ensamblaje de un cDNA que codifique un RNA infectivo con el genoma completo del VGPT, y que genere un virus que se replique en los tractos enterico y respiratorio y sea virulento. Se ha clonado el genoma completo del VGPT con la seguncia del aislado PUR-MAD(atenuado, respiratorio y poco enterico), excepto el gen S, procedente del aislado PUR-C11 (virulento, respiratorio y enterico),ya que datos previos indican que el gen S es un determinante del tropismo y la virulencia en el VGPT. Se han ensamblado las secuencias como un cromosoma artifical de bacterias y se ha demostrado el rescate de VGPT infectivo en celulas ST transfectadas con el cDNA del genoma viral. 4. Caracterizacion del virus generado a partir del cDNA infectivo. El virus recombinante rescatado mantiene los marcadores geneticos introducidos en el cDNA. La secuencia del virus clonado presenta un número de sustituciones de nucleótido esperado para un virus con genoma RNA. Estas sustituciones se localizan en zonas que no son esenciales para la replicación del virus o que presentan habitualmente un alta variabilidad, y ninguna de ellas se ha seleccionado en todos los clones analizados. El virus obtenido induce fusion celular en cultivos, es altamente virulento y presenta tropismo respiratorio y enterico. Estas caracteristicas son propias del virus parental que proporcionó el gen S y distintas a las del virus que aportó el resto del genoma. Las caracteristicas de los distintos clones estudiados permiten concluir que el gen S es un determinante de la fusión celular, del tropismo y de la virulencia del VGPT.

Autor: GUTIERREZ RIVAS MONICA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: En este trabajo se caracterizan una serie de variantes de la retrotranscriptasa (RT) del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1(VIH-1) portadoras de cambios de aminoácido que influyen en la interacción de la enzima con los desoxirribonucleotidos, y que debido a este efecto pueden alterar las fidelidad de copia o especificidad de nucleotido de la RT. En la primera parte de la Tesis se describe la caracterización de mutantes que afectan a la posición Phe-160. Este residuo se encuentra interaccionando con la Tyr-115, cuyo papel en el reconocimiento de nucleotido se demostró en nuestro laboratorio. Cambios no conservativos de Phe-160 por Ala, Gln o Ile producen una pedida importante en la actividad DNA polimerasa de la enzima, al perderse la interacción hidrofóbica entre las cadenas laterales de los aminoácidos de las posiciones 115 y 160. Los cambios de Phe por Trp mantienen la actividad DNA polimerasa de la RT, y los ensayos bioquimicos encaminados a determinar la fidelidad de copia de estas dos variantes de la RT mostraron pequeñas diferencias entre ellas y la enzima natural. De los estudios se puede incluir que si bien deteminante en la especificidad de nucleótido o fidelidad de copia siempre que se mantenge el aracter aromatico de su cadena lateral. Además se ha demostrado que la Tyr-115 juega un papel crucial para la discriminacion entre ribonucleotidos (rNTPs) y desoxirribonucleotidos (dNTPs), siendo incorporados los rNTPs con mayor eficacia por mutantes como la Y115V o Y115G, en los que la cadena lateral voluminosa de la Tyr-115 ha sido sustituida por cadenas laterales relativamente pequeñas. Finalmente, se ha estudiado el papel del cambio de Met-230 por Ile, que apareció como cambio compensador en experimentos in vitro llevados a cabo con virus portadores de la mutacion Y115W en la RT, que presentaban una baja tasa de replicación debida a la baja actividad polimerasa y fidelidad de copia conferida por el cambio en la posicion 115. En esta Tesis se demuestra que cuando la mutacion M230I aparece asociada el cambio Y115W, no solo se incrementa la actividad polimerasa de la RT, sino que tambien se restablece la fidelidad de copia, que pasa a ser similar a la de la RT silvestre, o mutada. Por otro lado, un exhaustivo analisis de la fidelidad de copia causada por una mutacion en el motivo estructural del llamado "primer grip" que afecta a interacciones con el iniciador, y que se encuentran relativamente alejado del sitio de union de dNTPs.

Autor: ZARICH DIMITREVIEVICH NATASHA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La proteína hSos1 es un activador de Ras que actúa facilitando la transición de Ras-GDP a Ras-GTP. Se han identificado dos isoformas de hSoS1 diferenciándose solamente por la presencia de un inserto de 15 aminoácidos localizado en la región carboxi-terminal de hSos1-Isf II, próximo a los sitios canónicos de unión a Grb2, y ausente en hSos1-Isf I. Asi mismo, hSos1-Isf II presenta mayor afinidad por la proteína adaptadora Grb2 y mayor actividad biológica respecto a hSos1-Isf I. En esta tesis doctoral planteamos identificar la causa de la diferente afinidad de la sisoformas de hSos 1 con Grb2 y localizar la zona dentro de la región carboxi-terminal responsable de la regulación nefativa de la actividad de hSos1 dilucidando el mecanismo de dicha regulación. Hemos identificado dos nuevos sitios (SH3-MBS) de unión a Grb2 en la región carboxi-terminal de hSos1, estando uno de ellos dentro del inserto de 15 aminoácidos específico para la isoforma II y responsable de la mayor afinidad de hSos1-Isf II a Grb2 respecto a hSos1-Isf I. También demostramos que el nuevo sitio de unión a Grb2 (SH3-MBS) presente dentro del inserto es responsable de la diferencia funcional que existe entre las dos isoformas. Detectamos que la proteína hSos1 es capaz in vivo de forma complejos estables con Grb2 mediante los nuevos sitios SH3-MBS y que estos complejos se comportan en la activación de Ras y de la ruta de MAPK fisiológicamente igual que las proteínas hSos1 completas. Hemos visto que los mutantes truncados de hSos1 en la región carboxi-terminal presentan una mayor actividad biológica respecto a las isoformas completas tanto en activación de Ras y la ruta de Raf-MEK-MAPK, como en cooperar con Ras en la inducción del fenotipo transformante. Demostramos que la zona responsable de la regulación negativa dentro de la región carboxi-terminal de hSos1 es la que incluye los primeros dos sitios de unión a Grb2, y que la región más carboxi-terminal no influye en dicha regulación. Dicha región carboxi-terminal de hSos1 ejerce de regulador negativo indirectamente, a través de su capacidad de unir la proteína adaptadora Grb2, y es esta proteína la que está moderando negativamente la actividad de hSos1 en estado basal. Para esta regulación se precisa la proteína Grb2 completa incluyendo el dominio SH2. Identificamos que las proteínas hSos1 se fosforila en tirosina dentro del dominio catalítico CDC25-H, en estado basal y tras la estimulación mitogénica se defosforila. Detectamos la interacción directa, en estado basal, de la proteína hSos1 con el dominio SH2 de Brb2 a través de la tirosina en posición 974, siendo esto la base del modelo de la regulación negativa que proponemos. En estado basal el dominio SH2 de Grb2 interacciona con la fosfotirosona (en posición 974) del dominio CDC-25 de hSos1, reprimiendo la actividad catalítica de hSos1 provocando una conformación más cerrada. Tras la estimulación mitogénica, el dominio SH2 cambia esta fosfo-tirosina por la fosfo-tirosina del receptor activado, así llevando hSos1 a la membrana plasmática. Como consecuencia de esto, ocurre la desfosforilación de hSos1 en tirosina, hay un cambio conformacional y aumento en la actividad catalítica de hSos1.